Синергетический эффект нового антибактериального препарата "ФС-1" с антибиотиками широкого спектра действия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Синергетический эффект нового антибактериального препарата «ФС-1» с антибиотиками широкого спектра действия

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Антибактериальные препараты занимают в настоящее время одну из важных частей лекарственного арсенала. Однако широкое внедрение антибиотиков в медицинскую и ветеринарную практику привело к тому, что у микроорганизмов сформировались разнообразные механизмы устойчивости, нейтрализующие или снижающие действия антибиотиков [Чернуха М.Ю., 2000; Белобородова Н.В., 2003]. Массивный антибактериальный прессинг является селектирующим фактором и способствует быстрому распространению устойчивости среди микроорганизмов [Saurina G, 2000; Карабак В.И, 2000].

Увеличение удельного веса инфекционных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами или их ассоциациями, характеризуются выраженным клиническим полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких агентов, что затрудняет интерпретацию результатов, поскольку каждый из возбудителей обладает рядом характеристик, сочетание которых может определять высокий биотический потенциал возбудителей в целом [Габидуллин З.Г., 2006].

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) устойчивость к медикаментам первого ряда у патогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания, колеблется от нуля почти до 100%. В некоторых случаях устойчивость к веществам второго и третьего ряда подвергает серьезному риску исхода заболевания [ВОЗ, 2001; ВОЗ, 2010].

Снижение эффективности антимикробной терапии, обусловленное формированием и широким распространением полирезистентных штаммов - возбудителей инфекционных заболеваний, является предпосылкой для разработки новых и эффективных, сохраняющих высокую противомикробную активность, но лишенных побочных действий антимикробных препаратов.

Одним из приоритетных направлений для решения этой сложной задачи является работа по созданию препаратов йода нового поколения. Способность йода с лёгкостью проникать через клеточные мембраны делает его применение особо ценным и при тех инфекциях, основное развитие которых разворачивается во внутриклеточных структурах (туберкулеза, бруцеллёз, хламидиоз и т.д.) [Абраамян А.Г, 2009].

Решению этой задачи посвящен целый цикл научных исследований, проводимых в РГП «Научный центр противоинфекционных препаратов». Научные изыскания в решении данных вопросов были направлены на создание антибактериальных агентов, представляющих собой ионные наноструктурированные комплексы, образованные полипептидами, карбогидратами, солями щелочных и щелочноземельных металлов интеркалированные йодом.

Настоящая работа посвящена изучению антибактериального действия ионных наноструктурированных комплексов в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Связь темы диссертации с крупными программами, основными научно-исследовательскими работами, проводимыми научными учреждениями. Работа выполнялась в рамках утвержденной

Научно-технической программы «Разработка новых противоинфекционных препаратов» на период 2004-2011 годы согласно Постановлению Правительства Республики Казахстан от 25.06.2004 г. за №703 «Некоторые вопросы разработки новых противоинфекционных препаратов».

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования является определение антибактериального действия ионных наноструктурированных комплексов в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить антибактериальное действие ионных наноструктурированных комплексов в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

2. Определить антимикробную активность наиболее эффективных ионных наноструктурированных комплексов с антибиотиками в отношении метициллин-резистентных и метициллин-чувствительных штаммов Staphylococcus aureus.

3. Изучить антибактериальную активность наиболее эффективных ионных наноструктурированных комплексов в отношении возбудителей туберкулеза в опытах in vitro и in vivo.

Научная новизна. Впервые установлена антимикробная активность ионных наноструктурированных комплексов в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, устойчивых к одному или нескольким антибактериальным препаратам.

Выявлено повышение чувствительности микробных клеток к антибиотикам под действием препарата ФС-1.

Впервые установлен синергетический эффект препарата ФС-1 с широко используемыми антибиотиками на модели референтного полирезистентного штамма Staphylococcus aureus.

Впервые показано, на модели экспериментального туберкулеза, что препарат ФС-1 проявляет терапевтическую эффективность при монотерапии и выраженный синергетический эффект при комбинированном применении с противотуберкулезным препаратом.

Установлено, что препарат ФС-1 препятствует развитию туберкулезного воспаления в паренхиматозных органах и способствует восстановлению их функции.

Практическая значимость. Выявленный эффект синергизма препарата ФС-1 с широко используемыми антибиотиками снижает лечебную дозу каждого компонента в сочетании и улучшает переносимость антибиотика, что особенно существенно при длительном курсе терапии.

Высокий эффект синергизма позволяет исключить низкую эффективность монотерпапии.

Полученные результаты явились основанием для составления заявки на изобретение: «Антибактериальный агент для лечения инфекционных заболеваний бактериальной природы», на которое получено положительное решение формальной экспертизы от 12.12.2011 за №031421.

Результаты данной работы легли в основу доклинического досье и явились обоснованием проведения клинических испытаний препарата ФС-1 в Республике Казахстан. Препарат ФС-1 в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний.

Результаты проявления синергизма препарата ФС-1 с широко используемыми антибиотиками вошли в курс лекций учебного процесса по терапии инфекционных болезней.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Определен спектр антибактериальной активности ионных наноструктурированных комплексов в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов in vitro.

2. Выявлен синергетический эффект препарата ФС-1 с антибиотиками широкого спектра действия на метициллин-резистентном штамме Staphylococcus aureus.

3. Установлено повышение терапевтической эффективности при комбинированном применении препарата ФС-1 с противотуберкулезным препаратом.

Личное участие автора. Все основные разделы представленной работы выполнены автором лично.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Научных Советах в РГП «Научный центр противоинфекционных препаратов» (2006-2011 гг.), первом международном конгрессе студентов и молодых ученых «Мир науки» (Алматы, 2007), втором международном конгрессе студентов и молодых ученых «Мир науки» (Алматы, 2008), Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦИ МОН РК «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития» (Алматы, 2008), VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), расширенном совещании кафедры биотехнологии и биологии Кыргызкого Национального аграрного университета им. К.И. Скрябина МОН КР (Бишкек, 2012).

Полнота отражений результатов диссертации в публикациях.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 9 статей.

Структура и объем и диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста, содержит 40 рисунков, 33 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, выводов, списка использованной литературы, включающего 167 источника и приложения.

Основное содержание диссертации

ионный туберкулез антибактериальный микроорганизм

Глава 1. В первой главе приведен обзор литературы по теме диссертации.

Глава 2. Изложены материалы и методы исследования.

Объектами исследования служили ионные наноструктурированные комплексы (ИНСК), образованные полипептидами, карбогидратами, солями щелочных и щелочноземельных металлов интеркалированные йодом.

В работе были применены микробиологические, биохимические, серологические, патологоанатомические, гистологические методы.

Математическую обработку результатов и графическое представление числовых экспериментальных данных осуществляли с помощью стандартного пакета статистических программ Microsoft Office Excel.

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Изучение антибактериального действия ИНСК в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов

Скрининг по изучению антимикробной активности 60 ИНСК осуществляли на музейном штамме S.aureus ATCC 6538-Р и клинических изолятах: E.coli O₅₅ №12, S.aureus №3, P.aeruginosa №4/32.

Каждое ИНСК тестировали в следующих концентрациях: 1000 мкг/мл,

500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 63 мкг/мл, 31 мкг/мл, 16 мкг/мл и 8 мкг/мл. Полученные результаты в виде диаграмм представлены на рисунках 1-6.



Рис. 1. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК КЕ

Рис. 2. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК КД

Рис. 3. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК КТ



Рис. 4. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК КCh

Рис. 5. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК КG

Рис. 6. Сравнительная антибактериальная активность ИНСК ФС

Проведенные скрининговые исследования in vitro показали, что из 60-ти ИНСК у 35 выявлена антимикробная активность в концентрации от 500 мкг/мл до 63 мкг/мл. При этом антимикробная активность проявлялась как к музейному штамму S. aureus АТСС 6538, так и к клиническим изолятам E. coli О₅₅ №12, P. aeruginosa №4/32, S. aureus №3.

Активность в исходном разведении (1000 мкг/мл) к разным штаммам зафиксирована у 13 ИНСК: КЕ-12', КД-6', КCh-1, КCh-2, КCh-3, КCh-4, КCh-8, KG-3, KG-4, KG-5, ФС-2, ФС-3, ФС-4.

Отсутствие антимикробной активности в исходном виде с концентрацией 1000 мкг/мл ко всем культурам, как к музейному штамму, так и к клиническим изолятам, выявлено у 12 ИНСК из 60, а именно у КЕ-5, КЕ-6, КЕ-7, КЕ-16, КД-22, КД-24, КТ-1, КТ-2, КТ-3, КCh-6, КCh-7, KG-2.

Согласно руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, для дальнейших исследований могут быть рекомендованы ИНСК с МИК ниже 1000 мкг/мл [Хабриев Р.У., 2005]. Исходя из этого, нами были исключены 25 ИНСК из дальнейших исследований.

Изучение фенотипических свойств у исследуемых микроорганизмов

Для характеристики биологических особенностей штаммов были использованы следующие методики: изучение тинкториальных, культуральных и биохимических свойств в зависимости от родовой принадлежности, а так же антигенной структуры.

При изучении морфологических свойств у исследуемых микроорганизмов установлены изменения только у S. aureus. После обработки 34 из 35 ИНСК штамм менял свое типичное морфологическое расположение на небольшие скопления или в виде отдельных клеток. Тогда как 1 ИНСК - ФС-1 не оказывал влияние на морфологию S. aureus.

Культуральные модификации наблюдались у штаммов S. aureus №3,

S. aureus АТСС 6538, E. coli O₅₅ №12, у P. aeruginosa №4/32 после воздействия ИНСК, проявившиеся в исчезновении гемолитической активности. Изменение гемолитической активности косвенно свидетельствует о снижении вирулентности штаммов, т.к. гемолизины, обуславливающие гемолиз эритроцитов, являются экзотоксинами микробных клеток.

У культуры S. аureus наблюдалось ещё одно изменившиеся свойство - более раннее (по времени) проявление лецитовителлазной активности на желточно-солевом агаре. До воздействия ИНСК на данный штамм проявление лецитовителлазной активности регистрировалось через 58 часов, то после обработки время регистрации составило 17-48 часов, т.е. в 1,2-3,5 раза быстрее. Ускорение реакции дает возможность говорить о влиянии ИНСК на метаболические процессы, приводящие к снижению патогенных свойств возбудителей.

При изучении действия соединения КД-20 на E. coli O55 №12 было выявлено изменение цвета колоний, что указывает на замедленную ферментацию лактозы. Данный факт позволяет предположить, что штамм

E. coli O₅₅ №12 становится более уязвимым к воздействию представителей аутофлоры in vivo.

При оценке биохимической активности у штамма P. aeruginosa №4/32 не установлено изменений. У штамма E. coli O₅₅ №12 в ходе исследования отмечены следующие изменения: появление способности ферментации дульцита, дезаминирования мочевины, декарбоксилирования аргинина и потерю ферментации триптофана, сахарозы, трегалозы, сорбитола. У штаммов S. aureus происходит выраженное замедление сроков проявления реакции плазмокоагуляции до 18 раз.

Полученные результаты указывают, что данные признаки приводят к резкому снижению степени вирулентности штаммов, т.е. патогенных свойств возбудителей.

Определение факторов естественной резистентности у исследуемых клинических изолятов

В ходе проведения исследований по определению факторов естественной резистентности у клинических изолятов под воздействием КЕ-4, КЕ-11, КЕ-13^', ФС-1, КД-7, КТ-9, КТ-11, KG-8 было установлено уменьшение среднего показателя адгезии (СПА), что определяет снижение абсорбции патогена на поверхности клеток-мишеней, тем самым ослабляется звено в развитии инфекционного процесса.

Определена антилизоцимная активность (АЛА) у всех клинических изолятов, которая участвует в защите патогена в условиях его внутриклеточного паразитирования. Следует выделить КЕ-1, КЕ-2, КЕ-3 и

ФС-1, которые действуют на бактериальные механизмы ингибирования лизоцима, за счет чего значения АЛА снижаются. Данный факт свидетельствует о припятствии колонизации макроорганизма, бактерицидном влиянии на возбудителя и снижении развития инфекционного процесса в организме. Таким образом, на основании проведенных исследований, показано, что только препарат ФС-1 приводит к совместному снижению СПА и АЛА.

Суммируя полученные результаты культурально-морфологических, биохимических свойств и факторов естественной резистентности, установлено, что воздействие ФС-1 на клинические штаммы приводит к исчезновению гемолитической активности, удлинению реакции плазмокоагуляции, снижению факторов естественной резистентности, что свидетельствует о потере вирулентности у культур, приводящей к купированию инфекционного процесса в организме. Это послужило основанием заключить, что ионный наноструктурированный комплекс ФС-1 может проявить себя как фармацевтическое антибактериальное средство нового поколения.

Изучение влияния препарата ФС-1 на метициллин-резистентные и метициллин-чувствительные штаммы Staphylococcus aureus в комбинации с антибактериальными препаратами

Проведенные скрининговые исследования по определению устойчивости к оксациллину / метициллину установили, что из 114 клинических изолятов

S. aureus 58 штаммов относятся к метициллин-резистентным штаммам (MRSA), а 56 штаммов - к метициллин-чувствительным (MSSA).

При определении антимикробной активности препарата ФС-1 установлена, его бактериостатическая и бактерицидная активность как против изолятов MSSA, так и против изолятов MRSA. При этом минимальная бактериостатическая активность была зафиксирована при концентрации

620 мкг/мл. Наибольшая антибактериальная активность составляла

2540 мкг/мл, хотя для подавляющего числа протестированных стафилококковых штаммов минимальная бактериостатическая активность проявилась в концентрации 1270 мкг/мл. При сравнении метициллин-резистентных и метициллин-чувствительных клинических изолятов установлено, что у 45 (77,6%) штаммов MRSA минимальная бактериостатическая активность выявлена в концентрации 1270 мкг/мл против 51 (88%) штаммов MSSA. Бактерицидная активность установлена в концентрациях 2540 мкг/мл для 13 (22,4%) штаммов MRSA и 28 (50,0%) штаммов MSSA и 1270 мкг/мл для 45 (77,6%) штаммов MRSA и 28 (50,0%) штаммов MSSA (таблица 1).

Таблица 1. Суммарная характеристика бактериостатической и бактерицидной активности препарата ФС-1 при воздействии на S. aureus

Концентрация ФС-1, мкг/мл	Минимальная бактериостатическая активность	Минимальная бактерицидная активность
	Количество изолятов (абсолютное количество, %)
	MRSA	MSSA	MRSA	MSSA
2540	2 (3,4%)	2 (3,6%)	13 (22,4%)	28 (50,0%)
1270	45 (77,6%)	51 (91,0%)	45 (77,6%)	28 (50,0%)
620	11 (19,0%)	3 (5,4%)	-	-

Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) препарата ФС-1 варьировала в пределах 2540-1270 мкг/мл (таблица 2). Причем ФС-1 в равной степени был эффективен как в отношении музейных культур, так и клинических изолятов, в том числе резистентных.

Таблица 2. Минимальная ингибирующая концентрация препарата ФС-1 при воздействии на стафилококковые клинические изоляты в сравнении с референтными штаммам

Бактериальные штаммы	Разброс МИК ФС-1, мкг/мл
S. aureus АТСС 43300 (MRSA)	2540
S. aureus АТСС 29213 (MSSA)	2540
MRSA n=58	2540-1270
MSSA n=56	2540-1270

Таким образом, препарат ФС-1 обладает выраженным антимикробным действием и проявляет одинаковую эффективность в отношении референтных и клинических штаммов MSSA и MRSA.

Следующий этап нашего исследования заключался в изучении противомикробной активности препарата ФС-1 в комбинации с антибиотиками и оценки возможного синергетического действия на модели референтного метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus ATCC 43300.

Для первой серии эксперимента был выбран ванкомицин (гликопептид), как антибиотик, используемый при лечении инфекций вызванных MRSA. Для тестирования использованы концентрации ванкомицина от 0,125 мкг/мл до 8 мкг/мл и ФС-1 в концентрациях: от 310 мкг/мл до 5080 мкг/мл.

Для второй серии опытов был выбран бета-лактамный антибиотик, к которому MRSA устойчивы - цефамандол (цефалоспорин второго поколения) в концентрациях от 0,125 мкг/мл до 128 мкг/мл и ФС-1 в концентрациях: от 310 мкг/мл до 5080 мкг/мл.

Для третьей серии опытов был выбран препарат группы хинолонов - ципрофлоксацин (хинолон) в концентрациях от 0,015 мкг/мл до 8 мкг/мл и ФС-1 в концентрациях: от 310 мкг/мл до 5080 мкг/мл.

Для четвертой серии опытов был выбран бета-лактамный антибиотик, к которому MRSA устойчивы - оксациллин (пенициллиназа-устойчивый пенициллин) в концентрациях от 0,25 мкг/мл до 1024 мкг/мл и ФС-1 в концентрациях: от 310 мкг/мл до 5080 мкг/мл.

Для пятой серии опыта был выбран антибиотик группы линкозамидов - линкомицин в концентрациях от 0,03 мкг/мл до 8 мкг/мл и ФС-1 в тех же концентрациях, что и в предыдущих опытах.

Обобщенные результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Таблица 3. Комбинированное действие препарата ФС-1 и антибиотиков на модели S. aureus ATCC 43300

Тестируемая комбинация	МИК при раздельном тестировании, мкг/мл	МИК при совместном тестировании, мкг/мл	Снижение МИК, в раз
ФС-1 / ванкомицин	2540/2	1270/2	2/-
ФС-1 / цефамандол	2540/64	1270/8	2/8
ФС-1 /ципрофлоксацин	2540/2	2540/2	-/-
ФС-1 / оксациллин	2540/256	1270/64	2/4
ФС-1 / линкомицин	2540/2	2540/2	-/-

В таблице 3 показаны результаты тестов по изучению совместного действия. Установлено, что при комбинированном применении препарата

ФС-1 и бета-лактамных антибиотиков (на примере оксациллина), а также цефалоспоринов II поколения (на примере цефамандола) проявляется синергетический эффект в отношении метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus ATCC 43300.

Совместное использование препарата ФС-1 и гликопептидов (на примере ванкомицина), а также хинолонов (на примере ципрофлоксацина) и линкозамидов (на примере линкомицина) приводит к индифферентности.

Таким образом, по результатам проведенных работ установлена антимикробная активность препарата ФС-1 к клиническим изолятам и контрольным референтным штаммам MRSA и MSSA. При совместном применении ФС-1 с оксациллином и ФС-1 с цефамандолом установлен эффект синергизма.

Оценка эффективности противотуберкулезного действия препарата ФС-1 в опытах in vitro и in vivo

В работе использовали чувствительный к противотуберкулезным препаратам музейный штамм M. tuberculosis H37Rv, штамм с множественной лекарственной устойчивостью M. tuberculosis MS-115 и штамм M. bovis An-2, устойчивый к пиразинамиду.

Антибактериальное действие препарата ФС-1 изучали по динамике роста микобактериальных штаммов в обогащенной жидкой среде в присутствии следующих концентраций: 3380 мкг/мл; 1840 мкг/мл; 1500 мкг/мл; 780 мкг/мл; 390 мкг/мл; 200 мкг/мл; 125 мкг/мл; 100 мкг/мл; 60 мкг/мл; 50 мкг/мл; 30 мкг/мл.

В качестве контроля использовали рост данных штаммов на среде, не содержащей ФС-1, а также на среде, содержащей препарат 1-го ряда изониазид в концентрации 0,1 мкг/мл.

Результаты исследования бактерицидной активности препарата ФС-1 по отношению к штаммам микобактерий туберкулеза представлены в таблицах 4-6.

Таблица 4. Бактерицидная активность препарата ФС-1 в отношении штамма M. tuberculosis H37Rv

Препарат - Концентрация, мкг/мл	Начало роста (сутки)	Начало плато (сутки)	Продолжительность фазы активного деления (сутки)
Без препарата	6,00	12,33	6,33
Изониазид - 0,1	Нет роста
ФС-1 - 3380	Нет роста
ФС-1 - 1840	Нет роста
ФС-1 - 1500	Нет роста
ФС-1 - 780	Нет роста
ФС-1 - 390	Нет роста
ФС-1 - 200	5,96	11,83	5,87
ФС-1 - 125	5,92	11,75	5,83
ФС-1 - 100	5,88	11,67	5,79
ФС-1 - 60	5,88	11,83	5,95
ФС-1 - 50	5,75	11,58	5,83
ФС-1 - 30	5,71	11,54	5,83

Таблица 5. Бактерицидная активность препарата ФС-1 в отношении штамма M. bovis An-2

Препарат - Концентрация, мкг/мл	Начало роста (сутки)	Начало плато (сутки)	Продолжительность фазы активного деления (сутки)
Без препарата	5,92	12,58	6,66
Изониазид - 0,1	Нет роста
ФС-1 - 3380	Нет роста
ФС-1 - 1840	Нет роста
ФС-1 - 1500	Нет роста
ФС-1 - 780	Нет роста
ФС-1 - 390	Нет роста
ФС-1 - 200	6,33	12,46	6,13
ФС-1 - 125	6,29	12,38	6,09
ФС-1 - 100	6,29	12,46	6,17
ФС-1 - 60	5,92	11,96	6,04
ФС-1 - 50	5,58	11,54	5,96
ФС-1 - 30	5,62	11,58	5,96

Таблица 6. Бактерицидная активность препарата ФС-1 в отношении штамма M. tuberculosis MS-115

Препарат - Концентрация, мкг/мл	Начало роста (сутки)	Начало плато (сутки)	Продолжительность фазы активного деления (сутки)
Без препарата	6,5	12,96	6,46
Изониазид - 0,1	6,42	12,71	6,29
ФС-1 - 3380	Нет роста
ФС-1 - 1840	Нет роста
ФС-1 - 1500	Нет роста
ФС-1 - 780	Нет роста
ФС-1 - 390	Нет роста
ФС-1 - 200	6,83	13,04	6,21
ФС-1 - 125	6,63	12,79	6,16
ФС-1 - 100	6,63	12,79	6,16
ФС-1 - 60	6,46	12,58	6,12
ФС-1 - 50	6,38	12,46	6,08
ФС-1 - 30	6,42	12,54	6,12

Из представленных в таблицах 4-6 данных видно, что на протяжении всего срока исследования наблюдалось под воздействием ФС-1 полное подавление размножения микобактерий в диапазоне концентраций от 3380 мкг/мл до 390 мкг/мл включительно, независимо от вида возбудителя туберкулеза.

В остальных тестируемых концентрациях препарата ФС-1 рост культур начинался от 5,62 до 6,83 суток.

Культивирование M. tuberculosis H37Rv и M. bovis An-2 на среде с изониазидом показало отсутствие микобактериальных клеток на протяжении всего срока эксперимента, тогда как в отношении штамма с множественной лекарственной устойчивостью M. tuberculosis MS-115 активность изониазида не проявлялась и характеризовалась типичным ростом в среде.

Для изучения терапевтической эффективности препарата ФС-1 на модели эксперементального туберкулеза использовали 50 самок морских свинок-альбиносов, весом 300 - 350 г. Заражение животных осуществляли аэрогенным путем в дозе 150 колониеобразующих единиц (КОЕ) M. tuberculosis H37Rv на легкое. Лечение животных в опытных группах (2, 3 и 4) начинали через 14 дней после заражения. ФС-1 вводили в дозе из расчета 5 мг/кг, а изониазид - 10 мг/кг массы тела. В группе животных, получавших комбинированное лечение препаратом ФС-1 с изониазидом, антибиотик вводили через 30 минут после ФС-1. Через 1 месяц после заражения проводили анализ процесса инфицирования и лечения путем макроскопирования и гистологических исследований. Через 2,5 месяца все животные 5-ти групп были подвергнуты эвтаназии и патологоанатомическому вскрытию. Эффективность лечения в опытных группах определяли по микробиологическим и гистологическим исследованиям.

Для определения количества микобактерий в легких у зараженных животных был произведен посев. Результаты высеваемости M. tuberculosis H37Rv представлены в таблице 7.

Таблица 7. Количество колониеобразующих единиц M. tuberculosis H37Rv из легких морских свинок через 2,5 месяца после заражения

Группа животных	КОЕ на легкое, (М±m)
Контрольные животные	(8,5±0,22)Ч109
Животные получавшие ФС-1	(3,4±0,74)Ч107
Животные получавшие изониазид	(5,4±0,54)Ч104
Животные получавшие изониазид+ФС-1	(1,4±0,81)Ч104

Согласно приведенным, в таблице 7 данным, количество высеваемых микобактерий из ткани легкого контрольной группы морских свинок было почти в 100 раз больше, чем у животных, получавших в течение 2 месяцев монотерапию препаратом ФС-1. У животных, получавших в аналогичный период изониазид и изониазид совместно с ФС-1, микобактерий в легком обнаружено на пять порядков меньше, чем у животных контрольной группы.

Гистологическими исследованиями у морских свинок контрольной (1-ой) группы установлены в легких множественные очаги казеозного некроза различных размеров, окруженные специфической грануляционной тканью, ограниченной по периферии тонкой фиброзной капсулой. Стенки бронхов всех генераций утолщены за счет отека, инфильтрации клеточными элементами воспаления; просветы сужены, содержат клетки слущенного эпителия и нейтрофильные лейкоциты (НЛ), участки внутриальвеолярного отека, кровоизлияния, зоны дистелектаза. Легочная ткань у таких животных сохраняет воздушность не более чем на 30-35% площади среза. Межальвеолярные перегородки значительно утолщены за счет кровенаполнения, отека, обширной инфильтрации моно- и полинуклеарами. Кровеносные сосуды с признаками стаза, в просветах определяются НЛ. В печени имеют место периваскулярные инфильтраты со значительным количеством НЛ, формирующих микронекрозы. Гепатоциты с признаками выраженной белковой дистрофии, особенно в периваскулярных зонах. В селезенке фолликулярная гиперплазия сочетается с обеднением реактивных центров лимфоидными элементами. Сосуды всех генераций с выраженными признаками стаза, кровенаполнения, максимально выраженном в мозговом веществе. Паренхима органа неравномерно инфильтрирована клеточными элементами воспаления, среди которых встречается много НЛ, в том числе формирующих микронекрозы. У одного животного обнаружены отдельные очаги казеоза.

Таким образом, полученные результаты показывают, что через 2,5 месяца в организме аэрогенно зараженных контрольных животных за счет микобактериальной диссеминации развился прогрессирующий туберкулезный процесс во всех паренхиматозных органах.

У инфицированных животных (2-я группа), получавших изониазид в течение эксперимента в легких очаги казеоза или другие признаки туберкулезного воспаления не выявлены, легочная паренхима имеет наиболее близкое к норме гистологическое строение, сохраняет воздушность до 90-95% площади среза. Небольшие периваскулярные или перибронхиальные рыхлые инфильтраты с преобладанием мононуклеаров, небольшим числом НЛ, без микронекрозов, сохраняются у отдельных животных. Межальвеолярные перегородки несколько утолщены за счет умеренной инфильтрации мононуклеарами с примесью НЛ. Кровенаполнение менее выражено, чем в других группах. В печени сосуды расширены, сохраняются участки белковой дистрофии гепатоцитов, замещение их соединительной тканью. В селезенке в красной пульпе небольшие скопления клеточных элементов воспаления, в том числе НЛ.

В третьей экспериментальной группе животных, получавших монотерапию препаратом ФС-1, путем гистологических исследований установлено, что введение препарата на всем протяжении эксперимента оказало выраженное противотуберкулезное действие. Хотя очаги казеозного некроза в легких сохраняются, однако они единичны и меньших размеров, имеют более плотную организацию, в том числе зоны казеоза. На гистологических срезах в легких морских свинок, заметно сокращена площадь инфильтративных изменений, благодаря чему участки воздушной паренхимы составляют до 50-60% площади среза. Определяются небольшие клеточные инфильтраты, содержащие НЛ. Вокруг бронхов формируется рыхлая соединительная ткань, много лимфонодулей. Изменения в печени и селезенке, характеризуются небольшими клеточными скоплениями с умеренным содержанием НЛ, инфильтративные изменения менее выражены, но имеются единичные очаги казеоза и микронекрозов. Количество фолликулов в селезенке намного меньше, чем в контроле, они имеют плотные центры.

У инфицированных морских свинок (4-я группа), получавших комплексную терапию препаратом ФС-1 совместно с изониазидом, изучение не выявило гистологических нарушений в строении паренхиматозных органов. Признаки туберкулезного воспаления так же не были выявлены. Легочная паренхима имеет нормальное гистологическое строение, сохраняет воздушность до 90-95% площади среза. У отдельных животных межальвеолярные перегородки полнокровны, инфильтрированы мононуклеарами, среди которых определяются единичные эозинофильные лейкоциты. Имеются небольшие участки кровоизлияний. В печени и селезенке макрофагальные элементы образуют заметные периваскулярные скопления, в составе которых определяются клетки крови.

Таким образом, проведенные in vivo исследования на модели морских свинок показали, что препарат ФС-1 оказывает выраженное противовоспалительное действие на течение экспериментального туберкулеза. Повышает воздушность легочной паренхимы более, чем в два раза. В сочетании с изониазидом препарат сохраняет свое действие и вызывает более заметное, чем при монотерапии, повышение проницаемости микроциркуляторного русла.

Выводы

1. Ионные наноструктурированные комплексы (ИНСК) проявляют выраженную антибактериальную активность, одинаково подавляя рост как грамположительных, так и грамотрицательных условно-патогенных и патогенных бактерий. МИК антимикробной активности у 35 ИНСК проявлялась в концентрации от 500 мкг/мл до 63 мкг/мл как к референтным штаммам, так и к клиническим полирезистентным изолятам микроорганизмов.

2. Воздействие ионных наноструктурированных комплексов на исследуемые микроорганизмы оказывает выраженное влияние на их культурально-морфологические, биохимические свойства; снижает вирулентность возбудителя инфекции путем утери гемолитической активности и резкого замедления реакции плазмокоагуляции, а также ускоряет сроки лецитовителлазной активности, свидетельствующей о более раннем наступлении гибели микробной клетки.

3. Под воздействием ионных наноструктурированных комплексов у исследуемых микроорганизмов снижаются адгезивные и антилизоцимные свойства культур, что приводит к потере факторов резистентности и их вирулентности.

4. Впервые установлена бактерицидная активность ФС-1 на 114 метициллин-резистентных и метициллин-чувствительных штаммах Staphylococcus aureus как к клиническим изолятам, так и к референтным штаммам.

5. Комбинированное применение ФС-1 и бета-лактамных антибиотиков (на примере оксациллина), а также цефалоспоринов II поколения (на примере цефамандола) приводит к синергетическому эффекту в отношении метициллин-резистентного S.aureus ATCC 43300.

6. Впервые в опытах in vitro и in vivo установлена выраженная антибактериальная активность ФС-1 против музейных, клинических и эпизоотических штаммов возбудителей туберкулеза.

7. ФС-1 оказывает терапевтическую эффективность при монотерапии, и выраженный синергетический эффект при комбинированном применении с изониазидом на модели экспериментального туберкулеза. Установлено, что ФС-1 препятствует развитию туберкулезного воспаления в паренхиматозных органах и способствует быстрому восстановлению их функции.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Изучение антибактериального действия «ФС-1» на полирезистентные клинические изоляты [Текст] / [Скрынникова Н.В., Баймуратова М.А.] // Материалы первого международного конгресса студентов и молодых ученых «Мир науки». - Алматы, 2007. - С. 63.

2. ?й ?ояндарында?ы туберкулезді процеске ФС-1 препаратыны? ?сері [Текст] / [Нурымбетов К.Д., Плазун А.А., Искакбаева Ж.А., Енин Е.А., Леонова Н.В.] // Материалы второго международного конгресса студентов и молодых ученых «Мир науки». - Алматы, 2008. - С. 65-67.

3. Влияние ФС-1 на клинические и референсные штаммы Staphylococcus aureus [Текст] / [Н.В. Леонова, А.Б. Кудабаев, Д.Г. Нашев] // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦИ МОН РК. Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития. - Алматы, 2008. - С. 279-280.

4. Изучение противотуберкулезной активности ФС-1 по отношению к Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv [Текст] / [С.С. Касымбекова, Н.В. Леонова] // Сборник тезисов VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2009. - С. 108-110.

5. К вопросу по изучению степени обсемененности и антибиоти-корезистентности клинических изолятов [Текст] / [М.А. Баймуратова, Н.В. Леонова, Т.Б. Есенаманова, Г.А. Ислямова, Г.М. Маликова] // Гигиена, эпидемиология и иммунология. - 2010. - №1. - С. 153-155.

6. Изучение комплексообразующих свойств (N-метилглю-козамино-1-карбонотиоил) - 4-бромбенз-амида и анти-бактериальная активность хе-латного ком-плекса с суль-фатом меди (2⁺) [Текст] / [Н.В. Леонова, И.В. Кулаков, А.И. Ильин, С.С. Касымбекова, Д.В. Баринов, О.В. Щукина] // IV Международная научная конференция молодых ученых «Инновационное развитие и востребованность науки в современном Казахстане». - Алматы, 2010. - С. 107-112.

7. Синтез и антибактериальная активность хелатного комплекса (n-метилглюкозамино-1-карбонотиоил) - 4-бромбензамида с сульфатом меди (II) [Текст] / [Ильин А.И., Кулаков И.В., Леонова Н.В., Касымбекова С.С., Щукина О.В., Баринов Д.Ю.] // Журнал общей химии. - 2011. - Т.81.- №6. - С. 978-982.

8. Патоморфологическая характеристика действия препарата ФС-1 на течение туберкулеза в организме зараженных животных [Текст] / [Керимжанова Б.Ф., Ильин А.И., Леонова Н.В.] // Гигиена, эпидемиология и иммунология. - 2011. - №1. - С. 61-64.

9. Определение антибактериальной активности препарата ФС-1 на микобактерии туберкулеза в эксперименте in vitro [Текст] / [Ильин А.И., Керимжанова Б.Ф., Леонова Н.В.] // Известия НАН РК Серия Биологическая и Медицинская. - 2011. - Т.4. - №286. - С. 26-35.

10. Изучение факторов естественной резистентности у клинических изолятов под влиянием ионно наноструктурированных комплексов [Текст] / [Леонова Н.В.] // Научно-практический журнал «Ветеринария». - 2012. - №1 (23). - С. 55-56.

11. Комбинированное действие лекарственного средства ФС-1 и антибиотиков широкого спектра действия против Staphylococcus aureus [Текст] / [Леонова Н.В.] // Научно-практический журнал «Ветеринария». 2012. - №1 (23). - С. 57-58.

12. Антибактериальная активность лекарственного средства ФС-1 в отношении метициллин-резистентных и метициллин-чувствительных Staphylococcus aureus [Текст] / [Леонова Н.В.] // Известия НАН КР. - 2012. - №1. - С. 65-68.

Размещено на Allbest.ru