Особенности цикла сон-бодрствование у крыс на ранней стадии беременности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности цикла сон-бодрствование у крыс на ранней стадии беременности

общая характеристика работы

крыса сон беременность

Актуальность проблемы

В последние годы возрастает количество сведений о важности пренатального периода для развития организма (Avishai-Eliner et al., 2002; Huizink et al., 2004; Отеллин и соавт., 2007). В современной нейронауке возникло новое направление "перинатальное программирование", в рамках которого рассматривается роль негенетических факторов в периоды пренатального и раннего постнатального онтогенеза (Edwards et al., 1993; Barker, 1995). В нашей стране еще в 1935г. начались исследования этой проблемы в лаборатории И.А. Аршавского, где и были заложены экспериментальные основы для изучения возрастной физиологии и патологии животных и человека. В дальнейшем И.А. Аршавским была создана нейроэнтропийная теория онтогенеза, в которой были изложены физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития (Аршавский, 1982). Согласно теории системогенеза П.К. Анохина (Анохин, 1948) на каждой стадии онтогенетического развития адаптивные возможности организма полностью соответствуют особенностям среды. Каждому из этапов развития соответствует определенное морфологическое обеспечение функций и обучение специфическому поведению. Онтогенез раннего поведения состоит из последовательных этапов, которым соответствует ряд постепенно усложняющихся и сменяющих друг друга механизмов сенсорного обеспечения (Шулейкина, 1971; Хаютин, Шулейкина, 1990). Продолжая исследования роли сенсорного притока в формировании функций развивающегося мозга, В.В. Раевский обосновывает представление об онтогенетических нишах, более полно характеризующее закономерности онтогенетического развития (Раевский, 2002). Говоря о принципах действия окружающей среды на формирующийся организм, нельзя не упомянуть труды выдающегося отечественного эмбриолога П.Г. Светлова (Светлов, 1960, 1978), создателя теории критических периодов развития, справедливой не только для постнатального, но и для пренатального развития.

О существенном влиянии условий пренатального периода на жизнеспособность плода и развитие потомства свидетельствуют многочисленные данные о негативных последствиях недостаточности питания, гипоксии и других вредящих условий окружающей среды во время беременности (Braastad, 1998; Granger, 2002; Отеллин и соавт., 2007).

Хотя одним из важнейших условий нормального развития организма признается здоровый сон матери во время беременности, в научной литературе депривация сна в этот период перечисляется лишь в числе различных методов создания неспецифического пренатального стресса (Huizink et al., 2004). Такое положение вещей, по-видимому, связано с тем, что в большинстве случаев отсутствие адекватного контроля делало невозможным разделить эффекты процедуры депривации и собственно нарушения сна. В связи с этим сведения о влиянии нарушения сна на жизнеспособность плода и развитие новорожденных крайне ограничены (Santiago et al., 2001; Sahota et al., 2003). Данные о естественном сне у женщин во время беременности также малочисленны, однако можно с уверенностью говорить о том, что структура цикла сон-бодрствование в период беременности претерпевает существенные изменения (Santiago et al., 2001).

В настоящее время все большую экспериментальную поддержку приобретает гипотеза, согласно которой "высшая" координация висцеральных функций осуществляется во время сна, когда открываются каналы проведения висцеральной информации в отделы коры мозга, во время бодрствования производящие анализ экстероцептивных сигналов (Pigarev, 1994; Пигарев, 2005). Можно предположить, что изменение электрической активности мозга во время сна отражает происходящую в период беременности радикальную перестройку висцеральных систем в организме и сопутствующее изменение характера афферентного притока (Аршавский, 1982; Born, 2002). Поскольку развитие плода, особенно на ранних этапах беременности, контролируется висцеральным сенсорным потоком в организме матери (Аршавский,1982; Granger, 2002; Gluckman, Hanson, 2004), естественно предположить, что нарушение ее сна в период беременности скажется на жизнеспособности плода и его дальнейшем развитии.

Необходимость изучения особенностей сна во время беременности, пополнения сведений о его структуре и регуляции в этот период на сегодняшний день становится все более очевидной. Поскольку исследования естественного сна и последствий его нарушения в период беременности на людях, по понятным причинам, ограничены, эти практически важные исследования необходимо проводить на животных моделях. Изучение данных литературы показало, что объективных электрофизиологических исследований сна крыс (наиболее распространенного объекта сомнологических исследований) в процессе беременности крайне мало. Работы группы японских ученых (Kimura et al., 1996; Kimura et al., 1998) оказываются практически уникальными. Они были выполнены, в основном, для проверки воздействия различных фармакологических веществ, касались только отдельных периодов беременности и не затрагивали проблемы нарушения сна и особенностей его регуляции. Однако авторам удалось показать, что сон беременных крыс по ряду характеристик сходен со сном беременных женщин, что придает особую важность изучению сна крыс в период беременности.

Таким образом, актуальность настоящей работы определяется острой необходимостью проведения подробного исследования структуры и регуляции цикла сон-бодрствование у крыс в процессе беременности.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было выявление особенностей структуры естественного сна и его регуляции у самок крыс до и во время беременности с использованием объективных методов фундаментальной сомнологии.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

· Создать экспериментальную установку для круглосуточной регистрации полисомнограммы у небеременных (контрольных) и беременных животных в условиях свободного поведения, позволяющую также проводить контролируемую депривацию их сна методом «диск над водой»;

· Проследить изменение структуры естественного сна крыс в течение первой недели беременности по сравнению с небеременными контрольными крысами;

· Оценить возможность применения метода «диск над водой» без обратной связи для обеспечения общей депривации сна в экспериментах, требующих кратковременного лишения сна беременных и небеременных крыс;

· Сопоставить эффективность депривации сна методом «диск над водой» без обратной связи для беременных и небеременных крыс;

· Исследовать гомеостатическую регуляцию сна после его трехчасовой депривации в течение трех последовательных дней у беременных и небеременных крыс.

Положения, выносимые на защиту

1. Система депривации сна «диск над водой» без обратной связи представляет собой адекватный метод изучения последствий кратковременной депривации сна крыс;

2. У крыс на ранней стадии беременности не меняется общее количество как медленного, так и быстрого сна, но происходит существенная перестройка суточного паттерна ряда параметров цикла сон-бодрствование, что говорит об изменении работы циркадного компонента регуляции сна в этот период;

3. У крыс на ранней стадии беременности компенсация последствий кратковременной депривации сна проходит более эффективно, по сравнению с небеременными животными, что свидетельствует о наличии у беременных крыс дополнительных защитных механизмов функционирования гомеостатического компонента регуляции сна.

Научная новизна работы

В рамках настоящей работы при помощи метода объективных электрофизиологических исследований впервые подробно описана структура цикла сон-бодрствование у крыс на ранней стадии беременности. Анализ данных с использованием показателей, ранее не применявшихся при описании сна, позволил продемонстрировать происходящие изменения в организации сонного цикла у крыс, связанные с началом и развитием беременности. В экспериментах с депривацией сна у крыс до и во время беременности методом «диск над водой» впервые выявлены особенности регуляции сна в гестационный период. Показано, что у крыс во время беременности механизмы компенсации последствий депривации сна функционируют более эффективно, чем у небеременных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы

В настоящем исследовании разработан и апробирован экспериментальный подход к изучению особенностей регуляции сна крыс во время беременности методом лишения сна в установке «диск над водой». Данная методика представляет собой экспериментальную базу для исследования влияния нарушения сна матери на жизнеспособность и развитие потомства. В свете того, что подобные исследования на людях по понятным причинам ограничены, важность изучения данного вопроса с использованием животных моделей несомненна.

Полученные в настоящей работе сведения о структуре цикла сон-бодрствование и особенностях его регуляции у крыс в процессе беременности представляют собой ценную базу для развития представлений о функциональном назначении медленного и быстрого сна и характере их взаимодействия в цикле сон-бодрствование.

Поскольку сон крыс и человека сходен по ряду параметров, результаты полученных экспериментов позволяют говорить о необходимости особого внимания к целостности сна женщин во время раннего периода беременности.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на регулярных международных школах-конференциях «Сон - окно в мир бодрствования» (Ростов-на-Дону, 2005, 2009; Москва, 2007); на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации», посвященном памяти профессора А.А. Филаретова (Санкт-Петербург, 2007); на VI Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы сомнологии» (Санкт-Петербург, 2008); на XIX Конгрессе Европейского общества исследователей сна (Глазго, 2008); на VI Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы сомнологии» (Санкт-Петербург, 2008); на конференциях молодых ученых в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (Москва, 2007, 2008); на международной школе для молодых ученых, организованной Европейским обществом исследователей сна и научным фондом EU «Marie Curie» (Бертиноро, 2009; Цюрих, 2009, Париж, 2009).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения полученных результатов, общего заключения, выводов и списка литературы, содержащего 222 источника. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 7 таблиц.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на 34 самках крыс Вистар в возрасте 3 месяцев (начальная масса тела 200-250 гг.), завезенных из питомника «Столбовая» Московской области.

Под глубоким общим наркозом (хлорал гидрат 325 мг/кг в/б) поверхность черепа освобождали от мягких тканей и имплантировали четыре винтовых регистрирующих электрода. Электроды вживляли стереотаксически (Paxinos, Watson, 1998) в точки с координатами AP = _1.0 от лямбды, L = _3.0 (над мозжечком, №1); AP = 1.0 от лямбды, L = 3.5 (над затылочной корой, №2); AP = _1.0 от брегмы, L = 2.5 (над теменной корой, №3); AP = _4.3 от брегмы, L = _2.0 (№4). Расположение электрода №4 обеспечивало оптимальную регистрацию тета-ритма гиппокампа. Электроды тонкими проводами соединяли с разъемом, обеспечивающим связь с регистрирующим кабелем. Для обеспечения надежной фиксации всей конструкции на голове животного дополнительно вкручивали два крепежных винта в боковые поверхности задней части черепа и один - в носовую кость; все винты и разъем заливали акриловой зуботехнической пластмассой.

В эксперименте к разъему на голове животного подключали гибкий кабель, по которому осуществлялась передача сигнала от регистрирующих электродов на входы полиграфа через систему скользящих контактов (Moog Inc., США). Кабель и система скользящих контактов были смонтированы на рычаге с противовесом, компенсирующим их тяжесть. Осью компенсирующего рычага был потенциометр, на который подавалось постоянное напряжение от источника питания. Данная схема позволяла преобразовать качание рычага, вызванного движениями животного, в изменение напряжения на выходе потенциометра. Таким методом производили регистрацию двигательной активности животного в условиях свободного поведения.

Для регистрации ЭЭГ и двигательной активности использовали полиграф Sagura-2000 (MKE Medizintechnik GmbH, Германия). Для каждого животного полисомнограмма включала запись ЭЭГ по двум каналам: между электродами №2 и №3 и №1 и №4, а также запись двигательной активности. Усиленные сигналы поступали на компьютер с установленным программным обеспечением Leonardo (MKE Medizintechnik GmbH, Германия). Частота оцифровки составляла 200 Гц для всех каналов. Для каналов ЭЭГ цифровые фильтры обеспечивали полосу пропускания частот 1.6-30 Гц, для каналов двигательной активности - 0.1-10 Гц.

Эксперименты проводили в установке «диск над водой (рис. 1). В течение эксперимента животные жили на диске диаметром 46 см, расположенном над поддонами с водой. Глубина воды не превышала 3 см. Пространство над диском было разделено вертикальными перегородками на две индивидуальные камеры длиной 60, шириной 20 и высотой 60 см. В каждой камере находились кормушка и поилка. При радиусе диска, равном 46 см, площадь участка диска для одного животного (492 смІ) была примерно равной площади, занимаемой животным в стандартной клетке вивария. Во время тренировочного периода и процедуры депривации сна диск приводился в движение при помощи мотора, управляемого компьютером.

Рис. 1. Схема установки для депривации сна «диск над водой»

Не менее чем через семь дней после операции животных помещали по одному в камеры экспериментальной установки и подключали кабель к разъему на голове. В камерах поддерживали световой режим 12 ч/12 ч (включение света в 8:00), который соответствовал световому режиму вивария. Момент включения света в камерах считали началом экспериментального дня. В установке было обеспечено существенное ослабление звукового притока извне. Температура воздуха в комнате и в камерах установки была в пределах от 21 до 24є С. Крысы имели неограниченный доступ к воде и пище. В первые два дня пребывания крысы в камере поверх диска помещали пластину из плексигласа для создания сплошного пола. Далее пластину убирали, и с этого момента крысы жили на диске над водой, налитой в поддон. В течение последующих семи дней после выключения света проводили сеансы тренировки, во время которых крыс обучали ходить по вращающемуся диску. После окончания тренировочного периода, к началу эксперимента, все животные были успешно обучены, что позволяло им ходить по диску и не падать в воду при его вращении.

Для депривации сна применяли периодическое вращение диска в автоматическом режиме: 8 секунд - вращение, 15 секунд - пауза между вращениями. Направление вращения диска меняли в случайном порядке. Скорость вращения составляла 3.4 оборотов в минуту. За 8 секунд диск поворачивался на половину оборота. Депривацию сна проводили в течение трех последовательных дней с 11:00 до 14:00. У беременных крыс депривацию сна начинали с 5-го дня беременности. Три дня депривации сна у крыс экспериментальных групп также сопровождались непрерывной регистрацией полисомнограммы.

Эстральные фазы у крыс определяли методом вагинальных мазков (Объекты биологии развития, 1975). В ночь эструса к каждой самке в экспериментальную камеру подсаживали самца. При этом с помощью пластины из плексигласа пол в камере снова делали сплошным. Первый день беременности определяли по наличию сперматозоидов в мазке. Начиная с этого дня, самцов отсаживали, сплошной пол убирали, и в дальнейшем беременные самки жили на диске над водой.

С помощью программного пакета Cartool в полисомнограммах визуально выделяли периоды бодрствования, медленного сна и быстрого сна. Выделение стадий в записи осуществляли без разбиения ее на эпохи, маркерами отмечали начало и конец выделяемых периодов. В записи не оставалось периодов, не отнесенных к одному из трех перечисленных состояний. Эпизоды любого вида короче двух секунд игнорировали. Для обработанного фрагмента записи определяли общую длительность каждого состояния, которую затем выражали в процентах от различных по длительности интервалов времени (1 ч, 12 ч и 24 ч). Для оценки степени фрагментарности сна в исследуемом временном интервале вычисляли количество коротких пробуждений, фрагментов записи, определенных как бодрствование, которые не превышали 16 секунд (Vyazovskiy et al, 2007).

Далее следует описание схемы экспериментов и анализа данных для отдельных разделов работы.

Особенности сна крыс на ранней стадии беременности.

Эксперимент проведен на 18 животных. В контрольную группу вошли небеременные крысы (n=12), в экспериментальную группу (n=6) - крысы на первой неделе беременности. После адаптации к камере и тренировочного периода у контрольных крыс, находящихся на неподвижном диске над водой, проводили непрерывную регистрацию полисомнограммы в течение трех последовательных дней. У животных экспериментальной группы на неподвижном диске над водой полисомнограмму непрерывно регистрировали в течение семи дней беременности, начиная с темного периода первого дня.

Для крыс контрольной группы оценивали значения выбранных показателей (перечислены ниже) для каждого из трех экспериментальных дней и затем вычисляли их усредненные значения за эти три дня. Для крыс экспериментальной группы значения показателей определяли отдельно для каждого из семи экспериментальных дней и сравнивали их со значениями аналогичных показателей у контрольных небеременных крыс.

Процент бодрствования, медленного сна и быстрого сна определяли за следующие временные интервалы: 24 часа, 12-часовой светлый период, 12_часовой темный период и одночасовые интервалы с начала дня до его завершения. Количество коротких пробуждений определяли для четырех 6_часовых интервалов (8:00 - 14:00, 14:00 - 20:00, 20:00 - 2:00, 2:00 - 8:00), 12_часовых светлого и темного периодов и суток в целом. Количество эпизодов бодрствования, медленного сна и быстрого сна оценивали за светлый и темный периоды, а также за сутки в целом. В 12-часовом светлом и темном периодах определяли длительности всех эпизодов медленного сна и быстрого сна. Далее эпизоды для каждого типа сна ранжировали по длительности и объединяли в группы. При анализе структуры медленного сна каждая группа включала в себя все эпизоды, длительность которых варьировала в пределах 10 секунд. Так, первую группу составили эпизоды продолжительностью до 10 секунд, вторую - от 11 до 20 секунд и так далее. В случае быстрого сна одну группу составляли эпизоды, длительность которых варьировала в пределах 30 секунд. Для каждой группы вычисляли количество эпизодов, вошедших в нее. Используя полученные данные, строили гистограммы распределения эпизодов по длительности. Для каждого из семи дней беременности у контрольных и экспериментальных крыс сравнивали характер распределения эпизодов определенной фазы сна по длительности в 12-часовом светлом периоде, характер распределения эпизодов определенной фазы сна по длительности в 12_часовом темном периоде, а также отличия дневной и ночной картин распределения эпизодов определенной фазы сна по длительности.

Сравнения групп проводили, вычисляя для каждого показателя медиану и межквартильный размах. Статистическую значимость различий определяли в программе Statistica 5.0 с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

Оценка эффективности метода «диск над водой» без обратной связи для депривации сна беременных и небеременных крыс.

Эксперимент проведен на 14 самках крыс. В начале эксперимента у всех крыс проводили непрерывную регистрацию полисомнограммы на неподвижном диске в течение трех последовательных дней (контрольная группа). Далее крысы подвергались депривации сна либо сразу (группа 1), либо после наступления беременности (группа 2). При обработке полученных полисомнограмм некоторые из них были отсеяны из-за наличия артефактов. В результате в данном исследовании в контрольную группу вошло 12 крыс, а в группы 1 и 2 - по 7 крыс.

Для анализа отбирали фрагменты полисомнограмм в период от 11:00 до 14:00 каждого экспериментального дня. Для отдельного фрагмента записи определяли общую длительность каждого состояния в процентах от трех часов (длительность депривации сна), затем вычисляли среднее значение за три дня. Таким образом, данные для каждой крысы были представлены долей бодрствования, медленного сна и быстрого сна в процентах от трех часов. Полученные величины для каждого состояния суммировали для животных одной группы, вычисляли их средние значения и стандартные отклонения. По всем показателям сравнивали группы 1 и 2 с контрольной группой, а также группы 1 и 2 между собой для оценки эффективности депривации сна у небеременных и беременных крыс. Статистическую значимость различий определяли в программе Statistica 5.0 при помощи t-теста для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05. Для проверки гипотезы о нормальности распределения использовали критерии Шапиро-Уилки и Колмогорова-Смирнова.

Особенности гомеостаза сна беременных и небеременных крыс.

Эксперимент проведен на 18 животных. В начале эксперимента в течение трех последовательных дней проводили непрерывную регистрацию полисомнограммы у крыс, находящихся на неподвижном диске (n=12, контрольная группа 1). Со следующего дня у небеременных крыс, составивших экспериментальную группу 1 (n=6) начинали процедуру депривации сна. Шесть других крыс (экспериментальная группа 2) подвергали депривации сна с 5-го по 7-й день беременности. Депривацию сна проводили в течение трех последовательных дней с 11:00 до 14:00 - период времени, характеризующийся у крыс высокой сонливостью (Tobler, Borbйly, 1993). Как показали предварительные поведенческие исследования (Пигарева, 2008), сон крыс в первой половине светлого периода отличается наибольшей глубиной. Три дня депривации сна у крыс двух экспериментальных групп также сопровождались непрерывной регистрацией полисомнограммы. Контрольную группу 2 (n=6) составляли крысы, находящиеся во время беременности на неподвижном диске, все остальные условия эксперимента сохранялись. Полисомнограмму у крыс контрольной группы 2 регистрировали во время 5-7-го дней беременности. Из-за наличия артефактов в записи для оценки доли быстрого сна можно было использовать данные, полученные только от пяти животных этой группы.

В ходе анализа данных определяли процент бодрствования, медленного сна и быстрого сна в следующих временных интервалах: 24 часа, 12-часовом светлом периоде, 12-часовом темном периоде, одночасовых интервалах с начала дня и до его завершения. Степень фрагментарности сна оценивали по количеству коротких пробуждений за период времени с 15:00 до 20:00. Для полученных величин каждого из вышеперечисленных параметров в каждой группе вычисляли медиану и межквартильный размах. При описании сна животных контрольной группы 1 использовали показатели, полученные путем усреднения за три экспериментальных дня. Для животных остальных групп каждый из трех дней рассматривали отдельно. По всем показателям сравнивали экспериментальные группы 1 и 2 с контрольными группами 1 и 2 соответственно для оценки различий в суточном распределении сна и динамики восстановления сна после депривации у беременных и небеременных крыс. Статистическую значимость различий определяли в программе Statistica 5.0 с помощью критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Особенности сна крыс на ранней стадии беременности.

Общее количество медленного и быстрого сна у беременных и небеременных крыс.

В светлом периоде суток контрольные крысы проводили в состоянии медленного сна 53.4% (52.1 - 54.8) времени. Для темного периода эти величины составили 29.7% (27.3 - 32.7), а для суток в целом - 41.8% (40.0 - 43.2). Анализ полученных данных показал, что после начала беременности суммарное количество медленного сна за исследованные временные периоды существенно не менялось. Быстрый сон у животных контрольной группы днем занимал 13.7% (12.0 - 14.6) времени, ночью - 5.1% (4.8 - 5.6), а суточный показатель составил 9.6% (8.6 - 10.2). Увеличение доли быстрого сна у экспериментальных животных наблюдали только на второй день беременности в темном периоде суток (8.0% (7.7 - 8.1), p < 0.05).

Суточный паттерн представленности медленного и быстрого сна у беременных и небеременных крыс.

При оценке количества сна в одночасовых интервалах от начала до конца экспериментальных суток (начало в 8:00) для каждого дня беременности были выявлены интервалы, отличающиеся по количеству быстрого или медленного сна от соответствующих интервалов у крыс контрольной группы.

Анализ суточных паттернов медленного и быстрого сна показал, что у небеременных крыс в темном периоде можно выделить два минимума сонливости (пика бодрствования): вечерний (от 21:00 до 22:00) и утренний (от 6:00 до 7:00). Бульшая часть случаев достоверных различий в доле как медленного, так и быстрого сна у беременных и небеременных крыс приходилась на период непосредственно перед утренним пиком бодрствования (с 5:00 до 6:00 количество сна резко падало), а также первую половину темного периода, где количество сна, наоборот, возрастало. За счет таких локальных изменений количества сна, паттерн сна в темном периоде суток у беременных животных приобретал характерный вид с двумя сильно выраженными пиками бодрствования и пиком сонливости между ними.

Количество эпизодов медленного сна, быстрого сна и бодрствования у беременных и небеременных крыс.

Было показано, что количество эпизодов медленного сна за 24 часа, а также за 12-часовые светлый и темный периоды значимо превышало контрольный уровень в каждый из семи рассматриваемых дней, за исключением темного периода 5-го дня беременности (Таблица 1).

Количество эпизодов быстрого сна отличалось от контрольного уровня (26 (19 - 29)) только для темного периода 7-го дня беременности (32 (28 - 36), p < 0.05). Возрастало и количество эпизодов бодрствования в каждом из светлых периодов шести дней беременности (со второго по седьмой). Их количество в темном периоде превышало контрольный уровень на 1-й, 3-й и 4_й дни. При рассмотрении данных за целые сутки было выявлено, что количество эпизодов бодрствования превышало контрольный уровень на 2-ой, 3-й, 4-й и 5-й дни беременности.

Количество коротких пробуждений у беременных и небеременных крыс.

Для первой недели беременности было характерно увеличение количества коротких пробуждений в светлом и темном периодах и, соответственно, в сутках в целом. При более подробном анализе значений этого параметра (в 6-часовых интервалах) было показано, что у экспериментальных крыс с первого по четвертый дни беременности количество коротких пробуждений для всех рассматриваемых временных интервалов было больше, чем у контрольных небеременных крыс. На пятый - седьмой дни беременности число коротких пробуждений превышало контрольный уровень только в некоторых рассматриваемых 6-часовых интервалах, однако, этого было достаточно для обеспечения отличия от контроля значений показателя за 12_часовые периоды и сутки в целом.

Таблица 1. Количество эпизодов медленного сна у контрольных небеременных крыс и крыс на первой неделе беременности (дни 1 - 7). Даны средние значения по группе. Звездочками отмечены значимые отличия от контрольного уровня (p < 0.05).

Распределение длительностей эпизодов медленного и быстрого сна в темный и светлый периоды суток у беременных и небеременных крыс.

Медленный сон. В распределении длительностей дневных эпизодов медленного сна у небеременных крыс можно выделить 2 пика: один в области 10-30 секунд, второй - около 110-120 секунд. Для такого распределения в темный период суток характерен только один максимум, совпадающий с первым пиком распределения в светлый период. Различия между этими распределениями затрагивали эпизоды продолжительностью от 110 секунд и более. Во время 12_часового светлого периода у небеременных крыс таких эпизодов медленного сна было значимо больше, чем во время 12-часового темного периода. С началом беременности описанное различие между дневным и ночным распределениями длительностей эпизодов медленного сна практически исчезало и постепенно восстанавливалось к концу первой недели беременности.

Сравнение распределений длительностей эпизодов медленного сна в светлом периоде у небеременных и беременных крыс показало, что в каждый из семи исследованных дней беременности распределение эпизодов медленного сна по длительности отличалось от такового у небеременных крыс. Эти различия затрагивали эпизоды длительностью до 110 секунд и более 250 секунд. В 12-часовом светлом периоде у беременных крыс в таком распределении появлялся явно выраженный пик в области 10 - 40 секунд. Многочисленные достоверные различия между количеством эпизодов больших длительностей (от 250 с) у беременных и небеременных крыс объясняются тем, что у беременных крыс такие эпизоды практически исчезали.

В темном периоде, как и в светлом, количество коротких эпизодов повышалось, однако в меньшей степени и более хаотично.

Быстрый сон. У небеременных крыс количество эпизодов быстрого сна длительностью до 30 секунд не различалось для двух 12-часовых периодов. Все остальные временные интервалы днем включали примерно в два раза больше эпизодов, чем ночью. Во время первой недели беременности такое значительное отличие между дневной и ночной картинами распределения длительностей эпизодов быстрого сна, как и в случае медленного сна, становилось гораздо менее выраженным.

Распределения эпизодов быстрого сна по длительности в светлом 12_часовом периоде у контрольных небеременных крыс и беременных крыс имели сложную форму, однако общим для всех них являлось наличие максимума, приходящегося на длительности до 60 секунд. В остальном различия распределений у беременных и небеременных крыс носили нерегулярный характер для разных дней беременности.

Распределения эпизодов быстрого сна по длительности в темном 12_часовом периоде у контрольных небеременных крыс и крыс на 1-7-ой дни беременности также имели сложную форму. Были выявлены отличия между контрольной и экспериментальной группой для разных дней беременности, характер которых, однако, не удалось описать в рамках какой-либо четкой закономерности.

Оценка эффективности метода «диск над водой» без обратной связи для депривации сна беременных и небеременных крыс.

Контрольные небеременные крысы, не подвергавшиеся депривации сна, с 11:00 до 14:00 находились в состоянии медленного сна 57.4±6.1% времени, тогда как быстрый сон занимал у них 13.4±2.2% времени. Доля бодрствования составляла, соответственно, 29.3±6.0%. На фоне процедуры депривации сна картина существенно менялась. В группе небеременных крыс (группа 1) время, проведенное за три часа в бодрствовании, составило 90.8±5.6%, в состоянии медленного сна животные проводили лишь 9.2±5.6% времени, а быстрый сон у них полностью отсутствовал.

Беременные крысы (группа 2) бодрствовали 92.5±6.8% времени. Доля сохранившегося медленного сна составила у них 7.5±6.8% времени. Быстрый сон в этой группе крыс также полностью отсутствовал.

Отличия контрольной группы от групп 1 и 2 были настолько очевидны, что не требовали дополнительного статистического подтверждения. Группы 1 и 2, согласно t-тесту, между собой не различались (p < 0.05). Таким образом, эффективность депривации в установке «диск над водой» без обратной связи составляла 100% для быстрого сна и не менее 85% для медленного сна, как у беременных, так и у небеременных животных.

Сравнение эффективности депривации медленного и быстрого сна в системе «диск над водой» в оригинальной версии с обратной связью и в нашей системе без обратной связи было проведено с использованием данных лаборатории А. Рехтшаффена (Everson et al., 1989). Сравнение показало отсутствие различий в степени сокращения как медленного, так и быстрого сна при использовании этих двух версий системы.

Особенности гомеостаза сна беременных и небеременных крыс.

Депривация сна у небеременных крыс.

В каждый из трех экспериментальных дней через час после завершения депривации у крыс экспериментальной группы происходило увеличение количества медленного сна, так называемая отдача медленного сна (рис. 2). В первый день количество медленного сна увеличивалось относительно фонового уровня в оставшееся до конца светлого периода время и в начале темного периода суток. На второй день проведения процедуры депривации сна отдача также происходила в середине темного периода и в первый час светлого периода (еще перед началом депривации сна в этот день, видимо, как продолжение отдачи первого дня). На третий день периоды длительностью 1 час с повышенным относительно контроля уровнем медленного сна присутствовали практически на протяжении всех суток. Процент медленного сна за сутки у крыс экспериментальной группы 1 не отличалось от контрольных показателей ни в один из трех исследованных дней. При этом во время светлого 12-часового периода крысы экспериментальной группы спали меньше, чем крысы контрольной группы в каждый из 3 дней.

Рис. 2. Изменение суточного распределения медленного сна у небеременных крыс (n=6) в результате общей депривации сна в течение трех дней (с 11:00 до 14:00). Серая линия - распределение медленного сна в контрольной группе (n=12). Темными линиями над кривыми отмечены интервалы времени, для которых доли медленного сна в экспериментальной и контрольной группах достоверно различались (p < 0.05).

Детальный (с интервалами в 1 час) анализ светлого периода не выявил повышения уровня быстрого сна после проведения депривации сна. Общее количество быстрого сна за сутки в каждый из трех анализируемых дней у животных экспериментальной группы не отличалось от фоновых показателей. В светлом периоде суток эти крысы проводили в быстром сне меньше времени, чем контрольные.

Количество коротких пробуждений, связанное обратной корреляцией со степенью глубины сна, за 5-часовой период (15:00 - 20:00) не различалось у крыс экспериментальной группы 1 и крыс контрольной группы 1 ни в один из трех исследованных дней.

Депривация сна у беременных крыс.

Через час после окончания процедуры депривации сна у беременных крыс в течение 1-2 часов наблюдали повышенное количество медленного сна. Количество медленного сна было увеличено также в течение последнего часа светлого периода (на 6-й день) и в течение 1 часа в конце темного периода (7-й день). В каждый из 3 дней во время светлого 12-часового периода суммарное количество медленного сна у крыс, подвергающихся депривации, было меньше, чем в контрольной группе. В первый день депривации общее количество медленного сна за сутки оставалось несколько сниженным, и не достигало контрольного уровня. Однако в следующие два дня (6-ой и 7-ой дни беременности) доля медленного сна за сутки у депривированных крыс уже не отличалась от контроля.

Трехчасовая депривация сна влияла и на распределение эпизодов быстрого сна. Количество быстрого сна увеличивалось в течение одного - двух часов через один час после окончания депривации (6-й и 7-й дни беременности), в последний час светлого периода (5-й и 6-й дни беременности), а также в последний час темного периода на 6-й день беременности. Для всех трех дней процент быстрого сна за сутки, а также за светлый и темный 12_часовые периоды у крыс экспериментальной группы 2 не отличался от такового в контроле.

У крыс экспериментальной группы количество коротких пробуждений за 5-часовой период (15:00 - 20:00) было значимо ниже по сравнению с контрольными показателями на 5-й и 7-й дни беременности.

Сравнение динамики восстановления сна беременных и небеременных крыс после депривации сна.

Для каждого экспериментального дня с начала светлого периода до определенного момента в сутках анализировали количество медленного сна за интервалы времени с шагом в один час. При сравнении экспериментальных групп (беременные или небеременные животные, подвергавшиеся депривации сна) и соответствующих им контрольных групп для каждого интервала получали значение «p», отражающее уровень значимости различий (рис. 3). При помощи подобного анализа данных можно было оценить, в какой момент времени в течение дня уровень медленного сна у крыс экспериментальной группы переставал отличаться от соответствующего контрольного значения. У небеременных крыс количество медленного сна увеличивалось до контрольного показателя к середине темного периода, тогда как у беременных крыс этого либо вообще не происходило до конца первого дня депривации (5-й день беременности), либо происходило в самом конце темного периода на 6-й и 7-й дни беременности.

Восстановление доли быстрого сна у крыс экспериментальных и соответствующих контрольных групп сравнивали суммарно за 12 часов светлого периода и за целые сутки. Анализ полученных данных показал, что как у беременных, так и у небеременных крыс количество быстрого сна, утраченное в результате проведения депривации, восстанавливалось в каждый из трех экспериментальных дней. Однако только у беременных животных это восстановление заканчивалось уже в светлый период суток.

Рис. 3. Динамика восстановления медленного сна у беременных и небеременных крыс после общей депривации сна в течение трех последовательных дней (с 11:00 до 14:00). Стрелками показаны моменты времени, в которые различия между экспериментальной (n = 6 для обеих экспериментальных групп) и соответствующей ей контрольной группой (n = 6 для обеих контрольных групп) превышали порог значимости (p = 0.05). См. объяснения в тексте.

Обсуждение результатов

В данной работе детально исследована структура сна крыс на первой неделе беременности. По всем анализируемым параметрам мы сравнивали сон беременных крыс со сном контрольных небеременных крыс, что позволило выявить особенности сна животных, связанные исключительно с началом и развитием беременности. Описание сна крыс проводили, регистрируя у них полисомнограмму в нормальных условиях и в условиях ограничения сна. Применение этих двух подходов позволило наряду со структурой цикла сон-бодрствование исследовать и закономерности регуляции сна у крыс во время первой недели беременности.

При изучении цикла сон-бодрствование у крыс мы применили большой набор показателей, часть которых ранее в фундаментальной сомнологии не использовали. Поскольку в доступной научной литературе присутствуют лишь отрывочные сведения об особенностях сна у крыс на ранней стадии беременности (Kimura, 1998), полученные нами данные можно считать уникальными. Мы показали, что цикл сон-бодрствование у крыс уже в начале беременности претерпевает ряд существенных изменений по сравнению со сном небеременных самок. Хотя общее количество как быстрого, так и медленного сна остается на фоновом уровне, суточный паттерн сна и организация сонного цикла существенно меняются. Медленный сон у беременных животных становится в значительной степени фрагментированным, а также, по-видимому, менее глубоким, судя по количеству коротких пробуждений. Фрагментация сна была отмечена и у беременных женщин на протяжении всех трех триместров, появляясь в самом начале беременности и принимая все более выраженный характер по мере ее углубления (Santiago, 2005).

Распределение сна в сутках, согласно двупроцессной модели регуляции сна (Borbйly, 1982), является результатом взаимодействия гомеостатического и циркадного компонентов. Циркадная регуляции всех процессов в организме, включая сон, возможна благодаря наличию у животных внутренних биологических часов, центральное управление которыми осуществляется нейронами супрахиазматического ядра гипоталамуса. Гомеостатическая регуляция сна отражает зависимость количества и глубины сна от длительности предшествующего бодрствования. У беременных крыс суточный паттерн сна отличается большей выраженностью пиков сонливости и бодрствования в темном 12-часовом периоде по сравнению с небеременными животными. Анализ распределения длительностей эпизодов медленного и быстрого сна свидетельствует об изменении вклада циркадного компонента - его ослаблении у беременных крыс.

Особенности работы гомеостатического компонента регуляции сна у беременных и небеременных крыс были выявлены в рамках данной работы в экспериментах с лишением сна. Характер восстановления сна после его трехчасовой депривации различался у небеременных и беременных крыс и свидетельствовал о более эффективном восстановлении сна у беременных животных. Так, у беременных животных в отличие от небеременных после трехчасовой депривации сразу возникала отдача быстрого сна и увеличивалась интенсивность медленного сна. Это позволило высказать предположение о наличии у беременных крыс более совершенных механизмов компенсации потери сна и особой функциональной важности этого состояния во время беременности. В ходе исследования были выявлены общие и индивидуальные черты в динамике различных параметров фаз сна после начала беременности. С этой точки зрения, полученные данные представляют собой ценную базу для развития представлений о функциональном назначении медленного и быстрого сна и характере их взаимодействия в цикле сон-бодрствование.

Известно, что ведущим процессом, обеспечивающим начало и поддержание беременности у млекопитающих, включая человека, является существенное изменение гормонального фона (Goebelsmann, 1979; Darling, Hawkins, 1981; Chrousos et al., 1998). Главную роль в этом процессе отводят повышению уровня половых гормонов прогестерона и эстрогена, а также гипофизарного гормона пролактина. Рецепторы половых гормонов были обнаружены у нейронов супрахиазматического ядра (Kruijver, Swaab, 2002), что предполагает возможность прямого воздействия этих субстанций на работу системы «биологических часов» у человека. Возможно, именно такой механизм лежит в основе изменения суточной ритмики цикла сон-бодрствование у крыс во время беременности. В научной литературе также описано взаимное влияние работы эндокринной системы организма и процесса сна (Banks, Dinges, 2007).. Сопоставление этих данных со сведениями о гормональных сдвигах на ранней стадии беременности у человека и животных могло бы дать ключ к пониманию изменения характера сна в этот период. Однако полученные нами результаты в таком контексте трактовать не удается, поскольку паттерн сна, наблюдаемый в наших экспериментах у беременных крыс, совершенно не соответствует тому, что можно было бы ожидать, опираясь на знание о влиянии различных гормонов на параметры цикла сон-бодрствование.

Полученные в работе результаты хорошо согласуются с висцеральной гипотезой сна (Pigarev, 1994; Пигарев, 2005). Эта гипотеза предполагает, что в процессе сна кора больших полушарий и, возможно, другие отделы центральной нервной системы, переключаются на анализ информации, поступающей в это время в мозг от висцеральных органов. Таким образом, именно паттерн висцеральной афферентации определяет характер электрической активности мозга в состоянии сна. Можно предположить, что продемонстрированная в наших экспериментах трансформация структуры сна у беременных крыс вызвана изменением паттерна висцеральной афферентации в связи с радикальной перестройкой в работе внутренних органов, происходящей уже в самом начала беременности (Аршавский, 1982; Born, 2002).

Следует подчеркнуть, что наши данные касаются лишь первой недели беременности. Вероятно, подобных или даже более сильных изменений можно ожидать на более поздних ее сроках. В связи с этим представляется важным продолжение исследований в данном направлении, так как они могут послужить основой для разрешения многих проблем, связанных с состоянием сна в процессе беременности. Вслед за В.А. Отеллиным и его коллегами (Отеллин и соавт., 2007), хотелось бы обратить внимание на важность здорового образа жизни, особенно, во время раннего периода беременности и, добавить, что гигиена сна матери может являться необходимым условием для обеспечения жизнеспособности потомства.

Существенной частью настоящего исследования стали и методические эксперименты, целью которых было рассмотрение возможности проведения депривации сна у беременных крыс в установке «диск над водой». Оценка эффективности применения модификации данного метода, как для беременных, так и для небеременных животных выявила высокую степень лишения сна крыс, особенно быстрого сна, исключаемого полностью, в дневной период времени, когда глубина сна максимальна (Tobler, Borbйly, 1993). Важно также то, что достигнутая степень сокращения сна была одинакова для беременных и небеременных животных. Таким образом, можно заключить, что модификация метода лишения сна «диск над водой» без обратной связи может быть использована для изучения сна у крыс с применением его умеренной депривации. Являясь упрощенной модификацией, эффективной и удобной в применении, данный способ депривации сна может составить основу для исследования влияния нарушений структуры сна беременных животных на жизнеспособность их потомства, что, в свою очередь, позволит приблизиться к пониманию функциональной роли сна во время особого и столь важного состояния организма.

ВЫВОДЫ

1. Эффективность общей депривации сна методом «диск над водой» без обратной связи выражалась в полном лишении быстрого сна и снижении доли медленного сна на 85% в равной степени для беременных и небеременных крыс в ходе трехчасовой депривации, что сопоставимо с эффективностью метода в оригинальной версии;

2. Установка «диск над водой» без обратной связи является адекватной для объективного электрофизиологического исследования сна крыс до и во время беременности и дает возможность автоматического проведения кратковременной общей депривации сна;

3. Общее количество медленного и быстрого сна у крыс на ранней стадии беременности не отличалось от фоновых показателей, тогда как суточные паттерны этих фаз сна менялись: становились существенно более выраженными ночные пики бодрствования и сонливости;

4. Сон крыс на протяжении первой недели беременности был значительно более фрагментирован по сравнению со сном небеременных крыс за счет увеличения количества эпизодов медленного сна и бодрствования, а также числа коротких пробуждений;

5. Различие между дневным и ночным распределениями длительностей эпизодов медленного и быстрого сна становилось менее выраженным у крыс на первой неделе беременности по сравнению с контролем;

6. У крыс на первой неделе беременности в светлом 12-часовом периоде менялось количество эпизодов медленного сна: увеличивалось число эпизодов длительностью до 110 секунд и уменьшалось число эпизодов длительностью более 250 секунд;

7. При проведении трехчасовой депривации сна в течение трех последовательных дней общее количество сна за сутки у беременных и небеременных крыс не отличалось от контрольного уровня за счет возникновения отдачи медленного и быстрого сна, хотя динамика отдачи сна у беременных и небеременных крыс была разной;

8. У небеременных крыс после депривации сна в светлое время суток сразу увеличивалось количество медленного сна, а также наблюдалось изменение его распределения в последующий темный период суток. Этот эффект усугублялся при повторении процедуры депривации в течение трех последовательных дней;

9. У беременных крыс механизмы компенсации последствий депривации сна функционируют более эффективно, чем у небеременных животных, поскольку полная компенсация количества как медленного, так и быстрого сна завершалась уже в светлый период суток, а изменений распределения сна в темном 12-часовом периоде не было выявлено.

Список публикаций по теме диссертации

1. Руцкова Е.М., Пигарева М.Л. Эффективность кратковременной депривация сна методом «диск над водой» без обратной связи у беременных и небеременных крыс. Журн. высш. нервн. деят. 2009. 59(2): 245-251.

2. Руцкова Е.М., Пигарева М.Л., Пигарев И.Н. Что больше влияет на систему «мать - плод» - собственно стресс или вызванные стрессом нарушения сна? Всероссийский симпозиум с международным участием «Гормональные механизмы адаптации», посвященный памяти профессора А.А. Филаретова. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2007. с. 72-73.

3. Руцкова Е.М., Пигарева М.Л. Депривация сна у беременных крыс. VI Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные проблемы сомнологии». Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2008. с. 86

4. Пигарев И.Н., Пигарева М.Л., Филаретова Л.П., Руцкова Е.М. Стресс, нарушения сна, висцеральные расстройства. VI Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные проблемы сомнологии». Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2008. с. 71

5. Pigareva M.L., Rutskova E.M. What is more important for the normal pregnancy: the total amount of sleep or sleep during the proper phase of the circadian rhythm? Journal of Sleep Research. 2008. V.17. Suppl. 1. P. 484.

6. Pigarev I.N., Pigareva M.L., Filaretova L.P., Rutskova E.M. Disturbances of normal sleep pattern as a possible reason of stress-induced visceral disfunctions. Journal of Sleep Research. 2008. V. 17. Suppl. 1. P. 262.

7. Руцкова Е.М. Гомеостаз сна. Лекция. Материалы 6-ой Международной школы конференции «Сон - окно в мир бодрствования». М. 2009. с. 64 - 69.

Размещено на Allbest.ru