Фенотипические и геномные признаки микроорганизмов, изолированных при раскопках мерзлотных курганов пазырыкской культуры Олон-Курин-Гол

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Комплекс методов, используемый в последнее время при исследовании палеопочв разновозрастных курганов эпох энеолита, бронзы, раннего железа и средневековья (IV тыс. до н.э. - XIV в. н.э.), позволил получить новые представления об истории развития почв и природной среды, оценить их роль в жизни древних обществ [1, 2]. Исследование ДНК микроорганизмов из древних останков человека вносит вклад в палеоэпидемиологию [3]. Расшифровка информации, заключенной в достоверном фактическом материале, полученном при исследовании точно датированных археологических объектов, позволяет реконструировать палеоэкологическую обстановку существования человека в конкретном регионе и в определенное время, уточнить роль этих условий в формировании древних групп населения [4]. В настоящей работе приведены данные по микробиологическому изучению содержимого погребальных камер захоронений представителей пазырыкской культуры (IV-III вв до н.э.) из долины реки Олон-Курин-Гол в Монгольском Алтае, содержавших мерзлоту.

Образцы для исследования. При раскопках курганов на могильниках Олон-Курин-Гол-6 и -10 отобраны образцы мерзлотных субстратов и органических останков из погребальных камер. Все работы проведены с соблюдением асептических условий, образцы незамедлительно помещали в стерильные пластиковые контейнеры с герметично завинчивающимися крышками. Описание образцов и места их взятия представлены в таблице 1.

Условия выделения и культивирования микроорганизмов. Образцы 1, 2, 3а, 3б, 3в, 5, 6, 7, представляющие собой талый лед с включениями различной природы, после усреднения образца растиранием в стерильной ступке, высевали по 0,1 мл на чашки с плотной питательной средой. К 1 г необводненных образцов (4, 8, 9) добавляли по 1 мл физиологического раствора, выдерживали смесь на качалке при комнатной температуре в течение 15 мин, затем растирали пробу до однородности в стерильной ступке. На чашки с питательной средой высевали по 0,1 мл полученных суспензий и их десятикратных разведений. Все процедуры по выделению психрофилов выполняли с использованием охлажденных питательных сред, растворов и инструментов.

Таблица 1. Перечень образцов, взятых для микробиологического анализа

Для выделения и культивирования микроорганизмов применяли питательные среды: рыбно-пептонный агар (РПА, ФГУП НПО «Микроген», МЗ РФ); жидкую и агаризованную среду LB (“Difсo”, США); крахмало-аммиачный агар [5], среду LB, разведенную дистиллированной водой в 5-10 раз. Высевы инкубировали при температурах 4, 20, 30, 37, 45 и 60°С. Выросшие колонии в течение 1-4 недель, отличающиеся морфологически, использовали для получения чистых культур.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов. Клетки микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Окраску клеток по Граму определяли методом [6], способность к образованию эндоспор - на РПА с добавлением MnSO4Ч Н2О в концентрации 0,005 г/л среды.

Физиологические и биохимические признаки, косвенные тесты на патогенность микробных изолятов выполняли в соответствии с [7]. Чувствительность к антибиотикам определяли с помощью аппликации дисков производства НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия) на поверхность питательного агара, засеянного испытуемым микроорганизмом.

Наличие эндонуклеаз рестрикции в микроорганизмах определяли при скрининге отдельных колоний штаммов используя в качестве субстратов для гидролиза ДНК фагов lсI857 и Т7. Электрофорез ДНК после рестрикции проводили в 1%-ной агарозе фирмы “Sigma”(США). В работе применены ферменты и субстратные ДНК производства фирмы СибЭнзим (г. Новосибирск). Содержание плазмидной ДНК в штаммах определяли методом скрининга по стандартной методике [8]. Выделение суммарной ДНК из чистых культур проводили путем лизиса клеток 5M гуанидинтиоционатным буфером (pH 11.0) при 65°С с последующей экстракцией сначала смесью фенола и хлороформа (1:1), а затем хлороформом. Осаждение ДНК из водной фазы осуществляли изопропиловым спиртом в присутствии 1М NaCl. Образцы ДНК хранили при температуре минус 20°С. ПЦР проводили с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: 5?-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 5`-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3`. ПЦР проводили в режиме: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 60 сек, 55°С - 60 сек, 72°С - 60 сек (30 циклов); 72°С - 5 мин (1 цикл). Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 3100 (Applied Biosystems, США), в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск; www.sequest.niboch.nsc.ru). При проведении секвенирующей реакции использовали внутренний праймер 5`-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3`. Полученные последовательности нуклеотидов гена 16S РНК сравнивали с последовательностями из международного банка данных NCBI c помощью пакета программ BLASTN.

Численность культивируемых микроорганизмов в образцах, отобранных в условиях мерзлоты, составляла от 1,4х102 до4,8х104 КОЕ/мл пробы и в большинстве образцов была достаточно близка для выделенных мезофильных и психрофильных изолятов (таблица 2).

Таблица 2. Титр жизнеспособных микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов и органических останков погребальных камер курганов пазырыкских могильников Олон-Курин-Гол-6, -10

микроорганизм палеоэкологический эндонуклеаза

Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей (н.п.) 16SpРНК и фенотипических признаков микробных изолятов проведено определение их таксономической принадлежности. Преобладающими среди выделенных микроорганизмов были представители таких повсеместно широко распространенных родов неспороносных бактерий как Pseudomonas (30 штаммов), Arthrobacter (13 штаммов), Acinetobacter (9 штаммов). В меньшем количестве обнаружены бактерии родов Flavobacterium (2 штамма), Stenotrophomonas (3 штамма), Chryseobacterium (3 штамма), Terrabacter (2 штамма). В единичных количествах в полученной коллекции микробных изолятов из пазырыкских курганов присутствовали штаммы родов Microbacterium, Exiguobacterium, Agrococcus, Brevundimonas, Аeromicrobium, Planococcus, Pussilimonas. Выделены также грамположительные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (4 штамма), Nocardia (1 штамм) и три штамма актиномицетов рода Streptomyces. Бактерии, образующие эндоспоры, были представлены двумя родами: Bacillus (21 штамм) и Sporosarcina (2 штамма). На филогенетических деревьях исследуемые штаммы имеют пронумерованное обозначение «ОК», образуют ветви, как близкие по таксономической принадлежности к ранее известным эубактериям (95-100% сходства), так и далеко от них отстоящие, в том числе выявлены микроорганизмы, не имеющие известных аналогов в банке данных.

Штаммы рода Pseudomonas являются обычными обитателями холодных почв, составляя около 7% от всего количества выделяемых психротолерантных микроорганизмов. Штаммы этого рода,изолированные из исследуемых образцов (рис. 1) как правило хорошо росли при 4, 20°С и 28-30°С, некоторые - при температуре от 4 до 45°С. К психрофилам, имеющим температурный оптимум ниже 10°С, можно было отнести штаммы Ok82р, Оk84р, Оk89р, Оk91р, Оk100р, Оk106р.

Рис. 1. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Pseudomonas, построенное методом ближайших соседей

Примечание: на рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки кладистических групп.

Особое внимание обращают на себя плазмидосодержащие штаммы Pseudomonas sp. Оk92 и Оk27, для которых характерны такие признаки патогенности, как плазмокоагулирующая, гемолитическая, желатиназная и лецитиназная активности. Кроме того, эти штаммы проявили множественную устойчивость к антибиотикам. Для псевдомонад характерно наличие плазмид, несущих гены устойчивости к неблагоприятным факторам среды, включая антибиотики. С помощью экспресс-метода плазмидные ДНК различного молекулярного веса обнаружены у большинства штаммов выделенных псевдомонад.

Грамположительные, аэробные коринебактерии рода Arthrobacter, часто обнаруживаемые среди психротолерантных бактерий, также выделены из исследуемых образцов (штаммы Ok4, Ok9, Ok35, Ok43, Ok60, Ok66, Ok71, Ok85р, Ok108р, Ok109р, Ok110р, Ok113р, Ok114р) (рис.2). В отличие от мезофильных бактерий этого рода, температурный оптимум у них был сдвинут в сторону пониженных температур - особенность, известная для многих микроорганизмов холодных и мерзлотных условий обитания [9,10]. Ферментативная активность штаммов в условиях опыта была слабо выражена. Эндонуклеазы рестрикции обнаружены у штаммов Оk85р и Оk109р, плазмидные ДНК - у штаммов Оk4, Оk9, Оk109р. Близкородственными микроорганизмами артробактерий являются выделенные аэробные коринеморфные бактерии родов Rhodococcus (штаммы Оk10, Оk13, Оk58, Оk70), Nocardia (штамм Оk98р) и актиномицеты рода Streptomyces (штаммы Оk22, Оk26 и Оk65).

Штаммы рода Acinetobacter. В соответствии с результатами анализа н.п. 16SрРНК штаммыОk45, Оk 48, Оk49, Оk50, Оk54, Оk57, Оk97р, Оk103р, Оk105р определены как принадлежащие к роду сапрофитных бактерий Acinetobacter широко распространенных в почве и воде. Известно также, что штаммы Acinetobacter spp. входят в состав микрофлоры кожи, желудочно-кишечного и урогенитального тракта и могут относиться к патогенам.

Рис.2. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК эубактерий рода Arthrobacter, Agrococcus, Microbacterium, Terrabacter, Rhodococcus, Streptomyces, построенное методом ближайших соседей. На рисунке указаны виды эубактерий и номера доступа в базе данных GenBank. В узлах указаны индексы поддержки кладистических групп

Клетки психротолерантных микробных изолятов, выделенных из образцов Олон-Курин-Гола и отнесенных к роду Acinetobacter, представляли собою грамотрицательные кокко-бациллы, кокки или укороченные, палочки, каталазоположительные, отрицательные по оксидазе и, как это свойственно представителям рода Acinetobacter, устойчивые к пенициллину (25 мкг/мл). Ферментативная активность штаммов этой группы была слабо выражена или в рамках проведенного тестирования отсутствовала. Признаки патогенности (гемолитическая, плазмокоагулазная, желатиназная, лецитиназная активности), выявляемые косвенным образом, у данных штаммов не были обнаружены.

Штамм Acinetobacter sp. Ok103р продуцировал эндонуклеазу рестрикции (ЭР) Asp103I, являющуюся изошизомером ЭР BamHI, представляющую биотехнологический интерес, так как максимальный уровень активности ЭР Asp103I проявляется при температуре 6-10°С. В настоящее время, в литературных источниках имеются сведения о изошизомерах данного фермента, однако, ни один из них не обладает температурным оптимумом ниже 20°С.

Грамположительные бактерии, образующие эндоспоры. Среди микроорганизмов, выделенных из мерзлотных образцов захоронения, преобладали неспороносные бактерии. В большинстве публикуемых работ указывается на малое содержание бактерий образующих эндоспоры в различных мерзлотных субстратах, либо их полное отсутствие. Отмечена высокая чувствительность бактериальных спор к негативным условиям среды в момент прорастания [11, 12]. Из 21-го штамма спорообразующих бацилл, выделенных из мерзлотных образцов, отобранных в камерах захоронения курганов Олон-Курин-Гола, 16 штаммов оказались мезофиллами, оптимальная температура роста этих штаммов составляла 20-28°С. Большая часть из них образовывала эллиптические эндоспоры, расположенные в клетке центрально или терминально. Исключением были штаммы Оk38 и Оk76р формирующие сферические эндоспоры терминального расположения, значительно превышающие диаметр клеток, аналогично клеткам известного вида Bacillus sphaericus. Для тринадцати штаммов бацилл показано наличие протеаз. Семь из них дополнительно продуцировали зкзонуклеазы. За исключением штамма Оk14 для всех бацилл была характерна каталазная активность, выраженная в разной степени, не обнаружены эндонуклеазы рестрикции; амилолитическая и липолитическая активности выявлены у единичных штаммов. Штамм Bacillus sp. Оk39 обладал наибольшей ферментативной активностью (шестью из восьми тестированных) и обнаружил при этом три косвенных фактора патогенности: лецитиназную, гемолитическую и желатиназную активности, проявил устойчивость к четырем широко применяемым антибиотикам - стрептомицину, гентамицину, эритромицину и левомицетину.

Штаммы Оk33, Оk72 и Оk88 отнесены к роду Sporosarcina в соответствии с данными анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК. Из микроорганизмов этого рода наиболее известна подвижная, спороносная уробактерия Sporosarcina ureae, обитающая в почве, моче, навозе, сточных водах и в воде очистных сооружений, способная расти в условиях щелочных сред [13]. Известны психрофильные представители этого рода, такие как Sporosarcina antarctica [14], Sporosarcina psychrophila и целый ряд других видов. Штаммы Sporosarcina sp. Оk72 и Оk88 являются психротолерантными, имеют фенотипические признаки характерные для представителей рода Sporosarcina, подтверждающие таксономическое определение штамма Оk72, полученное при анализе нуклеотидной последовательности 16S pРНК.

Грамотрицательные и грамположительные неспороносные бактерии, обладающие факторами патогенности. В эту группу условно объединены бактерии нескольких родов, не образующие эндоспоры: штаммы родов Terrabacter (штаммы Ok2 и Ok61), Stenotrophomonas(штаммы Ok6, Ok16 и Ok46), Agrococcus (штамм Ok32), Exiguobacterium (штамм Ok32), Microbacterium (штамм Ok55), Chryseobacterium (штаммы Ok56, Ok59, Ok67) и штамм Ok64, отнесенный к Brevundimonas. Штаммы Ok2, Ok61 по н.п. 16S РНК имеют 98-99% гомологии с представителями рода Terrabacter [15], обладают рядом признаков, характеризующих бактерии этого рода: имеют сферические, грамположительные клетки, с оптимум роста в пределах 20-30°С, не сбраживают глюкозу, отрицательны по оксидазе и имеют выраженную гемолитическую активность. Для более точной идентификации штаммов Ok2 и Ok61 нужны дополнительные исследования.

Штаммы Ok6 и Ok16, определенные в соответствии с результатами анализа н.п. 16S рРНК как Stenotrophomonas sp., обладают рядом сходных черт с бактериями этого рода: имеют грамотрицательные, палочковидные клетки, проявляют множественную, высокую устойчивость к антибиотикам, обладают гемолитической и желатиназной активностями. Для них также характерно наличие высокой протеолитической, липолитической и экзонуклеазной активности.

Более детального рассмотрения заслуживают неферментирующие, грамотрицательные, гемолитические штаммы Ok-56, Ok-59 и Ok-67, определенные как Chryseobacterium sp. Основные клинические формы проявления инфекций, вызываемых Chryseobacterium meningisepticum - менингит и бактериемия. Выделенные в работе штаммы, как свойственно батериям этого рода,обладают устойчивостью ко многим антимикробным препаратам, применяемым для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. На агаризованных средах эти штаммы образуют полупрозрачные колонии темно-желтого цвета, что обусловлено синтезом водонерастворимого пигмента флексирубина [16].

Неидентифицированные штаммы Ok19, Ok52, Ok62, Ok68, Ok69, Ok78р, Ok83р, Ok89р, Ok94, Ok95p, Ok100р, Ok101р, Ok104р, Ok107р, Ok111 и ряд других по первичным данным являются палочковидными, неспорообразующими, неферментирующими, грамотрицательными или грамположительными, психротолерантными бактериями, растущими в диапазоне температур 4 - 30°С. Детальная идентификации этих штаммов затруднительна ввиду очень слабого роста или его отсутствия при повторных попытках культивирования.

Следует отметить, что около 40% штаммов от общего количества выделенных 114 изолятов обладали гемолитической активностью и другими косвенными факторами патогенности. Среди них - 12 штаммов мезофильных бактерий Bacillus ssp., 5 штаммов Artrobacter ssp., а также - штаммы, идентифицированные как представители родов Stenotrophomonas,, Chryseobacterium, в составе которых известно большое количество высокопатогенных видов, и ряд других.

Тем не менее, несмотря на значительное количество условно патогенных штаммов, обнаруженных в образцах, взятых в погребальных камерах курганов, нет возможности говорить определенно об их причастности к болезни или смерти объектов захоронения, так как микроорганизмы упомянутых родов повсеместно встречаются в почве, воде, в составе нормальной микрофлоры людей и животных.

Литература

1. Молодин, В.И. Исследование российско-германско-монгольской экспедиции на северо-западе Монголии летом 2006 г. / В.И. Молодин // Российская археология. -2007.- №4.- С.42-50.

2. Демкина Т.С. Демкин В.А. Микробиологическая характеристика погребенных почв археологических памятников: новый подход в изучении палеоэкологии комплексных обществ // Комплексные общества Центр. Евразии в III-I тыс. до н. э. - Челябинск. - 1999. - С. 321-325.

3. Hershkovitz I., Donoghue H.D., Minnikin D.E. et al. Detection and molecular characterization of 9,000-year-old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic settlement in the Eastern Mediterranean // PLoS ONE. 2008. V. 3. № 10. P. e3426.

4. Демкин В.А. Палеопочвоведение и археология / В.А. Демкин. - Пущино: ОНТИ ПНЦ PAН, 1997. - 213 с.; Демкина Т.С. Демкин В.А. Палеоэкологическое значение микробоценозов погребенных почв археологических памятников степной зоны // Экология древних и современных обществ: ТДК. - Тюмень. - 1999. - С. 51-52.

5. Методы общей бактериологии /под ред. Ф. Герхарда и др. М.: Мир. 1983. -Т. 1. -536 C.; 1984. -Т. 3. -264 с.

6. Gregersen, T. Rapid method for distinction of gramnegative from gram-positive bacteria // Eur. J. Appl. Microbiol.Biotechnol.- 1978.- Vol.5.- P. 123-127.

7. Holt J.G. et al. (Eds) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 8th edition - Baltimore-London, William & Wilkins,1986.- Vol.1-2.- 1105 p.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. -480 с.

9. Абызов C.С. Микрофлора ледникового щита Центральной Антарктиды// Автореф. дис. докт. биол. наук.-М., 2001.

10. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A., Gilichinsky D.A, Rivkina E., Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: facts and hypothesis.// FEMS, 1997.- 20: 277-290.

11. D`Amico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. Psychrophilic microorgamisms.: challenges for life // EMBO Rep. - 2006. - Vol.7. - P. 385-389.

12. Лях C., Абызов С.С. Некоторые особенности микрофлоры Антарктики в связи со спецификой экстремальных условий существования // Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1976. - №2. - C. 252-262.

13. Kocur M;Martinec T. The taxonomic status of Sporosarcina ureae(Beijerinck) Orla-Jensen// Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon.-1963.-V. 13.-P. 201-209.

14. Yu Y, Xin YH, Liu HC, Chen B, Sheng J, Chi ZM, Zhou PJ, Zhang DC. Sporosarcina antarctica sp. nov., a psychrophilic bacterium isolated from the Antarctic//Int J Syst Evol Microbiol. 2008 Sep; 58(Pt 9): 2114-7.

15. Collins M.D., l.M. Dorsch,' and E. Stackebrandt' Transfer of Pimelobacter tumescens to Terrabacter gen. nov. as Terrabacter tumescens comb. nov. and of Pimelobacter jensenii to Nocardioidesas Nocardioides jensenii comb. nov.//”Int. J.Syst. Bacteriol. 1989. 39: 1-6.

16. Боронина Л.Г., Кукушкина М.П., Крутова К.В., Блинова С.М. Род Chryseobacterium (Flavobacterium): клиническое значение, идентификация. Чувствительность к антибиотикам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003.-Т. 5. -С 243-250.

Размещено на Allbest.ru