Изменение пула протеасом в постнатальном развитии и в злокачественно трансформированных клетках грызунов
Изучение активности химотрипсинподобных центров и относительного количества протеасом в пулах 26S и 20S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии, а также динамики появления иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в пулах 26S- и 20S-протеасом.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 09.03.2018 |
| Размер файла | 4,8 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
УДК 577.152.34+57.083.3
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Изменение пула протеасом в постнатальном развитии и в злокачественно трансформированных клетках грызунов
03.00.30 - биология развития и эмбриология
Астахова Татьяна Михайловна
Москва, 2007
Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук
Директор Института: доктор биологических наук, профессор Озернюк Николай Дмитриевич
Научный руководитель: доктор биологических наук Шарова Наталья Петровна
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Немова Нина Николаевна
доктор биологических наук, профессор Захарова Людмила Алексеевна
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва
Защита диссертации состоится «____» ____________ 2007 г. в ______ ч. на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, д. 26) Факс: (495) 135-80-12
Автореферат разослан «____» ____________ 2007 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат биологических наук Е.В.Волина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Протеасомы - это мультисубъединичные и мультикаталитические протеиназные комплексы эукариотических клеток (Multicatalytic Proteinase Complex, MPC). Термин «протеасома» был предложен К. Танака и А. Голдбергом и отражает как протеолитическую (протеаза) функцию комплекса, так и его природу как дискретной частицы - сомы.
Клетки млекопитающих и человека содержат несколько форм и субтипов протеасом. Наиболее изученными формами являются 26S- и 20S-протеасомы. 26S-протеасомы состоят из 20S-субчастицы - протеолитического «ядра» - и фланкирующих ее 19S-субчастиц. Они гидролизуют убиквитинированные белки в АТФ-зависимой реакции. 20S-протеасомы, помимо того, что являются протеолитическим «ядром» 26S-протеасом, способны, как самостоятельные частицы, гидролизовать некоторые белки без их предварительного убиквитинирования независимо от АТФ. Каждая из этих форм образована четырьмя субтипами, различающимися сочетанием конститутивных и иммунных протеолитических субъединиц.
Конститутивные 26S-протеасомы участвуют в регуляции клеточных процессов, таких как репликация и репарация ДНК, транскрипция, передача сигналов, клеточный цикл, апоптоз, поскольку гидролизуют белки, осуществляющие эти процессы, строго контролируемым способом. Иммунные 26S-протеасомы необходимы для развития иммунного ответа. Функции всех субтипов 20S-протеасом связаны, главным образом, с уничтожением поврежденных белков.
Принимая во внимание неоднозначную роль протеасом в многочисленных клеточных процессах, можно ожидать, что на разных этапах онтогенеза животных функции клеточного пула протеасом меняются, причем по-разному в различных органах и тканях. Литературные данные об изменениях пула протеасом в индивидуальном развитии животных малочисленны и разрозненны. Совсем нет сведений о функционировании протеасом в постнатальном развитии млекопитающих, сопряженном с интенсивными биохимическими и физиологическими перестройками организма. Исследования в этой области могут расширить представление о молекулярных механизмах онтогенеза и содействовать пониманию причин как врожденных, так и приобретенных заболеваний (в том числе злокачественных), связанных с нарушениями системы гидролиза белков в протеасомах.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование изменения пула 26S- и пула 20S-протеасом в печени (нелимфоидном органе) и селезенке (лимфоидном органе) крысы в постнатальном развитии и в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
Разработать метод разделения пулов 26S- и 20S-протеасом для их сравнительного анализа в различных органах.
Изучить активность химотрипсинподобных центров и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии.
Исследовать динамику появления иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в пулах 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы.
4. Изучить динамику формирования периартериальных лимфоидных оболочек (муфт) белой пульпы селезенки крысы.
5. Сравнить активность, состав и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши с таковыми в клетках легких здоровых животных.
Научная новизна. В работе впервые продемонстрирована возможность аналитического изучения нативных пулов 26S- и 20S-протеасом в различных органах млекопитающих, проведено детальное исследование этих пулов в первые три недели постнатального развития в печени и селезенке крысы и прослежена динамика формирования в этих органах иммунных протеасом, выявлены особенности пула 26S-протеасом в опухоли.
Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о появлении иммунных протеасом в лимфоидных (селезенке) и нелимфоидных органах (печени) в разные сроки в течение нескольких недель после рождения и отвечают на существующий до сих пор вопрос иммунологов, почему в эмбриональном и раннем постнатальном развитии млекопитающих при наличии Т- и В-лимфоцитов нет полноценного иммунного ответа. Не менее важным в понимании развития иммунной системы млекопитающих является и установленный нами факт, что формирование четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки совпадает в сроках постнатального развития с появлением иммунных протеасом в печени. Он позволяет понять механизм складывающихся в организме взаимоотношений лимфоидных и находящихся под их защитой нелимфоидных органов. Полученные результаты раскрывают новые перспективы в изучении развития иммунной системы в онтогенезе млекопитающих, которое следует рассматривать не только как созревание и миграцию клеток иммунной системы, но и как образование иммунных протеасом во всем организме. протеас пул селезенка печень
Проведенная нами работа по изучению особенностей пулов 26S- и 20S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши дала результаты, которые представляют ценность для фундаментальной науки и со временем могут найти применение в практической медицине.
Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на коллоквиумах лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН; Школе для молодых ученых, Научная биологическая станция Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН «Кропотово», июнь 2005 г.; 15-ом Международном конгрессе биологов развития, Австралия, сентябрь 2005 г.; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция», Москва, май 2006 г.; VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, апрель 2007 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и двое тезисов, одна статья и одни тезисы находятся в печати.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах и содержит 22 иллюстрации. Список литературы включает 128 цитируемых источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Протеасомы выделяли из печени (нелимфоидный орган) и селезенки (лимфоидный орган) белых крыс породы Wistar разных возрастов постнатального развития, печени, селезенки и легких здоровых мышей линии Balb/c и развившейся семидневной асцитной карциномы Krebs-II, привитой мышам линии Balb/c.
Пулы 26S- и 20S-протеасом разделяли методом двухэтапного фракционирования осветленных гомогенатов органов разным количеством сульфата аммония (Ben-Shahar et al., 1999). Идентификацию 26S- и 20S-протеасом проводили с помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В, анализа активности в присутствии 0,02% Ds-Na и по способности гидролизовать 35[S]ОДК.
Активность протеасом определяли по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Ben-Shahar et al., 1999). Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре при значениях возбуждающей длины волны 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин.
35[S]ОДК синтезировали в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. В качестве матрицы для синтеза 35[S]ОДК использовали плазмиду pCITE со вставкой гена ОДК, связанного на С-конце с последовательностью, кодирующей шесть остатков гистидина. Гидролиз 35[S]ОДК (3500 имп/мин) проводили в присутствии протеасом (300 ед.) и антизима (0,2 мкг). Пробы анализировали электрофорезом в 13%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Относительное количество протеасом определяли Вестерн-блоттингом с использованием антител к -субъединицам, формирующим 20S-субчастицы, и к субъединице Rpt6, входящей в состав 19S-субчастицы 26S-протеасом.
Иммунные субъединицы выявляли Вестерн-блоттингом с использованием антител к субъединицам LMP2 и LMP7.
Плотность полос, выявленных на рентгеновской пленке реакцией хемилюминесценции с использованием системы ECL, оценивали с помощью стандартной компьютерной программы «Image J».
Гистологические срезы селезенки окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в бальзам. Микроскопическое исследование полученных срезов проводили с помощью светового микроскопа Olympus AHBT3 (Австрия).
Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), а также с помощью увикорда (LKB Bromma, Швеция) по поглощению при длине волны 280 нм.
Результаты исследования и их обсуждение
Разработка метода разделения пулов 26S- и 20S-протеасом.
Классификации множественных форм протеасом до сих пор нет. Это затрудняет понимание физиологической роли тотального пула протеасом в различных органах, так как соотношение форм и субтипов протеасом ткане- и органоспецифично. Поэтому мы предлагаем разделить все многообразие протеасом на два основных пула - 26S и 20S, учитывая их главные структурные и функциональные различия. При разработке метода разделения пулов 26S- и 20S-протеасом мы исходили из известного факта, что формы 26S и 20S осаждаются при разном количестве сульфата аммония. При 0-40% от насыщения осаждаются, преимущественно, 26S-протеасомы, при 40-70% - 20S-протеасомы (Ganoth et al., 1988; Eytan et al., 1989; Ben-Shahar et al., 1999). После фракционирования сульфатом аммония исследователи обычно проводили дальнейшую очистку как пула 26S-, так и пула 20S-протеасом различными методами. В процессе этой очистки 26S-протеасомы в большей или меньшей степени разрушались. Поэтому нам представлялось логичным изучить возможность применения фракционирования препаратов сульфатом аммония в качестве единственного этапа разделения пулов протеасом для решения последующих задач.
Идентификацию 26S- и 20S-протеасом в полученных фракциях проводили с помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В, анализа активности в присутствии 0,02% Ds-Na и по способности гидролизовать 35[S]ОДК. С помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В показано, что фракция 0-40% (фракция 1) содержит протеасомы с М.м. более 2000 кДа, а фракция 40-70% (фракция 2) - протеасомы с М.м. около 900 кДа, что соответствует, по литературным данным, М.м. 26S- и 20S-протеасом (Coux et al., 1996). Известно, что 0,02% Ds-Na ингибирует активность 26S-протеасом, но активирует 20S-протеасомы (Dahlmann et al., 1993; Kisselev et al., 1998). Во фракции 1 было зафиксировано ингибирование активности в присутствии 0,02% Ds-Na на 56%, во фракции 2 активность повышалась на 260%. Таким образом, было доказано, что фракция 2 свободна от примеси 26S-протеасом и, следовательно, пригодна для изучения пула 20S-протеасом.
Реакция гидролиза ОДК была использована для уточнения форм протеасом во фракции 1. Способность гидролизовать ОДК без предварительного убиквитинирования в присутствии антизима характерна только для 26S-, но не 20S-протеасом (Murakami et al., 1992). 35[S]ОДК синтезировали в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. В качестве матрицы использовали плазмидный ДНК-вектор со вставкой гена ОДК. Уменьшение уровня ОДК наблюдали в присутствии фракции 1, но не фракции 2. Эти результаты подтвердили, что фракция 1 содержит нативный пул 26S-протеасом и может быть использована для аналитических исследований в дальнейшей работе.
Особенности формирования пулов 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии.
Динамика удельной активности пулов 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии показана на рис. 1. Удельная активность выражена в единицах на мг белка, содержащегося в осветленных гомогенатах селезенки и печени. Результаты исследования, отображенные на этом рисунке показывают, что в первые три недели постнатального развития активность пула 26S- (рис. 1а) и пула 20S-протеасом (рис. 1б) в селезенке (1) и печени (2) крысы падает дважды. Первый период падения активности начинается с 7-х сут, длится дольше по сравнению со вторым, минимальные значения активности в этом пике приходятся на 11-е сут. Второй минимум падения активности приходится на 19 сут постнатального развития.
Относительное количество 26S- и 20S-протеасом. Относительное количество 26S-протеасом в селезенке и печени на разных этапах развития оценивали с помощью Вестерн-блоттинга белков полученных фракций 1 и 2 с использованием моноклональных антител к субъединице Rpt6 (М.м. 46 кДа), входящей в состав регуляторной субъединицы 19S (рис. 2а). Из рисунка следует, что Rpt6 обнаруживается только в 26S пуле (блоты: 1 - селезенка, 3 - печень) и отсутствует в 20S пуле (блоты: 2 - селезенка, 4 - печень). То незначительное количество субъединицы Rpt6, которое выявляется во фракции 20S-протеасом на 21-е и 23-е сут, скорее всего, принадлежит 19S-субчастицам, не связанным с протеасомами.
Относительное количество 20S-протеасом определяли во фракции 2 тем же методом с использованием моноклональных антител к субъединицам 1,2,3,5,6,7 (29-32 кДа), входящим в состав -колец (рис. 3а, блоты: 1 - селезенка, 2 - печень).
После выявления специфических полос на рентгеновской пленке стандартной реакцией хемилюминесценции определяли их плотность и пересчитывали ее на мг белка осветленных гомогенатов.
Рис. 1. Удельная активность пулов 26S-протеасом (а) и 20S-протеасом (б), выделенных из селезенки (1) и печени (2) крыс разного возраста. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.
Результаты оценки относительного количества 26S- и 20S-протеасом в селезенке (1) и печени (2) представлены на рис. 2б и на рис. 3б соответственно. Динамика количества протеасом в пуле 26S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии имеет сходство с динамикой их удельной активности: периоды падения активности и содержания протеасом совпадают, однако строгой корреляции между этими величинами не наблюдается (рис. 2б и 1а). Для 20S-протеасом выявлена иная картина: их количество и в селезенке, и в печени не имеет достоверных различий на разных этапах развития (рис. 3б).
Рис. 2. Содержание субъединицы Rpt6 во фракциях селезенки и печени крыс разного возраста.
а - Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (1, 3) и 20S-протеасом (2, 4), полученных из селезенки (1, 2) и печени (3, 4), с использованием моноклональных антител к субъединице Rpt6. Маркер - овальбумин (М.м. 45 кДа).
б - Относительное количество субъединицы Rpt6 во фракциях 26S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2). За 100% принято количество Rpt6 в органах пятисуточных крыс. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.
Рис. 3. Содержание субъединиц альфа1,2,3,5,6,7 во фракциях селезенки и печени крыс разного возраста.
а - Вестерн-блоты белков фракций 20S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2), с использованием моноклональных антител к субъединицам альфа1,2,3,5,6,7. Маркер - карбоангидраза (М.м. 29 кДа).
б - Относительное количество субъединиц альфа1,2,3,5,6,7 во фракциях 20S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2). За 100% принято количество альфа1,2,3,5,6,7 в органах пятисуточных крыс. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.
Динамика появления иммунных субъединиц в пулах 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии отражена на рис. 4.
Замена конститутивных субъединиц на иммунные происходит во вновь образующихся протеасомах при определенных условиях, например, под воздействием ИФ (Rock, Goldberg, 1999). При этом конститутивные каталитические субъединицы X(5), Y (1) и Z(2) замещаются на иммунные субъединицы LMP7 (5i), LMP2 (1i) и LMP10 (2i). Субъединицы LMP2 и LMP10 встраиваются совместно, но независимо от LMP7. Включение LMP7, хотя и облегчается наличием LMP2 и LMP10, но может осуществляться и без них. Таким образом, в пулах протеасом наряду с конститутивными формируются и несколько субтипов иммунных протеасом. Какова их роль? Гидролиз генетически чужеродных белков, своих мутантных или вирусных, осуществляют как конститутивные, так и иммунные протеасомы. Но при гидролизе этих белков иммунными протеасомами в несколько раз возрастает выход олигопептидов длиной 8-11 аминокислотных остатков с «правильным» С-концом, содержащим гидрофобные аминокислоты или аргинин. Олигопептиды такой длины соответствуют размерам антигенных эпитопов. В комплексе с молекулами ГКГ класса I они выносятся на поверхность дефектной клетки для представления Т-киллерам. Последние распознают такой комплекс и запускают апоптоз дефектных клеток. В АПК, таких как макрофаги и дендритные клетки, иммунные протеасомы участвуют в активации «наивных» Т-лимфоцитов в цитотоксические Т-лимфоциты, или Т-киллеры. Таким образом, иммунные протеасомы являются первичным звеном в формировании иммунного ответа.
Содержание иммунных субъединиц LMP7 (30 кДа) и LMP2 (23 кДа) в пулах протеасом селезенки и печени исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к этим субъединицам. По содержанию субъединицы LMP2 судили и о содержании включающейся вместе с ней субъединицы LMP10. Обе иммунные субъединицы, LMP7 и LMP2, выявляются данным методом в заметном количестве в селезенке на 7-е постнатальные сутки (рис. 4, блоты 1-4), причем как в пуле 26S-протеасом (рис. 4, блоты 1, 3), так и в пуле 20S-протеасом (рис. 4, блоты 2, 4). В печени же обе субъединицы выявляются в незначительном количестве только на 17-е сутки постнатального развития (рис. 4, блоты 5-8), на 19-е сутки содержание их возрастает и, как в селезенке, они входят в состав и 26S-протеасом (рис. 4, блоты 5, 7), и 20S-протеасом (рис. 4, блоты 6, 8).
В ходе обсуждения полученных результатов мы пришли к выводу, что параллельное падение активности и количества протеасом можно рассматривать как результат истощения запасенного 26S-пула.
Рис. 4. Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (1, 3, 5, 7) и 20S-протеасом (2, 4, 6, 8), полученных из селезенки (1-4) и печени (5-8) крыс разного возраста. Использовали поликлональные антитела к субъединицам LMP7 (1, 2, 5, 6) и LMP2 (3, 4, 7, 8). Маркеры - карбоангидраза (М.м. 29 кДа), ингибитор трипсина (М.м. 20 кДа).
Уменьшение пула 26S-протеасом начинается на 7-е постнатальные сутки. В это же время в пуле 26S-протеасом селезенки появляются иммунные субъединицы. Следовательно, на 7-е сут начинается и обратный процесс - формирование нового пула 26S-протеасом, причем в селезенке это уже качественно иной пул, включающий в себя иммунные субъединицы, в то время как в печени вновь образуется пул конститутивных 26S-протеасом. Через 12 сут (на 19-е постнатальные сутки) начинается следующий период смены пулов 26S в этих органах, который сопровождается падением активности и относительного количества протеасом и в печени, и в селезенке, а также появлением иммунных субъединиц в печени. Полученные результаты и сделанные нами выводы согласуются с тем фактом, что время полужизни протеасом составляет 12 сут (Tanaka, Ichihara, 1989). Отсутствие строгой корреляции между динамикой удельной активности и относительным количеством протеасом в пуле 26S можно объяснить одновременным осуществлением нескольких процессов - устранением старого и формированием нового пула, изменением субъединичного состава протеасом, действием регуляторных белков. Так, например, известно, что замена конститутивных каталитических субъединиц на иммунные сопровождается изменением активности протеасом (Eleuteri et al., 1997).
Смена пулов 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии, по всей видимости, происходит одновременно со сменой пулов 26S-протеасом, о чем свидетельствует динамика их активности и появление в них иммунных субъединиц. Отсутствие видимого изменения количества 20S-протеасом не противоречит этому предположению и объясняется особенностями их сборки: формирование 20S-протеасом начинается с образования их неактивных предшественников (Coux et al., 1996).
Развитие белой пульпы селезенки в онтогенезе крысы.
В основе организации системы периферических органов иммунной системы лежит региональный принцип: каждый лимфоидный орган контролирует определенную часть тела (Ярилин, 1999). Печень находится в зоне иммунологического надзора селезенки. Поэтому параллельно с изучением динамики формирования иммунных протеасом в селезенке и печени крысы мы исследовали динамику развития белой пульпы селезенки, а именно, периартериальных лимфоидных оболочек (муфт), которые представляют собой функциональные зоны Т-лимфоцитов.
Срезы селезенки обрабатывали гематоксилин-эозином. Окрашивание этими красителями позволяет различать лимфоциты, обладающие крупными ядрами, среди всего многообразия клеток селезенки. На рис. 5 представлены фотографии срезов селезенки разных стадий развития, на
Рис. 5. Развитие белой пульпы селезенки крысы. Срезы окрашены гематоксилин-эозином. Увеличение: 10 Х. Стрелками обозначены зоны периартериальных лимфоидных оболочек.
которых прослеживается развитие муфт. На ранних стадиях развития Т- и В-лимфоциты в селезенке перемешаны, но в первые постнатальные дни растет количество зон концентрически расположенных клеток стромы в периартериальном пространстве белой пульпы, куда постепенно мигрируют Т-лимфоциты (Van Rees et al., 1990). Мы показали, что четко выраженные муфты вокруг артериол образуются к 15-18-м сут постнатального развития, что приблизительно совпадает по времени с началом формирования иммунных протеасом в печени (17-19-е сут) (рис. 4).
Установленные нами факты о 1) формировании иммунных протеасом в селезенке (лимфоидном органе) и печени (нелимфоидном органе) в первые три недели постнатального развития, 2) появлении иммунных протеасом в селезенке раньше, чем в печени, 3) образовании четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки одновременно с появлением иммунных протеасом в печени являются важными в понимании развития иммунной системы млекопитающих.
Клетки иммунной системы созревают уже в ходе эмбрионального развития. Однако функциональная активность клеток в эмбриональном и раннем постнатальном развитии выражена еще слабо. С одной стороны, данный факт можно объяснить незавершенной миграцией лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Например, у крыс она продолжается в течение нескольких недель после рождения (Van Rees et al., 1990; Ярилин, 1999). С другой стороны, очевидно, что полноценный иммунный ответ невозможен без формирования всех компонентов, участвующих в развитии иммунных реакций. Результаты проведенной работы объясняют причину неэффективного функционирования иммунной системы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии. Иммунные протеасомы, необходимые для запуска Т-клеточного иммунного ответа, выявляются в селезенке на первой неделе, а в печени - на третьей неделе после рождения. Иными словами, селезенка, по-видимому, готова к Т-клеточному иммунному ответу внутри самой себя к концу первой недели постнатального развития, когда в ней формируются иммунные протеасомы и уже присутствуют Т-лимфоциты и АПК. Более раннее обеспечение иммунной защиты селезенки как органа иммунной системы представлется важным для становления иммунитета в целом. Печень, находящаяся в зоне иммунной защиты селезенки, способна представить свои дефектные клетки к 17-19 сут постнатального развития, когда цитотоксические Т-лимфоциты могут перемещаться из белой пульпы селезенки с током крови и/или лимфы и уничтожать эти клетки.
Особенности пула протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши.
Соотношение между формами и субтипами протеасом (26S, 20S, конститутивными и иммуными) во многом определяет функции органов и тканей, в том числе злокачественно трансформированных. В данном разделе работы приводятся результаты анализа пула 26S- и пула 20S-протеасом клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши с таковыми клеток различных органов здоровых животных.
Клетки асцитной карциномы Krebs-II прививали мышам линии Balb/c. Асцитная карцинома Krebs/II - экспериментальная опухоль, полученная из эпителиальных клеток мыши. Для сравнения с карциномой исследовали органы здоровых мышей: легкие, состоящие в основном из эпителиальных клеток и представляющие корректный контроль, а также селезенку и печень - органы иного гистологического строения.
Иммунные 26S-протеасомы. В связи с известным свойством злокачественных клеток преодолевать иммуннологический контроль, наш интерес, прежде всего, был направлен на изучение уровня иммунных субъединиц в пулах протеасом в асцитной карциноме в сравнении с протеасомами здоровых органов.
Логично предположить, что в случае частичного или полного исключения иммунных субъединиц из состава протеасом клетка могла бы потерять способность продуцировать антигенные эпитопы в достаточном количестве и, избегая контакта с цитотоксическими Т-лимфоцитами, накапливать необходимый «комплект» мутаций и, в конечном итоге, давать начало злокачественной опухоли.
Действительно, с помощью иммуноблоттинга (рис. 6) нами показано, что в асцитной карциноме Krebs-II уровень иммунной субъединицы LMP7 (рис. 6 в) в 12 раз ниже, чем в контрольных клетках легких, и в 4-5 раз ниже, чем в селезенке и печени, из расчета на мг белка осветленных гомогенатов. Иммунная субъединица LMP2 (рис. 6 г) в клетках асцитной карциномы, в отличие от легких, селезенки и печени, практически не выявлялась.
Нужно отметить, что в многочисленных клеточных линиях злокачественных опухолей грызунов и человека с помощью RT PCR-анализа исследованы уровни мРНК полипептидов, участвующих в образовании и представлении антигенных эпитопов клеткам иммунной системы (Maeurer et al., 1996; Johnsen et al., 1998; Delp et al., 2000; Seliger et al., 2000; Matsui et al., 2002; Miyagi et al., 2003; Krishnakumar et al., 2004). В ряде клеточных линий опухолей различного гистогенеза выявлены низкие уровни мРНК (или мРНК не выявлена совсем) иммунных субъединиц протеасом и белков транспортеров ТАР1 и ТАР2, которые повышались после обработки клеток ИФ. При этом в качестве внутреннего контроля использовалась мРНК -актина. Однако авторы этих исследований сами
Рис. 6. Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (а, б, в, г) и 20S-протеасом (д, е, ж, з), полученных из селезенки, печени, легких и асцитной карциномы Krebs-II мыши. Использованы моноклональные антитела к субъединицам Rpt6 (а, д) и альфа1,2,3,5,6,7 (б, е) и поликлональные антитела к субъединицам LMP7 (в, ж) и LMP2 (г, з). Маркеры: овальбумин (М.м. 45 кДа), карбоангидраза (М.м. 29 кДа), ингибитор трипсина (М.м. 20 кДа).
отмечают несоответствие результатов, полученных ими при анализе уровня мРНК иммунной субъединицы LMP2 и исследовании этой субъединицы Вестерн-блоттингом в клеточной линии почечной карциномы мыши (Seliger et al., 2000). Мы полагаем, что более корректный подход заключается в сравнении уровня и мРНК, и белка в опухолевых и контрольных клетках. Это тем более важно потому, что в разных клетках соотношение субтипов иммунных протеасом различно. Как мы показали в данной работе, в здоровых клетках легких мыши уровень субъединицы LMP2 существенно ниже уровня субъединицы LMP7 (рис. 6 в, г). Если проводить исследование опухолей без учета особенностей контрольных клеток, можно придти к неверным выводам. Тем не менее, серия указанных статей дает основание полагать, что резкое сокращение количества иммунных субъединиц протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши обусловлено скорее низким уровнем мРНК, чем подавлением их синтеза или посттрансляционными процессами. Это предположение очерчивает пути поиска механизмов, определяющих количественный уровень иммунных протеасом, в направлении исследования регуляции транскрипции генов, кодирующих иммунные субъединицы.
Конститутивные 26S-протеасомы. Функции конститутивных 26S-протеасом заключаются в регуляции множества клеточных процессов посредством АТФ- и убиквитинзависимого гидролиза белков-участников этих процессов. Мы обнаружили, что пул 26S-протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши вдвое больше, чем в контрольных клетках легких (рис. 6 а, б). Если принять во внимание крайне низкое содержание в нем иммунных субъединиц, то можно сказать, что этот пул представлен, главным образом, конститутивными протеасомами. Активность химотрипсинподобных центров рассматриваемого пула протеасом в семь раз выше, чем в контрольных клетках. Возникает закономерный вопрос, для чего злокачественной опухоли нужен увеличенный пул столь активных конститутивных 26S-протеасом? Клетки злокачественных опухолей отличаются от контрольных клеток активным обменом белков. Для его осуществления, очевидно, и требуется более активный пул 26S-протеасом. Высокая активность этого пула поддерживается не только увеличением количества 26S-протеасом, но и изменением субъединичного состава - исключением из него иммунных субъединиц. Иными словами, исключение иммунных субъединиц из пула 26S-протеасом позволяет злокачественным клеткам добиваться двух целей: «уходить» из-под иммунного надзора и повышать активность конститутивных протеасом, обеспечивающих их жизнедеятельность.
Пул 20S-протеасом клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши подобен пулу 20S контрольных клеток легких по относительному количеству, по субъединичному составу (рис. 6е) и по активности протеасом. Это сходство представляется логичным, поскольку эта форма протеасом не участвует ни в регуляторном процесссе, ни в иммунном ответе. Пул 20S-протеасом в асцитной карциноме и здоровых органах взрослой мыши не имеет в своем составе иммунных субъединиц, в отличие от таковых в органах крысы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты данного исследования являются оригинальными, вносят значимый вклад в биологию развития и открывают перспективы в изучении физиологической роли протеасом.
Установленные нами факты о 1) формировании иммунных протеасом в селезенке и печени в разные сроки постнатального развития и 2) образовании четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки одновременно с появлением иммунных протеасом в печени являются важными в понимании развития иммунной системы млекопитающих. Они позволяют понять механизм складывающихся в организме взаимоотношений лимфоидных и находящихся под их защитой нелимфоидных органов. В этой связи начатая нами работа определяет необходимость дальнейших исследований динамики появления иммунных протеасом в других лимфоидных и нелимфоидных органах, а также распределения иммунных протеасом в различных клетках этих органов.
В огромном количестве публикаций, вышедших за последнее время, нет ни одной работы, в которой было бы проведено детальное исследование пула протеасом в злокачественно трансформированных клетках. Актуальность таких работ очевидна, хотя бы потому, что до сих пор не совсем понятен механизм, с помощью которого злокачественно трансформированные клетки «обманывают» иммунную систему. Одна из особенностей асцитной карциномы Krebs-II мыши - исключение иммунных протеасом из клеточного пула - позволяет клеткам опухоли «уйти» из-под иммунного надзора. Является ли исключение иммунных протеасом общим для всех или большинства злокачественно трансформированных клеток свойством? Ответ на этот вопрос мы надеемся получить в дальнейших исследованиях. Очень важно, на наш взгляд, изучение механизмов регуляции экспрессии иммунных субъединиц протеасом. Эти знания могут помочь найти пути восстановления их уровня, необходимого и достаточного для распознавания злокачественных клеток иммунной системой.
Данная работа полностью выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № № 03-04-49127, 06-04-48229).
Выводы
1. Разработан метод разделения пулов 26S- и 20S-протеасом для их сравнительного анализа в различных органах. Метод включает в себя фракционирование белков осветленных гомогенатов органов сульфатом аммония и позволяет сохранить оба пула в нативном состоянии.
2. В первые три недели постнатального развития в селезенке и печени крысы дважды происходит смена пулов 26S- и 20S-протеасом. При этом качественно новые пулы протеасом, содержащие иммунные субъединицы, в селезенке формируются раньше, чем в печени.
3. Образование четко выраженных муфт белой пульпы селезенки крысы к 15-18 сут постнатального развития совпадает по времени с появлением иммунных протеасом в печени.
4. Пул 26S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши превышает таковой в контрольных клетках легких вдвое; активность химотрипсинподобных центров протеасом этого пула в 7 раз выше, чем в клетках легких.
5. Уровень иммунной субъединицы LMP7 в пуле 26S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши в 12 раз ниже в сравнении с таковым в клетках легких. Иммунная субъединица LMP2 в этом пуле не выявляется в отличие от пула 26S-протеасом клеток легких.
6. 20S-протеасомы клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши не отличаются от 20S-протеасом клеток легких по активности, количеству и субъединичному составу.
Выражаю благодарность своим учителям академику Збарскому И.Б., ст.н.сотр. Бульдяевой Т.В., в.н.сотр. Кузьминой С.Н., с которыми связаны первые шаги в науке и большая интересная работа и жизнь в лаборатории. Научному руководителю Шаровой Н.П. за постоянную помощь в проведении экспериментов, обсуждении результатов, за терпение и душевную щедрость. Коллегам Михайлову В.С., Пескину А.В., Абрамовой Е.Б., Акопову С.Б., Столярову С.Д., Дмитриевой С.Б., Гореловой В.С., Ерохову П.А., Бондаревой Л.А. за участие в проведении экспериментов, помощь в оформлении иллюстративного материала и моральную поддержку. А также всем сотрудникам Института, выразившим интерес к работе. Своей семье, отнесшейся ко мне с большим вниманием в период оформления работы.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Е.Б.Абрамова, Т.М.Астахова, П.А.Ерохов, Н.П.Шарова. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Известия РАН. Серия биологическая. 2004. -№ 2. -С. 150-156.
2. Е.Б.Абрамова, Т.М.Астахова, Н.П.Шарова. Изменение активности и состава протеасом в постнатальном развитии крысы // Онтогенез. 2005. -Т. 36 -№ 3. -С. 205-210.
3. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, П.А.Ерохов. Особенности формирования пулов протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии // Биохимия. 2006. -Т. 71. -вып. 9. -С.1278-1286.
4. Т.М.Астахова, Н.П.Шарова. Исключение иммунных протеасом из клеток асцитной карциномы Krebs-II // Известия РАН. Серия биологическая. 2006. -№ 3. -С. 275-283.
5. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, С.Д.Столяров. Формирование иммунных протеасом и развитие иммунной системы в онтогенезе млекопитающих // Онтогенез. 2007. -Т. 38, в печати.
Тезисы:
1. Abramova E.B., Astakhova T.M., Bondareva L.A., Stolyarov S.D., Sharova N.P. Changes in proteasome pool in postnatal development of rat. Abstracts at the 15th International Society of Developmental Biologists Congress. 3-7 September 2005. Sydney, Australia. -P. 79.
2. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, С.Д.Столяров. Иммунные протеасомы и иммунитет // Материалы конференции, посвященной 80-летию со дня рождения А.А.Нейфаха «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция». Москва, 15-16 мая 2006 г. -С. 11.
3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Бондарева Л.А., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д. Изменение пулов 26S- и 20S-протеасом и становление иммунитета в постнатальном развитии млекопитающих // Тезисы докладов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва, 23-25 апреля 2007. -В печати.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Изучение активностей ключевых ферментов трех этапов эксцизионной репарации оснований в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Приготовление экстрактов эмбрионов морских ежей. Измерение активности ферментов репарации.
дипломная работа [2,4 M], добавлен 06.07.2011Определение понятия "игра". Представление о поведении животных. Игровое поведение у животных. Врожденное и приобретаемое в индивидуальном развитии поведение. Функции игры. Познавательная функция игровой активности животных. Формы игрового поведения.
реферат [30,2 K], добавлен 29.02.2016Гиппократ как основоположник современной клинической медицины. Заслуга ученых античности в развитии естественных наук. Содержание основных законов диалектики, применение диалектических методов исследования. Закон перехода количества в качество.
контрольная работа [44,1 K], добавлен 03.04.2011Мышевидные грызуны в условиях антропогенных нарушений ландшафтов. Характеристика, специфика живоловочных стационарных площадок и методика изучения мышевидных грызунов на них. Особенности автогрумминга у грызунов по внутри- и межвидовым ссаживаниям.
дипломная работа [1,5 M], добавлен 02.02.2018Изучение мышевидных грызунов, обитающих на территории Гомельского района Республики Беларусь. Изучение видового состава, особенностей распределения и видовой структуры сообществ микромаммалий лесных станций и сопутствующих биотопов Гомельского района.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 28.11.2017Строение и классификация гликозаминогликанов. Биосинтез, локализация и функции протеогликанов. Состав протеогликанов в трансформированных клетках. D-глюкуронил С5-эпимераза. Выделение РНК фенольным методом. Проверка чистоты РНК на содержание примеси ДНК.
дипломная работа [585,2 K], добавлен 21.08.2011История исследования потенциал-активируемых хлорных каналов, проблемы их трансмембранной топологии. Структура и назначение калиевых каналов внутреннего выпрямления. Действие глутамата на центральную нервную систему. Изоформы субъединиц ионных каналов.
реферат [18,9 K], добавлен 24.10.2009Наиболее важные черты общей организации млекопитающих, их строение на примере крысы. Порядок вскрытия крыс, знакомство с общим расположением внутренних органов, топография. Кровеносная, дыхательная, пищеварительная, мочеполовая и нервная системы крысы.
реферат [557,3 K], добавлен 09.12.2009Процесс дифференциации в развитии наук. Единство дифференциации и интеграции научного знания как важная закономерность процессов развития науки. Роль математики в развитии познания. Главные особенности применения математических методов в науке и технике.
реферат [20,0 K], добавлен 25.01.2012Исследование основных фаз процесса образования микротрубочек. Изучение особенностей их строения и функций. Анализ структур, образуемых системой микротрубочек и организующих их центров. Центросома - регулятор хода клеточного цикла в клетках эукариот.
презентация [564,8 K], добавлен 13.04.2013
