Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Специальность 03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Исследование ранних этапов развития у рыб: процесс активации и кальцийсвязывающие белки яйца

ОЗЕРОВА С.Г.

Москва - 2009

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук Минин Андрей Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Шарова Наталья Петровна

доктор биологических наук Катруха Алексей Генрихович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Защита диссертации состоится 20 мая 2009 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26).

Автореферат разослан 20 апреля 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Под активацией яйцеклетки в широком смысле понимают переход из состояния покоя к развитию. Активация происходит в процессе оплодотворения. Вопрос о том, какие клеточные и молекулярные механизмы задействованы в активации яйцеклетки, изучается на протяжении многих лет на самых разных живых объектах.

Для рыб характерно внешнее осеменение, при котором половые клетки выводятся в водную среду, где и происходит их слияние. Если осеменение не произошло, в неоплодотворенном яйце начинаются некоторые изменения, аналогичные происходящим при нормальном развитии, в частности повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция, экзоцитоз кортикальных гранул, образование оболочки оплодотворения. Для обозначения этого явления в литературе используются термины «спонтанная активация», «автоактивация». Природа включения спонтанной активации яйца рыб, равно как и активации при оплодотворении, остается неясной.

Изучение спонтанной активации имеет важное значение при решении некоторых проблем рыборазведения. Искусственное разведение рыб предполагает в качестве одной из задач разработку методов получения зрелых половых продуктов и проведение искусственного оплодотворения. Проблема сохранения у яйца способности к оплодотворению осложнена тем, что при попадании в водную среду икра рыб спонтанно активируется и теряет эту способность. В связи с этим особенно актуальным представляется изучение природы сигналов активации, а также возможности (механизмов) их ингибирования.

Разнообразные сигнальные процессы, приводящие к активации яйцеклетки, в настоящее время широко исследуются с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии. Главное внимание в этих работах уделяется сигнальной роли ионов кальция при активации. Повышение концентрации ионов кальция в яйце при активации может указывать на их роль в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул, как одного из типов секреции.

Однако существует Са2+-независимая секреция. Например, секреция в тромбоцитах под действием эндогенного диацилглицерина или его искусственных аналогов форболовых эфиров может происходить и без изменения концентрации внутриклеточного кальция. Возможно, что секреторный ответ в этом случае обеспечивается за счет стимуляции протеинкиназы С. Участие форболовых эфиров в процессе активации яйцеклетки показано для разных видов животных. О возможном существовании более чем одного механизма регуляции экзоцитоза в яйцеклетке свидетельствуют экспериментальные данные многих работ. Электронно-микроскопические исследования показывают, что популяция кортикальных гранул неоднородна по строению, размеру и распределению в кортикальном слое яйца. Разные типы гранул имеют различную чувствительность к веществам, вызывающим искусственную активацию яйцеклеток. Для некоторых видов рыб отмечено, что при активации кальциевая волна ни по времени, ни пространственно не совпадает с экзоцитозом кортикальных гранул. Все это делает актуальным изучение возможной роли диацилглицеринового сигнального пути в активации яйца рыб.

Единым механизмом реализации кальциевого сигнала в клетке является связывание ионов кальция при повышении их концентрации с белками. Изучение состава и свойств кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке и обеспечивающих кальциевую сигнализацию, позволит расширить представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих протекание процесса активации у рыб.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение клеточных и молекулярных механизмов активации яйцеклетки рыб, определяющей начало включения программы развития. Изучались сигнальные процессы, приводящие к активации яйца, а также компоненты яйцеклетки, обеспечивающие ее реализацию.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать роль подмембранного актинового цитоскелета в процессе спонтанной активации, в частности в экзоцитозе кортикальных гранул.

2. Исследовать влияние форболовых эфиров на процесс образования оболочки оплодотворения у двух карповых рыб: вьюна (Misgurnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio).

3. Исследовать влияние состава среды инкубации на активацию яйцеклеток вьюна (Misgurnus fossilis) и данио (Brachydanio rerio), а также влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению у яйцеклеток данных видов рыб.

4. Исследовать влияние искусственного изменения концентрации ионов кальция на процесс формирования оболочки оплодотворения у вьюна.

5. Идентифицировать кальцийсвязывающие белки, присутствующие в ооцитах данио.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации у рыб. Полученные данные открывают возможность для создания искусственных сред, позволяющих длительное время сохранять икру рыб, способную к оплодотворению, что представляет большой практический интерес для развития аквакультуры.

Также впервые установлено активирующее действие форболовых эфиров на процесс формирования оболочки оплодотворения у яйцеклеток рыб.

Был разработан микрометод выделения кальцийсвязывающих белков.

Протеомный анализ выделенных белков с использованием масс-спектрометрии позволил впервые идентифицировать в виде запасенных белков ооцита аннексины А5, А13.1, А1а, А2а и белок копин III, содержащий С2-кальцийсвязывающий домен.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии им. Д.П. Филатова Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2001); конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2004); конференции «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (203 источника). Работа содержит 17 рисунков и 4таблицы.

Результаты исследования и их обсуждение

Структура кортикального слоя неоплодотворенной яйцеклетки вьюна и ее изменения при спонтанной активации

Строение кортикального (поверхностного) слоя цитоплазмы яйцеклеток различается у разных видов рыб, что сказывается на особенностях протекания экзоцитоза кортикальных гранул в процессе активации. Структура кортикального слоя и кортикальных гранул яйца вьюна ранее описаны не были. На первом этапе мы изучали микроструктуру кортикального слоя яйца вьюна и ее изменения, происходящие при активации яйцеклетки в воде. Прижизненные наблюдения активированной яйцеклетки сочетались с изучением световых и электронных фотографий кортикальной области яйца до и после активации.

На рисунке 1 представлена фотография неактивированного яйца вьюна, находящегося в полостной жидкости, и того же яйца после 10 минут инкубации в воде. Неактивированное яйцо вьюна достигает 1,2 мм в диаметре, яйцевая оболочка плотно примыкает к поверхности яйца (рис. 1A). Оболочка яйца состоит из хорошо развитой zona radiatа, толщина которой составляет примерно 4 мкм, и примыкающей к ней наружной оболочки ворсинчатого строения (рис. 3A). При высоком увеличении можно видеть узкое щелевидное пространство толщиной около 0,4 мкм между плазматической мембраной и zona radiatа - перивителлиновое пространство, в котором находятся микроворсинки, отходящие от поверхности яйца (рис. 3А).

В периферическом слое цитоплазмы зрелых неактивированных яиц вьюна содержатся секреторные органеллы - кортикальные гранулы, которые

представляют собой пузырьки округлой или овальной формы диаметром от 4 до 25 мкм, окруженные мембраной, расположенные в один ряд. Гранулы разного размера распределены случайным образом. При этом в области анимального полюса присутствуют лишь единичные гранулы мелкого размера (рис. 2A).

Рис. 1. Образование оболочки оплодотворения у яйца вьюна при активации в воде. (А) - неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б) - яйцо вьюна через 10 минут после инкубации в воде. Масштабная линейка 1мм (А, Б).

При помещении неактивированного яйца вьюна в воду происходит экзоцитоз кортикальных гранул. При этом содержимое гранул выделяется под оболочку яйца и обводняется, что приводит к расширению перивителлинового пространства, которое при малом увеличении выглядит как прозрачная зона, отделяющая яйцевую оболочку от поверхности плазматической мембраны на значительное расстояние (рис. 1Б). За счет увеличения перивителлинового пространства, а также в результате набухания, размеры активированного яйца увеличиваются до 1,7 мм в диаметре (рис. 1Б).

Рис. 2. Полутонкие срезы яйца вьюна. (А) - интактное неактивированное яйцо вьюна в полостной жидкости. (Б) - интактное яйцо вьюна через 10 минут инкубации в воде. Кортикальные гранулы показаны стрелками. Aп - анимальный полюс яйца. Масштабная линейка 0,1 мм (А, Б).

На электронных фотографиях видно, что кортикальные гранулы, митохондрии и частицы диаметром 25-30 нм (по-видимому, рибосомы) отделены от плазматической мембраны яйца слоем фибриллярного материала толщиной 0,05-0,15 мкм (рис. 3А, Б), который представляет собой сеть актиновых микрофиламентов.

На полутонких срезах яйца, инкубированного 10 минут в воде, в периферическом слое цитоплазмы кортикальные гранулы отсутствуют (рис. 2Б). Толщина слоя актиновых микрофиламентов составляет 0,15-0,3 мкм (рис. 3Г), что превышает толщину этого слоя в неактивированном яйце (рис. 3А).

Рис. 3. Влияние инъекции фаллоидина на толщину подмембранного цитоскелета.

(А, Б) - подмембранная область интактного неактивированного яйца вьюна. (В) - подмембранная область яйца вьюна в месте инъекции 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Г) - подмембранная область интактного яйца вьюна через 10 минут инкубации в воде. Стрелками и скобкой обозначена толщина слоя актиновых микрофиламентов. КГ - кортикальные гранулы. ZR - zona radiatа. Масштабная линейка 1 мкм (А, В, Г).

Масштабная линейка 0,5 мкм (Б).

Влияние изменения концентрации ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетках вьюна

Участие ионов кальция в процессе экзоцитоза кортикальных гранул у вьюна мы изучали путем искусственного изменения концентрации ионов кальция в яйце. В первом варианте опытов в неоплодотворенное яйцо инъецировали раствор хелатора этих ионов - ЭГТА. Во втором случае инъецировали растворы, содержащие разные концентрации свободных ионов кальция. Об экзоцитозе кортикальных гранул судили по отхождению оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой.

В яйцеклетку вьюна инъецировали 10 нл PIPES буфера, содержащего 20 мМ ЭГТА и инкубировали 5 минут в полостной жидкости. В процессе инкубации каких-либо изменений морфологии яйцеклетки отмечено не было. Затем яйцо помещали в воду. При этом в месте инъекции ЭГТА образование оболочки оплодотворения не происходило (рис. 4Б), что мы объясняем локальным подавлением в этой области экзоцитоза кортикальных гранул. В качестве контроля в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл 100 мМ PIPES буфера и затем активировали в воде. При этом происходило отделение оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца (рис. 4А).

Во втором варианте опыта в неактивированное яйцо вьюна инъецировали 10 нл раствора, содержащего 2 мМ свободного кальция. Яйцо инкубировали в полостной жидкости. При этом наблюдалось локальное образование оболочки оплодотворения в области инъекции (рис. 4В). Активация была локальной даже при инъекции большой концентрации кальция - 10 нл буфера, содержащего 10 мМ свободного кальция (рис. 4Г). Если такие частично активированные большой концентрацией кальция яйца помещались в воду, то оболочка оплодотворения отделялась по всей поверхности яйца.

Тот факт, что инъекция кальция в неоплодотворенное яйцо, находящееся в полостной жидкости, вызывала локальное образование оболочки оплодотворения, может указывать на взаимосвязь между повышением концентрации ионов кальция и экзоцитозом кортикальных гранул. Однако обращает на себя внимание то обстоятельство, что при инъекции кальция образования оболочки оплодотворения по всей поверхности яйца не происходит.

Рис. 4. Влияние инъекции ЭГТА и Са2+ на экзоцитоз кортикальных гранул и активацию яйца.

(А) - яйцо, инъецированное 10 нл 100 мМ PIPIES буфера, инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде (контроль). (Б) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с ЭГТА (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, pH 7,2), инкубированное 5 минут в полостной жидкости и активированное в воде. (В) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 2 мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 22 мМ CaCl2, pH 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости. (Г) - яйцо, инъецированное 10 нл буфера с 10 мМ свободного кальция (100 мМ PIPIES, 20 мМ ЭГТА, 30 мМ CaCl2, pH 7,2), инкубированное 10 минут в полостной жидкости. (_) - место инъекции. Масштабная линейка 1 мм.

Участие актиновых микрофиламентов в активации яйца: влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул у вьюна

Исследования, проводившиеся ранее в нашей лаборатории, выявили, что у вьюна в кортикальном слое яйца расположена сеть актиновых микрофиламентов, состоящая из гамма-актина. В ряде работ на соматических секреторных клетках было показано, что для слияния секреторных гранул с плазматической мембраной необходима реорганизация кортикального слоя актиновых филаментов (Aunis, Bader, 1988; Cheek, Burgoyne, 1987).

В своей работе мы исследовали роль актиновых филаментов в процессе экзоцитоза кортикальных гранул в яйце вьюна с помощью микроинъекций фаллоидина - вещества, предотвращающего деполимеризацию фибриллярного актина.

В неактивированное яйцо инъецировали раствор фаллоидина в 2-4% DMSO (диметилсульфооксид). Концентрация фаллоидина составляла 0,1; 1 и 2 мг/мл. Инъецированные яйца инкубировали 5 минут в полостной жидкости, затем помещали в воду. О влиянии фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул судили по образованию оболочки оплодотворения в месте инъекции, которое наблюдали под бинокулярной лупой при малом увеличении.

Процесс экзоцитоза и реорганизацию кортикального слоя яйца регистрировали также на ультраструктурном уровне с использованием световой и электронной микроскопии области инъекции.

В качестве контроля в неактивированное, находящееся в полостной жидкости яйцо инъецировали 10 нл 2% или 4% DMSO. Затем яйца переносили в воду, при этом по всей поверхности яйца наблюдалось равномерное образование оболочки оплодотворения.

При инъекции 10 нл раствора фаллоидина в концентрации 0,1 и 1 мг/мл после активации яйца в воде наблюдалось локальное подавление образования оболочки оплодотворения в месте инъекции (рис. 5В, Г). На рисунке 5 видно, что яйцевая оболочка отделяется от поверхности плазматической мембраны по всей поверхности яйца, кроме области действия фаллоидина, размеры которой определяются количеством введенного вещества.

На полутонких срезах видно, что в области инъекции фаллоидина (левая часть яйца на рис. 5Д) экзоцитоз кортикальных гранул подавлен. Кортикальные гранулы располагаются в основном под плазматической мембраной, а некоторая часть их - в виде небольших скоплений во внутренней части яйца (рис. 5Д). В интактной области яйца (правая половина среза на рис. 5Д) кортикальные гранулы отсутствуют, что указывает на их нормальный экзоцитоз.

При инъекции больших доз фаллоидина (20 нл, 2 мг/мл) на электронных микрофотографиях можно наблюдать непрерывный слой кортикальных гранул на некотором расстоянии от плазматической мембраны (рис. 5Е).

Толщина слоя актиновых микрофиламентов в области инъекции фаллоидина составляла 0,4-1,5 мкм (рис. 3Б), что существенно выше по сравнению с толщиной этого слоя в неактивированном яйце, равной 0,05-0,15 мкм (рис. 3А).

Рис. 5. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул.

(A) - неактивированное яйцо в полостной жидкости; (Б) - яйцо через 10 минут после инкубации в воде; (В, Г) - яйца, инъецированные фаллоидином: (В) - 10 нл, 1 мг/мл и (Г) - 10 нл, 0,1 мг/мл. (Д) - полутонкий срез яйца, инъецированного 10 нл фаллоидина (1 мг/мл). (Е) - полутонкий срез яйца, инъецированного 20 нл фаллоидина (2 мг/мл). (_) - место инъекции. Стрелками обозначены кортикальные гранулы (Д, Е).

Влияние ингибиторов протеаз лейпептина и апротинина на спонтанную активацию яйца вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению

При нересте попадающая во внешнюю водную среду икра разных видов рыб через определенное время теряет способность к оплодотворению. Это связано со спонтанной активацией яйца, сопровождающейся образованием оболочки оплодотворения. В экспериментальных условиях, при выдерживании икры в какой-либо искусственной среде или в полостной жидкости, она также может утрачивать способность к оплодотворению. Характеристики процесса спонтанной активации: время активации, состав солевой среды, компоненты, предотвращающие спонтанную активацию, - значительно варьируют у разных видов рыб. В нескольких работах показана защита яйца данио от спонтанной активации в солевых физиологических растворах с декстрозой и БСА (Becker, Hart, 1999; Lee et al., 1999).

Мы изучали способность сред разного состава предотвращать спонтанную активацию яйцеклеток двух видов рыб - вьюна и данио. Для этого небольшие порции икры вьюна и данио в течение 10 минут инкубировали в средах разного состава, а также в полостной жидкости вьюна и сыворотке крупного рогатого скота. Активацию оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние сред разного состава на образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио

Название среды	Вьюн *)	Данио *)	Источник
Раствор Рингера для золотой рыбки	+	+	Ivanenkov et al., 1990, собственные данные
Бескальциевый раствор Рингера	+	+	Ivanenkov et al., 1990, собственные данные
FBSS + декстроза	+	+	Becker K.A., Hart N.H., 1999, собственные данные
FBSS + альбумин	+	+	Lee K.W. et al, 1999, собственные данные
HENKS	+	+	Собственные данные
Сыворотка крупного рогатого скота	-	-	Собственные данные
Полостная жидкость	-	-	Собственные данные

*) Знаком (+) обозначены среды, в которых через 10 минут инкубации наблюдалось образование оболочки оплодотворения более чем у 90% яиц, знаком (-) - те, в которых в течение данного времени оболочка не образовывалась. цитоскелет экзоцитоз форболовый рыба

Как видно из таблицы, активация икры вьюна и данио не происходила только при инкубации в полостной жидкости и в сыворотке крупного рогатого скота, ингибирующее активацию действие которых сохранялось даже при разведении в 10 раз. Некоторые из полученных нами данных отличаются от литературных. Возможно, несовпадение результатов объясняется обнаруженным нами эффектом полостной жидкости сохранять свои ингибирующие свойства при разведении. Неоплодотворенные яйцеклетки рыб при их получении в лабораторных условиях погружены в полостную жидкость. При любых манипуляциях с яйцеклетками отделить их полностью от полостной жидкости, не повредив, невозможно. Если икру инкубировать в небольших объемах солевой среды, то ингибирующий эффект может быть обусловлен не составом среды инкубации, а действием веществ полостной жидкости. При постановке экспериментов мы брали количество тестируемой среды, более чем в 10 раз превосходящее объем взятой в опыт икры. В работах, из которых мы брали рецепты сред, количественные параметры разведения икры, к сожалению, не приводятся.

Мы также исследовали влияние ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио. Были использованы ингибиторы протеаз широкого действия и разной природы - лейпептин, низкомолекулярный ингибитор, и апротинин, белковый ингибитор протеаз. Влияние ингибиторов на процесс спонтанной активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения.

Небольшие порции икры вьюна (30-50 икринок) инкубировали в солевом растворе HENKS с концентрациями лейпептина от 0,005 до 1мМ. В качестве контроля икру в тех же условиях инкубировали в растворе HENKS без лейпептина. При инкубации неоплодотворенной икры с различными концентрациями лейпептина более 90% икринок в каждой порции оставались неактивированными (у этих икринок мы не наблюдали образования оболочки оплодотворения). В контроле через 10 минут все яйца активировались. Столь же высокий процент неактивированных яиц (около 90%) был отмечен и при увеличении времени инкубации икры в среде с ингибитором до двух часов.

Рис. 6. Выживаемость зародышей вьюна, полученных из икры, инкубированной перед оплодотворением с различными концентрациями лейпептина.

Нами был экспериментально рассмотрен вопрос, сохраняет ли икра, инкубированная в солевой среде с лейпептином, способность к оплодотворению и дальнейшему развитию. Для этого небольшие порции икры, полученной от разных самок вьюна, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов в растворе HENKS с различными концентрациями лейпептина от 0,005 до 1 мМ. В качестве контроля икру от тех же самок при тех же условиях инкубировали 2 часа в полостной жидкости вьюна. Затем икру в опыте и контроле оплодотворяли. Подсчет развивающихся зародышей производили через 24 часа после оплодотворения. Результаты опытов представлены на рисунке 6.

Процент выживших зародышей в опыте и контроле рассчитывали по формуле Nж./Nобщ. Nобщ. - количество икринок в пробе. Nж. - количество зародышей, выживших через 24 часа после оплодотворения. В контрольных опытах икру инкубировали в полостной жидкости, так как в растворе HENKS без ингибиторов протеаз икра вьюна в течение 10 минут полностью активируется и теряет способность к оплодотворению. Цифрами 1, 2, 3, 4 обозначены порции икры от разных самок.

При инкубации неоплодотворенной икры вьюна в растворе HENKS с 1 мМ лейпептина в течение суток 95-100% яиц оставались неактивированными, но при этом икра полностью утрачивала способность к оплодотворению.

Для изучения влияния апротинина на спонтанную активацию яиц вьюна использовали следующие концентрации ингибитора: 1; 0,5 и 0,25 мг на 1 мл среды. Было показано, что апротинин в указанных концентрациях предотвращает спонтанную активацию яиц вьюна. При концентрации апротинина 1 мг на 1 мл среды 85% яиц вьюна сохраняли способность к оплодотворению.

Аналогичные эксперименты были проведены на икре данио. Лейпептин в концентрации 1мМ также предотвращал спонтанную активацию икры данио. В то же время апротинин в концентрации 1мг на 1мл среды не оказывал ингибирующего эффекта на процесс спонтанной активации яиц данио.

Различия в действии апротинина на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио можно объяснить разной доступностью и особенностями структуры протеаз-мишеней в яйце разных видов рыб. Видоспецифичность действия других ингибиторов протеаз на сохранение яйцом способности к оплодотворению была отмечена и в работах на золотой рыбке и радужной форели (Hsu, Goetz, 1993; Coffman, Goetz, 2000).

Влияние форболовых эфиров на образование оболочки оплодотворения у вьюна

Повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция рассматривают как триггер многих внутриклеточных процессов при активации. В своей работе мы изучали зависимость процесса активации не только от ионов кальция, но и от активности протеинкиназы С (PKC). Искусственными активаторами PKC являются форболовые эфиры, структурные аналоги диацилглицеролов. С помощью этих веществ исследуется роль PKC в самых разных внутриклеточных процессах. Так, было показано, что форболовые эфиры вызывают активацию яйцеклеток шпорцевой лягушки (Bement, Capco, 1989; Grandin, Charbonneau, 1991) и млекопитающих (Sun et al., 1997). Данные о влиянии форболовых эфиров на процесс активации яйца рыб в литературе отсутствуют.

Для изучения влияния форболовых эфиров на активацию яиц вьюна необходимо было в первую очередь найти среду инкубации, в которой не идет спонтанная активация. Поэтому небольшие порции зрелой неоплодотворенной икры вьюна и данио инкубировали в течение 10 минут в 2 мл полостной жидкости. Затем в полостную жидкость добавляли один из форболовых эфиров: ТФА (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат), ФДБ (форбол-12,13-дибутират) и РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат) до концентрации 0,1-1 мкМ. Процесс активации оценивали по образованию оболочки оплодотворения. Примерно через 5 минут после добавления к икре любого из форболовых эфиров у 90-95% яйцеклеток как вьюна, так и данио наблюдалось образование оболочки оплодотворения. При этом активация под действием форболовых эфиров происходила несколько медленнее, чем в воде, что может указывать на разнокачественность процессов, происходящих в том и другом случаях.

Неактивированную икру вьюна инкубировали также 10 минут в 2мл раствора HENKS с 1 мМ лейпептина. Затем в пробу добавляли PMA до концентрации 0,1-1 мкМ, что вызывало образование оболочки оплодотворения у 95% инкубированных икринок.

Обнаруженная нами активация икры рыб под действием форболовых эфиров, позволяет предположить, что процесс формирования оболочки оплодотворения может идти с участием PKC, при этом действие ее осуществляется на более поздних этапах сигнальных путей относительно процессов, связанных с активностью протеаз.

Идентификация кальцийсвязывающих белков

Включение программы развития в яйце, т.е. его активация, предполагает наличие в нем всех необходимых компонентов, запасенных в процессе оогенеза. Одним из универсальных сигнальных механизмов активации яйца у самых разных видов животных является кратковременное повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция. В частности, результаты наших экспериментов указывают на участие ионов кальция в процессе образования оболочки оплодотворения при активации у вьюна.

Роль ионов кальция в передаче сигналов в клетке определяется исключительно их взаимодействием с различными кальцийсвязывающими белками. Поэтому одной из задач наших исследований стало изучение кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетке рыб.

Ранее в нашей лаборатории было показано наличие в яйцеклетках вьюна кальцийсвязывающих белков: кальмодулина и S100, относящихся к суперсемейству EF-hand-содержащих белков (Ivanenkov et al., 1993). Были начаты исследования кальцийсвязывающих белков семейства аннексинов у вьюна. Мы продолжили исследования белков группы аннексинов у рыб на другом лабораторном объекте - данио, для которого мог быть применен метод идентификации белков с использованием масс-спектрометрии. Этот подход применим только в том случае, если имеются данные по массам триптических пептидов, полученные на основе известной аминокислотной последовательности исследуемого белка. Переход на новый объект был обусловлен тем, что, в отличие от вьюна, геном данио известен, аннотированы гены аннексинов, известна полная аминокислотная последовательность этих белков.

Общим молекулярным свойством аннексинов является их способность обратимо связываться с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция in vitro. На основе этого их свойства нами был разработан микрометод выделения аннексинов из ооцитов данио. Идентификацию выделенных белков проводили по следующей схеме: из ооцитов данио выделяли кальцийсвязывающие белки. Смесь белков разделяли методом одномерного либо двумерного электрофореза. Индивидуальные белковые пятна и полосы из гелей вырезали и исследовали методом Peptide Mass Fingerprint. При этом для повышения достоверности результатов полосу белка одной и той же молекулярной массы из разных гелей и разных выделенных образцов белков анализировали многократно.

Масс-спектрометрический анализ белковых полос одномерного и двумерного электрофореза позволил идентифицировать в ооцитах данио аннексины А5, А1а, А2а и А13.1 и копин III (табл. 2). Причем, как видно из таблицы, аннексины А13, А1 и А2 представлены только одной формой белка, хотя известно, что у данио имеются три изоформы А1 и по две А2 и А13, кодируемые разными генами.

Табл. 2. Идентификация образцов белков, выделенных из зрелых ооцитов данио кальцийзависимым переосаждением с кислыми фосфолипидами

Название белка	Номер в базе данных UniGene	Номер фрагмента геля *)	Значимость определения в разных опытах (scores**)
Аннексин А1а	GI|31419751	II, 2	57, 100
Аннексин А2а	GI|38566042	II	77, 80, 91, 100
Аннексин А5	GI|40254660	III, 1	151, 80, 68
Аннексин А13.1	GI|13397821	II, 3	73, 94, 124
Копин III	GI|29571133	I	101, 168

*) Римскими цифрами обозначены фрагменты геля двумерного фореза, арабскими - одномерного, фотографии гелей не приведены.

**) В соответствии с протоколом метода достоверно иденти- фицированными считаются белки, для которых значение scores выше 50 (p<0.05).

Копины относятся к большому суперсемейству белков, содержащих кальцийсвязывающий С2-домен. Так же, как и аннексиновый домен, С2-домен белков в присутствии ионов кальция взаимодействует с кислыми фосфолипидами мембраны. Вероятно, именно это позволило выделить белок данного семейства из гомогената ооцитов данио методом, который мы разработали для выделения аннексинов. Такой метод выделения копинов ранее не был описан.

Наличие кальцийсвязывающего белка копина III в виде запасенного белка в ооцитах показано впервые.

мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио

Одним из ранних событий, происходящих при активации яйца, является инициация белкового синтеза на запасенных в процессе оогенеза

мРНК. В ходе настоящей работы мы анализировали не только кальцийсвязывающие белки, но также их мРНК, наличие которых, наряду с запасенными белками в случае раннего включения трансляции, может обеспечивать протекание процессов, связанных с активацией.

Из ооцитов данио мы выделяли тотальную РНК и анализировали ее методом ОТ-ПЦР. В реакции использовали праймеры, специфичные к наиболее вариабельным 5'-концевым последовательностям аннексинов А13.1, А13.2 и А3. В ходе реакции ОТ-ПЦР для всех исследуемых аннексинов были получены одиночные ПЦР-продукты (рис. 7). Далее полосы были вырезаны из геля, образцы ДНК выделены и секвенированы. Нуклеотидные последовательности анализированных фрагментов показали их полную идентичность соответствующим участкам известных последовательностей аннексинов А13.1, А13.2 и А3.

Рис. 7. Электрофорез в 2% агарозном геле ПЦР-продуктов, полученных в ходе реакции ОТ-ПЦР с использованием тотальной РНК данио и праймеров, специфичных к 5`-концевым последовательностям аннексинов:

(А) - аннексина А13.1; (Б) - аннексина А3 (1) и аннексина А13.2 (2). К - контроль. Цифрами 500, 600 обозначен размер в парах оснований маркерной ДНК.

Таким образом, мы показали наличие в ооцитах данио мРНК А13.1, А13.2 и А3. Аннексин А13.1 был идентифицирован в ходе работы на белковом уровне в смеси выделенных белков, а для А13.2 и А3 наличие белков показано не было. Вероятно, трансляция аннексинов А13.2 и А3 происходит на более поздних стадиях развития яйца на запасенных мРНК.

Для аннексина А13 млекопитающих в эпителиальных клетках было показано существование двух сплайс-форм белка, которые отличаются друг от друга делецией 41 аминокислитного остатка (рис. 8). То, что в ходе реакции ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными для аннексинов А13.1 и А13.2, нами были получены одиночные полосы ПЦР-продуктов, длины которых соответствовали ожидаемому размеру, может свидетельствовать об отсутствии альтернативных сплайс-форм мРНК А13.1 и А13.2 в ооцитах данио.

Рис. 8. Схема экзон-интронной структуры и сайтов потенциального альтернативного сплайсинга генов аннексинов А13.1, А13.2 данио и гена А13 млекопитающих.

На рисунке представлена схема экзон-интронной структуры генов аннексина А13.1 (А) и А13.2 (Б) данио и А13 (В) млекопитающих, а также структура соответствующих генам мРНК. Серыми блоками обозначены экзоны, с указанием их размера (сверху). Белыми блоками обозначены интроны, с указанием их размера (снизу). Голубым цветом обозначены нетранслируемые 5' и 3' области мРНК аннексинов, красным - экзон, присутствующий только в мРНК изоформы b аннексина млекопитающих. AUG - место начала трансляции.

На рисунке 8 показано положение праймеров, с использованием которых были получены 5`-концевые последовательности кДНК аннексинов А13.1 и А13.2. Как видно, потенциальные участки альтернативного сплайсинга, находятся внутри области, ограниченной праймерами.

Кроме того, на других парах праймеров нами были получены полноразмерные кДНК аннексинов А13.1 и А13.2, которым соответствовали мРНК с открытой рамкой считывания. В ходе дальнейшей работы полученная полноразмерная кДНК аннексина А13.2 была клонирована и экспрессирована в бактериальной системе.

Проведенное сравнение аминокислотных последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 показало высокую степень гомологии двух белков. Аминокислотные последовательности аннексинов А13.1 и А13.2 имеют характерную для аннексинов структуру: высокое сходство С-концевых участков и высокую вариабельность N-концевых последовательностей. Основные различия у двух аннексинов наблюдаются в N-концевых участках белков (рис. 9). Существование таких высоко гомологичных белков являться иллюстрацией широко распространенного у рыб явления дупликации генов. Такие различия, как V9-T9 и Y11-F11 могут быть связаны с теоретически предсказуемой возможностью разной посттрансляционной модификации аннексинов А13.1 и А13.2: треонин (T) и тирозин (Y), в отличие от валина (V) и фенилаланина (F), могут фосфорилироваться разными протеинкиназами.

В отличие от рыб, у млекопитающих имеется только один ген аннексина А13 и альтернативность посттрансляционной модификации может реализоваться за счет существования разных сплайс-форм белка.



Рис. 9. Сравнение N - концевых последовательностей аннексинов А13.1 и А13.2 данио. Красным цветом обозначены аминокислотные остатки, являющиеся потенциальными сайтами фосфорилирования.

Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2

Для экспрессии белка аннексина А13.2 в клетках E. сoli была получена конструкция на основе вектора pQE30.

Рекомбинантный белок А13.2 из лизата бактерий выделяли двумя способами: методом очистки на Ni-NTA агарозе согласно протоколу фирмы «Qiagen» и методом осаждения с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция. Второй метод использовался нами для выделения нативных белков аннексинов из ооцитов данио. Используя метод переосаждения с фосфолипидами, из лизата бактерий было выделено около 1 мг рекомбинантного белка А13.2.

Заключение

На основании полученных данных по влиянию ингибиторов протеаз на процесс спонтанной активации нами предложена следующая гипотеза, объясняющая механизм спонтанной активации яйца рыб. На поверхности яйца имеются протеазы, участвующие в процессе активации яйца, возможно, за счет расщепления рецепторов, активируемых протеазами. В полостной жидкости рыб, как и в крови и тканевой жидкости, имеются эндогенные ингибиторы протеаз. При разведении полостной жидкости в условиях, когда икра попадает в водную среду во время нереста, ингибиторы перестают действовать и икра активируется протеазами. Мы предполагаем, что лейпептин и апротинин предотвращают спонтанную активацию, выполняя ту же роль, что и эндогенные ингибиторы полостной жидкости, а именно ингибируют протеазы на поверхности яйца, которые могут гидролизовать активируемые протеазами рецепторы на поверхности яйца.

В ходе проведенных экспериментов нами было показано, что форболовые эфиры в концентрации 0,1-1 мкМ вызывают образование оболочки оплодотворения у яйцеклеток вьюна и данио. Заслуживает внимания тот факт, что для яйцеклеток рыб этот эффект был обнаружен впервые. Вопрос, в какой каскад реакций и на какой именно стадии включаются форболовые эфиры в ходе процесса активации, требует дальнейшего изучения. Активирующий яйцо эффект форболовых эфиров наблюдался нами на фоне действия ингибиторов протеаз, что указывает на предшествование активирующего действия протеаз этапу, на котором действуют форболовые эфиры.

Исследование кальцийсвязывающих белков, присутствующих в яйцеклетках рыб, представляет особый интерес для изучения процесса активации яйца, тесно связанного с кальциевой сигнализацией. Различные кальцийсвязывающие белки в последние несколько десятилетий активно изучаются у самых разных организмов. Большое внимание уделяется белкам группы аннексинов, поскольку их внутриклеточные функции до сих пор остаются неизвестны. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце как автономной клетке является первым необходимым шагом в изучении их функций. В ходе проведенной работы нами было установлено присутствие в ооцитах данио аннексинов А5, А13.1, А2а, А1а в виде запасенных белков, а также материнских мРНК аннексинов А3 и А13.2. Впервые в ооцитах данио с использованием метода масс-спектрометрии был идентифицирован белок копин Ш.

Результаты данного исследования являются оригинальными, вносят значительный вклад в изучение процесса активации яйцеклетки - одной из фундаментальных проблем биологии развития и клеточной биологии.

Выводы

1. Стабилизация актиновых микрофиламентов локально подавляет формирование оболочки оплодотворения и экзоцитоз кортикальных гранул в яйцеклетке вьюна при спонтанной активации.

2. Впервые показано участие форболовых эфиров, искусственных активаторов протеинкиназы С, в процессе образования оболочки оплодотворения яйца рыб.

3. Впервые показано, что ингибиторы протеаз лейпептин и апротинин подавляют процесс спонтанной активации яйцеклеток вьюна и данио, при этом сохраняя их способность к оплодотворению.

4. Искусственное повышение концентрации ионов кальция в яйце вьюна вызывает, а понижение подавляет образование оболочки оплодотворения.

5. В ооците данио впервые идентифицированы кальцийсвязывающие белки аннексины: А5, А13.1, А2а, А1а. Показано присутствие материнской мРНК аннексинов А13.1, А13.2 и А3.

6. Впервые в ооците данио обнаружен белок копин III, относящийся к семейству кальцийсвязывающих белков, содержащих С2-домен.

Публикации по теме диссертации

1 Ivanenkov V.V., Minin A.A. and Ozerova S.G. Phalloidin inhibits cortical granule exocytosis and ooplasmic segregation in loach eggs // Cell Differentiation and Development. 1990. V. 29. P. 21-36.

2. Минин А.А., Озерова С.Г., Хайдарова Н.В., Зарайский А.Г. Изучение белка группы аннексинов в раннем развитии рыб. II. Определение полной аминокислотной последовательности // Онтогенез. 2002. Т. 33. №4. С. 264-267.

3. Озерова С.Г., Минин А.А. Изучение белков группы аннексинов в раннем развитии рыб. IV. Идентификация кальцийсвязывающих белков в яйце данио с использованием масс-спектрометрии // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 3. С. 222-226.

4. Минин А.А., Озерова С.Г. Спонтанная активация яиц рыб предотвращается ингибиторами протеаз // Онтогенез. 2008. Т. 39. №5. С. 1-5.

Тезисы конференций

5. Озерова С.Г. Две изоформы аннексина А13 в яйце Brachydanio rerio // Онтогенез. 2005. Т. 36. №3. С. 236-237.

6. Озерова С.Г., Минин А.А. Изучение кальцийсвязывающих белков группы аннексинов у рыб: свойства и экспрессия в раннем развитии // Материалы конференции, посвященной 80-летию со дня рождения А.А. Нейфаха «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006).

Размещено на Allbest.ru