Куриный эмбрион как модель для изучения канцерогенеза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кубанский государственный медицинский университет

Куриный эмбрион как модель для изучения канцерогенеза

Лысов Е.Е., Минина Я.И., Певзнер Д.А., Лазарев В.В., Конев С.С., Погосян С.А., Трофименко А.И.

Применение куриных эмбрионов в качестве моделей для изучения физиологических и патологических процессов в организме человека имеет давнюю историю важных открытий и разработок. Несмотря на широкое применение ряда позвоночных и беспозвоночных животных в качестве объектов для экспериментов в современной науке, куриные эмбрионы по-прежнему занимают важное место в научной практике. Благодаря новым молекулярным и генетическим инструментам, применяемым на куриных эмбрионах, совершенствуется процесс изучения нормальных и патологических процессов. Развитая сосудистая сеть хориоаллантоисной мембраны и ее поверхностное расположение делают куриные эмбрионы удобной платформой для изучения таких тканевых процессов, как морфогенез, ангиогенез и метастазирование опухолей. Современные технологии визуализации позволяют проводить оценку этих процессов в режиме реального времени, точно описывать стадии этих явлений. Существующие экспериментальные методики по работе на куриных эмбрионах отрыли широкие возможности не только в изучении этиологии и патогенеза опухолевого роста, но и в разработке новых противоопухолевых препаратов. Таким образом, куриный эмбрион - уникальная модель, которая позволяет обойти многие ограничения при изучении канцерогенеза in vivo.

Механизмы, обеспечивающие выживаемость клеток и их подвижность в процессе эмбриогенеза, во многом совпадают с механизмами канцерогенеза и метастазирования. Определение генов и факторов транскрипции, регулирующих эпителиально-мезенхимальное перемещение, облегчило понимание механизмов гаструляции, миграции клеток нервного гребня и, в итоге, метастазирования [5]. Это доказывает возможность применения куриных эмбрионов в качестве моделей для исследований: как в области эмбриологии, так и онкологии. Куриный эмбрион - уникальная модель, которая позволяет обойти многие ограничения при изучении канцерогенеза in vivo. Доступность хориоаллантоисной мембраны, хорошо васкуляризованной экстарэмбриональной ткани, расположенной под скорлупой и толерантной к ксеротрансплантатам опухолевых клеток, делают ее удобным объектом для проведения экспериментальных исследований. Этим объясняется давняя история успешного применения хориоаллантоисной мембраны в качестве биологической платформы для изучения молекулярных механизмов опухолевого роста, включая метаплазию, вирусный канцерогенез, реакции на ксенотрансплантацию опухолевых клеток, ангиогенез и метастазирование [10]. Поскольку куриный эмбрион является иммунодефицитным, на хориоаллантоисной мембране хорошо приживаются как нормальные, так и опухолевые клетки [10]. Важно то, что на хориоаллантоисной мембране опухолевые клетки сохраняют основные свойства, в том числе способность к росту, инвазии, ангиогенезу и перестройке соседних структур. В связи с этим, данный объект является исключительно удобной моделью для изучения молекулярных механизмов опухолевого роста [1, 10]. эмбрион человек опухолевый клетка

Миграция опухолевых клеток и метастазирование

За последние годы особое внимание уделялось механизмам миграции опухолевых клеток и ее роли в метастазировании [9]. Хориоаллантоисная мембрана успешно адаптирована в качестве модели для количественного анализа ключевых этапов метастатического процесса с использованием видоспецифичных и количественных Alu-ПЦР для обнаружения диссеминированных опухолевых клеток человека во вторичных тканях [10]. Выявление диссеминированных клеток с помощью Alu-ПЦР делает возможным количественную оценку метастазирования в органы, колонизированные не менее, чем 25 клетками [9, 10, 12]. Такой подход был использован для демонстрации роли матриксных металлопротеиназ в ходе метастазирования и позволил количественно выявить среди опухолевых клеток их типы с различной способностью к метастазированию. Среди матриксных металлопротеиназ, идентифицированных в хориоаллантоисной мембране с культивируемой на ней тканью, куриная ММП-13 (кММП-13) была единственным ферментом, индукция и экспрессия которого кореллировала с началом ангиогенеза и формированием кровеносных сосудов. кДНК кММП-13 была клонирована и рекомбинантно экспрессирована. Белок кММП-13 был очищен, изучен in vitro, и испытан in situ на коллагене выращиваемой ткани. ММП-13-позитивные клетки появляются в хориоаллантоисной мембране вскоре после стимуляции ангиогенами культивируемой ткани. Морфологически, клетки содержащие кММП-13, представляют из себя гемопоэтические клетки моноцитарного/макрофагального ряда. In vitro, кММП-13-проэнзим быстро и эффективно активировался каскадом урокиназный активатор плазминогена - плазминоген - плазмин с образованием коллагеназы, способной расщеплять нормальный, но не мутантный коллагеназо-резистентный коллаген. Нанограммы очищенного кММП-13 вызывали в клеточных культурах на хориоаллантоисной мембране ангиогенез сопоставимый с вызванным сосудистыми факторами роста. Это свойство кММП-13 эффективно блокируется селективными ингибиторами протеаз, что говорит о том, что кММП-13 in vivo играет определенную роль в качестве фактора ангиогенеза.

Zijlstra и соавт. разработали высокочувствительный метод мониторинга метастатической диссеминации опухолевых клеток в курином эмбрионе, который далее был использован для сравнительной оценки этапов метастатического каскада двух злокачественных клеточных линий, HEp3 и HT1080. При помощи alu-ПЦР было выявлено, что спонтанное метастазирование линии HEp3 происходит с высокой скоростью и эффективностью. За 7 дней число злокачественных клеток в опухоли составляет 1-2x104/легкое. Напротив, скорость метастазирования линии HT1080 в 50-100 раз ниже, и через неделю количество клеток находится в диапазоне 200-400/легкое. При этом, сравнение процесса образования метастазов этими клеточными линиями позволяет объяснить более медленное метастазирование HT1080 двумя отчетливыми факторами: в 8-10 более низкий уровень интравазациии в этой линии и более позднее начало роста во вторичном органе [10].

Также эта стратегия использовалась для определения роли в метастазировании скаффолд-белка CD151, регулирующего подвижность опухолевых клеток [12]. Для изучения последствий нарушения подвижности опухолевых клеток разработан ряд новых методик с использованием эмбрионов птиц [4, 6, 12]. Микроскопическая оценка опухолевых клеток в хориоаллантоисной мембране показала наличие чрезвычайно динамичной клеточной среды, в которой опухолевые клетки активно продвигались через опухолевую ткань и прилегающую строму [12]. При изучении картины иммобилизации, вызванной ингибитором метастазирования - антителами к CD151 - было выявлено, что клетки стали неспособны к отсоединению от первичной опухоли, что лишало их способности к передвижению, интравазации и метастазированию [12]. Визуализация in vivo также выявила значительное влияние внеопухолевых сосудистых и стромальных клеток куриных эмбрионов на миграцию клеток опухоли [7].

Исследование роли гемодинамики и ангиогенеза при опухолевом росте

Сосудистое снабжение нормальных тканей или новообразований необходимо для их выживания, и потому куриные эмбрионы сыграли немалую роль в ранних описаниях кровеносной системы позвоночных сделанным Уильямом Гарвеем и Марчелло Мальпиги. Сосуды развивающегося цыпленка и экстраэмбриональные оболочки легко определяемы, а поверхностное расположение делает их удобными для наблюдения и проведения манипуляций. Изучение in ovo ангиогенеза, вызванного опухолевым ростом, началось в 20 веке на хориоаллантоисной мембране, и на ранних этапах визуализация продолжала осуществляться в яйце. С современными неинвазивными, in vivo моделями [12] на куриных эмбрионах возможен мониторинг процессов неоваскуляризации in vivo. Особый класс вирусных наночастиц позволяет визуализировать образовавшиеся сосуды в растущей опухоли и проводить мониторинг целенаправленной доставки веществ в опухоль на хориоаллантоисной мембране [4]. Этот подход к всесторонней оценке неоплазии становится стандартом для изучения как молекулярных процессов, лежащих в основе опухолей, так и возможных методов лечения [2].

Когда развивающийся эмбрион извлекается из яйца и выращивается exovo, хориоаллантоисная мембрана оказывается растянутой на поверхности белка и желтка, открывая доступ к своей сосудистой сети, благодаря чему она становится удобной платформой для проведения длительных экспериментов [7]. Чрезвычайно удобный доступ к сосудам был оценен многими экспериментаторами. Работы, проведенные на хориоаллантоисной мембране, выявили потребность опухоли в неоваскуляризации и продемонстрировали, что ингибиторы ангиогенеза способны блокировать ее рост. На данной модели были открыты ингибиторы ангиогенеза грибкового происхождения, а также показано, что эндостатин, выделяемый во время протеолитической реорганизации внеклеточного матрикса, является фактором, угнетающим сосудистый рост [8]. Известно, что для стимуляции ангиогенеза опухоли активируют продукцию ряда ангиогенных факторов, включая факторы роста фибробластов (aFGF and bFGF), а также сосудистого эндотелального фактора роста (VEGF). Однако, многие злокачественные опухоли также выделяют ингибиторы ангиогенеза, в том числе ангиостатин и тромбоспондин. Отсюда понятно, что ангиогенный фенотип - это результат дисбаланса между положительными и отрицательными регуляторами ангиогенеза [8].

Были выявлены гемопоэтические клетки, выделяющие матриксные металлопротеиназы MMP9 и MMP13, необходимые для реорганизации матрикса во время ангиогенеза [11].

Современные технологические достижения в области систем визуализации позволили наблюдать за ходом васкуляризации хориоаллантоисной мембраны и четко выделить стадии ангиогенеза [6, 7]. Новые контрастные препараты являются селективными в отношении развивающихся сосудов, что позволяет увидеть специфические структуры на микроскопическом уровне [6, 7]. Поскольку опухоли хорошо растут на поверхности хориоаллантоисной мембраны и индуцируют рост ее сосудов, это удобная модель для визуализации кровотока in vivo в режиме реального времени. Высокое разрешение при этом позволяет выявить ток жидкости и динамику распространения молекул в новообразовании [4]. Lewis и др. разработали методику, суть которой заключается в использовании вирусных наночастиц в качестве платформы для наблюдения ангиогенеза в хориаллантоисной мембране. Биодоступный вирус мозаики коровьего гороха, меченый флуоресцентным красителем, позволяет получить яркие наночастицы со способностью дисперсии in vivo, благодаря чему возможна визуализация эндотелия в период не ранее 72 часов. При этом глубина расположения сосудов, доступных исследователю при использовании данного метода, составляет до 500 мкм [7]. Наблюдение за тем, как наночастицы проходят через сосуды, питающие опухоль, позволяет прогнозировать, каким образом вводимые в сосудистое русло препараты будут распределяться в опухоли и окружающих тканях. Технология создания микроскопических слепков также позволяет осуществлять контроль за неоваскуляризацией. Визуализация динамики образования сосудов опухоли на хориоаллантоисной мемране - более быстрый, простой и дешевый способ в сравнении с использованием в качестве объекта исследования млекопитающих, что оправдывает возможность их использования для скрининга лекарств и разработки средств их селективной доставки. Последние, будучи связанными с терапевтическими препаратами, делают их более специфичными в отношении опухолевых клеток [1, 2, 12]. Bobek и др. было изучено влияние комбинации стрептокиназы и гемцитабина на метастазирование карциномы Льюиса. Клетки опухоли, стабильно экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), были добавлены в куриные эмбрионы на 12 сутки периода инкубации. Через 7 дней с помощью флуоресценции метастазы карциномы Льюиса были обнаружены в головном мозге развивающегося эмбриона, сердце и грудине, с наибольшим их количеством в мозге. Аналогичный опыт провели с одновременным добавлением стрептокиназы и гемцитабина по отдельности и в комбинации. Комбинация гемцитабин-стрептокиназа угнетала метастазирование во все указанные органы [1].

Куриный эмбрион как модель для исследования меланомы

Первичная кожная меланома непосредственно не является причиной летального исходу, поскольку основные поражения внутренних органов и смерть, обусловлены ее метастазами. Поскольку изучение клеток меланомы in vitro в двухмерных (плоских) культурах зачастую недостаточно точно воспроизводит реальную картину опухолевого процесса, более информативны трехмерные модели, точнее моделирующие изменения в организме, происходящие во время запуска и прогрессирования неопластической трансформации [3]. Для создания трехмерной модели изучения механизмов миграции и инвазии клеток меланомы in vitro возможно использование куриных эмбрионов. После трансплантации клеток меланомы, происходящих из нервного гребня, в нервную трубку, клетки продолжают миграцию в медиальном и латеральном направлениях и, в итоге, подвергаются апоптозу в определенных зонах. При встраивании в эктопические зоны, такие, как область ромбовидного мозга или ямки диска зрительного нерва, происходит злокачественная инвазия опухолевых клеток и тканевая деструкция. В противоположность данному явлению, меланоциты не способны к спонтанному продолжению миграции клеток нервного гребня. Злокачественная инвазия меланоцитов может быть индуцирована предварительной обработкой трансформирующим ростовым фактором бета из семейства bmp-2 [3]. Трансплантация клеток рака молочной железы MCF7 имеет иной образец роста в ромбовидном мозге, нежели клетки меланомы. Модель культивирования клеток меланомы на курином эмбрионе является легко осуществимой, бюджетной платформой для изучения особенностей инвазии опухолевых клеток в эмбриональных тканях. Это может быть полезно для исследования инвазивных свойств клеток, индуцированных эмбриональными онкогенами, а также для разработки методик воздействия на опухолевые клетки с целью устранения их инвазивных свойств.

Література

1. Bobek V. Development of a green fluorescent protein metastatic-cancer chick-embryo drug-screen model // Clinical & experimental metastasis. - 2004. - V. 21. - №. 4. - P. 347-352.

2. Botkjaer K. A. Targeting tumor cell invasion and dissemination in vivo by an aptamer that inhibits urokinase-type plasminogen activator through a novel multifunctional mechanism // Molecular Cancer Research. - 2012. - V. 10. - №. 12. - P. 1532-1543.

3. Busch C. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion //PloS one. - 2013. - V. 8. - №. 1. - P. e53970. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053970

4. Cho C. F. Evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging // Journal of visualized experiments: JoVE. - 2011. - №. 52. doi:10.3791/2808

5. Delile J. A cell-based computational model of early embryogenesis coupling mechanical behaviour and gene regulation // Nature communications. - 2017. - V. 8. - P. 13929. doi:10.1038/ncomms13929

6. Leong H. S. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles // Nature protocols. - 2010. - V. 5. - №. 8. - P. 1406. doi:10.1038/nprot.2010.103

7. Lewis J. D. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging // Nature medicine. - 2006. - V. 12. - №. 3. - P. 354. doi:10.1038/nm1368

8. O'Reilly M. S. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth // Cell. - 1997. - V. 88. - №. 2. - P. 277-285.

9. Palmer T. D. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model // Journal of visualized experiments: JoVE. - 2011. - №. 51. doi:10.3791/2815

10. Zijlstra A. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction // Cancer research. - 2002. - V. 62. - №. 23. - P. 7083-7092.

11. Zijlstra A. Collagenolysis-dependent angiogenesis mediated by matrix metalloproteinase-13 (collagenase-3) // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - V. 279. - №. 26. - P. 27633-27645.

12. Zijlstra A. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151 // Cancer cell. - 2008. - V. 13. - №. 3. - P. 221-234.

Размещено на Allbest.ru