Прижизненные исследования механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Прижизненные исследования механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кокурина Татьяна Николаевна

Санкт-Петербург 2013

Работа выполнена в лаборатории функциональной морфологии и физиологии нейрона Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор заслуженный деятель науки РФ Сотников Олег Семенович

Официальные оппоненты:

Чалисова Наталья Иосифовна, доктор биологический наук, профессор, ведущий научный сотрудник группы пептидной регуляции старения Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Данилов Ревхать Константинович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии (с курсом эмбриологии) Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится «30» сентября 2013 года в 11.00 часов на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Автореферат разослан «___» __________ 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук Н.Э. Ордян

миелиновый нервный глиальный реактивный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Миелиновое нервное волокно - это уникальный симбиоз отростка нейрона и глиальной клетки, характеризующийся сложными структурными и функциональными взаимодействиями. Современная литература пополняется всё новыми фактами о видах нейроно-глиальных взаимоотношений в различных отделах нервной системы. Но до сих пор периферическое миелиновое волокно и присущие ему формы коммуникации остаются не до конца изученными.

Одним из видов взаимодействия аксона и шванновской клетки является реактивная перестройка миелинового нервного волокна, которая представляет собой третью промежуточную форму состояния нервного волокна между его нормальным состоянием и дегенерацией. Реактивные изменения миелинового волокна однотипны при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды и при различных заболеваниях периферической нервной системы (Hildebrand, Johansson, 1991; Doppler, Werner, Henneges et al., 2012). Следовательно, подробное изучение механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна является актуальной проблемой.

Поскольку предыдущими исследователями (Robertson, 1958,б; Trapp, Kidd, 2004; Scherer, Arroyo, Peles, 2004) основное внимание уделялось строению миелинового волокна в статике, до сих пор остается под вопросом, каким образом в динамике при реактивной перестройке связаны между собой структурные изменения аксона и шванновской клетки, какую роль они играют в обеспечении неэлектрической функции проводника. Дополнительные исследования требуются для понимания, за счёт каких процессов происходят эти структурные изменения миелинового нервного волокна. Этим мало изученным проблемам посвящена данная диссертационная работа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось функциональное исследование механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна и выяснение взаимоотношения осевого цилиндра с миелиновыми структурами глиальной клетки при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить процесс реактивной структурной кинетики живого миелинового нервного волокна в растворе Рингера.

2. Исследовать взаимозависимость перестройки аксона и миелиновых структур шванновской клетки при изменении тоничности внешней среды.

3. Изучить нейроно-глиальные взаимоотношения структур волокна при его механическом повреждении.

4. Электронно-микроскопически определить плотность распределения цитоскелетных белковых структур реактивно изменённой аксоплазмы.

5. Исследовать процесс передачи жидкой фракции аксоплазмы между аксоном и глией при реактивной перестройке в водных и безводных средах.

6. Определить возможность регуляции интенсивности реактивной перестройки путём изменения осмотического давления аксоплазмы.

Научная новизна исследования. Проведённые исследования впервые на живых миелиновых волокнах выявили комплекс ранних, обратимых, реактивных изменений структурных компонентов волокна и продемонстрировали их взаимозависимость. Впервые представлена полная кинетика функционального значимого процесса обратимых изменений волокна. В работе подробно изучены неизвестные ранее процессы, приводящие к изменению структуры миелиновых насечек, а также выявлены и подробно рассмотрены причины, так называемой, "ретракции миелина" в области перехвата Ранвье. Доказано, что функционально значимая варикозная деформация аксона зависит не от набухания, а от его множественного локального сужения при неизменности диаметра волокна. Путём морфометрических исследований впервые показано, что увеличение объёма насечек Шмидта-Лантермана, набухание перехватов Ранвье и перикарионов шванновской клетки связано с транслокацией водной фракции аксоплазмы в структуры миелиновой оболочки. Таким образом, продемонстрирован новый тип функциональных глио-нейрональных взаимоотношений.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение диссертации состоит, прежде всего, в том, что в работе впервые на живых нервных волокнах рассматриваются новые функциональные механизмы нейроно-глиального взаимодействия. Продемонстрирован взаимосвязанный комплекс всех элементов миелинового волокна, зависимость структурной перестройки сателлитной шванновской клетки от геометрических, пространственных изменений аксона. Впервые выявлен механизм реактивной перестройки, который заключается в транслокации водной фракции аксоплазмы в глиоплазму шванновской клетки, причём показано, что этот процесс протекает и при полном отсутствии внешней воды, в безводных средах. Изменение геометрических параметров миелинового волокна при обратимой реактивной перестройке также имеет большое значение для понимания его электрофизиологических процессов (Bradley, Jaros, Jenkison 1977; Shrager, Chiu, Ritchie et al., 1987).

Работа имеет большое практическое значение поскольку, изучение выявленных новых механизмов глио-нейрональных взаимоотношений в нервной системе определяет направление фармакологического поиска средств терапевтического вмешательства. Практически важным представляются результаты опытов, которые демонстрируют, что развитие реактивных изменений миелиновых волокон, а, следовательно, начальный этап их патологии можно затормозить при увеличении осмотического давления коллоида аксоплазмы за счёт деполимеризации его цитоскелета. Структурная диагностика реактивных изменений биопсийного материала может помочь уточнить прогноз и диагноз ряда заболеваний.

Положения, выносимые на защиту.

1. В периферическом миелиновом нервном волокне существует такой тип взаимодействия между аксоном и шванновской клеткой как ранняя, обратимая, неспецифическая реактивная перестройка.

2. Структурные изменения затрагивают все компоненты миелинового нервного волокна и обеспечиваются транслокацией водной фракции из аксона в цитоплазму шванновской клетки.

3. Частично ингибировать реактивную перестройку миелинового волокна возможно с помощью увеличения осмотического давления коллоида аксоплазмы при диссоциации основных цитоскелетных белков.

Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на: 1. Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию академика В.Н. Черниговского, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург - Колтуши, 2007); 2. VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); 3. Научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2008); 4. Конференции молодых учёных, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург - Колтуши, 2010); 5. II Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); 6. VIII Международном междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2012); 7. VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные статьи в журналах из списка ВАК, 1 статья в академическом сборнике и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав с изложением экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 217 страниц. Из них- 82 рисунка, 8 схем и 2 таблицы. Список литературы включает 371 источник: 34 отечественных и 337 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на живых периферических нервных волокнах седалищного нерва лягушки Rana temporaria.

Методика выделения интактных и механически повреждённых волокон. Выделяли седалищный нерв лягушки с фрагментом пояснично-крестцового отдела позвоночника. Для разрушения плотной эпиневральной соединительнотканной оболочки препарат переносили на 40 мин при температуре 21-23^оС в 0,4 % раствор проназы (Serva), приготовленный на основе раствора Рингера для лягушек. Затем нерв с фрагментом позвоночника отмывали от протеолитического фермента в физиологическом растворе и помещали на тонкое предметное стекло в каплю раствора Рингера. Двумя острыми электролитически заточенными иглами надрывали эпиневральную оболочку нерва и постепенно снимали её с дистального конца. Далее расправляли полученный препарат, сверху накладывали одиночные волокна стекловаты для его фиксации и накрывали препарат покровным стеклом. Волокна исследовались в двух типах импровизированных микрокамер: проточной микрокамере, когда необходима была смена окружающей среды препарата, и запечатанной микрокамере, когда требовалось не допустить подсыхание препарата и исключить малейшие колебания волокна. Механически повреждённые нервные волокна получали при расщеплении нерва. Наблюдение за препаратом осуществлялось в течение 2-6 часов с помощью компьютерной автоматизированной микровидеоустановки, созданной на базе инвертированного фазовоконтрастного микроскопа БИОМЕД-3И ФК (Россия). Производилась цейтраферная видеосъемка - 1 кадр каждые 10 минут. Из полученных изображений с помощью программы Adobe After Affects 7.0 монтировались фильмы процесса возникновения и развития реактивной перестройки живого миелинового волокна.

Методика исследования одиночных нервных волокон при воздействии растворов разной тоничности. Одиночные живые нервные волокна исследовались в проточной микрокамере. С одной стороны от камеры на отрезок фильтровальной бумаги наносили гипотонический раствор, с другой стороны ? помещали новый отрезок фильтровальной бумаги. Процедуру периодически повторяли, чтобы не допустить подсыхание препарата. Гипотонические растворы готовились на основе раствора Рингера для лягушки, разбавленного в 2, 3, 4 раза (что соответствовало 50 %, 33 %, 25 % содержанию солей в растворе).

Методика исследования нервных волокон в безводных средах. Расщеплённый нерв вначале осторожно обезвоживали на фильтровальной бумаге, затем его помещали на предметное стекло в безводную среду вазелинового масла или перфтордекалина. Затем с помощью двух препаровальных игл расправляли нервные волокна. Сверху помещали волокна стекловаты, медленно накрывали покровным стеклом, придерживая его иглой, и запаивали микрокамеру вазелином Перфтордекалин ? жидкое химически инертное вещество, которое является одним из компонентов заменителя крови и обладает способностью к оксигенации тканей и противовоспалительными свойствами (Борисова, Штрыголь, 2004; Усенко, Панченко, Царев и др., 2004; Кузнецова, 2007).

Методика электронно-микроскопических исследований. Расщеплённый нерв фиксировали в течение 1-го часа охлажденным 2,5 % раствором глютарового альдегида на основе 0,1 М какодилатного буфера с рН 7,2-7,4. В последующем проводили дофиксацию 1 % охлажденным раствором четырехокиси осмия (OsO₄) в течение 1 часа. Далее осуществляли дегидратацию спиртами и заливку материала общепринятым методом для электронно-микроскопических исследований. Фиксированный материал резали на ультратоме LKB-5 (Швеция) и просматривали под фазовоконтрастным микроскопом. Ультратонкие срезы изучали под электронным микроскопом JEM100B (Япония). Негативы сканировали в просвечивающем режиме с помощью сканера HP SсanJet G4050 (Китай). Позитивные изображения подвергали морфологическому анализу.

Количественный анализ материала. Прижизненный светооптический материал. У живых миелиновых волокон после механической травмы с помощью программы ImageJ измеряли диаметр волокна и осевого цилиндра вне зоны и в зоне набухших миелиновых насечек Шмидта-Лантермана. Также измеряли диаметр волокна и осевого цилиндра в области миелиновых насечек до и после воздействия гипотонического раствора. Электронно-микроскопический материал. Необходимые измерения параметров живого нервного волокна проводились с помощью программ Slice и ImageJ. Программа Slice, написанная для данных исследований, позволяет определить плотность распределения цитоскелетных структур в аксоне. Плотность расположения структур цитоскелета определялась в аксоне следующим образом: на изображение наносилась прямая линия, автоматически отображался график распределения оптической плотности вдоль этой линии, вычислялись и отображались на графиках локальные максимумы оптической плотности. Отображение локальных максимумов выполнялось с учетом задаваемых значений фонового порога оптической плотности и "ширины полосы", представляющей собой разность между соседними значениями локальных максимума и минимума. Плотность распределения локальных максимумов вычислялась как количество локальных максимумов на единицу длины линии, что соответствовало плотности распределения структур цитоскелета аксона вдоль наносимой линии. На электронно-микроскопических снимках с помощью программы ImageJ измеряли длину микротрубочек осевого цилиндра до и после воздействия колхицина. Полученные данные статистически обрабатывались.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При исследовании длительного переживания интактных нервных волокон удалось выявить, что реактивная перестройка ? это комплекс структурных изменений осевого цилиндра, насечек Шмидта-Лантермана, перехватов Ранвье и перикариона шванновской клетки. В зоне осевого цилиндра она заключалась в его варикозной деформации. В области миелиновых насечек структурная перестройка проявлялась в их набухании, расслоении компактного миелина на крупные комплексы ламелл и одновременном сужении осевого цилиндра в этой зоне (рис.1).

Для структурных изменений перехвата Ранвье также было характерно расслоение миелина паранодиума и кажущееся расширение межсегментарной щели. Реактивная перестройка перикариона шванновской клетки заключалась в его набухании и вдавливании в осевой цилиндр. Диаметр локально суженного осевого цилиндра под набухшими насечками, перехватами, перикарионами шванновских клеток было примерно одинаковым, равным около 1/3 его исходного диаметра, и соответствовало размеру плотного "кончика" в области ампутации волокна. Эти участки осевого цилиндра, по-видимому, представляли собой участки плотного аксиального тяжа, где филаментозно-тубулярные агрегаты цитоскелета формируют плотные пучки.

Таким образом, исследования переживающих нервных волокон демонстрируют, что реактивные изменения всех его компонентов взаимозависимы.

Рис. 1. Динамика развития реактивной перестройки миелиновой насечки в виде её набухания и расслоения компактного миелина при переживании волокна. 1 ? неизменённая миелиновая насечка; 2 ? набухшая миелиновая насечка; 3 ? расслоение компактного миелина; 4 ? сужение осевого цилиндра. Эффект Emboss. Прижизненная микрокиносъёмка. Фазовый контраст. Об. 40Ph, ок. 17.

При набухании миелиновых структур значительных изменений наружного диаметра волокна не было заметно, а осевой цилиндр местами уменьшался, поэтому можно предположить, что набухание миелиновых структур происходило за счёт аксоплазмы. Чтобы проверить это предположение, а также рассмотреть возможность обратимости процесса реактивной перестройки и неспецифичность данных структурных изменений, исследовали влияние на нервное волокно гипотонических растворов.

Морфометрические исследования диаметров наружного контура волокна в зоне миелиновых насечек до и после воздействия гипотонического раствора показали, что волокно практически не набухало. При этом в той же области наблюдалось существенное уменьшение (на 29 %) диаметра осевого цилиндра. Было продемонстрировано, что теоретически возможное количество воды, полученное волокном из внешней среды в 5,3 раза меньше, чем возросший объём миелиновой насечки. Следовательно, возможно, набухание миелиновых насечек при реактивной перестройке волокна происходило не за счёт воды внешней среды, а за счёт аксоплазмы.

С помощью замены среды вновь на изотоническую было продемонстрировано восстановление реактивно изменённого волокна до исходного состояния (рис. 2). В результате опытов с гипотоническим раствором было выявлено, что развивается точно такой же комплекс реактивных изменений, как и при переживании волокна.

В опытах было также показано, что при механическом воздействии все отмеченные реактивные изменения волокна оказались принципиально такими же и как при переживании волокна в изотонической среде, и при воздействии гипотонии, то есть подтверждается свойство неспецифичности ранней структурной реакции.

Причину набухания насечек при механической травме мы выявляли путём сопоставления наружного диаметра волокна и осевого цилиндра в области набухшей насечки с наружным диаметром волокна и осевого цилиндра в стороне от насечки. Таким образом, мы определяли, произошло ли набухание за счёт воды внешней среды или за счёт воды собственного осевого цилиндра.

Как показали морфометрические исследования наружные диаметр волокна вне и в области набухших миелиновых насечек не изменился при их реактивной перестройке, но при этом резко уменьшился (на 59,5 %) диаметр осевого цилиндра. Следовательно, есть все основания утверждать, что при механической травме набухание насечек Шмидта-Лантермана происходило путём транслокации воды из осевого цилиндра. Так как набухание насечек развивалось параллельно с набуханием паранодиума и перикариона, то можно считать, что все объёмные перестройки нервного волокна происходили в результате внутренней передачи водной фракции аксоплазмы.

Рис. 2. Реактивные изменения и восстановление различных участков одного и того же интернодального сегмента миелинового волокна после воздействия гипотонической среды. а-г - динамика процесса;a - исходное состояние двух сегментов одного миелинового волокна (1 - неизменённые насечки); б - набухание насечек (2) и локальное сужение осевого цилиндра (3); в, г - восстановление структур нервного волокна в изотоническом растворе. Прижизненная микрокиносъёмка. Фазовый контраст. Об. 40Ph, ок. 16.

Так как локально суженный при реактивной перестройке аксон представляет собой плотную структуру, которая имеет одинаковые размеры в области конуса нормального перехвата, изменённого паранодиума, между набухшими насечками и набухшего перикариона, а также в зоне ампутации волокна, можно было предположить, что речь идёт о появлении участков относительно твёрдой белковой фракции аксоплазмы, скорее всего агрегатов микротрубочек и микрофиламентов. Это проверялось с помощью электронно-микроскопической методики, при измерении плотности распределения (концентрации) этих структур в различных зонах осевого цилиндра.

С помощью электронно-микроскопических исследований было показано, что после механической травмы в зонах реактивно измененных насечек, перехватов и перикарионов плотность распределения цитоскелетных структур аксоплазмы оказалась в среднем на 62 % больше, чем эта плотность вне изменённых структур миелина (рис. 3).

При этом она была тем больше, чем значительнее степень реактивных изменений. Такая же особенность локального увеличения плотности филаментозно-тубулярных структур наблюдалась при реактивной перестройке безмиелиновых нервных волокон, связанных с образованием варикозностей осевого цилиндра. Связывающая варикозность суженная часть аксонов характеризовалась резким увеличением (в 2 раза) концентрации микротрубочек и других филаментов.

Таким образом, увеличение плотности распределения цитоскелетных структур аксона в области миелиновых структур соответствовало увеличению их концентрации и уменьшению жидкой фракции аксоплазмы.

плотность распределения цитоскелетных структур в области неизменённой насечки = 0,056

Рис. 3. Увеличение плотности распределения цитоскелетных структур пропорционально степени реактивных изменений миелиновых насечек. а, в, д ? электронно-микроскопический снимок б, г, е ? график профиля плотности распределения цитоскелетных структур; ось ординат ? величина оптической плотности, отн. ед./пикс.; ось абсцисс ? длина профиля оптической плотности, пикс.; 1 ? миелиновая насечка; 2 ? агрегация цитоскелетных структур в области суженного осевого цилиндра. Электронная микроскопия. Ув. 24000, 14000, 14000.

Для того чтобы окончательно проверить нашу гипотезу о набухании одной клетки за счёт цитоплазмы другой (глиоплазмы за счёт аксоплазмы) казалось целесообразным проведение экспериментов, в которых бы полностью отсутствовала внешняя вода. Эти эксперименты были осуществлены с помощью жидких химически инертных безводных сред (вазелинового масла и перфтордекалина).

Наблюдаемые изменения нервного волокна в безводной среде вазелинового масла принципиально не отличались от изменений, происходивших в изотоническом растворе. Миелиновые насечки, несмотря на отсутствие внешней воды, с течением времени набухали и вдавливались в осевой цилиндр.

В области перехватов контур миелиновой оболочки терял контрастность, и создавалось впечатление расширения межсегментарной щели. Перикарион шванновский клетки набухал, ядро становилось четко очерченным, осевой цилиндр в этих областях локально сужался.

Далее этот процесс глио-нейронального обмена проверялся в безводной среде перфтордекалина, которая в отличие от вазелинового масла обогащена кислородом. Перфтордекалин - жидкое химически инертное вещество, которое нерастворимо в воде (Malchiodi-Albedi, Perilli, Formisano et al., 1998; Кузнецова, 2007). В его среде развивались реактивные изменения всех структур миелинового волокна также, как это происходило в водном растворе Рингера (рис. 4).

Таким образом, полученные данные демонстрируют, что реактивная перестройка живого миелинового волокна может развиваться при полном отсутствии наружной воды. Следовательно, набухание миелиновых структур происходит за счёт перераспределения жидкой фракции из аксона в шванновскую клетку. Её механизм по-видимому заключается в следующем. При травме волокна возникают конформационные изменения белков аксоплазмы с их агрегацией. Это прослеживается на электронно-микроскопических снимках в виде объединения цитоскелетных структур в пучки и тяжи под набухшими насечками, перехватами и перикарионами. В результате процесса начальной денатурации белков закономерно образуется слабосвязанная вода и уменьшается осмотическое давление аксоплазмы. Под влиянием возникшего градиента осмотического давления между аксо- и глиоплазмой она перемещается в глиальные структуры миелина.

В связи с этим возникает предположение о том, что степень выраженности реактивной перестройки изменяется при колебании осмотического давления аксоплазмы, и по-видимому можно увеличить осмотическое давление в аксоне путём диссоциации и фрагментации макромолекулярных цитоскелетных структур осевого цилиндра.

Рис.4. Набухание перикариона шванновской клетки и миелиновых насечек живого миелинового волокна в безводной среде перфтордекалина.

1 ? перикарион шванновской клетки; 2 ? миелиновые насечки; 3 ? формирующаяся варикозность осевого цилиндра. Прижизненная микроскопия. Фазовый контраст. Об. 40Ph, ок. 17.

Для этого мы использовали специфические белки колхицин и цитохалазин В. Можно было ожидать, что таким образом удастся уменьшить градиент осмотического давления и замедлить транслокацию воды из аксоплазмы в миелиновые структуры волокна и тем самым уменьшить степень реактивных изменений.

В электронно-микроскопических исследованиях влияние колхицина на микротрубочки проявлялись прежде всего тем, что на ультратонких срезах выявилось укорочение микротрубочек (рис. 5), что видимо было связано с их диссоциацией и фрагментацией.

Для того, чтобы выявить влияние изменённого коллоидного состояния аксоплазмы, мы сопоставили степень реактивных изменений расщеплённых волокон до и после действия ингибиторов цитоскелета.

По сравнению с контролем под действием раствора колхицина отмечалось увеличение числа неизменённых насечек на 30,1 %, а волокна с сильно повреждёнными насечками полностью отсутствовали. Количество сохранившихся, неповреждённых перехватов Ранвье оказалось на 23,5 % больше, чем в контроле, а значительно повреждённых перехватов на 23 % меньше, чем в контроле. Таким образом, колхицин путём диссоциации микротрубочек действительно способен отчётливо регулировать степень реактивных изменений и, следовательно, влиять на интенсивность неспецифического повреждения миелинового волокна.

Рис. 5. Фрагменты укороченных микротрубочек при воздействии колхицина 1 - микротрубочки; 2 - нейрофиламенты; 3 - эндоплазматический ретикулум. Электронная микроскопия. Ув. 48000.

После воздействия цитохалазина В, диссоциирующего микрофиламенты, число нормальных насечек по сравнению с контролем выросло только на 6 %, слабо изменённых насечек уменьшилось на 5 %, а волокна с сильно изменёнными насечками не встретились. Количество неповреждённых перехватов Ранвье по сравнению с контролем уменьшилось на 5,9 %, слабо изменённых увеличилось на 5,7 %, а число значительно повреждённых перехватов осталось таким же. Таким образом, цитохалазин В, по-видимому, оказал очень слабое воздействие на осмотическое давление коллоида аксоплазмы и реактивную перестройку миелиновых волокон.

Тем не менее, приведённые данные свидетельствуют о том, что механизм реактивной перестройки, и, следовательно, ранних патологических изменений, действительно зависит от осмотического водообмена между аксоном и шванновской глией и может целенаправленно регулироваться изменением осмотического давления в аксоплазме волокна.

На основании наших прижизненных экспериментов при формировании реактивной перестройки миелинового волокна выявлена принципиально новая форма нейроно-глиальных взаимоотношений. В отличие от других видов взаимодействий, описанных прежними исследованиями (Brunetti, Di Giamberardino, Porcellati et al., 1981; Николлс, Мартин, Валлас и др., 2008; Bay, Butt, 2012). В проведённой работе были чётко отдифференцированы основные структурные компоненты миелинового волокна (насечки Шмидта-Лантермана, перехват Ранвье, перикарион шванновской клетки и осевой цилиндр) и продемонстрировано, что все структуры миелинового волокна изменяются одновременно и оказывают взаимное влияние друг на друга. На одиночных живых миелиновых волокнах удается выявить, что при их переживании происходит сходные процессы расслоения ламелл миелина в паранодальной области волокна и в насечках Шмидта-Лантермана. Набухающая цитоплазма в насечках и перехватах отражает общий процесс перестройки всей шванновской клетки. Эта возможность была подтверждена нашими опытами, показавшими, что при переживании, действительно, набухание паранодиума и насечек всегда сопровождается и обводнением перикариона.

Таким образом, единые комплексные изменения представляют собой естественную, филогенетически закрепленную, реакцию нервного волокна на разрыв аксона. В связи с этим можно было ожидать неспецифическое проявление этой же реакции и при других видах внешнего воздействия. Использованные нами в экспериментах такие факторы как воздействие гипотонической среды и механическое повреждение действительно подтверждают свойство неспецифичности реактивных изменений волокна.

Поскольку в процессе реактивных изменений отмечены объемные осмотические изменения структур: набухание насечек, перехватов, перикариона, было решено исследовать влияние на нервные волокна гипоосмотической внешней среды. Колебания тоничности (ионной силы морской воды), как известно, является одним из древнейших факторов внешней среды, с которой встречались первые клеточные формы жизни. Многие изменения объема живых клеток считаются осмотически зависимыми процессами (Хочачка, Сомеро, 1977; Шмидт-Ниельсен, 1982).

Исследования показали, что структурные изменения в гипотонической среде могут возникать рано и развиваться достаточно быстро. Удалось продемонстрировать свойство обратимости реактивной перестройки и восстановления волокна до исходного состояния с помощью замены среды вновь на изотоническую.

Можно было полагать, что миелиновые структуры набухают, как и другие свободные клетки, за счет воды внешней среды в результате возможного аутолиза веществ цитоплазмы. Однако обращает на себя внимание тот факт, что внешние контуры нервного волокна в наших экспериментах длительное время не набухают в гипотонических 30% - 50% растворах. Это свидетельствует о том, что они, так же, как и другие живые клетки не подчиняются закону Вант-Гофа, не набухают пропорционально воздействию, как это происходит с неживыми тканями. То есть они имеют собственные внутриклеточные компенсаторные механизмы. Поэтому обводнение глиоплазмы в данном случае может рассматриваться как приспособительный, внутренний компенсаторный процесс.

На геометрической модели изменённого волокна количественно было показано, что объём обводнённой фракции аксоплазмы, который переместился в насечки, существенно больше, чем количество воды, возможно полученное волокном из внешней среды. Из этого следует, что набухание миелиновых структур при реактивной перестройке волокна происходит за счёт внутренней клеточной воды.

Еще одно примечательное явление, которое удается выявить в наших опытах, -- это множественное, локальное уменьшение диаметра осевого цилиндра в области миелиновых насечек, паранодиума и перикариона шванновской клетки. Сужение осевого цилиндра имеет предел. Видимо, это объясняется концентрацией филаментозно-тубулярного цитоскелетного материала (формирование "аксиального тяжа") в центре аксона, подобно тому, что имеет место в области щели перехвата. Наличие сходных пучков микротрубочек обнаружено в аксонах с помощью электронного микроскопа (Papasozomes, Payne, 1986).

С помощью наших исследований выявлено, что с плотным аксиальным тяжем напрямую связано образование варикозностей. Механизм формирования и размер варикозностей, по-видимому, не зависят от размера органелл (митохондрий), как предполагают S.E. Sasaki-Sherrington, J.R. Jacobs и J.K Stevens (1984). Авторы не рассматривают большинство случаев, когда варикозности существуют без органелл. Нами показано, что варикозности формируются не в результате набухания, а в результате локального сужения осевого цилиндра в местах, соответствующих набухшим насечкам, перехватам и перикарионам. У тонких волокон, по-видимому, в образовании варикозностей принимают участие и силы поверхностного натяжения, которые появляются у волокна в результате отмешивания аксоплазмы на белковый филаментозно-тубулярный агрегат (аксиальный тяж) и фракцию, слабо связанной воды аксоплазмы. Поэтому сходные между собой варикозности находятся на плотном осевом тяже и имеют примерно одинаковый диаметр (жемчужное состояние).

Так как при набухании всех миелиновых структур отмечалась ассоциация филаментозно-тубулярных органелл цитоскелета аксоплазмы вплоть до размеров аксиального тяжа, то можно было предположить, что это связанно с агрегацией белков при их начальной денатурации. Для проверки данного предположения были проведены электронно-микроскопические исследования основных белковых цитоскелетных структур аксоплазмы в области нормальных и реактивно изменённых компонентов волокна.

После механической травмы в реактивно измененных волокнах обнаружили резкую дифференцировку аксоплазмы в зонах насечек, перехватов и перикарионов. В этих локальных участках плотность распределения цитоскелетных структур аксона оказалось в среднем на 62 % больше, чем эта плотность вне изменённых компонентов волокна. При этом плотность распределения цитоскелетных структур была тем больше, чем значительнее степень реактивных изменений. У безмиелиновых волокон в суженной части аксона, между варикозностями, происходит такая же агрегация белковых филаментозно-тубулярных цитоскелетных структур. Увеличение плотности их распределения означает рост интенсивности их адгезии, что как известно, характерно для ранней денатурации белка при повреждении цитоплазмы. Агрегация белков закономерно сопровождается отмешиванием слабосвязанной воды белкового коллоида. Мы предполагаем, что это происходит и в наших экспериментах. Как известно, при повреждении клетки связанная вода может превращаться в свободную воду (Кяйвяряйнен, 1980). Агрегация белков и появление слабосвязанной воды в аксоплазме непременно должно свидетельствовать о падении ее осмотического давления. Возможно, в результате возникшего осмотического градиента между аксоплазмой и глиоплазмой шванновской клетки происходит межклеточная транслокация воды в миелиновые структуры волокна. Такому своеобразному нейроно-глиальному взаимодействию, видимо, способствует тесное пространственное отношение аксональной и глиальной мембран, отделенных только 20 нм, и их симбиотические связи в нормальных условиях.

Для того чтобы подтвердить наше предположение о транслокации водной фракции из аксоплазмы в глиоплазму, было необходимо исключить поступление воды в миелиновое волокно из окружающей среды. Это было осуществлено с помощью экспериментов с повреждением миелиновых волокон в безводных химически инертных средах (вазелинового масла и перфтордекалина). Оказалось, что весь комплекс структурных реактивных изменений в отсутствии внешней воды в отсутствии внешней воды развивается в полном объёме, хотя и несколько медленнее. Следовательно, механизм реактивной перестройки миелинового волокна заключается не в обычном набухании цитоплазмы шванновской клетки, а во внутренней транслокации водной фракции из аксоплазмы в глиоплазму.

Проанализировав механизмы обратимой реактивной перестройки миелинового волокна, мы считали необходимым попытаться выяснить возможности регулирования этого процесса.

Известно, что осмотическое давление коллоидного раствора зависит от числа растворенных частиц на единицу воды. Поэтому регулировать его величину можно либо изменением в клетке величины водной фазы, либо путем модуляции частиц в коллоидном растворе при их ассоциации ? диссоциации, то есть изменением степени дисперсности. В связи с этим было решено повлиять на степень диссоциации цитоскелетных белковых структур аксоплазмы, с помощью их фрагментации. Этого можно было достичь путем деполимеризации основных цитоскелетных структур аксоплазмы, микротрубочек и микрофиламентов, колхицином и цитохалазином соответственно. Предполагалось увеличение коллоидного осмотического давления аксоплазмы, уменьшение интенсивности транслокации воды и, следовательно, ингибирование степени реактивных изменений волокна.

Воздействие колхицина, действительно, уменьшило число реактивно изменённых волокон. Цитохалазин В оказал слабое воздействие на степень реактивной перестройки миелиновых волокон.

Проведённые исследования свидетельствуют о том, что механизм реактивной перестройки миелинового нервного волокна является осмотически зависимым и представляет собой транслокацию водной фракции из аксоплазмы в глиоплазму. С помощью изменения осмотического давления аксоплазмы возможно целенаправленно регулировать степень реактивных изменений миелиновых волокон, и следовательно, влиять на интенсивность их ранних патологических изменений.

ВЫВОДЫ

1. Реактивные структурные изменения периферических миелиновых нервных волокон на внешние воздействия являются ранней, обратимой и неспецифической перестройкой, включающей в себя единый комплекс, который состоит из набухания и расслоения миелиновых насечек Шмидта-Лантермана и перехвата Ранвье, обводнения перикариона шванновской клетки и варикозной деформации осевого цилиндра.

2. Отсутствие общего набухания волокна в гипотоническом растворе при набухании миелиновых насечек за счёт локального уменьшения объёма осевого цилиндра свидетельствует о возможной транслокации обводнённой фракции аксоплазмы в глиоплазму шванновской клетки.

3. Механизм перемещения обводнённой фракции аксоплазмы в глиоплазму включает адгезию белковых цитоскелетных структур с увеличением их агрегации вплоть до формирования аксиального пучка, соответствующее отмешивание жидкой фракции и падение осмотического давления аксоплазмы и транслокацию воды в глиоплазму по градиенту осмотического давления.

4. Регуляция степени реактивной перестройки волокон возможна с помощью изменения осмотического давления аксоплазмы путём фрагментации белковых цитоскелетных структур деполимеризующими их агентами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах из списка ВАК

1. Сотников О.С., Кокурина Т.Н., Соловьёва И.А., Сергеева С.С. Ранние реактивные изменения области узловых перехватов миелиновой оболочки нервных волокон (прижизненное исследование) // Морфология. - 2011. - Т. 139, №3. - С. 46-50. (Sotnikov O.S., Kokurina T.N., Solov'eva I.A., Sergeeva S.S. Early Reactive Changes at Myelin Sheaths Gaps (nodes of Ranvier) of Nerve Fibers (a supravital study) // Neurosс. Behav. Physiol. - 2012. - V. 42, № 7. - P. 775-779).

2. Сотников О.С., Кокурина Т.Н., Кузнецова И.Н., Васягина Н.Ю. Транслокация воды из осевого цилиндра в структуры миелиновой оболочки нервного волокна // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2011. - Т. - 151, №6. - С. 705-708. (Sotnikov O.S, Kokurina T.N., Kuznetsova I.N, Vasyagina N.Y Water translocation from the axial cylinder to myelin sheath structures of the nerve fiber // Bull. Exp. Biol. Med. - 2011. - V. 151, № 6. - P. 757-760).

3. Васягина Н.Ю., Сотников О.С., Кокурина Т.Н., Краснова Т.В. Сократительная активность живых изолированных нейронов и попытка её ингибирования с помощью цитохалазина В // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2013. -Т. 155, № 2. - С. 251-254.

4. Кокурина Т.Н., Сотников О.С., С.А. Новаковская, А.C. Егоров, Р.В. Кожевец, С.Д. Солнушкин, В.Н. Чихман. Взаимозависимость изменений нейрона и шванновской клетки в процессе реактивной перестройки миелинового волокна // Морфология. - 2013. - Т. 143. - №. 2. - С. 35-42.

Тезисы докладов и статьи в сборниках

5. Т.Н. Кокурина. Транслокация воды из осевого цилиндра в структуры миелиновой оболочки нервного волокна (прижизненные морфологические исследования) // Тез. Межинститутской конференции молодых учёных, посвященной 100-летию академика В.Н. Черниговского, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды». - СПб. - 2007. - С. 41.

6. Т.Н. Кокурина, И.Н. Кузнецова, О.С. Сотников, К.Н. Дудкин. Структура миелиновых волокон, переживающих в безводной среде перфтордекалина // Тез. VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения, «Механизмы функционирования висцеральных систем». - СПб. - 2008. - С. 89-90.

7. Т.Н. Кокурина. Изменение миелиновых структур живого нервного волокна за счёт воды аксоплазмы // Тез. научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». - СПб. - 2008. - С. 50-51.

8. Кокурина Т.Н., Рашевская Ю.В. Прижизненные исследования перехватов Ранвье // Тез. конференции молодых учёных, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды». - СПб. - 2010. - С. 54-55.

9. Сотников О.С., Васягина Н.Ю., Кокурина Т.Н. Аксиальный цитоскелетный тяж - динамическая структура осевого цилиндра // Альманах. - М.: ЗАО Ретиноиды. - 2011. - Вып. 32. - С. 88-97.

10. Кокурина Т.Н., Краснова Т.В. Зависимость реакции набухания насечек Шмидта-Лантермана миелинового нервного волокна от F-актиновых филаментов // Cб. науч. статей II Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине". - СПб. - 2011. - Т. 2. - С. 205-207.

11. Кокурина Т.Н., Сотников О.С. Феномен транслокации воды из аксона в шванновскую клетку // Материалы VIII Международного междисциплинарного конгресса "Нейронаука для медицины и психологии". - Судак. - 2012. - С. 208-209.

12. Кокурина Т.Н., Солнушкин С.Д., Чихман В.Н. Состояние цитоскелета при реактивной перестройке нервных волокон // VIII Всероссийская конференция с международным участием, посвящённая 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем». - СПб. - 2012. - С. 109-110.

Размещено на Allbest.ru