Микробиоценоз толстого отдела кишечника собаки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Красноярский государственный аграрный университет

Микробиоценоз толстого отдела кишечника собаки

Макаров А.В.

Счисленко С.А.

Юшковская Ю.М.

Красноярск, Россия

Abstract

The research of the intestinal micro flora of healthy dogs has been conducted. Qualitative and quantitative content of normal micro flora of the dogs in the Krasnoyarsk territory has been determined.

В борьбе с инфекционными заболеваниями часто забывают о том, что собственная микрофлора хозяина способна блокировать инфекционный процесс. Установлено, в естественной среде обитания необходим симбиоз макроорганизма с заселяющей его микрофлорой, так, например, безмикробные животные могут жить и развиваться только в условиях искусственной изоляции. В любом микробиоценозе различают характерную для данного вида и случайную микрофлору.

Установлено, что нормальная микрофлора осуществляет внутри макроорганизма множество функций: участвует в регуляции газового состава кишечника и других полостей организма хозяина; продуцирует энзимы, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот; продуцирует биологически активные соединения (витамины, антибиотики, токсины, и т.д.), обеспечивает колонизационную резистентность.

Видовой состав нормальной микрофлоры пищеварительного тракта представлен следующими микроорганизмами:

полость рта: Actinomyces, Arachnia, Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Spirochetes, Streptococcus, Vellionella и др.

желудок: Lactobacillus, Streptococcus, Sarcina и др.

тонкий отдел кишечника: Bifidobacterium, Lactobacillus, Vellionella, Clostridium, Eubacterium, Peptococcus и др.

толстый отдел кишечника: Acetovibrio, Acidominococus, Anaerovibrio, Bacteroides, Bifidobacterium, Butirovibrio, Campilobacter, Clostridium, Corpococcus, Disulfomonas, Eubacterium, Fusobacterium, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Roseburia, Ruminococcus, Selenomonas, Spirochetes, Succinomonas, Vellionella, Vulinella и др.

Такие представители микрофлоры, как энтеробактерии, включая кишечную палочку, стафилококки, грибы и другие аэробы, составляют не многим более 1-4%.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя небольшие подвижные или неподвижные споронеобразующие палочки. Некоторые бактерии имеют капсулы, особенно при первичном выделении из клинических образцов. Являются аэробами или факультативными анаэробами; большинство растет на простых питательных средах с мясным экстрактом, некоторые имеют специфические потребности при росте. На большинстве плотных сред образуют круглые выпуклые и блестящие (иногда слизистые) S-колонии. Также могут формировать плоские, неровные и зернистые R-колонии (часто их формирование обусловлено потерей капсулы). Высокоподвижные виды дают «феномен роения» на плотной среде. Большинство энтеробактерий не пигментировано, хотя отдельные штаммы и виды могут продуцировать красный, розовый, желтый или голубой пигмент.

Энтеробактерии характеризуются дыхательным и бродильным метаболизмом. Разлагают глюкозу, другие углеводы и спирты с образованием кислоты и газа, но существуют и газонеобразующие виды. Каталазаположительны (исключая один серотип рода Shigella), оксидазаотрицательны. Восстанавливают нитраты до нитритов (исключая некоторых представителей родов Enterobacter, Erwinia, Klebsiella и Yersinia), не нуждаются для роста в присутствии NaCl.

Семейство включает более 20 родов, объединяющих более 100 видов бактерий, обитающих на растениях, в почве, входящих в состав микробных ассоциаций кишечника животных и человека

Важнейших функций нормальной микрофлоры является ее участие в кооперации с организмом хозяина в обеспечении колонизационной резистентности, под которой подразумевается совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина посторонними микроорганизмами. В случае снижения колонизационной резистентности (в первую очередь уменьшения бифидо- и лактофлоры) увеличивается число и спектр потенциально патогенных микроорганизмов, происходит транслокация их и производимых ими токсинов через стенку кишечника или других полостей, что может сопровождаться возникновением эндогенной инфекции. Чаще всего снижение колонизационной резистентности сопровождается развитием различных заболеваний желудочно-кишечного тракта.

В своих исследованиях Н.В. Данилевская охарактеризовала физиологическую значимость основных представителей нормальной микрофлоры. В.В. Субботин и др. установили, что основу нормальной микрофлоры кишечника собак составляют неспорообразующие облигатные анаэробные микроорганизмы. Важнейшими представителями резидентной флоры кишечника являются бифидо- и лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы.

Следует отметить, что в условиях города Красноярска данные исследования не проводились, поэтому целью нашей работы являлось изучение состава микрофлоры толстого отдела кишечника здоровых собак на территории Красноярска, а именно выявление микроорганизмов семейства Enterobacteriacae, родов Lactobacillus и Bifidobacterium.

В период с ноября 2009 по март 2010 года нами были проведены исследования кала двадцати здоровых собак. Работа проводилась на базе НИИЦ КрасГАУ. Кал отбирали в стерильную емкость из прямой кишки.

После забора материал доставлялся в лабораторию, в течении двух часов. После того, как кал был доставлен, из него делалось разведение 10^-1. Из 10^-1 проводили дальнейшие разведения до 10^-12. Из разведения 10^-1 делался посев на хлор-магниевую среду в количестве 1 мл для накопления патогенной микрофлоры.

Из более значимых разведений проводился посев на среды Плоскирева, Эндо, на 5%-й кровяной агар из разведений 10^-4, 10^-5 и 10^-6 в количестве 0,05 мл с последующим растиранием шпателем. Для определения лактобактерий проводили посев на агаризованную среду Рогоза. Для количественного определения бифидобактерий проводили посев на среду Блаурока из каждого разведения 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11 и 10^-12 по три пробирки в количестве 1мл для определения НВЧ. При посеве на среды Блаурока и Рогоза создавались анаэробные условия.

Все питательные среды подвергали инкубации при температуре 37^оС,так на средах Плоскирева, Эндо, хлор-магниевой 24 часа, на 5%-ом кровяном агаре 48 часов, средах Блаурока и Рогоза 72 часа.

На среде Плоскирева можно было наблюдать плоские розовые колонии диаметром 3-6 мм и плоские колонии диаметром 4-5мм, окрашенные в цвет среды.

На среде Эндо появились выпуклые малиновые колонии диаметром 2 мм с металлическим блеском; плоские розовые колонии диаметром 2-3 мм; темно-малиновые колонии диаметром 2-3 мм без металлического блеска.

На кровяном агаре наблюдались колонии диаметром 3-5мм белого цвета с г-гемолизом или в-гемолизом.

На среде Рогоза наблюдались бесцветные колонии диаметром 1-3 мм линзовидной или звездчатой формы. На среде Блаурока - колони в виде гречишных зерен.

С культур, выросших на средах Блаурока и Рогоза, делались мазки со всех колоний и окрашивались по Граму. Так, микроорганизмы, выросшие на среде Блаурока, имели вид тонких грамположительных прямых или слегка изогнутых палочек, вследствие чего они были отнесены к роду Bifidobacterium .Микроорганизмы, выросшие на среде Рогоза, представляли собой неспорообразующие грамположительные каталазоотрицательные неподвижные палочки и были отнесены к роду Lactobacillus.

С хлор-магниевой среды проводили посев петлей на висмут-сульфитный агар, который подвергали инкубации при температуре 37^оС 48 часов. При наличии роста на среде колоний типичных или атипичных для рода Salmonella проводили типизацию.

Со сред отбирались колонии, схожие по культуральным свойствам, после чего каждой колонии присваивался номер и производился пересев на скошенный мясо-пептонный агар, который подвергался инкубации при температуре 37^оС 24 часа. Для исключения оксидазоположительной флоры, так как все энтеробактерии оксидазоотрицательны, проводили реакцию с помощью тест-полосок.

Затем был произведен пересев со скошенного мясо-пептонного агара на среды Олькеницкого, Гисса, Кларка, Симонса, 2-%-ю пептонную воду, фенилаланинагар и триптофанагар для определения биохимических свойств микроорганизмов. Все среды подвергались инкубации. При учете биохимических реакций на средах Гисса, мы обращали внимание на изменение цвета среды (свидетельство сбраживания сахара до кислоты) и наличие разрывов среды (определение способности образовывать газ).

Для определения индолообразования, к бульонной культуре, выросшей в 2%-ой пептонной воде, приливали 2-3мл эфира, затем добавляли несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола эфир окрашивался в розовый цвет.

При учете биохимической реакции на среде Симонса, обращали внимание на изменение цвета среды. Микроорганизмы, усваивающие цитрат, окрашивали среду в синий цвет.

На выросшую на фенилаланинагаре и триптофанагаре культуру вносили 4-5 капель 10%-го водного раствора FeCl₃ по скошенной части агара. При наличии в культуре фенилаланиндезаминазы образовывалась дорожка зеленого цвета.

Для реакции с метилротом, к четырехсуточной культуре, выросшей на среде Кларка, добавляют 3-5 капель метилового красного. В случае образования кислоты при ферментации глюкозы, среда окрашивалась в красный цвет. При слабом кислотообразовании цвет среды желтый.

Для постановки реакции на ацетоин, к четырехсуточной культуре, выросшей на среде Кларка, добавляли равный объем 6%-го раствора L-нафтола и 40%-го КОН. Через 4-6 часов инкубирования в термостате, отмечали изменение цвета среды. При положительной реакции среда приобретала розовый цвет с желтым оттенком.

При учете реакций на среде Олькеницкого, мы так же отмечали изменение цвета разрывов среды. О ферментации лактозы (сахарозы) судят по изменению цвета среды в скошенной части, а о ферментации глюкозы - в столбике, в котором при газообразовании появляются пузырьки воздуха (разрывы среды или её отслоение от стенок пробирки). Образование сероводорода устанавливают по почернению среды. При росте культуры, гидролизующей мочевину, происходит щелочение, вследствие чего вся среда приобретает малиновый цвет. В случае указанного расщепления мочевины в среде Олькеницкого учет ферментации углеводов невозможен.

Далее проводились дополнительные биохимические тесты (определение в-галактозидазы, лизина, орнитина, инозита, сорбита, малоната Na) с помощью систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов (набор №2 для межродовой и видовой дифференциации энтеробактерий)

После проведенных исследований выяснилось, что в толстом отделе кишечника здоровых собак присутствуют следующие виды микроорганизмов (КОЕ/г): Escherichia coli (3,08 ±0,44)* 10⁷; Serratia marcescens (2,35±0,51)* 10⁷, Klebsiella (1,51±0,62)*10⁷(из них Klebsiella aranae - (7,25±0,38)*10⁶, Klebsiella pneumonia - (1,54±0,23)*10⁶, Klebsiella rhinoschleromatis - (6,3±0,14)* 10⁶), Proteus (1,58±0,2)* 10⁷ ( из них Proteus mirabilis - (1,94±0,21)* 10⁵ и Proteus rettgeri - (1,57±0,2)*10⁷), Citrobacter amalonaticus - (2,28±0,22)*10⁶, Lactobacillus - (3,29±0,2)*10⁸, Bifidobacterium - (8,4±0,08)*10¹⁰. Патогенная микрофлора не обнаружена.

Содержание различных кишечных микроорганизмов по отношению к Escherichia coli в %:

Serratia marcescens - меньше на 23% чем Escherichia coli ; Klebsiella - меньше на 50%; Proteus - меньше на 48%; Citrobacter amalonaticus - меньше на 92%. Содержание по отношению к Enterobacteriacae: Lactobacillus на 276% больше; Bifidobacterium - больше на 96*10³%.

Проводя бактериологическое исследование кала здоровых собак, мы попытались установить норму содержания различных микроорганизмов в толстом отделе кишечника. Впервые был установлен нормальный микробиологический состав толстого отдела кишечника собаки на территории города Красноярска.

На основании проведенных исследований нами были сделаны выводы о том, что в толстом отделе кишечника здоровых собак преобладают микроорганизмы родов Lactobacillus и Bifidobacterium, патогенная микрофлора отсутствует, бактерии родов Klebsiella sp., Proteus sp., Citrobacter sp, содержатся в наименьшем количестве.

микрофлора пищеварительный кишечник собака

Литература

1. Медицинская микробиология (учебное пособие) под редакцией доктора медицинских наук профессора А.М. Королюка и доктора медицинских наук доцента В.Б. Сбойчакова. - Санкт-Петербург: ЭЛБИ-СПб, 2002.

2. Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей - М: Колосс, 2006.

3. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований - М: Медицина, 1978.

4. Субботин В.В., Данилевская Н.В. Микрофлора кишечника собак: физиологическое значение, возрастная динамика, дисбактериозы, коррекция - Ветеринар №1, 2002, с.40-44.

5. Данилевская Н.В. Физиологическая роль основных представителей нормальной микрофлоры мелких домашних животных - Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные №1, 2008, с 28-31.

Размещено на Allbest.ru