Изучение изменения деятельности кардиореспираторной системы лабораторных животных под воздействием антител к глутамату

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение изменения деятельности кардиореспираторной системы лабораторных животных под воздействием антител к глутамату



Содержание

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Кардиореспираторная система: взаимосвязь сердечно-сосудистой и респираторной систем

1.2 Регуляция дыхания

1.3 Периферические хеморецепторы

1.4.Патологические типы дыхания

1.5 Влияние глутаматергической и ГАМКергической систем на работу кардиореспираторной системы

1.6 Участие глутамата в формировании респираторных реакций

1.7 Участие ГАМКергической системы в формировании респираторных реакций

Глава 2. Методика

Глава 3. Результаты

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Список литературы



Список использованных сокращений

АД - артериальное давление

ЧСС - частота сердечных сокращений МОД - минутный объём дыхания

ЧД - частота дыхания ПТГ - пневмотахограмма

ВПД - внутрипищеводное давление ГАМК - гамма-аминомасляная кислота ГОМК - гамма-оксимасляная кислота КРС - кардиореспираторная система ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

НАД - никотинамид аденин динуклеотид



Введение

Актуальность данной работы заключается в недостаточности данных о роли глутаматергической системы в регуляции дыхания. Наиболее эффективным способом, является выполнение работы с использованием данных о хорошо изученном влиянии ГАМКергической системы в регуляции дыхания. В данном случае нами было выбрано исследование кардиореспираторной системы лабораторных животных. Работа выполнялнена в Лаборатории патофизиологии кардиореспираторной системы ФГБНУ НИИ ОПП, в которой проводятся исследования кардиореспираторной системы с использованием лабораторных животных. Так же нужно отметить, что выбранная нами область является обширной и не укладывается в рамки дипломной работы. Поэтому область наших исследований была ограничена хеморецепторной чувствительностью кардиореспираторной системы.

Цель нашего исследования: изучить влияние антител к глутамату на хеморецепторную регуляцию дыхательного ритма до и после активации ГАМКегрической системы оксибутиратом.

Для достижения поставленной цели, нам предстояло решить следующие задачи:

1. Сравнить работу хеморецепторного контура регуляции дыхания у нормальных животных и у животных с предварительно введенными антителами к глутамату.

2. Сравнить хеморецепторную регуляцию дыхания у животных с активированной ГАМКергической системой и у животных с предварительно отключенной глутаматергической системой и активированной ГАМКергической системой.

3. Оценить возможность коррекции нарушений дыхательного ритма вызванных оксибутиратом с помощью антител к глутамату.

Методы, использованные нами в работе можно разделить на две большие группы: практические и теоретические. Практические методы более подробно рассмотрены во второй главе. К теоретическим методам можно отнести анализ литературы, обобщение и систематизация. Анализ литературы является основным и неотъемлемым элементом при работе в любой области и в любом направлении, особенно если это касается науки. Метод обобщения применялся для того, чтобы информация, полученная из разных источников методом анализа, приняла целостный, не разорванный вид. Применение этого метода во многом облегчило систематизацию полученного материала, что в свою очередь позволило улучшить качество практической и теоретической части работы, и позволило провести более полный, грамотный и научно-обоснованный анализ результатов.

В первой главе работы представлен обзор литературы по выбранной тематике. Приведены данные о работе кардиореспираторной системы, а также дана информация о физиологии элементов КРС: сердечно-сосудистой и дыхательной системы, а также приведена информация об использованных веществах. Так же в обзоре литературы приведены имеющиеся данные о роли глутамат- и ГАМКергической систем в регуляции дыхания. Во второй главе работы подробнее рассмотрены использованные практические методы работы, а так же приборы и материалы. В третьей и четвертой главах приведены результаты и произведён разбор и анализ полученных данных. В конце работы представлены выводы, сделанные на основании проведённого анализа полученных данных.

сердечный респираторный глутамат



Глава 1. Обзор литературы

1.1 Кардиореспираторная система: взаимосвязь сердечно-сосудистой и респираторной систем

Для понимания механизмов работы кардиореспираторной системы и грамотного анализа данных, необходимо разобраться в строении и взаимосвязях составных частей. Кардиореспираторная система, представляет собой тесно связанные сердечно-сосудистую и респираторную системы. Важную роль в этом взаимодействии играет хеморецепторная система. При проведении этого исследования мы изучали работу центральных и периферических хеморецепторов. Центральные хеморецепторы реагируют на изменение содержания углекислого газа в крови, а периферические хеморецепторы реагируют на изменение концентрации кислорода и уровня pH в крови, а также изменение концентрации двуокиси углерода. Информация от них передаётся в мозг по афферентным волокнам языкоглоточного нерва в центральную нервную систему и используется регуляторами вегетативных систем для управления функциями организма, в частности, дыханием и кровообращением. Исходя из этого можно понять что рецепторы расположенные в стенках каротидного синуса и регистрирующие изменения химического состава крови влияют на работу дыхательной системы, посредством передачи нервных импульсов к дыхательному центру головного мозга, который в свою очередь регулирует глубину и частоту дыхания.

Сердечно-сосудистая система

Сердечно-сосудистая система представлена четырехкамерным сердцем и системой кровеносных сосудов, составляющих малый и большой круги кровообращения. Малый круг кровообращения сосредоточен в лёгких, а большой обеспечивает кровью весь организм. Основной функцией малого круга кровообращения является газообмен, поэтому он сосредоточен в

лёгких. Сосудистая часть представлена не только собственно сосудами

малого круга, но и бронхиальными, обеспечивающими питание бронхов и лёгочной паренхимы. Помимо генеральной регуляции кровотока, в малом круге наблюдаются эффекты регуляции локального кровотока, что позволяет кровеносной системе работать в соответствии с потребностями дыхательной системы. Помимо основной - газообменной функции - малый круг, в системной гемодинамике, также выполняет функцию резервуара переменной ёмкости, а также фильтра, задерживающего разного рода эмболы образующиеся в венозной сети при изменениях свойств крови или нарушениях эндотелия. Лёгочные сосуды участвуют в метаболизме многих циркулирующих вазоактивных веществ.

Респираторная система

Респираторная система состоит из органов обеспечивающих функцию внешнего дыхания человека (газообмен между вдыхаемым атмосферным воздухом и циркулирующей по малому кругу кровообращения кровью). Газообмен осуществляется в альвеолах лёгких, и в норме направлен на выделение из вдыхаемого воздуха кислорода и выделение во внешнюю среду образованного в организме углекислого газа. Крыса, находясь в состоянии покоя, совершает в среднем 65 дыхательных движений в минуту. Вентиляция лёгочных альвеол осуществляется чередованием вдоха (инспирация) и выдоха (экспирация). При вдохе в альвеолы поступает атмосферный воздух, а при выдохе из альвеол удаляется воздух, насыщенный углекислым газом.

Газообмен

Доставка кислорода и выведение углекислого газа представляют фундаментальные процессы жизнеобеспечения организма. Процессы насыщения крови кислородом и выведения углекислого газа необходимы для понимания функций и принципов работы хеморецепторной системы.

Итак, обмен кислорода и углекислоты в лёгких происходит пассивно, благодаря разнице парциальных давлений газов в альвеолярном воздухе и их напряжением в крови. Процесс обмена называется диффузией, а разность парциальных давлений называется диффузионной. Лёгочная мембрана, через которую происходит обмен, представляет собой сложное неоднородное образование из эпителия альвеол и эндотелия капилляров. Каждая из этих тканей располагается на своей базальной мембране. Также, пространство между мембранами заполнено гомогенным аморфным веществом соединительной ткани и эластическими волокнами. Внутренняя поверхность альвеол покрыта сурфактантом, обусловливающим натяжение поверхности альвеол, а так же выполняющим защитную функцию. Местами, капиллярные и альвеолярные мембраны соприкасаются и иногда срастаются вместе. Физико-химические свойства мембран таковы, что растворимость кислорода в ней в двадцать раз меньше растворимости углекислоты. Эта закономерность практически исключает возможность нарушения процесса выведения углекислоты из организма.

1.2 Регуляция дыхания

Главная функция системы регуляции дыхания - поддержание вентиляции лёгких, адекватной метаболическим нуждам организма. Дыхательная система включает в себя два основных контура регулирования -- хемо- и механорецепторный. Контур хеморецепторного (газообменного) регулирования проходит через дыхательный центр, вентиляторный аппарат, систему транспорта газов, хеморецепторы и афферентные (хемочувствительные) пути. Контур механорецепторного регулирования включает ДЦ, афферентные пути, дыхательные мышцы, вентиляторный аппарат, механорецепторы легких и мышц и афферентные (механочувствительные) пути. Оба контура регулирования замыкаются через общий регулятор ДЦ.

Регуляция в покое происходит по продукции углекислого газа, зависящей от потребления кислорода. В настоящее время установлено, нейроны ствола мозга не обладают специфической чувствительностью к изменению газового состава и кислотно-основного состояния омывающей их крови. Их активация вызванная гиперкапнией, гипоксией и ацидозом, всегда опосредована стимуляцией соответствующих хеморецепторов. Интенсивность внешнего дыхания регулируется дыхательным центром продолговатого мозга в соответствии с информацией о РаСО2, РаО2 и рН, получаемой от периферических рецепторов, а также по составу омывающей его крови. При этом дыхательный центр не способен адекватно ответить на изменения, если изолировать его от периферии, что говорит о важной роли периферических хеморецепторов. Так же, стоит отметить, что центральные хеморецепторы регулируют дыхание в состоянии покоя и в течение длительного времени, а периферические имеют большее значение при кратковременных физических нагрузках и состояниях отличных от состояния покоя.

Центральный аппарат, участвующий в регуляции дыхания, представляет собой сложную иерархическую систему, включающую в себя нервные образования спинного, продолговатого мозга и вышележащие отделы ЦНС. Церебральные, отделы мозга оказывают значительное влияние на деятельность системы дыхания. Их участие обеспечивает возможность произвольного управления вентиляцией легких, адаптивное приспособление дыхательных реакций к изменениям среды обитания, выработку условных дыхательных рефлексов, осуществление опережающих реакций на возмущающие воздействия.

Вышележащие уровни управления, которые включают структуры, расположенные в коре больших полушарий и других отделах ЦНС, воздействуют как опосредованно через дыхательный регулятор -- ДЦ, определяя необходимые в данных условиях значения регулируемых показателей, так и непосредственно на спинномозговые центры (мотонейроны дыхательных мышц), осуществляя программы произвольного

управления дыханием.

Автоматическая (метаболическая) система регуляции дыхания осуществляется без непосредственного и детального контроля со стороны вышестоящих по иерархии подсистем по восходящей, начиная с продолговатого мозга.

Автогенератор дыхательного ритма [20] обеспечивает формирование правильно чередующихся дыхательных движений, каждое из которых состоит из двух (а по мнению некоторых исследователей, из трех) фаз -- вдоха и выдоха, которые являются результатом деятельности особых групп дыхательных нейронов продолговатого мозга, составляющих как собственно генератор ритма, так и генератор формы (паттерна) дыхательного цикла [65, 66].

1.3 Периферические хеморецепторы

Периферические хеморецепторы образуют две зоны - аортальную и синокаротидную. В области синокаротидной зоны лежит каротидное тело. Оно расположено в месте раздвоения сонной артерии - синокаротидной рефлексогенной зоне. Каротидное тело представляет собой соединительнотканное образование, заключенное в капсулу с большим количеством кровеносных сосудов и афферентных и эфферентных волокон. В аортальной зоне расположены аортальные тела. По своей структуре они похожи на каротидное тело. Они иннервируются афферентными ветвями блуждающего нерва.

Роль углекислого газа в регуляции дыхания

В 1885 году Мишер-Рюш предположил, что раздражителем дыхательного центра является углекислота, а не кислород. Эта точка зрения шла вразрез с мнением его современников которые полагали что раздражителем является кислород. В начале ХХ столетия Холден провёл серию экспериментов доказывавших правоту Мишера-Рюша. В этих

экспериментах было обнаружено постоянство концентрации СО2 в артериальной крови, омывающей центральные хеморецепторы дыхательного центра, а СО2 был признан адекватным раздражителем. Также им была разработана методика исследования состава альвеолярного воздуха. Изучение альвеолярных проб показало значительное постоянство концентрации СО2 (РАСО2). В дальнейших исследованиях, было показано, что при повышении концентрации СО2 в альвеолярном воздухе всего на 0,17%, вентиляция лёгких увеличивается вдвое. Впоследствии, эта теория была развита Холденом, из неё следовало, что дыхание регулируется нервным путём и гуморальным, в соответствии с РаСО2 и РАСО2. Увеличение вентиляции после повышения РАСО2 и апноэ после гипервентиляции является веским доказательством теории Холдена о роли СО2.

1.4 Патологические типы дыхания

Нарушения функционирования автоматического регулятора дыхания обычно сопровождаются появлением характерных по паттерну дыхательных движений, которые не обеспечивают адекватной вентиляции организма, а также нарушениями характера дыхания во сне (синдром «проклятие ундины»), во время которого произвольная система рефляции отключается и потому не может компенсировать недостаточность автоматического дыхания. Таким образом, при структурных и функциональных поражениях ДЦ ствола мозга обычно возникает патологическое дыхание центрального происхождения.

Патологическим называется такое дыхание, при котором сохраняются дыхательные движения, но они не обеспечивают необходимого организму адекватного газообмена. Патологические изменения регуляции дыхания схематически можно подразделить на 3 группы:

1. Первичные поражения системы регуляции центрального происхождения;

2. Нарушения регуляции дыхания, связанные с патологическими изменениями в исполнительном аппарате внешнего дыхания

легких, дыхательных путях, дыхательных мышцах и грудной клетке);

3. Вторичные нарушения системы регуляции дыхания. возникающие при длительных и значительных изменениях газового состава артериальной крови [34]. Хотя поражение каких-либо звеньев дыхательной системы по отдельности встречается редко [3], такая систематизация нарушений дыхательной функции и возникающих при этом патологических типов дыхания удобна для практических целей.

Нарушения центральной регуляции дыхания в целом также могут быть подразделены на 3 группы:

1. Нарушения церебральной системы регуляции;

2. Нарушения метаболической системы регуляции;

3. Нарушения функции мотонейронов дыхательных мышц.

Нарушения церебральной (произвольной) системы регуляции дыхания [4] включают в себя потерю способности дышать по команде, произвольно менять характер дыхательных движений (в частности, переходить от брюшного дыхания к грудному), задерживать дыхание на вдохе или выдохе, выполнять функциональные пробы во время обследования.

Что же касается метаболической (автоматической) регуляции дыхания [3], то она осуществляется так называемым центральным регулятором дыхания, состоящим из трех функциональных элементов (автогенератора дыхательного ритма, хеморецепторного контура регуляции и механорецепторного контура регуляции), который обеспечивает меняющиеся в зависимости от условий метаболические потребности организма в кислороде и удаляет избыток углекислого газа. Каждый из этих элементов играет свою роль в формировании ритма и регуляции дыхания.

В случае первичного поражения системы регуляции дыхания, несмотря на полную анатомическую сохранность исполнительного аппарата внешнего

дыхания (дыхательные пути и легкие, дыхательные мышцы и грудная

клетка), развиваются нарушения вентиляции легких, часто приводящие к тяжелым формам дыхательной недостаточности, вплоть до остановки дыхательных движений. В общем смысле причиной возникновения патологических типов дыхания центрального генеза является поражение системы регуляции внешнего дыхания, возникающее чаще всего при заболеваниях ЦНС когда нарушаются функции нейронов супрабульбарных структур ДЦ и их связи с другими отделами мозга, проведение нервной импульсации от рецепторов и органов чувств к ДЦ и передача регулирующих сигналов от него к мотонейронам и дыхательной мускулатуре. Обычно патологическому типу дыхании присущи специфические дыхательные движения, характеризуемые определенной формой дыхательных циклов или своеобразием их группировки. На основании этих особенностей выделяют так называемые типы (паттерны) патологического дыхания.

В связи с отсутствием однозначных представлений о механизмах формирования патологических типов дыхания их классификация затруднена, и в настоящее время сохраняется система довольно условных обозначений типов дыхания по внешним признакам или же употребляются эпонимические названия -- по имени авторов, впервые их описавших. Как признак отчаяния и безнадежности внести, наконец, ясность в данный вопрос, можно считать появившийся в литературе призыв оставить дальнейшие безуспешные попытки создания новой классификации путем выяснения реальных меха- низмов формирования патологических типов дыхания центрального происхождения, а также сохранить эпонимические обозначения, дабы не вносить еще большую путаницу в сложившиеся представления [52]. Мотивы такого призыва по-своему понятны, поскольку, несмотря на давнюю историю, все еще не только не сформулирована общая теория патогенеза нарушений центральной регуляции дыхания, но даже отсутствует удовлетворительное объяснение причины возникновения хотя бы одного из типов патологического дыхания в отдельности.

По изменениям собственно дыхательного ритма, являющимся следствием нарушений регуляции дыхания, можно выделить следующие группы патологического дыхания:

1. Регулярное (правильное) дыхание -- центральная неврогенная гипервентиляция, центральная альвеолярная гиповентиляция, апнейстическое дыхание, так называемое большое дыхание Куссмауля;

2. Периодическое дыхание -- дыхание Биота (дыхание «кластерного» типа) и дыхание Чейна--Стокса;

3. Нерегулярное (неправильное) дыхание -- атактическое.

Очевидно, что кроме изменений ритма при перечисленных нарушениях меняются также и другие показатели.

В регуляции дыхания человека участвует сложная система структур, располагающихся на нескольких уровнях ЦНС. Согласно существующим представлениям, регуляция дыхания осуществляется двумя функционально и анатомически раздельными системами, а именно, произвольной и автоматической [20].

Нервные центры церебральной системы сосредоточены преимущественно в соматомоторных областях коры головного мозга и лимбических структурах. Основной функцией этой системы является произвольная регуляция и адаптация дыхания к сложным поведенческим реакциям, реализуемым, в том числе и по команде, т.е. через вторую сигнальную систему [14, 16, 23, 25]. Произвольная регуляция осуществляется во время бодрствования путем передачи регулирующих импульсов частично через ретикулярную формацию ствола мозга, а в основном -- непосредственно по кортикоспинальному пути к мотонейронам дыхательных мышц, расположенным в передних рогах спинного мозга [4, 9, 13, 18, 17, 23]. Говоря о расстройстве церебральных влияний на дыхание, следует отметить, что при повреждении центров и проводящих путей, локализованных в полушариях большого мозга, возможно появление

дыхания типа Чейна--Стокса, апноэ после гипервентиляции, увеличение

гипервентиляционного ответа на вдыхание углекислого газа и другие расстройства дыхательных движений.

Однако вряд ли тип дыхания достаточно жестко связан с топикой поражения в нервной системе. Так, М.Д. Сидоровская [24] не обнаружила зависимости типа дыхательных движений от локализации очага и характера повреждения: оказалось, что при одной и той же локализации патологического очага возникают различные паттерны дыхательных движений.

Современные представления о причинах возникновения патологических типов дыхания центрального происхождения наиболее четко сформулированы в работах Л.М. Поповой [20]: «Теоретические основы патогенеза дыхательной недостаточности неврогенного происхождения заложены в учении о локализации путей и центров, регулирующих дыхательный акт и участвующих в его осуществлении. Поэтому рассмотрение процессов развития дыхательной недостаточности при заболеваниях нервной системы неотделимо от степени функционального и анатомического повреждения центров, контролирующих дыхание и расположенных на различных уровнях головного мозга и ствола, проводящих путей, соединяющих центры управления со спинным мозгом, и, наконец, периферических отделов нервной системы и дыхательных мыши, осуществляющих дыхательный акт. В условиях патологии наступает различная степень повреждения путей и центров, регулирующих дыхание и обеспечивающих деятельность дыхательной мускулатуры. Дискоординация неврогенных структур проявляется патологическими формами дыхательных движений и, в конечном итоге, приводит к нарушениям газообмена».

Таким образом, возникновение патологических типов дыхания тесно увязывается с повреждением центров, прежде всего церебральной (произвольной) регуляции дыхания, распределенных по всему головному мозгу, и соединяющих их между собой нервных путей. В то же время

накоплены экспериментальные данные и клинические наблюдения, которые,

на наш взгляд, не могут быть удовлетворительно объяснены в рамках такой жесткой структурной схемы. Основные аргументы объединены в несколько групп.

Во-первых, общепризнанно, что отделение верхних отделов головного мозга после классической межбугровой децеребрации не оказывает заметного влияния на работу ДЦ продолговатого мозга и характер дыхания после такой операции описывается как эйпноэ. Совокупность сведений такого рода ставит под сомнение роль центров произвольной регуляции дыхания, располагающихся в верхних отделах головного мозга, и указывает на важнейшее значение структур нижней части ствола мозга в патогенезе дыхательных расстройств.

Во-вторых, известно, что при одной и той же локализации патологического процесса могут формироваться различные типы дыхания, причем описаны случаи взаимоперехода одного типа патологического дыхания в другой. Не обнаружена также взаимосвязь между типом патологического дыхания и природой патологического процесса.

В-третьих, исходя из предположения об определяющей роли повреждения нервных центров и нервных путей, невозможно понять, почему патологическое дыхание возникает при сердечной недостаточности, т.е. при такой патологии, которая не связана с нарушениями деятельности ЦНС и центральной регуляции дыхательной системы, однако дыхание Чейна-Стокса впервые было описано именно у таких больных.

В-четвертых, у практически здоровых людей (спортсменов- альпинистов, прошедших предварительное медицинское обследование) в условиях высокогорной гипоксии во время сна отмечены случаи появления нарушений дыхательного ритма, напоминающие по своему характеру периодическое дыхание типа Чейна-Стокса.

1.5 Влияние глутаматергической и ГАМКергической систем на работу кардиореспираторной системы

Несомненно, что глутамат и ГАМК являются важнейшими нейротрансмиттерами, вовлеченными в функционирование центрального генератора ритма. Следует отметить, что его активность напрямую связана с интенсивностью метаболизма и высвобождения глутамата и ГАМК в соответствующих ядрах ствола мозга. Вместе с тем метаболизм глутамата и ГАМК в пределах ЦНС и состояние соответствующего рецепторного аппарата могут существенно изменяться под воздействием гипоксической и гиперкапнической стимуляции. Конечный результат - уровень и особенности функционирования - будет всегда зависеть от баланса возбуждения, определяемого действием глутамата, и торможения, обусловленного влияниями ГАМК. Очевидно, что взаимодействие глутамата и ГАМК - агентов с достаточно тесно взаимосвязанной биохимией - в механизмах контроля активности церебральных структур, ответственных за управление респираторной функцией, требует дальнейшего подробного изучения.

1.6 Участие глутамата в формировании респираторных реакций

NMDA-рецепторы присутствуют во всех регионах ствола мозга, связанных с ограничением времени инспирации [57]. Глутамат принимает непосредственное участие в передаче респираторных сигналов к мотонейронам. В исследованиях с применением микроинъекций антагонистов NMDA- и AMPA-рецепторов в вентральные рога спинного мозга на уровне сегментов С3-С5 было обнаружено, что передача респираторного сигнала в бульбо-спинальном направлении основывается на участии рецепторов обоих подтипов [36]. Внеклеточная аппликация агонистов NMDA- и AMPA-рецепторов вызывает увеличение частоты ПД респираторных нейронов [53].

Глутамат определяет степень интенсивности электрической активности респираторных нейронов, воздействуя на NMDA- и AMPA-рецепторы. В частности, было установлено, что фазное повторяющееся возбуждение нейронов определяется AMPA-рецепторами [44]. Показано, что дизоцильпин подавляет активность РI-нейронов либо сдвигает ее относительно респираторных фаз. Это указывает на непосредственную причастность NMDA-аппарата данных нейронов к механизму выключения инспирации [40]. Кроме того, обнаружено, что фармакологическое блокирование NMDA-рецепторов вызывает увеличение длительности инспирации с укорочением фазы 1 экспирации и без существенных изменений экспираторной фазы 2 [39].

Глутаматергический механизм (NMDA- и AMPA-рецепторы) является важным элементом генерации респираторного ритма в бульбарной нейронной сети [44]. AMPA-рецепторы опосредуют фазные возбуждающие постсинаптические потенциалы в респираторных нейронах, определяя паттерн их импульсации во время активной фазы. Установлено, что именно NMDA-зависимый механизм обусловливает фазный переход от инспирации к экспирации.

Глутамат является гипотетическим кандидатом на роль агента, определяющего тоническое возбуждение респираторных нейронов влияниями, поступающими из центральных хемочувствительных структур.

Известно, что гипоксия сначала приводит к увеличению интенсивности вентиляции, а затем постепенно ее снижает [51]. Начальное усиление вентиляции связано со стимуляцией периферических хеморецепторов каротидных гломусов (КГ), а последующий спад респираторной реакции определяется центральными эффектами гипоксии. Показано, что афферентная импульсация от артериальных хеморецепторов содействует высвобождению глутамата в областях мозга, связанных с контролем респираторной функции, в частности в структурах вентральной поверхности

ствола мозга [49], способствуя поддержанию интенсивной вентиляции как ответа на гипоксическую стимуляцию.

Установлено, что максимум респираторной реакции совпадает с наибольшей степенью высвобождения глутамата в ЦНС [55]. В частности, повышение частоты респирации в ответ на предъявление гипоксического стимула является одним из маркеров упомянутого интенсивного высвобождения глутамата, которое опосредуется NMDA- и неNMDA- рецепторными механизмами [57]. Последующее падение интенсивности вентиляции связывают с высвобождением и накоплением тормозных медиаторов (в частности, ГАМК) в респираторных стволовых структурах [51]. Вместе с тем оказалось, что уменьшение интенсивности вентиляции во второй фазе респираторной реакции на гипоксическую стимуляцию также связано с активацией NMDA-рецепторов [38].

Эффект участия NMDA-рецепторов проявляется как увеличение длительности инспирации; в то же время длительность экспирации падает, а конечный результат представляет собой повышение частоты дыхания.

Следствием экспозиции к гипоксии является снижение частоты дыхания; данный феномен получил название кратковременной депрессии частоты [45]. Предполагается, что гипоксическая и постгипоксическая депрессия частоты дыхания связана с пролонгацией фазы экспирации за счет возбуждения экспираторных нейронов через глутаматергический механизм [38]. Участие NMDA-рецепторного аппарата в формировании ранней и поздней фаз респираторной реакции на гипоксию также подтверждается результатами исследований, проведенных в НИИ ОПП [43]. Периферические NMDA-рецепторы не обязательно образуют некий тандем с центральными NMDA-рецепторами, однако они могут существенно облегчать возбуждение на позднем этапе экспозиции к гипоксии. В этом случае блокирование NMDA-рецепторов, по-видимому, может способствовать усугублению развивающейся депрессии вентиляции

[56]. Как известно, хроническая гипоксия способствует повышению

чувствительности центральных структур, задействованных в контроле дыхания. Предполагается, что этот процесс связан с NMDA-опосредуемыми механизмами [54].

Таким образом, можно кратко сформулировать следующие выводы об основных функциях глутамата в механизмах контроля респираторной функции. Глутамат действует преимущественно через аппарат NMDA- и AMPA-рецепторов; NMDA-рецепторы вовлечены в ограничение длительности фазы инспирации; пластичность NMDA-рецепторного аппарата играет существенную роль в адаптации системы дыхания к длительной гипоксии.

1.7 Участие ГАМКергической системы в формировании респираторных реакций

Содержание ГАМК в различных структурах в пределах ЦНС заметно варьирует. Применительно к рассматриваемому вопросу можно заметить, что высокие концентрации ГАМК отмечаются в нейронах ядер ствола мозга (ядерных структур, связанных с респираторным контролем, - парабрахиального ядра, голубого пятна) и спинного мозга [46, 47, 50]. Найдены свидетельства ГАМК-эргических проекций от нейронов респираторных структур ствола мозга в спинной мозг на уровне С3-С5, т. е. в область локализации диафрагмальных мотонейронов [59]. В большинстве респираторных нейронов в неактивной фазе респираторного цикла наблюдаются ТПСП. Внеклеточные аппликации ГАМК к респираторным нейронам вызывают гиперполяризацию их клеточной мембраны одновременно с понижением входного сопротивления и прекращением генерации ПД [43].

Следует отметить, что ГАМК в равной степени тормозит активность и инспираторных, и экспираторных нейронов [42]. Существует предположение, что ГАМК-эргические синаптические влияния в ЦНС

наиболее характерны для зон, связанных с конвергенцией сенсорных

стимулов и обработкой сенсорной импульсации [41]. Подтверждением этой точки зрения стали результаты исследования влияния агонистов ГАМК на чувствительность дыхательной системы к импульсации от механорецепторов легких (в экспериментах применяли перерезку блуждающего нерва - ваготомию) и на чувствительность к основным видам респираторной стимуляции - гипоксии и гиперкапнии [26, 27]. Было показано, что активация ГАМК-эргической системы приводит к исчезновению реакции дыхательной системы на ваготомию, что свидетельствовало о центральном блокировании передачи механорецепторной импульсации [26, 27]. Кроме того, оказалось, что агонисты ГАМК способствуют перенастройке системы контроля дыхания - от регуляции согласно концентрации СО2 к регуляции по уровню О2 [26, 27].

Результаты исследований роли ГАМК-эргической системы в формировании дыхательной активности в условиях микровведений ГАМК и ее агонистов (оксибутирата, мусцимола или баклофена) в вентролатеральной части ядра одиночного пути показали, что при воздействии на ГАМКА-рецепторы формируется апнейстическое дыхание, а при активации ГАМКВ-рецепторов возникает не только апнейстическое, но и периодическое дыхание [28, 29, 32]. Препараты, являющиеся активаторами ГАМК-эргической системы, в разной степени влияют на ГАМКВ-рецепторы (в порядке убывания интенсивности воздействия: баклофен>фенибут>окси-г-аминомасляная кислота) [29]. У кошек и крыс введение ГАМК-агонистичных агентов (в частности, оксибутирата) эффективно снижало частоту дыхания и способствовало проявлению дыхательной аритмии [30]. Внутривенное введение ГАМКА-миметика оксибутирата сначала вызывало у кошек периодическое апнейстическое дыхание с задержками на вдохе, а затем у трети животных возникало регулярное “машинообразное” дыхание, характеризующееся точным повторением респираторного паттерна от цикла к циклу [28, 29].

Аналогичный тип дыхания (но без инспираторных задержек) при введении оксибутирата у крыс проявлялся в гораздо меньшем количестве случаев (35% по сравнению с 80 %), однако характерной особенностью, наблюдаемой у крыс, было отсутствие перехода на “машинообразное” дыхание [32]. По- видимому, крысы отличаются более высокой устойчивостью механизма формирования дыхательного ритма в случае активации ГАМК-эргической системы по сравнению с кошками.

Таким образом, можно предположить, что ГАМК-эргические пути являются существенным элементом, обеспечивающим поддержание спонтанной респираторной активности. Предполагается, что именно ГАМК является медиатором, определяющим периодичность разрядов инспираторных нейронов ствола мозга [37].

Как установлено, гипоксия способствует повышению концентрации ГАМК в мозгу, которое зависит от степени и длительности гипоксического воздействия [41]. Более того, подобное повышение уровня ГАМК и его предшественника глутамата, по-видимому, связано с истощением запасов АТФ в клетках мозга [48]. Уменьшение количества АТФ при гипоксии сопровождается повышением активности декарбоксилазы глутаминовой кислоты, что в свою очередь увеличивает продукцию ГАМК. Гипоксия также может способствовать повышению концентрации ГАМК в результате ингибирования ГАМК-трансаминазы за счет снижения рН во время эпизодов гипоксии/ишемии [48].

С одной стороны, в условиях гипоксии эффект возбудительных агентов, высвобождающихся в вентролатеральной части ядра одиночного пути, может “перекрывать” депрессорное влияние ГАМК, с другой - гипоксия может способствовать изменению активности механизмов обратного захвата трансмиттеров и вносить коррективы в работу специфических ферментов. В частности, экзогенная ГАМК может препятствовать преобразованию глутамата в ГАМК за счет ингибирования GAD. Выраженная гипоксия, обычно ведущая ко вторичному угнетению

дыхания, вероятно, сопряжена с увеличением содержания ГАМК в стволе мозга. Этот факт позволяет предполагать участие данного нейропередатчика в развитии некоторых форм патологически модифицированного дыхания [28]. Таракановым И.А. и Сафоновым В.А. было высказано предположение о механизмах формирования некоторых типов патологического дыхания, в которых ведущая роль отводится изменениям в системе ГАМК [31, 32].

Известно, что при одной и той же локализации патологического процесса в мозгу может формироваться патологическое дыхание различных типов, причем описаны случаи спонтанного взаимоперехода одного типа дыхания в другой. До настоящего времени, однако, не было установлено связи между типом патологического дыхания и природой патологического процесса, хотя и отмечалось, что наиболее распространенной общей причиной клинических и экспериментально моделируемых нарушений дыхания является гипоксия различного генеза.

Предполагается, что в этих условиях происходит накопление ГАМК и ее метаболита - г-оксимасляной кислоты (ГОМК) - в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ). Очевидно, что количество ГАМК, выделяющееся в ЦСЖ, будет зависеть от степени ишемии/гипоксии, размеров очага последней и запасов ГАМК в данном очаге.

Согласно гипотезе Тараканова и Сафонова [31, 32], ГАМК вместе с током ЦСЖ передвигается интрацистернально в каудальном направлении, где обогащенный ГАМК ликвор омывает дно IV желудочка мозга. Расположенный в упомянутом регионе ствола мозга является существенным компонентом генератора дыхательного ритма и зоной проекций, поступающих от хемо- и механорецепторов. Кроме того, данное ядро считают ключевой структурой, необходимой для формирования апнейстического периодического дыхания.

Таким образом, предложенная гипотеза [31, 32] базируется на следующих положениях. Патологические (апнейстический и периодический) типы дыхания следует считать не формой “чисто

дыхательной” патологии как таковой, связанной с органическим повреждением структур центрального регулятора дыхания, а преимущественно проявлением гиперпродукции ГАМК и ГОМК.

Исходя из представлений о двухфазной схеме формирования дыхательного цикла (инспирация и экспирация), можно предположить, что стимуляция ГАМКВ- рецепторов в указанных выше условиях способствует нарушению деятельности механизма выключения инспирации, т. е. затрудняет переход от фазы вдоха к фазе выдоха, в то время как активация ГОМК-рецепторов задерживает переход от фазы выдоха к фазе вдоха. Если же исходить из трехфазной схемы дыхательного цикла (инспирация, постинспирация, экспирация), то под действием оксибутирата (агониста ГАМКА-рецепторов) - между экспирацией и инспирацией [32].



Глава 2. Методы исследования

Эксперименты были проведены на 20 беспородных белых крысах обоего пола и носили острый характер. Масса особей равнялась 400-600 г, возраст - не менее трех месяцев. В качестве функциональной нагрузки применялись гиперкапническая (5-6% углекислого газа в воздухе) и гипоксическая (10% кислорода в азоте) газовые смеси и оксибутират лития (40% раствор). Газовую смесь получали путём смешивания воздуха, азота и углекислого газа из баллона.

Фракционную концентрацию газа в смеси рассчитывали на основании соотношения потоков газов и воздуха, определяемых с помощью прибора контроля микроклимата ПКМ. Содержание кислорода и углекислого газа в смеси контролировали после прохождения смеси через блок увлажнения, где она насыщалась парами воды при температуре 37оС для предотвращения высыхания слизистой оболочки дыхательных путей при дыхании “сухими” газами из баллонов.

Работа выполнена с помощью установки на основе хирургического монитора МХ-01. Параметры системной гемодинамики, артериальное давление и частоту сердечных сокращений, регистрировали посредством катетера введённого в бедренную артерию. Катетер был присоединён к датчику высокого давления хирургического монитора. Сигналы с датчика усиливали и обрабатывали с целью получения показателя среднего артериального давления с помощью блока артериального давления.

Для регистрации внутрипищеводного давления, в пищевод вводился катетер с эластичным баллончиком на конце. Баллончик заполнялся водой. Этот катетер присоединялся к датчику низкого давления. Сигнал от него поступал к блоку обработки венозного давления монитора МХ-01. Давление в системе устанавливалось таким, чтобы во время пассивного выдоха оно составляло 0 мм рт. ст.

При изучении роли ГАМК-ергических механизмов воздействия на хемочувствительность рецепторов кардиореспираторной системы, мы использовали ГАМК-миметик оксибутират лития, т.к. это в большей степени соответствует положению, существующему в организме в нормальных и патологических условиях. Оксибутират является ГАМК- позитивным оксипроизводным, который легче, чем ГАМК, проникает через гематоэнцефалический барьер. Для активации ГАМК- и ГОМК-рецепторов был выбран наиболее легковоспроизводимый и наименее травматичный путь введения. Способность выбранного вещества проникать через ГЭБ позволяла воздействовать на соответствующие рецепторы всего организма, включая и интересующие нас хеморецепторы аортального и каротидного синуса, а так же на дыхательный центр мозга. Вещество вводили системно, через катетер, вставленный в бедренную вену.

Подготовка крыс к эксперименту заключалась во внутрибрюшинной наркотизации животных этаминалом, из расчёта 50 мг/кг, и последующей фиксации животного на препаровальном столе. Температура тела животного измерялась ректально с помощью специального датчика хирургического монитора сразу после наркотизации и поддерживалась на уровне 37,5 - 38,5оС градусов с помощью лампы инфракрасного света.

После достижения наркотического состояния, проводилось частичное вскрытие животного с применением минимального количества надрезов для минимизации количества нарушений целостности кровеносной системы. Вскрытие проводилось на уровне верхней трети трахеи. В пищевод вставлялся датчик внутрипищеводного давления (ВПД), а в трахею вставляли дыхательную канюлю, через которую во время тестирования подавали гиперкапническую газовую смесь. Затем производилось вскрытие задней лапы для подключения датчиков хирургического монитора с помощью артериального катетера для получения данных об артериальном давлении, а в вену вставлялась канюля для введения активных веществ.

Перед началом эксперимента, жизненные показатели животного приводились к состоянию близкому к норме (BTPS).

После достижения необходимого результата начиналась первая часть эксперимента: в лёгкие животного, в течение пяти минут, подавали гиперкапническую газовую смесь. В течение следующих десяти минут после прекращения подачи смеси, животное приходило в состояние физиологической нормы. А затем вводили оксибутират лития, из расчёта 750 мг/кг. Вводили вещество в течение минуты, ориентируясь на показатель среднего АД, т.к. препарат вызывает падение АД, а быстрое введение может спровоцировать остановку дыхания. Затем в течение получаса после введения наблюдалось нарушение ритма дыхания. Эти нарушения служили сигналом для начала второй части эксперимента, во время которой, мы повторно подавали гиперкапническую газовую смесь.

Так же в работе нами был использован аналогово-цифровой преобразователь, который позволял оцифровать сигнал с МХ-01 для последующей обработки с помощью ПК и цифровой двухканальный тензометрический усилитель DTA-001, спроектированный и собранный в НПФ “Биола” Института экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Этот прибор позволяет получить представление периодических вариаций биоимпеданса в частотной области с помощью преобразования Фурье, представленного в виде графиков зависимости амплитуды от частоты. Обработка сигнала с тензорного усилителя проводилась с помощью программного пакета «А5» идущего в комплекте с DTA-001.

Для изучения возможностей корректировки реакции КРС при активации ГАМКергической системы, было принято решение подействовать на глутаматергическую нейромедиаторную систему. Это решение объясняется физиологической ролью глутаматергической системы, т.к. эта система является активаторной, а ГАМКергическая система является тормозной. В качестве вещества для оказания влияния на глутаматергическую систему нами были выбраны антитела к глутамату. Эти антитела были получены в Лаборатории нейроиммунопатологии ФГБНУ НИИ ОПП. Полученные антитела вводили интраназально с использованием механического дозатора (микропипетки) со сменными колпачками.

В экспериментах были частично использованы методические разработки Лаборатории, такие как дозировка препарата антител для использования в экспериментах (10мкл/кг, 600мкг/кг)

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного пакета Statistica 6, а так же с использованием математического модуля программы Excel из набора приложений Microsoft Office 2010. Блок-схема установки представлена на рисунке 2, а её внешний вид на рисунке 1. Параметры дыхания и системной гемодинамики регистрировали на самописце Н-338, подключенном к монитору МХ-01. Полученные результаты выражали как среднее арифметическое ± ошибка среднего (M±m). Достоверность различия оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Достоверным считали отличие при p?0,05.

Таблица 1 Количество крыс, использованных в экспериментах (по сериям)

Серия экспериментов	Число животных
Деятельность КРС в условиях гипоксии и гиперкапнии до и после активации ГАМКергической системы	6
Коррекция деятельности КРС при активации ГАМКергической системы	14
Всего	20

Рисунок 1. Общий вид экспериментальной установки

Рисунок 2. Блок-схема экспериментальной установки

Рисунок 3. Животное закреплённое в стереотаксическом станке перед началом эксперимента



Глава 3. Результаты

В ходе первой серии экспериментов мы наблюдали качественную реакцию дыхательной системы на изменение газового состава вдыхаемого воздуха. Количественные значения представлены в таблице 2. В таблице приведены числовые значения показателей дыхания и системной гемодинамики.

Таблица 2 Реакция на подачу гиперкапнической газовой смеси до и после введения оксибутирата лития

Параметр	До введения	После введения
	фон	5-я минута	фон	5-я минута
ЧСС, мин-1	394±11	400±10	360±11	330±12
АД мм рт.ст.	105±7	115±6	95±7	87±3
МОД, мл/мин	27,2±2	64,6±3	23,7±3	24,8±3
ЧД, мин-1	64,7±2	66,3±3	39,4±4	35,3±2
ДО, мл	0,45±0,045	0,899±0,01	0,732±0,02	0,89±0,015

В ходе экспериментов изменения ЧСС и АД выявлены не были. Увеличение дыхательного объёма также связано с началом подачи смеси (рисунок 5). Уменьшение частоты дыхания в большей степени связано с увеличением амплитуды дыхательных движений. Так же, необходимо отметить, что изменение хемочувствительности не связано с нарушениями в процессе ритмогенеза. Другими словами, мы наблюдали ослабление реакции организма на увеличение содержания углекислого газа во вдыхаемом воздухе во всех экспериментах.

После введения оксибутирата у крыс наблюдался патологический тип дыхания, в виде периодического апнейстического дыхания. Этот тип дыхания представляет собой группы из двух-трех дыхательных циклов с продолжительной паузой между группами в фазе спокойного выдоха.

Рисунок 4. Изменение внешнего дыхания во время гипоксии до введения оксибутирата. Стрелками отмечено начало и окончание подачи газовой смеси.

Рисунок 5. Изменение внешнего дыхания во время гиперкапнии до введения оксибутирата. Стрелками отмечено начало и окончание подачи газовой смеси.

Во время подачи гипоксической газовой смеси, была отмечена нормализация дыхательного ритма, но этот эффект мы наблюдали только до окончания симуляции гипоксии. Во время гиперкапнического воздействия, нормализация дыхательного ритма не наблюдалась.

В ходе второй серии экспериментов для изучения возможностей коррекции деятельности КРС при стимуляции ГАМК-медиаторной системы, подопытных животных мы разделили на две группы. В первой группе были животные, которым предварительно ввели антитела к глутамату, а во второй группе животным антитела к глутамату вводили после развития периодического дыхания.

У крыс, которым антитела к глутамату вводили до эксперимента, в ответ на введение оксибутирата ритм дыхания замедлялся, но дыхательные движения были регулярными и периодического дыхания не возникало. Ритм дыхания был ровным с редкими вставочными вдохами. Однако у второй группы крыс, так же, как и у крыс в первой серии экспериментов наблюдалось изменение ритма дыхания после введения оксибутирата на периодическое апнейстическое, которое сохранялось продолжительное время, но в течение 10-15 минут после интраназального введения антител к глутамату, ритм дыхательных движений нормализовывался.



Глава 4. Обсуждение результатов

В первой серии экспериментов мы наблюдали классическую реакцию на повышение количества углекислого газа во вдыхаемом воздухе. Реакция заключалась в увеличении глубины и минутного объема дыхания с уменьшением его частоты. Эти эффекты связаны физиологически, т.к. практически невозможно поддерживать частоту дыхания на прежнем уровне при увеличении глубины дыхания почти в два раза, при условии, что глубина дыхания автоматическая и намеренно не ограничена. Эта реакция является защитной и призвана усилить газообмен в лёгких, что приводит к увеличению насыщения крови кислородом.

Эффекты, наблюдаемые после активации ГАМК-ергической системы отличаются от зарегистрированных в контрольных условиях. Отличия заключаются в ослаблении чувствительности к увеличению концентрации углекислого газа во вдыхаемом воздухе, и как следствие, отсутствие статистически значимого изменения вентиляции, а также глубины и частоты дыхания.

В ходе экспериментов нами так же были замечены изменения ритмичности дыхания. Мы наблюдали периодическое апнейстическое дыхание, но этот эффект объясняется воздействием выбранного нами вещества на ГАМК-ергическую систему и не связан с хемочувствительностью рецепторов кардиореспираторной системы. Причина наблюдаемого нами эффекта заключается в центральном блокировании передачи хеморецепторной импульсации и переходе на регуляцию дыхания по концентрации кислорода[26; 27].

Во второй серии экспериментов животные были поделены на две группы. В первую группу входили животные которым антителами к глутамату вводили предварительно, а вторая группа животных получала антитела после активации ГАМКергической системы.

В ходе экспериментов второй серии в разных группах животных наблюдались различные реакции КРС на изменение газового состава вдыхаемой смеси, после введения ГАМК-миметика. Наиболее заметным отличием между реакциями было изменение типа дыхания.

В первой группе животные в условиях гипоксии проявили слабую чувствительность к изменению газового состава дыхательной смеси. В первую очередь эта реакция связана с эффектом удаления глутамата из систем мозга отвечающих за регуляцию дыхания. По имеющимся данным, глутамат является стимулятором хеморецепторной системы дыхания [11]. Так же в литературе описана роль глутамат- и ГАМК-ергических систем мозга в регуляции дыхания. В условиях гипоксии усиление вентиляции легких связано со стимуляцией глутаматергической системы мозга, а постепенное ослабление вентиляции связано с выработкой и накоплением тормозных медиаторов, в частности, ГАМК [51, 55, 57]

В условиях гиперкапнии, так же как и в условиях гипоксии, ярко выраженные реакции отмечены не были. При этом объяснение наблюдаемых нами реакций КРС совпадает с объяснением реакции на гипоксию. Важным отличием результатов работы с животными первой группы от результатов первой серии экспериментов является отсутствие серьёзных нарушений дыхательного ритма. Периодическое апнейстическое дыхание не наблюдалось ни в одном из экспериментов проведенных на животных с предварительно введенными антителами к глутамату. Отсутствие периодического апнейстического дыхания, может быть связано со снижением количества глутамата в мозге животного, и как следствие ослаблением деятельности регуляторных систем активируемых глутаматом.

Во второй группе в условиях гипоксии после введения оксибутирата, было отмечено нарушение дыхательного ритма, выраженное в становлении периодического апнейстического типа дыхания, т.н. «двоек», которые не наблюдались в течение всего периода подачи гипоксической газовой смеси.