Влияние светового режима, мелатонина и эпиталона на биомаркеры старения, возрастную патологию и продолжительность жизни

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00. 53 - геронтология и гериатрия

Автореферат

на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

ВЛИЯНИЕ СВЕТОВОГО РЕЖИМА, МЕЛАТОНИНА И ЭПИТАЛОНА НА БИОМАРКЕРЫ СТАРЕНИЯ, ВОЗРАСТНУЮ ПАТОЛОГИЮ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ

ВИНОГРАДОВА Ирина Анатольевна

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

доктор медицинских наук, профессор Петрищев Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Александров Валерий Анатольевич

Ведущая организация:

ГУ «Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН

Защита состоится 2009 г. на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу 197110, г. Санкт-Петербург, просп. Динамо, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент Л.С. Козина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Прогресс медицины и ее успешное развитие в экономически развитых странах приводит к постепенному увеличению средней продолжительности жизни и, в силу этого, к прогрессивному старению населения [Анисимов В.Н., 2003; Rajaratnam S.M.W., Arendt J., 2001]. Непрерывное увеличение продолжительности жизни является одной из причин увеличения доли пожилых в общей численности населения [Arking R., 1991]. Это приводит к увеличению общественного и научного интереса к проблемам теоретической и экспериментальной геронтологии [Khavinson V.Kh., 2002]. Основная задача геронтологии и гериатрии - сделать жизнь пожилых людей более здоровой и активной - становиться все более актуальной. Изучение структурно-функциональной организации и механизмов регуляции систем жизнеобеспечения в норме и при развитии процесса старения является одной из проблем фундаментальной геронтологии [Dilman V.M., 1994].

Ряд вопросов о механизмах старения в различных условиях, под действием различных стрессорных факторов можно исследовать, только проводя эксперименты на животных. Лабораторные животные, как модельные системы для изучения старения, возрастной патологии у людей и для разработки подходов к лечению, имеют большое значение [Каркищенко Н.Н., 2004].

Различные стрессорные воздействия могут привести к увеличению продолжительности жизни или к ее сокращению. Одним из регуляторов физиологических ритмов у человека и животных является смена циркадианного цикла дня и ночи. Установлено, что воздействие света ночью напрямую связано с серьезными проблемами поведения, а также с состоянием здоровья и развитием злокачественных новообразований [Хавинсон В.Х., и др., 2003; Di Lorenzo L. et al., 2003; Ha M., Park J., 2005; Anisimov V.N., 2006]. Эксперименты на плодовых мушках показали, что воздействие постоянного освещения приводит к уменьшению продолжительности их жизни. У грызунов ночное освещение приводит к нарушению овуляторного цикла и к последующему развитию опухолей в молочной железе, яичниках и матке [Анисимов В.Н., 2003; Prata Lima M.F. et al., 2004; Filipski E. et al., 2005]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о повышенном риске развития рака молочной железы и толстой кишки у работников ночных смен и о сниженном риске у слепых женщин [Rafnsson V. et al., 2001; Pukkala E. et al., 2002; Reynolds P. et al., 2002; Schernhammer E.S. et al., 2003]. В настоящее время воздействию светового загрязнения (включенного освещения ночью) подвергается довольно большое число людей. Вот почему становиться актуальным экспериментальные исследования, выясняющие роль нарушения светового режима в процессе старения и канцерогенеза.

На Северо-Западе России (в условиях Карелии) наблюдается своеобразный фотопериодизм, проявляющийся длинным световым днем в весенне-летний период (с середины мая до середины июля - сезон «белых ночей») и короткой продолжительностью дня в осенне-зимний период (4,5 часов). Модифицирующее действие постоянного освещения на физиологические процессы организма описано многими исследователями [Солонин Ю.Г., 1998; Анисимов В.Н. и др., 2003; Батурин Д.А. и др., 2004; Van der Beek E.M., 1996; Wehr T.A., 2001; Stevens R.G., 2006]. Однако влияние сезонных колебаний освещенности, как естественного нарушения циркадианного ритма, изучено недостаточно.

Разработка новых геропротекторов, способных задержать старение всего организма или наиболее важных органов и систем, и исследование их влияния на возрастные гормонально-метаболические и иммунологические изменения является одним из актуальных направлений в геронтологических исследованиях. В связи с этим встает вопрос о безопасности длительного применения средств продления жизни, что включает в себя не только непосредственные побочные и токсические эффекты, но и отдаленные последствия, например, развитие новообразований. В ряде работ показано, что геропротекторы обладают антиканцерогенными свойствами, однако при длительном применении некоторых из них наблюдается увеличение частоты развития опухолей [Анисимов В.Н., 2003]. Поэтому актуальным является всестороннее комплексное изучение действия геропротекторов в эксперименте, позволяющее оценить их действие на процессы старения, развитие возрастной патологии и новообразований.

К наиболее перспективным геропротекторам относят препарат мелатонин (МЛТ) и пептид эпиталон (ЭПТ), регулирующий функцию эпифиза [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001; Анисимов В.Н., 2003]. Известно, что с возрастом наблюдается снижение уровня индольного гормона эпифиза МЛТ в организме [Raitier M.N., 1992; Arendt J., 2005; Anisimov V.N., 2006; Di Bella L., Gvalano L., 2006], что вызывает большой интерес к изучению этого гормона, обладающего разнообразными эффектами. Во многих работах при использовании МЛТ отмечено увеличение продолжительности жизни [Pierpaoli W., Regelson W., 1994; Mocchegiani E. et al., 1998], тогда как в других опытах наблюдалось отсутствие увеличения продолжительности жизни и возрастание частоты опухолей [Романенко В.И., 1983]. Применение МЛТ угнетает канцерогенез у пинеалэктомированных крыс или животных, содержащихся в стандартном чередующемся или постоянном режиме освещения [Baturin D.A. et al., 2001]. Представленные данные предполагают возможность использования МЛТ в качестве препарата для профилактики развития злокачественных новообразований у людей, подвергающихся световому загрязнению.

Синтетический пептид ЭПТ [Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003], стимулирующий продукцию МЛТ, обладает способностью увеличивать среднюю и максимальную продолжительность жизни и замедлять темп старения у плодовых мух. У мышей разных линий ЭПТ оказывает неоднозначное действие [Попович И.Г., 2004]. Действие ЭПТ на крыс в сочетании с различными световыми режимами ранее не изучалось. Исследование геропротекторных свойств МЛТ и ЭПТ в различных световых режимах, включая и естественное освещение на Северо-Западе России (Карелия), в сравнительном аспекте является весьма актуальным.

Длительное наблюдение за лабораторными животными позволяет оценить динамику различных маркеров биологического возраста, процесс развития возрастной патологии и опухолей, а также изучить влияние различных световых режимов и исследуемых препаратов на старение и спонтанный канцерогенез. Биомаркерами возраста и гомеостаза в исследованиях часто служат такие показатели, как масса тела, количество потребляемого корма, поведенческие тесты, физическая работоспособность, репродуктивная функция, уровень свободнорадикальных процессов и многие биохимические параметры (уровень гормонов, состояние углеводного и жирового обменов и др.) [Анисимов В.Н., 2003]. В качестве интегрального показателя темпа старения используют динамику выживаемости и смертности животных.

Следует отметить, что исследования с комплексным использованием этих критериев, наряду с известными показателями интенсивности канцерогенеза (частота опухолей, латентный период и др.) при изучении влияния такого стрессирующего фактора как нарушение светового режима, в том числе и сезонного колебания освещенности на Северо-Западе России, и применения геропротекторов (мелатонина и эпиталона) не проводились.

Цель исследования

Комплексное сравнительное изучение длительного влияния различных световых режимов (стандартный чередующийся режим, постоянное освещение, естественное освещение Северо-Запада России, постоянная темнота) в сочетании с применением геропротекторов (мелатонина и эпиталона) на показатели биологического возраста, развитие возрастной патологии и спонтанный канцерогенез у самцов и самок крыс, а также оценка темпов старения организма и развития ассоциированных с возрастом различных патологических процессов.

Задачи исследования

Изучить влияние различных световых режимов (стандартное освещение, постоянное освещение, естественное освещение Северо-Запада России, постоянная темнота) на биомаркеры гомеостаза и старения, развитие возрастной патологии, показатели продолжительности жизни и спонтанный канцерогенез у крыс. световой патология канцерогенез геропротектор

Сравнить темпы изменения биомаркеров гомеостаза и старения, показателей продолжительности жизни, развития возрастной патологии у крыс при различных световых режимах.

Оценить влияние экзогенного мелатонина на продолжительность жизни, показатели гомеостаза и биологического возраста, а также на развитие спонтанных опухолей у крыс при различных световых режимах.

Оценить влияние эпиталона на продолжительность жизни, показатели гомеостаза, биологического возраста и развитие спонтанных опухолей у крыс при различных световых режимах.

Провести сравнительный анализ эффективности мелатонина и эпиталона в различных световых режимах и оценить перспективы их дальнейшего изучения в качестве средств профилактики преждевременного старения и предупреждения новообразований у человека в условиях светового загрязнения.

Научная новизна исследования

В диссертационной работе впервые установлено, что в условиях модулированного фотопериодизма (постоянное освещение, естественное освещение Карелии, постоянная темнота) у крыс возникают нарушения функционирования основных систем организма, сопровождающиеся более ранним развитием возрастной патологии по сравнению с особями, находящимися в стандартном режиме освещения.

Впервые изучено влияние различных световых режимов на показатели гомеостаза и биологического возраста (потребление корма и воды; масса тела; диурез; эстральный цикл; поведенческие реакции; физическая и умственная работоспособность; уровень свободнорадикальных процессов в тканях; биохимические показатели жирового, углеводного и белкового обменов; гормональный статус), развитие спонтанных опухолей и продолжительность жизни у крыс.

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о неблагоприятном действии естественного освещения Карелии («белые ночи» в летний период и удлиненная темновая фаза в осенне-зимний период) на показатели гомеостаза, продолжительность жизни и риск развития спонтанных опухолей.

Впервые изучено влияние экзогенного мелатонина и синтетического пептида эпиталона на биомаркеры старения и гомеостаза, продолжительность жизни и возникновения спонтанных опухолей у крыс, содержащихся в различных световых режимах.

Впервые проведена комплексная оценка эффективности применения мелатонина и эпиталона на показатели старения и гомеостаза, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у самцов и самок крыс при различных режимах освещения.

Научно-практическая значимость работы

Метод комплексной оценки влияния различных режимов освещения и применения препаратов (мелатонина и эпиталона) на старение, показатели гомеостаза, развитие возрастной патологии и спонтанного канцерогенеза является достаточно адекватным и оптимальным, что позволяет экстраполировать полученные результаты на человека.

Выявленные закономерности следует учитывать при идентификации факторов риска ускоренного старения, преждевременного развития возрастной патологии, возникновения и развития доброкачественных и злокачественных новообразований, а также для разработки научно-обоснованных мер их профилактики.

Применение мелатонина и эпиталона замедляет возникающее полиорганное снижение функциональных резервов организма, проявляющееся снижением толерантности к стрессорным воздействиям, и снижает риск возникновения спонтанных опухолей, что свидетельствует о глубокой связи механизмов старения и канцерогенеза.

Выявление геропротекторного эффекта и антиканцерогенных свойств мелатонина и эпиталона у животных, содержащихся в условиях нарушенного светового режима, свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения этих препаратов в качестве средств профилактики ускоренного (преждевременного) старения и рака в группах повышенного риска (лица, проживающие в северных районах России или работающие при инвертированном освещении).

Положения, выносимые на защиту

Содержание самцов и самок крыс в условиях постоянного освещения сопровождается ускоренным старением многих функциональных систем и организма в целом, развитием возрастной патологии и спонтанных опухолей, уменьшает продолжительность жизни.

Содержание самцов и самок крыс в условиях световой депривации тормозит возрастные изменения большинства показателей биологического возраста и старения, снижает риск развития опухолей и увеличивает продолжительность жизни.

Содержание в условиях естественного освещения Карелии проявляется у самцов и самок крыс неблагоприятным влиянием на биомаркеры старения и гомеостаза, увеличением риска развития опухолей и уменьшением продолжительности жизни.

Применение препаратов эпифиза (мелатонина и эпиталона) оказывает защитный эффект, уменьшает неблагоприятное влияние постоянного освещения, улучшает показатели гомеостаза, замедляет процессы старения и увеличивает продолжительность жизни животных.

Пептидный препарат эпифиза эпиталон обладает более выраженными геропротекторными и антиканцерогенными свойствами, чем мелатонин, в условиях нарушенного светового режима и является перспективным препаратом для исследования в геронтологии и для практического применения в гериатрии, в частности, для коррекции нарушений гомеостаза, возникающих в условиях нарушенного фотопериодизма.

Публикации

По теме диссертации опубликована 61 работа, включая 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для опубликования результатов диссертационных исследований.

Работа поддержана грантами РФФИ 2004-2006 №04-04-49168-а «Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни, возрастную патологию и их фармакологическая коррекция»; РГНФ 2004-2006 № 04-06-00120а «Белые ночи на Европейском Севере - как фактор, нарушающий функцию репродуктивной системы. Возможности фармакологической коррекции»; РГНФ-Север 2004-2006 №04-06-49602 а/с «Модельное исследование адаптационных возможностей организма при изменении циркадианных ритмов в течение годового цикла при проживании в северных климатогеографических зонах»; РФФИ-Север 2005-2007 №05-04-97525-р_север_а «Экспериментальные основы влияния освещенности на гормональный статус и некоторые биохимические показатели в условиях Карелии»; РФФИ 2007-2009 №07-04-00546 «Влияние возраста на динамику адаптационных изменений активности ферментов к различным световым режимам и их фармакологическая коррекция»; РГНФ-Север 2007-2009 № 07-06-42602а/С «Белые ночи на Русском Севере - как фактор, нарушающий возрастную адаптацию водно-солевого обмена. Возможности фармакологической коррекции».

Апробация диссертации

Основные результаты работы были представлены на отечественных и международных форумах: III, V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2003; 2007); III Международной научной конференции "Состояние биосферы и здоровье людей" (Пенза, 2003); II Международном симпозиуме "Проблемы ритмов в естествознании" (Москва, 2004); 11-15 Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2004; 2005; 2006, 2007, 2008); VI международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2004); V международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2005) XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); Международный симпозиум «Жизнь и работа на Севере» (Костомукша, 2003); 10 симпозиум «Витамины и адаптация» (Йена, Германия, 2005); 4 Интернациональное совещание «Психоэмоциональные, поведенческие и когнитивные расстройства у пожилых - ABCDE» (Болонья, Италия, 2006); 14 Европейский биогеронтологический конгресс (Москва, 2006); Международной конференции «Погода и биосистемы» (СПб, 2006); Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006); Конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (Сочи, 2006); V и VI Европейском конгрессе по старению (Австрия, 2006; Санкт-Петербург, 2007); XII Международном симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2007); Международном конгрессе «Социальная адаптация, поддержка и здоровье пожилых людей в современном обществе» (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «50 лет мелатонину: итоги и перспективы исследований» (Санкт-Петербург, 2008), Российских конференциях по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2007, 2008).

Связь с планом НИР

Диссертационная работа является темой, выполняемой по основному плану НИР Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Петрозаводский государственный университет».

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Объем работы составляет 373 страницы. Список литературы содержит 401 источник, в том числе 155 отечественных и 246 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 70 таблицами и 79 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Эксперименты были проведены на 1001 крысе, собственной разводки, первоначально полученных из НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова. Животных содержали в стандартных помещениях вивария площадью 25 м2 в клетках размером 44х25х62 см по 10 животных при температуре 22±20С. Все животные получали стандартный готовый лабораторный корм и воду без ограничений. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным.

В работе были использованы мелатонин (N-acetyl-5-methoxy-tryptamine) (Sigma; США); эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), синтезированный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН; физиологический раствор (Polfa; Польша).

На крысах изучали влияние различных световых режимов в сочетании с применением мелатонина и эпиталона на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и частоту спонтанных опухолей. Исследование проводили до естественной гибели животных. Для измерения освещенности помещений использовали люксметр "Ф-107" (Россия).

В 25-дневном возрасте всех крыс рандомизировано разделили на 4 группы. Первая группа крыс (159 самцов и 144 самки), находилась в условиях стандартного фиксированного режима освещения (12 часов свет 750 лк: 12 часов темнота; LD). Вторая группа животных (148 самцов и 144 самки) находилась в условиях естественного освещения (NL), в данном случае учитывались особенности годовой фотопериодичности Северо-Запада России. Многократные измерения освещенности производились в различное время суток в течение годового цикла. При данном режиме освещенность помещений определялась сезоном года: зимой минимальная продолжительность дня составляла 4,5 часа, а летом продолжительность светового дня достигала 24 часов («белые ночи»). Освещенность в помещении изменялась в течение суток и составляла на уровне клеток в утренние часы - 50-200 лк на 1 м2 площади, днем - до 1000 лк в ясный день и 500 лк в пасмурный день, к вечеру - от 150 до 500 лк на 1 м2 площади. Третья группа крыс (145 самцов и 149 самок) содержалась при круглосуточном постоянном освещении (750 лк; LL). Животные четвертой группы (51 самец и 61 самка) находились в условиях световой депривации (DD), при этом освещенность в помещении составляла 0-0,5 лк на 1 м2 площади.

В возрасте 4 месяцев крыс первых 3 групп разделили на 3 подгруппы. Крысы первой подгруппы получали 5 дней в неделю с питьевой водой в ночное время МЛТ (10 мг/л). Крысам второй подгруппы ежемесячно 5 дней в неделю подкожно в утренние часы вводили ЭПТ по 0,1 мкг на крысу в 0,1 мл физиологического раствора. Крысы третьей подгруппы являлись контрольными.

В работе исследовали различные показатели гомеостаза и старения (масса тела, поглощение корма и воды, диурез, эстральный цикл, поведенческие реакции, физическая работоспособность, процессы обучения и памяти). Проводили измерение уровня свободнорадикальных процессов, оценивали биохимические показатели жирового, углеводного, белкового и электролитного обменов, гормональный статус. Исследовали динамику гибели животных, продолжительность жизни и различные параметры канцерогенеза.

У крыс ежемесячно одновременно с взвешиванием производили определение количества потребляемого корма; проводили визуальный и пальпаторный осмотр на наличие опухолей и других заболеваний. У самцов регистрировали количество выпитой воды, диурез и содержание в моче глюкозы и кетонов (тест-полоски для анализа мочи «Multistix 10 SG»; «Байер», США), а также поведенческие, психоэмоциональные и когнитивные процессы. Для расчета функциональных периодов развития крыс-самцов были использованы методы, предложенные И.И. Шмальгаузеном (1935) и S. Brody (1945) [Махинько В.И., Никитин В.Н., 1977]. Поведенческие реакции изучали в тесте «открытое поле» [Буреш Я. и др., 1991]. Психоэмоциональные проявления оценивали по трехбалльной системе [Родина В. И. и др., 1993]. Тест «челночный лабиринт» использовали для оценки когнитивных процессов [Навакатикян М.А., Платонова Л.Л., 1988]. Для оценки статической работоспособности использовали тест «горизонтальный экран-сетка» [Анисимов В.Н. и др., 2001]. Для оценки динамической работоспособности использовали тест «принудительного плавания» [Бобков Ю.Г. и др., 1984]. У самцов и самок фиксировали время полового созревания (опущения яичек в мошонку и время открытия влагалища). Раз в три месяца у самок, начиная с 3-месячного возраста, брали влагалищные мазки для изучения эстральной функции. Пять особей из каждой исследуемой группы в возрасте 6, 12, 18 и 24 месяцев исследовали рентгенографически для определения возрастных изменений скелета.

В возрасте 3, 6, 12, 18 и 24 месяца у 10 крыс из каждой подгруппы собирали кровь, животных вскрывали и отбирали образцы тканей для последующего биохимического и морфологического исследования. Стандартными биохимическими методами определяли уровень глюкозы, общего белка, холестерина, в-липопротеидов, мочевины, креатинина, ионов натрия и калия в крови [Комаров Ф.И. и др., 1976]. Содержание трийодтиронина, тироксина, тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови определяли в автоматическом анализаторе IMMULITE (США) с помощью твердофазных, хемилюминесцентных ферментных иммунных наборов IMMULITE; при помощи иммуноферментного метода (наборы фирмы «Биохиммак», США) - содержание пролактина и С-пептида. Оценивали суммарную динамику изучаемых параметров по коэффициенту стабильности гомеостаза (КСГ), который представлял собой отношение общего числа биохимических и эндокринологических показателей, соответствующих значениям у зрелых крыс в возрасте 3 мес., к общему числу изучаемых показателей [Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 1991].

Оценивали параметры, характеризующие уровень образования свободных радикалов и системы антиоксидантной защиты в печени, почках, сердце, скелетной мышце: уровень хемилюминесценции, активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Состояние антиоксидантной системы (АОС) определяли хемилюминесцентным методом с использованием двух люминофоров: люминола и люцегинина и двух активаторов свечения: соли железа двухвалентного и перекиси водорода. Активность СОД исследовали модифицированным адренохромным методом Fridovich, активность каталазы по количеству разложенной перекиси водорода - спектрофотометрическим методом по Beers, Sizes; содержание белка определяли методом Lowry.

Убитых или павших по ходу опыта животных вскрывали. На аутопсии осматривали все внутренние органы. Новообразования классифицировали согласно рекомендациям МАИР как «фатальные» или как «случайные» [Gart J.J. et al., 1986]. Все опухоли и основные внутренние органы, подозрительные на наличие опухолевого роста, после обычной гистологической обработки изучали микроскопически. Использовали гистологическую классификацию опухолей, предложенную МАИР [Turusov V.S., Mohr U., 1990].

Рассчитывали среднюю продолжительность жизни (СПЖ) всех и последних 10% максимально проживших крыс, максимальную продолжительность жизни (МПЖ). При анализе скорости старения параметры модели Гомперца определяли по реальным данным, используя метод максимального правдоподобия в приложении для Гауссовских статистических систем [Gauss System and Graphic Manual, 1994]. При расчете кинетических параметров популяционного старения использовали модель Гомперца для функции выживания:

,

где параметры б и в связаны с популяционной скоростью старения и начальной силой смертности, соответственно.

Параметр б часто характеризуется также величиной времени удвоения силы смертности (MRDT), рассчитанный как ln(2)/б. Для анализа выживания использовали метод Кокса. Доверительные интервалы для показателей скорости старения рассчитывали, используя log-подобные функции [Cox D.R., Oakes D., 1996].

Анализ данных проводился в среде интегрированных пакетов статистических программ STATGRAPH, STADIA, EXCEL общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стьюдента, непараметрическому U-критерию Уилксона-Манна-Уитни, точным методом Фишера и методом ч2, а также P-value, рекомендованного МАИР. Для оценки влияния различных факторов (режим освещенности, препарат, пол животных) на изучаемые показатели использовали многофакторный дисперсионный анализ и рассчитывали уравнение регрессии [Ивантер Э.В., Коросов А.В., 2003].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние светового режима на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию

Одной из задач исследования явилось изучение влияния различных режимов освещения на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и спонтанный канцерогенез. Последовательный анализ изучаемых параметров показал, что скорость старения крыс в различных режимах неодинакова (табл. 1). Изменение большинства показателей указывает на неблагоприятное влияние LL и NL режима. Данные таблицы 1 являются суммарным результатом эффекта нарушения фотопериодизма, когда возраст подопытных животных равнялся 24 месяцам. За животными наблюдали до времени гибели последней крысы.

Таким образом, у крыс, находящихся в условиях LL, отмечалось снижение прироста массы тела, повышение потребления корма, увеличение времени полового созревания; чаще встречались такие заболевания, как пневмония, кератит, конъюнктивит, катаракта, инфекции ЖКТ и мочевыделительной системы, ринит, отит и миокардит; наблюдалось повышение уровня пролактина, тироксина, С-пептида, глюкозы, холестерина, бета-липопротеидов, мочевины и креатинина с одновременным снижением уровня ТТГ, общего белка и калия в крови; снижение КСГ. В печени этих животных наблюдалось снижение содержания каталазы, СОД, белка; в почках - снижение содержания каталазы, СОД, общей активности АОС; в сердце - снижение содержания белка; в скелетной мышце - снижение общей АОС, каталазы, СОД и белка; увеличение спонтанного канцерогенеза.

Для самок крыс, находящихся в режиме LL, было характерно снижение массы тела, более быстрое старение эстральной функции, снижение СПЖ и МПЖ. У самцов наблюдались уменьшение фазы прогрессивного и стабильного роста; увеличение продолжительности предстарческого периода; более ранее наступление старческого периода, более ранее появление глюкозы, кетонов в моче; выраженная глюкозурия; снижение диуреза; повышение двигательной активности и психоэмоциональных проявлений; снижение когнитивных функций и физической работоспособности. Самцы и самки уже в возрасте 3 месяцев весили больше, чем крысы в LD режиме. Относительное количество особей, имеющих абдоминальное ожирение, было больше в этой группе по сравнению с другими (табл. 2).

Имеются данные о положительной корреляции между повышенной массой тела и развитием новообразований [Weindruch R., Walford R., 1988; Dilman V.M., 1994], наши результаты находятся в определенном соответствии с этими наблюдениями. Расчет силы влияния возраста животных, различных режимов освещения, сезона года на массу тела крыс методом многофакторного дисперсионного анализа выявил зависимость динамики массы тела самцов от возраста (48,17%; F=62,88; р<0,05) и сезона года (9,68%; F=16,9; р<0,05).

Таблица 1 - Суммарная оценка влияния различных световых режимов на показатели гомеостаза, биомаркеры старения, продолжительность жизни и развитие спонтанных опухолей у самцов и самок крыс в процессе онтогенеза

Примечания. ^ - увеличение эффекта ; v - снижение эффекта = - нет влияния.

У самцов в LL режиме сокращались прогрессивный и стабильный рост и предстарческий период наступал раньше (рис. 1). Эти данные согласуются с коэффициентом стабильности гомеостаза, рассчитанным для этой группы крыс (рис. 2), а также с количеством потребления воды крысами самцами и суммарным временем удержания на горизонтальном экране-сетке. Снижение потребления воды крысами и суммарного времени удержания начиналось с возраста 12 месяцев, что соответствует окончанию фазы стабильного роста. Повышенная тревожность крыс в этом режиме также рассматривалась как проявление старения [Маркова Е.В. и др., 2005]. Гормональный дефицит МЛТ, провоцируемый LL освещением, способствовал развитию такой распространенной формы возрастной патологии, как нарушение когнитивной деятельности мозга. Снижение физической работоспособности наступало гораздо раньше, чем у крыс в режиме LD: с 12 месяца - снижение суммарного времени удержания, с 16 месяца - латентного времени удержания и с 18 месяца - продолжительности плавания. Параллельно в скелетных мышцах наблюдалось угнетение АОС, снижение содержания белка, что и обуславливало снижение физической работоспособности.

Таблица 2 - Распределение самцов крыс по массе тела в исследуемых группах

Примечания. * p<0,01; 1 р<0,05 - различия с показателем контрольной группы в LD режиме достоверны; а p<0,01 - различия с показателем контрольной группы в данном световом режиме достоверны (метод ч2)

Рис. 1. Продолжительность периодов постнатальной жизни самцов крыс в различных режимах освещения.

Примечания. Стандартное освещение - LD; постоянное освещение - LL; естественное освещение - NL; световая депривация - DD.

Ускорение возрастного изменения эстральной функции под влиянием LL выражалось в увеличении средней продолжительности овариального цикла, нарушением соотношения регулярных и иррегулярных эстральных циклов, увеличением частоты длинных эстральных циклов. У крыс этой группы наблюдался персистирующий эструс, псевдобеременность и анэструс. Повышение уровня пролактина в сыворотке крови у крыс в условиях LL подтверждается данными о связи гиперпролактинемии, нарушении репродуктивной функции и развитии климактерических дисфункций [Пивоварова С.В. и др., 2001; Романцова Т.И. и др., 2001]. О нарушении функции щитовидной железы в условиях LL можно судить по изменению уровня тироксина и ТТГ в крови.

Рис. 2. Динамика коэффициента стабильности гомеостаза у самок (А) и самцов (Б) крыс в различных режимах освещения.

Примечания. Стандартное освещение - LD; постоянное освещение - LL; естественное освещение - NL; световая депривация - DD. ^ р<0,05 - различие с показателем в группе LD в соответствующем месяце достоверны; * р<0,05 - различие с показателем в трехмесячном возрасте достоверны (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни).

Известно, что циркадианный ритм мочеобразования проявляется в том, что диурез и экскреция ряда ионов выше днем, чем ночью. При этом показано значение эпифиза в организации ритма данной физиологической функции организма [Гуткина О.Г., Наточин Ю.В., 2005]. Снижение диуреза у самцов с 15-месячного возраста, появление инфекций мочевыделительной системы и патологических сдвигов в биохимическом анализе крови указывало на более раннее возникновение нарушений водно-солевого обмена и функции почек по сравнению с режимом LD. В самих почках отмечено снижение активности АОС, что указывает на более яркое развитие процессов старения в органе. Почки являются наиболее чувствительным к действию серотонина органом, предполагая, что в условиях LL наблюдается повышенное выделение серотонина и сниженное - МЛТ, можно объяснить подобные изменения в мочевыделительной системе [Анисимов В.Н., 2003].

Анализ полученных данных указывает на неблагоприятное влияние LL освещения на показатели липидного и углеводного обменов, что согласуется с результатами ряда исследований о связи эпифиза с эндокринной регуляцией обменных процессов [Комаров Ф.И. и др., 2004; Turek F.W. et al., 2005]. Абдоминальное ожирение, гиперхолестеринемия, гипергликемия, гипербеталипопротеинемия, гиперинсулинемия и глюкозурия, обнаруживаемые у крыс, позволяют сделать вывод о наличии синдрома инсулинорезистентности (метаболического синдрома) у этих животных.

Рис. 3. Влияние светового режима на кривые выживаемости у самок (А) и самцов (Б) крыс.

Примечания. Стандартное освещение - LD; постоянное освещение - LL; естественное освещение - NL; световая депривация - DD.

В LL режиме происходило снижение иммунной защиты организма, подтверждаемое подверженностью крыс инфекционным заболеваниям. СПЖ и МПЖ были меньше у самок этой группы, а частота развития спонтанных новообразований повышена у крыс обоего пола (рис. 3, 4, 5; табл. 3, 4).

Наши наблюдения совпадают с многочисленными экспериментальными исследованиям, изучающими воздействие света ночью на спонтанный канцерогенез [Лазарев Н.И. и др., 1976; Deerberg F. et al., 1997; Baturin D.A. et al., 2001; Anisimov V.N. et al., 2004]. Данные литературы свидетельствуют о важной роли эпифиза в развитии рака МЖ - эпифизэктомия или содержание при LL освещении стимулирует развитие рака МЖ [Анисимов В.Н. и др., 2003]. Имеются работы, отмечающие роль повышенного содержания пролактина в патологии МЖ и яичка (лейдигомы) [Коркушко О.В. и др., 2006; Щепотин И.Б. и др., 2007] или отмечающие роль эндогенного серотонина, уровень которого возможно повышен в условиях LL освещения, в развитии онкопатологии [Анисимов В.Н. и др., 2003].

Рис. 4. Влияние светового режима на динамику возникновения опухолей у самок (А) и самцов (Б) крыс.

Примечания. Стандартное освещение - LD; постоянное освещение - LL; естественное освещение - NL; световая депривация - DD.

У крыс (табл. 1), находящихся в условиях NL, наблюдались снижение прироста массы тела, увеличение количества потребляемого корма и времени полового созревания, повышенная заболеваемость пневмонией, конъюнктивитами, кератитами, ринитами, отитами катарактой, инфекциями мочевыделительной системы и ЖКТ; повышен спонтанный канцерогенез; в крови был повышен уровень пролактина, С-пептида, тироксина, глюкозы, холестерина, бета-липопротеидов, мочевины и креатинина с одновременным снижением содержания общего белка, ТТГ, трийодтиронина и КСГ; в печени снижена активность каталазы и АОС в целом. В почках снижено содержание СОД, повышено содержание каталазы. В сердце снижена активность АОС, содержание белка. В скелетной мышце снижена активность АОС, каталазы, СОД, белка. У самок наблюдалось снижение веса, ускоренное старение эстральной функции, снижение продолжительности жизни. У самцов имело место повышение массы тела, удлинение фазы прогрессивного роста и предстарческого периода, укорочение фазы стабильного роста и более раннее наступление старческого периода; снижение диуреза, укорочение времени появления и увеличение количества глюкозы и кетонов в моче; повышение двигательной активности и психоэмоционального поведения, снижение умственной и физической работоспособности.

Самцы в режиме NL весили достоверно больше в возрасте 3 месяцев по сравнению с особями в условиях LD, их вес соответствовал весу самцов в режиме LL. Возраста 3 месяцев крысы достигали в июле, то есть период полового созревания приходился на период «белых ночей», когда продолжительность светового дня практически совпадала с LL режимом. Поэтому время полового созревания сокращалось и соответствовало времени полового созревания животных в режиме LL. Вес у самцов в этом световом режиме был наибольшим, также как количество особей имеющих абдоминальное ожирение (табл. 2), что соответствовало параметрам, полученным в режиме LL. Удлинение фазы прогрессивного роста связано с тем, что по мере взросления крыс уменьшалась продолжительность светового дня (с 24 часов в июне до 4,5 часов в декабре) и окончание этого периода пришлось на январь.

Таким образом, продолжительность фотопериода приближалась к условиям DD, поэтому длительность фазы прогрессивного роста в NL и DD режимах совпадает. Фаза стабильного роста была укорочена, так как в данном случае она пришлась на весну и продолжительность фотопериода приближалась к условиям LL, что в результате привело более раннему наступлению старческого периода (рис. 1).

Рис. 5. Влияние светового режима на динамику возникновения злокачественных опухолей у самок (А) и самцов (Б) крыс.

Примечания. Стандартное освещение - LD; постоянное освещение - LL; естественное освещение - NL; световая депривация - DD.

Регрессионный анализ показал достоверность влияния продолжительности светового дня в NL режиме на потребление корма самками и самцами крыс (в остальных световых режимах зависимость не обнаружена). Физиологические показатели (возрастное снижение диуреза, потребления воды, суммарного времени удержания) совпадали с окончание фазы стабильного роста у крыс-самцов. Таким образом, повышенная освещенность в первые месяцы жизни животных в условиях NL Карелии ускоряла рост организма, а снижение освещенности в осенне-зимний период способствовало замедлению роста. Волнообразный характер изменений двигательной активности, психоэмоциональных проявлений и поведения самцов отражал изменение продолжительности светового дня в течение годового цикла. Особенно чувствительной к изменениям освещенности оказалась реакция груминга - наблюдалась криволинейная регрессия между количеством умывающихся крыс, числом актов груминга и продолжительностью дня. Кроме этого, была найдена зависимость уровня пролактина от продолжительности светового дня. Для самцов было характерно развитие метаболического синдрома, на что указывают изменения жироуглеводного обмена и обнаружение абдоминального ожирения у крыс (табл. 2).

Таблица 3 - Влияние различных режимов освещения на частоту развития опухолей и продолжительность жизни самок крыс

Примечания. CПЖ - средняя продолжительность жизни; МПЖ - максимальная продолжительность жизни. a p<0,05; б p<0,01; в p<0,001 - различие с показателем в группе LD достоверно (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни); # - в скобках даны 95% доверительные интервалы.

Повышение уровня свободного тироксина с одновременным снижением содержания ТТГ и трийодтиронина указывают на возрастное нарушение функции щитовидной железы. Найдена зависимость концентрации свободного тироксина и трийодтиронина от продолжительности светового дня в течение годового цикла. Снижение КСГ указывает на нарушение гомеостаза у крыс в NL режиме, что приводило в итоге к снижению продолжительности жизни и повышению спонтанного канцерогенеза (рис. 3, 4, 5; табл. 3, 4). Диагностированная гиперпролактинемия оказывала определенное влияние на развитие новообразований. Многочисленные наблюдения показывают, что экспериментально вызванное увеличение уровня пролактина в организме ускоряет возникновение карцином, пролактин выступает в качестве промотора, стимулирующего возникновение опухолей МЖ [Ельцина Н.В., 1976].

Таблица 4 - Влияние различных режимов освещения на частоту развития опухолей и продолжительность жизни самцов крыс

Примечания. CПЖ - средняя продолжительность жизни; МПЖ - максимальная продолжительность жизни. a p<0,05; б p<0,01; в p<0,001 - различие с показателем в группе LD достоверно (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни); # - в скобках даны 95% доверительные интервалы.

Итак, NL режим способствовал более раннему созреванию организма, сокращению стабильного периода жизни, нарушению гомеостаза, увеличению темпов старения, сокращению продолжительности жизни и повышал риск развития спонтанных новообразований. Ряд показателей подвергался сезонным колебаниям освещенности в зависимости от продолжительности светового дня, на что указывают проведенные регрессионный и дисперсионный анализы. Возможно, в условиях NL нарушались периодические процессы, которые направлены на приспособление организма к циклическим изменениям окружающей среды, что и приводило к более быстрому старению. Угнетение функции эпифиза во время «белых ночей» вело к нарушению функционирования «биологических часов» организма, основной функцией которых является «подстройка» биологических ритмов функционирования организма к циклу «свет-темнота» [Комаров Ф.И. и др., 2004].

В условиях DD (табл. 1) у крыс наблюдались повышенный прирост массы тела; сниженное количество потребляемого корма; запаздывание полового созревания; пониженная заболеваемость пневмониями, кератитами и конъюнктивитами; в крови - повышенное содержание общего белка, калия и трийодтиронина; пониженное содержание пролактина; повышение КСГ; в почках - снижение активности каталазы и содержания белка; в сердце - содержание каталазы и СОД; увеличение продолжительности жизни и снижение риска развития спонтанных опухолей. У самцов отмечалось увеличение фазы прогрессивного роста и продолжительности предстарческого периода; более позднее наступление старческого периода; возрастное снижение диуреза, более позднее появление глюкозурии, в то время как кетоны появлялись несколько раньше, чем в режиме LD. Двигательная активность, статическая выносливость и психоэмоциональное поведение были снижены, а динамическая выносливость повышена. У самок наблюдалось снижение массы тела и замедление старения эстральной функции. Наименьшее количество изменений в сравнении с режимом LD отмечалось в режиме DD, хотя изменения изучаемых показателей далеко не однозначны. Крысы имели наименьший вес в возрасте 3 месяцев, что согласуется с данными о том, что низкий вес в молодом возрасте и значительный уровень возрастного нарастания веса могут являться признаками увеличения продолжительности жизни [Miller R.A. et al., 2002].

Параллельно у животных отмечалось снижение потребления корма. Снижение веса при уменьшении потребления пищи способствует замедлению скорости старения [Walford R.L, 1974; Weindruch R., Walford R.L., 1988]. Известно, что содержание животных в темноте, повышающее выработку МЛТ, оказывает антигонадотропное действие [Arendt J., 2005]. Мы наблюдали задержку полового созревания у крыс и замедление старения репродуктивной системы у самок. Удлинение прогрессивного роста у самцов подтверждалось задержкой полового созревания (рис. 1). Замедление старения репродуктивной системы соответствовало сниженному уровню пролактина в крови и более низкой частоте развития спонтанных опухолей репродуктивной системы [Анисимов В.Н. и др., 2003]. Низкая заболеваемость косвенно указывала на стабильное состояние иммунной системы крыс. Не отмечалось развитие катаракт у животных, что объясняется зависимостью развития этого заболевания от интенсивности освещения [Логвинов С.В. и др., 2003]. У крыс не наблюдалось возрастного снижения общего белка, калия и трийодтиронина, что приводило к повышению КСГ (рис. 2). Более высокие значения этого коэффициента указывают на более молодой биологический возраст особей, находящихся в DD режиме.

Увеличение продолжительности предстарческого периода и более позднее наступление старческого согласовывалось с более высокими значениями КСГ. АОС почек и сердца оказалась более чувствительна к отсутствию световой фазы. Снижение активности каталазы и содержания белка в почках, возрастное снижение диуреза, более ранее появление кетонов в моче указывают на то, что происходит старение почечной ткани. В сердце снижалась активность АОФ, что указывает на более быстрое старение этой ткани в условиях DD. У самцов наблюдалось повышение динамической выносливости в тесте принудительного плавания, что совпадает с результатами других исследований по влиянию постоянной темноты на динамику принудительного плавания у крыс [Ованесов К.Б., 1989]. Увеличение продолжительности жизни крыс в условиях DD (рис. 3), снижение риска развития спонтанных опухолей (рис. 4, 5;табл. 3, 4), уменьшение их количества, множественности и метастазирования согласуется с другими работами, в которых световая депривация увеличивает продолжительность жизни и тормозит канцерогенез у лабораторных животных [Анисимов В.Н. и др., 2003; Батурин Д.А., 2004].

Таким образом, DD режим в наших исследованиях способствовал задержке полового созревания, увеличению продолжительности жизни, снижению темпов старения организма и риска развития опухолей.

Влияние мелатонина и эпиталона на показатели биологического возраста, продолжительность жизни и возрастную патологию у крыс в различных световых режимах

Другой задачей исследования явилось изучение влияния МЛТ и ЭПТ на показатели биологического возраста и гомеостаза, продолжительность жизни и возрастную патологию в различных световых режимах. Сходство биологических эффектов МЛТ, эпиталамина и ЭПТ дают основание предполагать, что они оказывают влияние на пинеальную секрецию МЛТ [Кузник Б.И. и др., 1998; Anisimov V.N. et al., 1994]. ЭПТ представляет собой препарат весьма перспективный для восстановления снижающегося с возрастом уровня МЛТ и соответственно для профилактики и лечения возрастных заболеваний, в этиопатогенезе которых важная роль отводится МЛТ. Обобщенные результаты влияния МЛТ и ЭПТ в различных режимах освещения на биомаркеры старения, показатели гомеостаза, продолжительность жизни и развитие спонтанных новообразований представлены на таблице 5.