Получение сырого гонадотропного гормона

Размещено на http://www.allbest.ru/

Получение сырого гонадотропного гормона

Абай Г.,

Алибаев Н.Н.,

Бекетауов О.

Введение

Использование гормональных препаратов на основе гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (СЖК) эффективно повышает многоплодие у сельскохозяйственных животных[1].

СЖК - это гормональный препарат, представляющий собой стерильную сыворотку, получаемую из крови здоровых кобыл в период от 40 до 90 дня жеребости[3].

Впервые о содержании гонадотропного гормона в сыворотке жеребых кобыл сообщили H. Cole и G. Hart. По их данным у оплодотворенных кобыл гигантски возрастает в начале второго месяца жеребости содержание гонадотропного фактора в крови. Количество его достигает примерно такой же концентрации, как в гипофизе,-100- 200 и даже 300м.е. в миллилитре, или 100-300 тыс. в литре. В это время в яичниках у жеребых кобыл образуется вторая партия желтых тел. Это гигантское возрастание продукции гормона, однако сравнительно не продолжительно: через 11/2- 2 месяца количество его начинает постепенно снижаться и к четвертому месяцу становиться таким же, как у нежеребой кобылы [3].

Таким образом, кобыла в начале жеребости является мощным продуцентом одного из ценнейших гормонов. Однако, вследствие не совершенных методов определения гонадотропной активности, а также достоверно не изученных факторов прямо или косвенно влияющих на активность гонадотропина сыворотки, вопрос рационального использования животных реципиентов, улучшения качества, а также увеличения производства СЖК остается открытым, что в конечном итоге снижает экономическую эффективность использования препаратов, изготовленных на основе СЖК. Все это требует более детального изучения причин влияющих на гонадотропную активность СЖК, а также совершенствования традиционных и разработки новых методов определения гонадотропина в сыворотке крови жеребых кобыл, отбора продуцентов ГСЖК и получения сухих гормонов [6].

Материалы и методы

Работа была проведена на кафедре «Биотехнология» Южно-Казахстанского государственного университета им. М. Ауэзова, в лаборатории «Биотехнология» Юго- Западного научно-исследовательского института животноводства.

Объектом исследования послужили кобылы-доноры породы «джабе» в количестве 16 голов, разного возраста (3-10 лет) и в разные сроки жеребости (40-80 дней).

Материалом исследования послужили сыворотка жеребых кобыл (СЖК) и гонадотропин сыворотки жеребых кобыл.

Исследуемые животные были отобраны в частных крестьянских хозяйствах «Жанторе» и «Жайлау» Южно-Казахстанской области.

Препарат СЖК содержит гонадотропный гормон, который при введении животному стимулирует функцию половых желез, вызывает развитие дополнительных фолликулов при полноценном половом цикле и регулирует его фазы при некоторых формах бесплодия[2].

Заготовка сыворотки жеребых кобыл осуществляется в период с 40 по 80 день жеребости, когда в ней содержится максимальное количество гонадотропных гормонов.

Сроки жеребости кобыл-доноров определяли по дате случки. Через 40-45 дней после случки проводили диагностику жеребости кобыл на половозрелых самцах озерных лягушек[3].

Для проведения диагностики жеребости кобыл от каждой кобылы-донора было взято по 10 мл крови.

Гонадотропин крови жеребых кобыл вызывает появление спермиев в моче самцов озерных лягушек. Реакцию считают положительной, если в поле зрения микроскопа обнаруживают спермии у двух из трех подопытных самцов; отрицательной, если спермиев нет у всех трех лягушек[7].

После установления жеребости кобылы-доноры поступают для взятия крови.

Получение гонадотропина традиционными методами из СЖК осуществлялось путем осаждения балластных белков. Сыворотку смешивали с охлажденным до - 4 - 7 0С этиловым спиртом, разведенным 10М раствором уксусной кислоты и 4М раствором уксусно-кислого натрия в следующем объеме и соотношении масс. % А 15, 1-23, 5; Б 4,9- 12,5; этиловый спирт остальное.

Гонадотропин осаждают, смешивая центрифугат с охлажденным до -1-5є C этиловым спиртом в соотношении 1: (1,25-1,50) в течение 1-2 час. Полученный осадок молочного цвета (гонадотропин) отделяем от поверхностной жидкости. С пробирок собираем осажденный влажный ГСЖК и растворяем в физиологическом растворе в коллоидной мельнице из расчета 1,0-1,5 кг сырой массы на 15-20 л. Стабилизируют добавлением 40-50 г/л аминоуксусной кислоты. Осветляют раствор сепарированием, проводят коррекцию рН до 7,6-7,8, затем стерилизующую фильтрацию и лиофильное высушивание готового препарата.

В работе использованы наиболее известные способы осаждения балластных белков из СЖК. СЖК смешивали с охлажденным до 4-70 С этиловым спиртом, разведенным 10 М раствором уксусной кислоты и 4М раствором уксуснокислого натрия в следующем соотношении:

· 10М раствор уксусной кислоты 19,3%,

· 4М раствор уксуснокислого натрия 8,7%

· этиловый спирт 72,0%.

Затем полученную смесь центрифугировали со скоростью 40 об/мин, после устанавливали рН 5,9-6,0, выдерживали 30 мин для осаждения балластных белков. После балластные белки отбрасывают, а центрифугат собирали в емкости для осаждение гонадотропина.

Соотношение гормонов в плазме крови определяли на микростриповом фотометре американского производства «Stat Fax 2100», предназначенного для иммуноферментного анализа. Подсчет результатов концентраций ФСГ и ЛГ в сыворотке обследуемого образца производили с помощью многоканального спектрофотометра при длине волны 450 нм.

Результаты исследований, полученные в процессе опытных работ, обрабатывали методом вариационной статистики [9].

Результаты исследований

Для осаждения сырого гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл использовали также два способа.

· -способ, к объему центрифугата, полученного после очистки от балластных белков добавляли охлажденного до 50С этилового спирта в соотношении 1:1,25. Смесь выдерживали для осаждения гонадотропина в течение 2 часа.

· -способ, к объему центрифугата, полученного после очистки от балластных белков добавляли охлажденного до 100С этилового спирта в соотношении 1:1:1. Смесь выдерживают для осаждения гонадотропина в течение 6 часов.

Результаты получения сырой массы гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл разного возраста с использованием двух способов приведены в таблице 1.

Таблица 1- Выход сырого гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл разного возраста

Как видно из данных таблицы 1, выход сырой массы гонадотропина из сыворотки, полученной от разных по возрасту кобыл-доноров было относительно равное.

В I способе выход сырого гонадотропина составил от 740,8±25,49 мг до 1088±28,23 мг., во II способе от 706,1±23,3 мг до 1087±57,71 мг.

Следует отметить, что выход сырого гонадотропина из сыворотки крови 3-х летних кобыл-доноров оказался низким, сыворотки крови 5-и, 7-и, 8-и летних кобыл-доноров показали более высокую результативность. Сыворотки крови оставшихся кобыл-доноров занимали промежуточное положение.

Выход сырого гонадотропина из сыворотки крови жеребых кобыл 3-х летнего возраста в среднем ниже от 226,6 до 364,3 г по сравнению с другими группами. Разница высокодостоверна (Р<0,001).

При этом, высокий выход сырого гонадотропина показали сыворотки, полученные от доноров со сроком жеребости 60-75 дней, а низкий показатель отмечен в сыворотке доноров со сроком жеребости 40-45 дней.

Различия по выходу сырого гонадотропина между этими группами выскодостоверна.

Идентичная тенденция установлена по выходу сырого гонадотропина из сыворотки крови доноров с разными сроками жеребости (таблица 2).

Таблица 2- Выход сырого гонадотропина из сыворотки крови доноров с разными сроками жеребости

Так, например, выход сырого гонадотропина из сыворотки крови доноров в зависимости от их сроков жеребости в первом способе составил в пределах от 802,6±32,54 мг до 1115,5±40,90 мг, а во втором способе - от 722,7±36,8 мг до 1112,1±52,7 мг.

В целом, между использованными методами получение сырого гонадотропина достоверных отличий не установлено. В среднем всего получено 139,364 г сырой массы гонадотропина.

Однако, следует отметить, что значительное влияние на выход сырого гонадотропина оказали сроки жеребости кобыл-доноров.

гонадотропин гормон жеребый кобыла

Выводы

Наибольший выход сырого гонадотропина получен из сыворотки, полученной от 3- 5-и летних кобыл-доноров со сроком жеребости 65-80 дней и не зависимо от способов их получения в среднем составил от 1569 до 2360 мг, а минимальный выход показала сыворотка, полученная от кобыл-доноров со сроком жеребости 40-45 дней.

Выход сырой массы гонадотропина из сыворотки, полученной от доноров 6-8 лет со сроком жеребости 60-70 дней составил от 2204 мг до 2471 мг.

Высокий выход сырого гонадотропина показали сыворотки, полученные от доноров в возрасте 9-10 лет со сроком жеребости 55-65 дней. Выход сырого гонадотропина колебался в пределах от 2021 мг до 2334 мг.

Таким образом, на выход сырого гонадотропина, использованные способы существенного влияния не оказали, значительное влияние оказали возраст и сроки жеребости кобыл-доноров.

Литература

1. Бекетауов О., Алибаев Н.Н., Адилбеков Н. Биологические свойства СЖК в зависимости от дней жеребости донора-продуцента //Проблемы экологии, аридного кормопроизводства и животновотсва в Казахстане: матер. межд. науч.-практ. конф.- Шымкент: 2009. -С.221-222

2. Клинский Ю.Д. К вопросу о гормональной активности СЖК.-Овцеводство. - 1967. - №6. - С.24-27.

3. Падучева А.Л. Гормональные методы повышения плодовитости сельскохозяйственных животных.-Москва:Колос,1965.-с35-43.

4. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология.- Москва: Высшая школа, 2003.-с.191-195

5. Murphy BD (2012). Equine chorionic gonadotropin: an enigmatic but essential Centre de Recherche en Reproduction Animal, Facultй de Mйdecine Vйtйrinaire

6. Алибаев Н., Бекетауов О. Сущность проблемы сохранения генетических ресурсов каракульской породы овец, Алматы, 2002, №12, С.11-12.

7. Allen, W.R. A quantitative immunological assay for pregnant mare serum gonadotrophin.- J. Endocrinol. - 1969. - №43. - p. 581-591.

8. Омбаев А.М. О сохранении генофонда каракульских овец в Казахстане //Сборник научных трудов КазНИИК, Алматы, 1998, Т.22, С.3-7.

9. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. Москва 1980

Размещено на Allbest.ru