Микробиологические технологии в процессах ремедиации природных и техногенных объектов
Разработка технологии биоремедиации земли, загрязненной нефтепродуктами. Определение эффективности использования липолитически активных микроорганизмов для очистки жиросодержащих сточных вод. Применение микробиологических препаратов "Ленойл" и "Азолен".
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 26.12.2017 |
| Размер файла | 91,9 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://allbest.ru
На правах рукописи
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Микробиологические технологии в процессах ремедиации природных и техногенных объектов
Специальности: 03.00.23 - «Биотехнология»
03.00.16 - «Экология»
Силищев Николай Николаевич
Уфа - 2009
Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы «Ферменты и метаболиты почвенных и ризосферных микроорганизмов» (ГР № 01200210612)
Научные консультанты: Мелентьев Александр Иванович, доктор биологических наук, профессор
Логинов Олег Николаевич, доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН
Киреева Наиля Ахняфовна, доктор биологических наук, профессор
Дзержинская Ирина Станиславовна, доктор биологических наук, профессор
Ведущая организация: Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г.Пущино
Защита состоится 27 марта 2009 года в 10 часов на заседании Объединенного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ДМ 002.136.01 при Институте биологии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69. Тел/факс: 8(347) 235-62-47, e-mail: ib@anrb.ru
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г.Уфа, Проспект Октября, 69.
Автореферат разослан « « хх 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, Р.В. Уразгильдин
кандидат биологических наук, доцент
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из серьезных проблем восстановления природной среды при добыче, транспортировке и переработке нефти является ликвидация нефтяного загрязнения и утилизации отходов нефтяной промышленности. Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биохимического потенциала микроорганизмов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме (Киреева, 1996). Одним из крупнотоннажных техногенных отходов нефтепереработки при производстве смазочных масел является отработанная отбеливающая земля, содержащая в своем составе полициклические ароматические и смолистые соединения. Так, например, в 1998 году только на полигоне промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез» было накоплено свыше 150 тыс. тонн нефтезагрязненного грунта. Технологии биоремедиации нефтезагрязненных грунтов техногенного происхождения хотя и существуют, но их эффективность сравнительно невысока.
Другой серьезной экологической проблемой является очистка сточных вод предприятий пищевой промышленности и канализационных систем от жиров. Одним из перспективных способов решения этой проблемы является биоферментная технология их разложения на локальных очистных сооружениях конкретного предприятия (Молоканов с соавт., 2005). Биоферментные технологии по разложению и утилизации жиров основаны на использовании микробных липаз и микроорганизмов, способных к их продуцированию. Однако, на рынке Российской Федерации представлены лишь несколько препаратов зарубежного происхождения.
В настоящее время разработаны и производятся различные биопрепараты, предназначенные для ремедиации природных и техногенных объектов от последствий загрязнения нефтью и нефтепродуктами. В Институте биологии Уфимского научного центра РАН разработан новый высокоэффективный биопрепарат «Ленойл», созданный на основе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species. Поиск эффективных способов активизации микроорганизмов очищаемой почвы или грунта для создания полноценного микробного сообщества в нефтезагрязненных субстратах и разработка новых эффективных технологий их биоремедиации, поиск активного продуцента липаз, который мог бы стать основой отечественного биопрепарата для деструкции жиров, являются актуальной задачей.
Цель и задачи исследований. Целью исследований явилась разработка микробиологических технологий для ремедиации природных и техногенных объектов. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1. Разработать технологии биоремедиации отработанной отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, основанные на использовании биохимического потенциала микроорганизмов избыточного активного ила биологических очистных сооружений и микроорганизмов-нефтедеструкторов биопрепарата «Ленойл».
2. Разработать биотехнологии очистки отработанной отбеливающей земли и чернозема типичного, загрязненного сырой нефтью, основанные на применении комплекса микробиологических препаратов, включающего биопрепарат-нефтедеструктор «Ленойл», а также биопрепараты на основе азотфиксирующих микроорганизмов и продуцентов липазы и биологически активных веществ.
3. Разработать технологии очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения и биохимической очистки сточных вод производства изопропанола, основанные на использовании биопрепарата «Ленойл».
4. Выделить из природных и техногенных мест обитания новые штаммы липолитически активных микроорганизмов.
5. Определить эффективность использования липолитически активных микроорганизмов для биологической очистки жиросодержащих сточных вод и процессов ремедиации нефтезагрязненных объектов.
Научная новизна. Изучены микробиологические процессы, протекающие в отработанной отбеливающей земле и черноземе типичном, загрязненных углеводородами нефти, при различных приемах рекультивации. Разработаны новые способы биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, основанные на использовании избыточного активного ила биологических очистных сооружений, неорганических химических соединений и биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл». Впервые разработана биотехнология очистки отработанной отбеливающей земли и нефтезагрязненного чернозема типичного, основанная на применении комплекса микробиологических препаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин». Разработаны новые способы очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения и биохимической очистки сточных вод производства изопропанола, основанные на использовании биопрепарата «Ленойл».
Выделены и идентифицированы новые штаммы бактерий рода Serratia, проявляющие высокую липолитическую активность: Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2. Определен спектр окислительной активности этих бактерий по отношению к жирам растительного и животного происхождения, углеводородам различных классов, нефти и продуктам ее переработки.
Практическая значимость. Разработаны и запатентованы в Российской Федерации новые способы рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами (Патенты РФ № 2183142, 2237711, 2297290). Доказана высокая эффективность использования различных вариантов технологии биологической рекультивации отработанной отбеливающей земли. За период 1998-2007 гг. в ОАО «Орскнефтеоргсинтез» по разработанной технологии рекультивировано свыше 150 тыс. тонн этого техногенного отхода нефтепереработки. Доказана высокая эффективность совместного использования биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» для осуществления процесса ремедиации различных нефтезагрязненных субстратов. Разработанная биотехнология успешно испытана в 2006-2007 гг. в промышленных условиях при проведении рекультивационных работ на территории НГДУ «Бугурусланнефть» ОАО «Оренбургнефть». Разработанная биотехнология ремедиации с использованием сухой препаративной формы биопрепарата «Ленойл» также успешно прошла промышленные испытания на территории Краснодарского края при ликвидации последствий нефтяного загрязнения в 2006 г. Разработаны и запатентованы в Российской Федерации новые способы очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения и биохимической очистки сточных вод производства изопропанола (Патенты РФ № 2241032, 2263080). Доказана высокая эффективность использования биопрепарата «Ленойл» при очистке верхового болота от нефтяного загрязнения на территории Ханты-Мансийского округа. биоремедиация очистка микроорганизм ленойл
Разработаны и запатентованы в Российской Федерации новые штаммы бактерий рода Serratia, которые могут быть использованы в качестве продуцентов липолитических ферментов (Патенты РФ № 2308485, 2310685). Показана возможность использования штаммов Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2 при разработке биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод и комплексного препарата для ремедиации нефтезагрязненных объектов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- разработка технологий биологической ремедиации природных и техногенных объектов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, основанных на биохимическом потенциале микроорганизмов;
- новые штаммы бактерий рода Serratia, обладающие высокой липолитической активностьью, в качестве основы биопрепарата для деструкции жиров и комплексного препарата для ремедиации нефтезагрязненных объектов.
Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на 1) Международных конференциях: научно-практической конференции «Хозяйственно-питьевая и сточные воды: проблемы очистки и использования» (Пенза, 2000), XV, XVII, XIX научно-технических конференциях «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2002, 2004, 2006), научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2004), научно-практических конференциях «Нефтепереработка и нефтехимия - 2005; -2007» (Уфа, 2005, 2007), VIII семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2005» (Пущино, 2005), XIII конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), III научно-технической конференции «Наука, образование, производство в решении экологических проблем» (Уфа, 2006), научно-технической конференции «Китайско-Российское научно-техническое сотрудничество. Наука-образование-инновации» (Харбин, 2008); 2) Всероссийских конференциях: конференции «Почва, жизнь, благосостояние» (Пенза, 2000), II научно-практической конференции «Отходы-2000» (Уфа, 2000), научно-практической конференции «Роль средств химизации в повышении продуктивности агроэкосистем» (Уфа, 2003), II научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2003), II и III научных Internet-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 2003, 2004), Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), III научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2007), Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология-2003» (Пущино, 2003), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003), научной конференции «Новые технологии, инновации, изобретения» (Иркутск, 2005), IV Съезде общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Пущино, 2006).
Публикации. Основные результаты исследований изложены в 60 научных работах, из них 14 Патентов Российской Федерации и 15 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей ученой степени доктора наук.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 273 страницах компьютерного набора. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов исследования, выводов и практических предложений. Работа иллюстрирована 24 рисунками и диаграммами, 86 таблицами. Список литературы включает 318 источников (224 отечественных и 94 зарубежных авторов).
Личный вклад автора. Автору принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Он принимал личное участие на всех этапах исследований, в обобщении и интерпретации полученных результатов, в подготовке научных публикаций.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научным консультантам - д.б.н., профессору Мелентьеву А.И., д.б.н., профессору Логинову О.Н., сотрудникам лаборатории биологически активных веществ, к.б.н. Свешниковой, к.б.н. Четверикову С.П., к.б.н. Пугачевой Е.Г., к.т.н. Васильевой Н.С., к.б.н. Поскряковой Н.В., к.б.н. Биккининой А.Г., к.б.н. Коршуновой Т.Ю., к.б.н. Бакаевой М.Д., сотрудникам лаборатории прикладной микробиологии к.б.н. Бойко Т.Ф., к.б.н. Галимзяновой Н.Ф. за постоянную помощь в проведении экспериментов и обсуждении результатов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследования служили отработанная отбеливающая земля, загрязненная нефтепродуктами, чернозем типичный, загрязненный в результате разлива сырой нефти, и углеводородсодержащий отход, отобранный из шламонакопителя ОАО «Уфаоргсинтез».
Биопрепараты «Ленойл» и «Азолен» вносили в загрязненный грунт ежемесячно: в лабораторных экспериментах в дозе 2·108 КОЕ/г субстрата и из расчета 10 литров на 1 м2 с титром 108 КОЕ/мл в полевых экспериментах, биопрепарат «Бациспецин» в дозе 1·106 КОЕ/г субстрата в соответствии со схемами опытов. Наработка опытных партий микробиологических препаратов для проведения полевых экспериментов была осуществлена на ГУП «Опытный завод Академии Наук Республики Башкортостан», биопрепарата «Ленойл» в соответствии с ТУ 9291-016-22657427-2002, биопрепарата «Азолен» в соответствии с ТУ 9291-018-22657427-2005.
Схемы опытов включали варианты как совместного, так и отдельного применения микробиологических препаратов «Ленойл» и «Азолен». Контролем служили варианты опыта без интродукции микроорганизмов.
Для наблюдения за процессом биодеградации усредненные образцы грунта анализировали ежемесячно.
В качестве фитомелиоранта была использована Суданская трава (Sorghum sudanense).
Микробиологический анализ образцов ризосферы растений проводили согласно стандартной методике, описанной Звягинцевым (1980).
Содержание углеводородов определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы или грунта хлороформом на аппарате Сокслета по Богомолову (1984).
Фитотоксичность загрязненной и рекультивируемой почвы оценивали биотестом с помощью семян тест-растений: кресс - салата (Lepidium sativum) и редиса (Raphanus sativus, сорт красный с белым кончиком). Степень фитотоксичности грунта оценивали по соотношению числа проросших и непроросших семян и выражали в процентах по Гродзинскому (1991).
Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефти и нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии на элективные питательные среды. Численность бактерий, усваивающих органический азот, учитывали на мясопептонном агаре, азотфиксаторов - на среде Эшби, углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) - на среде Цукамуры.
Объектами исследований являлись штаммы липолитически активных микроорганизмов, выделенные из активного ила биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината. Качественное определение липолитической активности, позволяющее установить наличие липазы, проводили на твердых жирах (бараньем и свином), окрашенных нильским голубым сернокислым (Методы общей бактериологии, 1984).
Определение культуральных и физиолого-биохимических характеристик культур проводили по стандартным методикам (Практикум…, 1976; Методы общей бактериологии, 1984).
Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании Определителя бактерий Берджи (1997) и путем секвенирования фрагментов гена 16S рРНК.
Липолитическую активность микробной биомассы определяли по модифицированному методу Ота и Ямада (Ota et. al., 1966). Титр культуры определяли посевом на мясо-пептонный агар (МПА).
Синтез липаз изучали на средах с различными источниками углерода (соевая мука (ТУ - 9146-002-43327088-00), свиной и бараний жиры) и органического азота (пептон, дрожжевой экстракт, автолизат пивных дрожжей). Окислительную активность исследуемых микроорганизмов определяли по выделению углекислого газа. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах объемом 500 мл. В качестве питательной среды использовали 250 мл минеральной среды (K2HPO4 - 1 г; (NH4)2SO4·- 5 г; вода дистиллированная - 1 л) с добавлением 1% источника углерода и 5 мл суточной культуры микроорганизмов с содержанием клеток 1,0·109 КОЕ/мл. С помощью компрессора-дозатора со скоростью 520 мл/мин в герметично закрытые колбы подавали стерильный атмосферный воздух. Воздух, прошедший через колбу с микроорганизмами, окисляющими субстрат, улавливали поглотителем углекислого газа, в качестве которого использовали 200 мл 0,1 н. NaOH. Из колб с поглотителем посуточно отбирали аликвоту 10 мл и оттитровывали 0,1 н. HCl. Окислительную активность определяли по количеству образовавшегося углекислого газа, оттитрованного кислотой. В качестве контроля использовали колбы, не засеянные микроорганизмами. Длительность эксперимента составляла 3 суток.
Процесс биодеградации растительных и животных жиров исследуемыми микроорганизмами осуществляли на минеральной среде Раймонда. В ряде экспериментов в качестве дополнительных компонентов питательной среды вносили соевую муку (в концентрациях 0-2,5 мас.%) и автолизат пивных дрожжей (в концентрациях 3-9 мас.%). Жиры и масла вносили в количестве 1 мас.%. Микроорганизмы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на качалке при температуре 35°С, со скоростью вращения 180 об/мин в течение 16-96 часов. Инокулят вносили в виде суточной культуры микроорганизмов с содержанием клеток 3,0·109 КОЕ/мл. Остаточное содержание жиров определяли весовым методом после экстракции гексаном (Bridoux et al., 1994).
Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента на 5% уровне значимости. Полученные экспериментальные данные были обработаны на персональном компьютере с помощью программы Excel-2000.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Биопрепараты в процессах ремедиации
При разработке процессов биоремедиации природных и техногенных объектов были использованы биопрепараты «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин», разработанные в Институте биологии Уфимского научного центра РАН и запатентованные в Российской Федерации.
Основу биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл», составляет природный консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species. Биомассу консорциума бактерий Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 получали культивированием на жидкой среде следующего состава, г/л: Na2CO3 - 0,1; CaCl2 - 0,01; MnSO4·7H2O - 0,02; FeSO4·7H2O - 0,02; NaH2PO4 - 1,5; K2HPO4 - 1,0; MgSO4·7H2O - 0,2; NH4NO3 - 2,0; источником углерода служило дизельное топливо - 1%; вода дистиллированная - до 1 л.
Биоудобрение комплексного действия «Азолен» на основе почвенных азотфиксирующих микроорганизмов Azotobacter vinelandii ИБ 4, нарабатывали на жидкой среде 40 имеющей состав, г/л: КН2РO4 - 0,2; КНРO4 - 0,8; CaSO4·2Н2O - 0,1; MgSO4·7H2 O - 0,2; FеСl3 - 0,01; Nа2МоO4 - 0,01; сахароза - 20 г; дистиллированная вода - до 1 л (Егоров, 1976).
Биопрепарат «Бациспецин» содержит в основе природный штамм Bacillus sp. 739, продуцирующий различные биологически активные вещества. В работе использовали сухую препаративную форму биопрепарата с титром 2,0·106 КОЕ/г.
Выделены и идентифицированы новые штаммы бактерий рода Serratia, проявляющих высокую липолитическую активность (Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2), которые могут быть использованы в качестве продуцентов липолитических ферментов.
Краткая характеристика биопрепаратов приведена в табл. 1.
Таблица 1
Характеристика биопрепаратов-нефтедеструкторов, азотфиксаторов и продуцентов липаз
|
Основа биопрепарата |
Назначение биопрепарата |
Уровень патентной чистоты |
|
|
Консорциум микроорга-низмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 |
Биопрепарат «Ленойл» Нефтедеструктор ТУ 9291-016-22657427-2002 ТУ 9291-020-22657427-2004 |
Патент РФ № 2232806 |
|
|
Азотфиксирующие бактерии Azotobacter vinelandii ИБ 4 |
Биоудобрение «Азолен» ТУ 9291-018-22657427-2005 |
Патент РФ № 2224791 |
|
|
Азотфиксирующие бактерии Azotobacter vinelandii ИБ 1 |
Перспективен в качестве биоудобрения |
Патент РФ № 2224791 |
|
|
Бактерии Baсillus species 739 |
Стимулятор роста растений |
Патент РФ № 1743019 |
|
|
Бактерии Serratia species ИБ 3-1 |
Продуцент липазы |
Патент РФ № 2308485 |
|
|
Бактерии Serratia marcescens ИБ 2-2 |
Продуцент липазы |
Патент РФ № 2310685 |
При исследовании влияния состава питательной среды на биосинтез липаз новыми штаммами бактерий рода Serratia было показано, что значения липолитической активности сильно варьируют среди различных видов Serratia и зависят от содержания в питательной среде сложных органических компонентов (соевой муки, дрожжевого экстракта).
Для штаммов Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наибольший выход липолитических ферментов.
Для культивирования штамма ИБ 2-2 использовали питательную среду, содержащую 0,5 мас.% соевой муки и 6 мас.% дрожжевого экстракта, а также 0,5 мас.% К2НРО4 и 0,1 мас.% (NH4)2SO4.
Культивирование штамма ИБ 3-1 проводили на питательной среде, содержащей 2,5 мас.% соевой муки, 4,0 мас.% дрожжевого экстракта, а также 0,5 мас.% К2НРО4 и 0,1 мас.% (NH4)2SO4. Динамика липолитической активности штаммов Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 представлена в табл. 2.
Таблица 2
Динамика липолитической активности штаммов Serratia marcescens ИБ 2-2 и Serratia species ИБ 3-1 на оптимальных питательных средах
|
Время культивирования, ч |
Липолитическая активность, мкМ олеиновой кислоты/мл-1•час-1 |
||
|
Штамм Serratia marcescens ИБ 2-2 |
Штамм Serratia species ИБ 3-1 |
||
|
5 |
0 |
0 |
|
|
10 |
15 |
2 |
|
|
15 |
50 |
150 |
|
|
20 |
110 |
275 |
|
|
25 |
125 |
350 |
|
|
30 |
285 |
490 |
|
|
35 |
123 |
312 |
|
|
40 |
50 |
25 |
|
|
45 |
0 |
0 |
Таким образом для новых штаммов бактерий Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2 подобраны питательные среды, на которых указанные штаммы показали ферментативную активность, намного превышающую показатели, известные из патентных данных для бактерий этого рода.
Штаммы запатентованы в Российской Федерации как «Штамм бактерий Serratia species - продуцент липазы» и «Штамм бактерий Serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров».
Исследованные штаммы бактерий рода Serratia обладают высокой окислительной активностью по отношению к жирам растительного и животного происхождения, а также способны окислять углеводороды (алифатические, циклические, окисленные), нефть и некоторые продукты ее переработки (табл. 3).
Таблица 3
Окислительная способность микроорганизмов р. Serratia по отношению к жирам и углеводородам, мг CO2/г субстрата
|
Субстрат |
Штамм |
||
|
Serratia sp. ИБ 3-1 |
Serratia marcescens ИБ 2-2 |
||
|
Подсолнечное масло |
61 |
69 |
|
|
Кукурузное масло |
156 |
134 |
|
|
Оливковое масло |
100 |
154 |
|
|
Свиной жир |
143 |
91 |
|
|
Говяжий жир |
60 |
120 |
|
|
Кулинарный жир |
65 |
109 |
|
|
Нонан |
29 |
93 |
|
|
Декан |
72 |
106 |
|
|
Ундекан |
119 |
100 |
|
|
Тетрадекан |
65 |
106 |
|
|
Парафин |
21 |
5 |
|
|
Толуол |
28 |
73 |
|
|
Циклогексан |
156 |
32 |
|
|
Нафталин |
45 |
10 |
|
|
Бензиловый спирт |
17 |
31 |
|
|
Октиловый спирт |
51 |
34 |
|
|
Нефть |
106 |
9 |
|
|
Дизельное топливо |
108 |
8 |
Исходя из данных, полученных в ходе эксперимента, можно заключить, что исследуемые штаммы бактерий р. Serratia продуцировали комплекс ферментов оксигеназной системы, позволяющий этим бактериям окислять углеводороды различных классов.
Известно, что для деградации липидов используются ферментные системы, очень похожие на системы биодеградации нефти (Margesin et al., 1999). В связи с этим новые штаммы бактерий рода Serratia, обладающие как высоким уровнем липолитической активности, так и широким спектром окислительной активности по отношению к углеводородам различных классов, нефти и продуктам ее переработки, являются весьма перспективными объектами при создании биопрепаратов для процессов биоремедиации нефтяного загрязнения.
Изучение эффективности процесса очистки жиросодержащих сточных вод (табл. 4) исследуемыми микроорганизмами проводили на модельных растворах, которые готовили на основе питательной среды Раймонда.
Таблица 4
Биодеградация растительных и животных жиров бактериями р. Serratia в условиях модельных опытов по очистке воды
|
Время культивирования, ч |
Seraatia marcescens ИБ 2-2 |
Serratia species ИБ 3-1 |
|||
|
Исходное содержание жира, мас.% |
Степень утилизации жира, мас.% |
Исходное содержание жира, мас.% |
Степень утилизации жира, мас.% |
||
|
Оливковое масло |
|||||
|
16 |
1,30 |
72 |
1,29 |
100 |
|
|
24 |
1,16 |
75 |
1,43 |
100 |
|
|
48 |
1,32 |
77 |
1,06 |
100 |
|
|
Подсолнечное масло |
|||||
|
16 |
1,40 |
72 |
1,30 |
98 |
|
|
24 |
1,21 |
72 |
1,56 |
100 |
|
|
48 |
1,25 |
94 |
2,00 |
100 |
|
|
Кулинарный жир |
|||||
|
24 |
1,31 |
70 |
1,05 |
51 |
|
|
48 |
1,16 |
86 |
1,07 |
78 |
|
|
72 |
1,06 |
99 |
1,32 |
97 |
|
|
96 |
1,29 |
100 |
1,28 |
100 |
|
|
Свиной жир |
|||||
|
24 |
1,40 |
61 |
1,00 |
92 |
|
|
48 |
1,21 |
73 |
1,02 |
95 |
|
|
72 |
1,22 |
83 |
1,05 |
97 |
|
|
96 |
1,10 |
100 |
1,28 |
100 |
В качестве субстратов использовали оливковое и подсолнечное масла, а также свиной и кулинарный жиры, которые вносили в модельные растворы в концентрации 1 мас.%. В качестве инокулята была использована биомасса изучаемых микроорганизмов р. Serratia, полученная на оптимальных питательных средах.
Показано, что твердые жиры животного происхождения полностью утилизировались после 96 часов культивирования обеими штаммами в условиях очистки модельных растворов, что в свою очередь свидетельствует о том, что штаммы Serratia species ИБ 3-1 и Serratia marcescens ИБ 2-2 могут служить основой биопрепарата для очистки жиросодержащих сточных вод.
2. Разработка технологий биоремедиации отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты
Наиболее сложными для биорекультивации объектами являются почвы с содержанием углеводородов более 10-15 мас.%, участки, загрязненные тяжелыми или высокотоксичными нефтепродуктами, а также отличные от почв грунты с низкой микробиологической активностью [Левин с соавт., 1995; Маркарова, Ренжина, 2001; Логинов с соавт., 2002].
Одним из таких объектов является отработанная отбеливающая земля (ОЗ), используемая в качестве тонкодисперсного природного адсорбента в процессе контактной доочистки минеральных масел. Отбеливающая земля представляет собой субстрат, насыщенный полициклическими ароматическими углеводородами и смолистыми соединениями (18-25 мас.%), принадлежащими к группе загрязнителей, с трудом разлагающихся в природных условиях.
Загрязненная углеводородами отбеливающая земля является техногенным субстратом, комплекс микроорганизмов которого не обладает достаточной функциональной активностью и сбалансированностью для эффективной самоочистки.
В связи с этим процесс биоремедиации, очевидно, должен включать в себя кроме интродукции специализированных углеводородокисляющих микроорганизмов и внесение микроорганизмов, способствующих созданию условий для успешной биодеградации загрязнителя.
Одной из проблем, которая затрудняет утилизацию углеводородов микроорганизмами в загрязненном субстрате, является резкое смещение соотношения С:N в сторону углерода. Поэтому применение в ходе процесса ремедиации бактерий, способных пополнить запасы азота в загрязненном субстрате, способно, по нашему мнению, существенно повысить эффективность биодеградации углеводородов.
В модельных экспериментах изучен процесс биорекультивации отработанной отбеливающей земли с помощью комплекса биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен». Концентрация нефтепродуктов в отбеливающей земле составляла 18,1 мас.%.
Биопрепараты «Ленойл» и «Азолен» вносили в загрязненный грунт ежемесячно в дозе 2·108 КОЕ/г субстрата. Поскольку технология рекультивации нефтезагрязненных почв, как правило, предполагает использование полного минерального удобрения, в схему опыта был включен вариант совместного использования комплексных минеральных удобрений (нитрофоска в дозе 0,25 г/кг субстрата) и биопрепаратов.
В табл. 5 представлены данные о динамике биодеградации нефтепродуктов в отбеливающей земле. Наиболее высокая скорость утилизации углеводородов была зарегистрирована в первый месяц во всех вариантах опыта. За это время из субстрата удалялось 20-40 мас.% углеводородов. В последующий период процесс очистки замедлялся. Возможно, это обусловлено быстрой деструкцией парафиновых фракций и доминированием к концу инкубационного периода в составе остаточного загрязнения тяжелых ароматических фракций, труднодоступных для усваивающих углеводороды микроорганизмов.
Таблица 5
Степень биодеградации нефтепродуктов (мас.%) при использовании комплекса биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» для ремедиации отработанной отбеливающей земли
|
Вариант опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
|||||
|
30 |
60 |
90 |
120 |
150 |
||
|
Контроль (ОЗ) - без интродукции микроорганизмов |
1±0,4 |
2±0,3 |
3±0,5 |
3±1,1 |
5±1,7 |
|
|
ОЗ +минеральные удобрения |
5±1,6 |
6±1,4 |
13±6,57 |
13±4,1 |
15±6,56 |
|
|
ОЗ + Азолен |
21±3,2 |
21±7,45 |
23±7,45 |
26±3,1 |
27±1,5 |
|
|
ОЗ +Ленойл |
32±4,3 |
35±5,11 |
37±4,1 |
48±2,4 |
55±8,9 |
|
|
ОЗ + Ленойл + минеральные удобрения |
32±6,57 |
39±6,56 |
43±8,95 |
55±2,3 |
69±1,2 |
|
|
ОЗ + Ленойл +Азолен |
37±3,3 |
40±4,95 |
45±1,8 |
51±8,95 |
78±3,5 |
При использовании биопрепарата «Ленойл» за время эксперимента (150 сут.), степень деградации загрязнителя составила 55 мас.%, при внесении биоудобрения «Азолен» - 27 мас.%, на фоне минеральных удобрений деструкция нефтепродуктов под действием микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» увеличилась до 69 мас.%.
Внесение биоудобрения «Азолен» было более эффективным, чем минеральные удобрения.
В варианте совместного применения микробиологических препаратов «Ленойл» и «Азолен» степень деградации поллютанта была максимальной и составила 78 мас.%.
Изучение динамики численности углеводородокисляющих микроорганизмов показало, что совместное применение в процессе рекультивации биопрепарата «Ленойл» и биоудобрения «Азолен» позволило в течение всего эксперимента поддерживать численность углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) на максимально высоком уровне.
Высокая численность УОМ отмечалась и в вариантах опыта с применением биоудобрения «Азолен» без дополнительной интродукции разлагающих углеводороды микроорганизмов.
Очевидно, положительный эффект от применения «Азолена» на загрязненной отбеливающей земле связан с оптимизацией азотного питания в субстрате. Стимулирующее влияние интродукции биомассы различных видов бактерий р. Azotobacter на самоочищение нефтезагрязненной почвы было отмечено и другими авторами (Градова, 2003).
Это положение подтверждается данными о численности олигонитрофильных микроорганизмов. Учитываемое количество микроорганизмов этой группы после использования биопрепаратов к концу инкубации значительно возрастало.
Определение фитотоксичности рекультивируемой отбеливающей земли показало, что применение комплекса микробиологических препаратов «Ленойл» и «Азолен» позволяет за время эксперимента почти полностью нейтрализовать токсичность загрязненного грунта для растений. Всхожесть семян редиса (Raphanus sativus) в этих вариантах опыта составила 96%.
Таким образом, совместное использование биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» и биоудобрения «Азолен», на первом, микробиологическом этапе биоремедиации отработанной отбеливающей земли, позволило снизить содержание остаточных углеводородов в грунте с 181±1,2 г/кг до 3,9±0,8 г/кг, уменьшить фитотоксичность очищаемого субстрата и дало возможность перейти к этапу фитомелиорации.
Для проведения фитомелиорации была выбрана Суданская трава (Sorghum sudanense), т.к. она характеризуется высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам внешней среды (Мукатанов, Чанышев, 2006).
Как показали результаты лабораторного эксперимента, посев Суданской травы положительно сказывался на процессе дальнейшей биодеградации загрязнителя.
Содержание остаточных нефтепродуктов в отбеливающей земле под посевами Суданской травы снизилось на 28 мас.% за 90 суток, тогда как без посева растений степень биодеградации составила лишь 3,4 мас.% (рис. 1).
Рис. 1. Биодеградация нефтепродуктов в отбеливающей земле при фитомелиорации Суданской травой (Sorghum sudanense)
Максимальная численность микроорганизмов, в том числе и УОМ, отмечена в ризосфере растений, что свидетельствует о создании оптимальных условий для их развития и хорошо согласуется с динамикой процесса деструкции углеводородов (табл. 6).
Полученные в лабораторных условиях результаты по ремедиации отбеливающей земли с использованием комплекса биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» нашли свое подтверждение и в условиях полигона промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез».
Таблица 6
Динамика численности микроорганизмов в отбеливающей земле при фиторемедиации (млн. КОЕ/г)
|
Контроль (без растений) |
Почва между растениями |
Ризосфера |
|||||||
|
30 сут. |
60 сут. |
90 сут. |
30 сут. |
60 сут. |
90 сут. |
30 сут. |
60 сут. |
90 сут. |
|
|
Гетеротрофные микроорганизмы |
|||||||||
|
0,82±0,02 |
0,91±0,04 |
1,30±0,29 |
3,00±0,36 |
9,60±0,37 |
45,0±2,9 |
78,0±1,4 |
120±19 |
9300±100 |
|
|
Олигонитрофилы |
|||||||||
|
0,40±0,28 |
0,98±0,04 |
0,36±0,05 |
3,10±0,27 |
4,20±0,31 |
27,0±5,1 |
13,0±1,1 |
85,0±2,5 |
260±12 |
|
|
Углеводородокисляющие микроорганизмы |
|||||||||
|
0,16±0,01 |
0,37±0,03 |
1,20±0,31 |
9,80±0,16 |
12,0±1,9 |
86,0±1,7 |
180±21 |
280±31 |
7900±340 |
Наибольшая степень биодеградации нефтепродуктов в полевых условиях выявлена при совместном применении биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен», эта величина составила 69 мас.% за 150 суток, что в 1,6 раза выше, чем при использовании только биопрепарата «Ленойл» (рис. 2).
Рис. 2. Степень биодеградации нефтепродуктов в рекультивируемой отбеливающей земле в полевом эксперименте
Самая высокая численность углеводородокисляющих микроорганизмов в условиях полевого эксперимента также выявлена при комплексном внесении биопрепаратов (рис. 3).
О деградации наиболее токсичных нефтяных компонентов свидетельствует и самая низкая фитотоксичность грунта в этом варианте (15% через 150 сут.).
Полученные в лабораторных и подтвержденные в полевых условиях результаты, показывающие высокую эффективность комплекса биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» для ремедиации отработанной отбеливающей земли, позволили разработать и запатентовать «Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами» (Патент РФ № 2297290).
Рис. 3. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в отбеливающей земле в процессе ее ремедиации (тыс. КОЕ/г).
Разработаны также альтернативные варианты технологии биологической ремедиации отработанной отбеливающей земли, основанные на использовании биохимического потенциала микроорганизмов избыточного активного ила биологических очистных сооружений и внесении в рекультивируемый субстрат таких неорганических соединений, как суперфосфат или перекись водорода (Патент РФ № 2183142), или с дополнительной интродукцией биомассы биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» (Патент РФ № 2237711).
Практическое широкомасштабное применение различных вариантов разработанной технологии осуществлено в период 1998-2007 гг. на полигоне промышленных отходов ОАО «Орскнефтеоргсинтез», где за этот период рекультивировано около 150 тыс. тонн отбеливающей земли.
Проведение комплекса рекультивационных мероприятий снизило класс опасности отбеливающей земли с опытных участков и позволило отнести ее к малоопасным веществам, обращение с которыми не требует дополнительных мер предосторожности (4-ый класс токсичности).
3. Разработка технологий биоремедиации чернозема типичного, загрязненного сырой нефтью
Эффективность совместного использования биопрепаратов «Ленойл», «Азолен», «Бациспецин», а также биопрепаратов, обладающих липолитической активностью, для биоремедиации чернозема типичного, загрязненного сырой нефтью (НЗП), изучали в лабораторном эксперименте. Содержание углеводородов в модельных пробах составляло 13 мас.%.
Анализ полученных данных показал положительное влияние всех испытанных биопрепаратов уже в течение первого месяца биорекультивации, но эффективность их использования была различной (табл. 6).
Оптимальным для деградации углеводородов явилось совместное применение трех биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин» или биопрепаратов на основе липолитически активных микроорганизмов, при этом снижение содержания углеводородов к концу эксперимента составило от 91,0 до 91,5 мас.%, что в 1,2 раза превысило значение этого показателя, достигнутое при внесении только биопрепарата «Ленойл» (71%). Биоудобрение «Азолен» на фоне «Ленойла» позволило повысить эффективность процесса до 77%, а совместное применение биопрепарата «Ленойл» и «Бациспецин» до 82,3 %.
Таблица 6
Степень биодеградации углеводородов (мас.%) при различных приемах рекультивации чернозема типичного
|
Варианты опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
|||
|
30 |
60 |
90 |
||
|
Контроль (НЗП)- без интродукции микроорганизмов |
1,0±0,1 |
1,5±2,3 |
6,9±1,8 |
|
|
НЗП + Азолен |
6,1±1,4 |
18,0±1,8 |
32,0±5,4 |
|
|
НЗП + Ленойл |
41,5±1,5 |
62,0±1,2 |
71,0±2,6 |
|
|
НЗП + Ленойл+Азолен |
39,2±3,6 |
70,7±5,6 |
77,0±3,5 |
|
|
НЗП + Бациспецин |
32,0±1,3 |
56,7±3,7 |
66,0±1,5 |
|
|
НЗП + Ленойл+Бациспецин |
53,0±3,4 |
60,7±6,3 |
82,3±1,3 |
|
|
НЗП + Бациспецин+Азолен |
26,1±2,8 |
55±5,1 |
67,9±1,7 |
|
|
НЗП+ Ленойл+Азолен+Бациспецин |
55,2±1,2 |
75,3±4,2 |
91,5±2,5 |
|
|
НЗП + КЖ Serratia sp. ИБ 3-1 |
10,0±1,3 |
25,5±2,7 |
36,0±1,7 |
|
|
НЗП + Ленойл + КЖ Serratia sp. ИБ 3-1 |
51,0±3,2 |
64,4±5,3 |
80,1±1,7 |
|
|
НЗП + Ленойл + КЖ Serratia sp. ИБ 3-1 + Азолен |
56,3±1,2 |
76,3±4,0 |
91,3±2,5 |
|
|
НЗП + КЖ Serratia marcescens ИБ 2-2 |
9,8±1,3 |
25,3±2,5 |
35,7±1,6 |
|
|
НЗП + Ленойл + КЖ Serratia marcescens ИБ 2-2 |
50,5±3,0 |
64,0±3,0 |
79,8±1,7 |
|
|
НЗП + Ленойл + КЖ Serratia marcescens ИБ 2-2 + Азолен |
56,2±3,3 |
75,9±2,7 |
91,0±2,0 |
Анализ численности микроорганизмов показал, что применение в процессе рекультивации биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» положительно сказывалось на численности УОМ.
Очевидно, возрастание количества УОМ происходило за счет интродукции микроорганизмов, входящих в «Ленойл», во всех вариантах опытов с этим биопрепаратом, численность УОМ возросла - до 109 КОЕ/г через 90 суток (табл. 7).
Внесение биоудобрения «Азолен» и биопрепарата «Бациспецин» также позволило повысить количество микроорганизмов, участвующих в трансформации углеводородов нефти, по-видимому, это связано как со стимуляцией аборигенной углеводородокисляющей микробиоты (варианты опыта: НЗП + Азолен; НЗП + Бациспецин), так и с улучшением условий для микроорганизмов, составляющих основу биопрепарата «Ленойл» (варианты опыта: НЗП + Ленойл + Азолен; НЗП + Ленойл + Бациспецин) - табл.8.
Таблица 7
Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов (КОЕ/г·106) при различных приемах рекультивации чернозема типичного
|
Вариант опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
|||
|
30 |
60 |
90 |
||
|
Контроль (НЗП) - без интродукции микроорганизмов |
5,0±1,3 |
11,4±1,3 |
19,5±3,2 |
|
|
НЗП + Ленойл |
291±16 |
1185±38 |
3110±56 |
|
|
НЗП + Азолен |
181±6 |
390±26 |
1280±18 |
|
|
НЗП + Ленойл+Азолен |
350±18 |
870±17 |
5100±38 |
|
|
НЗП + Бациспецин |
131±8 |
580±11 |
1480±11 |
|
|
НЗП + Ленойл+Бациспецин |
370±4 |
1800±10 |
3800±110 |
|
|
НЗП + Бациспецин+Азолен |
119±2 |
918±18 |
1410±44 |
|
|
НЗП + Ленойл+Азолен+Бациспецин |
310±18 |
3110±3 |
7110±86 |
Наибольшая численность олигонитрофилов была зафиксирована в варианте совместного использования трех биопрепаратов уже на 30 сутки и сохранялась на высоком уровне при дальнейшей инкубации, что свидетельствует о хорошей выживаемости штамма Azotobacter vinelandii ИБ 4, составляющего основу биоудобрения (численность возросла - до 109 КОЕ/мл) (табл. 8).
Таблица 8
Динамика численности олигонитрофилов (КОЕ/г·106) в черноземе типичном, при различных приемах его рекультивации
|
Вариант опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
|||
|
30 |
60 |
90 |
||
|
Контроль (НЗП)- без интродукции микроорганизмов |
4,0±1,4 |
4,1±1,4 |
8,1±1,3 |
|
|
НЗП + Ленойл |
18±2 |
19±6 |
68±11 |
|
|
НЗП + Азолен |
168±11 |
600±11 |
1100±56 |
|
|
НЗП + Ленойл+Азолен |
53 ±14 |
31±7 |
680±26 |
|
|
НЗП + Бациспецин |
58±7 |
71±18 |
210±18 |
|
|
НЗП + Ленойл+Бациспецин |
130±18 |
510±15 |
900±72 |
|
|
НЗП + Бациспецин+Азолен |
780±30 |
810±18 |
1910±83 |
|
|
НЗП + Ленойл+Азолен+Бациспецин |
900±56 |
1700±35 |
2810±31 |
Совместное применение биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин» способствовало максимальному снижению токсичности очищаемой почвы по отношению к семенам кресс-салата - через 90 суток всхожесть составила 96,6%.
Биопрепарат-нефтедеструктор, содержащий биомассу консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5, биомассу азотфиксирующих бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 и биомассу спорообразующих микроорганизмов Bacillus species 739 запатентован в Российской Федерации (Патент РФ № 2323970).
Положительные результаты, свидетельствующие об эффективности совместного применения биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» в лабораторных исследованиях, были использованы в процессе рекультивации почвы на месте аварийного разлива нефти, произошедшего в 2002 году. Содержание углеводородов в загрязненной почве составляло 10 мас.%.
Применение для рекультивации в полевых условиях биопрепаратов «Ленойл» и «Азолен» подтвердило высокую эффективность нового способа. При обработке чернозема типичного, загрязненного сырой нефтью, биопрепаратом «Ленойл» на фоне минеральных удобрений (МУ) степень биодеградации нефти через 120 суток составила 70% (табл. 9). Интенсифицировать процесс деструкции удалось за счет совместного внесения биопрепарата «Ленойл» и биоудобрения «Азолен» - степень биодеградации в этом варианте опыта была максимальной, и к концу вегетационного сезона деструкция углеводородов составила - 85,7%, что в 1,2 раза выше, чем при использовании биопрепарата «Ленойл» на фоне минеральных удобрений. Полученные данные свидетельствуют о том, что деструкция поллютанта протекает более эффективно при использовании биоудобрения «Азолен», чем при внесении минеральных удобрений.
Таблица 9
Степень биодеградации углеводородов (мас.%) при различных вариантах рекультивации чернозема типичного (полевой опыт)
|
Варианты опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
||||
|
30 |
60 |
90 |
120 |
||
|
Контроль (НЗП) - без интродукции микроорганизмов |
4,7±1,2 |
7,4±0,7 |
13,8±2,3 |
16,6±1,8 |
|
|
НЗП + Азолен |
10,9±1,9 |
18,8±1,8 |
25,7±5,1 |
37,6±1,8 |
|
|
НЗП + Ленойл + минеральное удобрение |
27,2±2,8 |
41,2±3,6 |
63,7±1,0 |
70,0±0,8 |
|
|
НЗП + Ленойл + Азолен |
27,5±5,1 |
51,1±3,2 |
54,9±2,0 |
85,7±2,1 |
Данные по определению численности УОМ в полевых условиях согласуются с результатами, полученными в ходе лабораторного эксперимента. При совместном внесении биоудобрения «Азолен» и биопрепарата-нефтедеструктора «Ленойл» количество УОМ возрастало в большей степени, и сохранялось на высоком уровне на протяжении всего периода рекультивации (рис. 4).
После проведенных рекультивационных мероприятий токсическое воздействие нефтяного загрязнения на всхожесть семян кресс-салата (Lepidium sativum) максимально снизилось в образцах, обработанных комплексом биопрепаратов, что свидетельствует об удалении наиболее токсичных нефтяных компонентов и подтверждает факт максимального снижения содержания остаточных углеводородов нефти в этом варианте опыта (всхожесть семян составила 73%).
Рис. 4. Динамика численности углеводородокисляющих микроорганизмов в черноземе типичном при ремедиации (млн. КОЕ/г)
Таким образом, в ходе лабораторных и полевых исследований показано, что использование комплекса биопрепаратов «Азолен», «Бациспецин» и «Ленойл» для очистки чернозема типичного от нефтяного загрязнения позволяет активизировать микробиологическую деградацию поллютантов и снизить фитотоксичность нефтезагрязненного чернозема типичного по отношению к растениям. Степень биодеструкции углеводородов при начальной концентрации нефти в почве, составляющей 10 - 13 мас.%, за 120 суток с использованием комплекса биопрепаратов достигла 85,7- 91,5 мас.%.
4. Изучение биоремедиации углеводородсодержащего отхода с помощью комплекса биопрепаратов
В лабораторных условиях исследована возможность применения комплекса биопрепаратов («Ленойл», «Азолен», «Бациспецин») для ускорения разложения углеводородов в отходах шламонакопителей ОАО «Уфаоргсинтез».
Углеводородсодержащие отходы смешивали в различных концентрациях со структурообразователями (опилки - 20%; фосфогипс - 20%; чернозем типичный до содержания нефтепродуктов в субстрате - 5 мас.% - (Фон I), 10 мас.% - (Фон II), и 20 мас.% - (Фон III).
Интродукция в субстрат (Фон I) микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» позволила снизить содержание нефтепродуктов на 37,9 мас.% (табл. 10).
Таблица 10
Биодеградация нефтепродуктов (мас.%) в утилизируемом субстрате, содержащем 5 % нефтепродуктов
|
Вариант опыта |
Сроки отбора проб, сут. |
|||||
|
30 |
60 |
90 |
120 |
150 |
||
|
Контроль (Фон I)- без интродукции микроорганизмов |
0±0 |
0,3±0,1 |
0,8±0,2 |
1,4±0,9 |
4,0±1,2 |
|
|
Фон I+минеральные удобрения |
1,3±0,1 |
1,4±0,3 |
2,0±0,3 |
2,1±0,4 |
4,3±2,1 |
|
|
Фон I+Ленойл |
12,1±1,3 |
13,7±1,4 |
20,6±2,4 |
33,7±2,3 |
37,9±3,2 |
|
|
Фон I+Ленойл+минеральные удобрения |
17,8±2,1 |
25,0±3,2 |
27,7±3,7 |
35,7±2,4 |
38,5±1,5 |
|
|
Фон I+Ленойл+Бациспецин |
15,1±1,3 |
21,6±3,6 |
29,4±2,5 |
38,9±3,2 |
45,9±4,3 |
|
|
Фон I + Ленойл + Бациспецин + минеральные удобрения |
17,4±1,8 |
24,8±1,3 |
31,1±3,2 |
35,2±4,3 |
47,4±2,6 |
|
|
Фон I+Ленойл+Азолен |
17,0±1,6 |
20,3±2,5 |
24,7±2,1 |
35,5±3,8 |
42,4±4,2 |
|
|
Фон I +Ленойл+Азолен+Бациспецин |
18,4±2,3 |
30,2±3,2 |
45,7±4,3 |
51,2±4,1 |
57,6±3,1 |
Внесение биопрепарата «Бациспецин» совместно с биопрепаратом «Ленойл» стимулировало процесс биодеградации, при этом степень деградации нефтепродуктов составила 45,9 мас.%. Обнаружено, что деструкция углеводородов протекает намного эффективнее в вариантах совместного использования биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин», чем при их индивидуальном применении.
Степень деструкции углеводородов в оптимальном варианте составила 57,6 мас.%. Аналогичная тенденция была характерна и для субстратов с более высоким содержанием загрязнителя (Фон II - 10 % и Фон III - 20 %). Однако, при максимальном уровне загрязнения (Фон III), деструкция углеводородов была не так эффективна, к концу эксперимента она составляла 47,4 %, а при 10% концентрации углеводородов (Фон II), разложилось 50,8 % загрязнителя.
Рис. 5. Динамика численности УОМ при различных приемах утилизации субстрата, содержащего 5% нефтепродуктов (млн. КОЕ/г)
Анализ динамики численности углеводородокисляющих микроорганизмов показал, что после периода адаптации (120 суток) максимальное развитие этой группы микроорганизмов достигалось при комплексном внесении биопрепаратов «Ленойл», «Азолен» и «Бациспецин» в субстрат, содержащий 5% нефтепродуктов (рис. 5).
Сходная динамика выявлена и при использовании комплекса биопрепаратов для утилизации более загрязненных субстратов (Фон II и Фон III), однако, численность УОМ в них была существенно ниже.
Подтверждением детоксикации субстрата под влиянием комплекса биопрепаратов явилось увеличение всхожести семян кресс-салата (Lepidium sativum), которая в конце эксперимента составила - 89 % - Фон I, 70 % -Фон II, и 51% - Фон III.
5. Оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» для ремедиации водных объектов от нефтяного загрязнения
Серьезной проблемой, особенно для нефтедобывающих регионов Западной Сибири, остается нефтяное загрязнение водных поверхностей озер, болот и других водных источников, находящихся на территории производственной деятельности предприятий по добыче и транспорту нефти. Эффективность существующих биотехнологических способов ликвидации нефтяного загрязнения в условиях непроточных и неаэрируемых водоемов при высокой степени нефтяного загрязнения является весьма низкой.
Разработан и запатентован в Российской Федерации новый способ очистки водной поверхности от нефти и нефтепродуктов, сущностью которого является внесение в загрязненную воду бактериальной культуры, представляющей собой консорциум микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 с общим титром, не менее 108 КОЕ/мл (Патент РФ № 2241032).
Аэрация в водоеме, загрязненном нефтью или нефтепродуктами, для поддержания жизнедеятельности аэробных микроорганизмов-нефтедеструкторов осуществляется принудительным забором нефтезагрязненной воды и распределением ее методом дождевания по поверхности водного объекта.
В 2002 году биопрепарат «Ленойл» был испытан для очистки водного объекта от нефтяного загрязнения на территории Ханты-Мансийского округа в таежной зоне.
Полигон был заложен на верховом болоте, расположенном на территории НГДУ «Правдинскнефть» К-29, обрабатываемая площадь 3517 м2. Мониторинг осуществлялся Научно-исследовательским институтом экологии и рационального использования природных ресурсов (г. Тюмень). Исходное содержание нефтяных углеводородов на полигоне составило 272,42 г/кг для верхнего горизонта (0-5 см) и 57,68 г/кг для нижнего (5-20 см).
Наряду с биопрепаратом «Ленойл» в испытаниях использованы и известные биопрепараты «Дизойл» (ООО «Салют-Технолоджис-вест») и Деградойлас с МД» (ООО «Сервисэкология»).
По оценке специалистов НИИ экологии и рационального использования природных ресурсов для участка, где был использован биопрепарат «Ленойл», характерным является общее повышение численности микроорганизмов на два порядка по сравнению с фоном, что указывает на интенсификацию процесса разложения нефти.
При этом коэффициент биодеградации через 3 месяца после обработки биопрепаратом был равен 1,76 (для сравнения коэффициент биодеградации для биопрепарата «Дизойл» составил 1,34, для биопрепарата «Деградойлас с МД» - 0,61 и в контроле, т.е. без использования биопрепаратов - 0,56).
Полученные результаты позволяют рекомендовать препарат «Ленойл» для биологической ремедиации водных объектов от нефтяного загрязнения.
Этот препарат оказался также эффективным при очистке сточной воды, содержащей изопропанол и алкилсульфаты, полученной при производстве изопропилового спирта.
Новый способ биохимической очистки сточных вод, основанный на использовании микроорганизмов биопрепарата «Ленойл», запатентован в Российской Федерации - Патент РФ № 2263080. Разработанный способ может быть реализован в процессе локальной очистки сточных вод, образующихся при производстве изопропилового спирта.
Подобные документы
Проблема очистки масло- жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности. Иммобилизованные биокатализаторы на основе активного ила. Получение биокатализатора на основе клеток Penicillium roqueforti. Недостатки дрожжей Yarrowia lipolytica.
презентация [1,2 M], добавлен 03.12.2014Изучение особенностей микроорганизмов. Микроэкологический риск при использовании высоких технологий. Характеристика технологии приготовления препаратов и опытов. Правила микроскопирования. Влияние гигиенических навыков на распространение микроорганизмов.
научная работа [23,6 K], добавлен 06.09.2010Виды тлей, вредящих в защищенном грунте, применение энтомофаг против них в теплицах. Микробиологическая борьба с вредителями защищенного грунта. Методика разведения виковой тли. Оценка влияния микробиологических препаратов на пятнистую оранжерейную тлю.
дипломная работа [181,7 K], добавлен 05.02.2011Участие микроорганизмов в биогеохимических циклах соединений углерода, азота, серы, в геологических процессах. Условия обитания микроорганизмов в почве и воде. Использование знаний о биогеохимической деятельности микроорганизмов на уроках биологии.
курсовая работа [317,9 K], добавлен 02.02.2011Характер роста периодической культуры. Эффективность использования субстрата для достижения конечной емкости. Хемостат как модель роста микроорганизмов в природных системах. Способность микроорганизмов выживать в условиях голодания и при стрессе.
курсовая работа [936,8 K], добавлен 29.01.2013Микрофлора готовых лекарственных форм. Объекты санитарно-бактериологического обследования в аптеках. Определение микробной обсемененности растительного лекарственного сырья. Микробная обсемененность препаратов. Определение патогенных микроорганизмов.
презентация [2,4 M], добавлен 06.03.2016Характер и оценка влияния разнообразных факторов внешней среды на микроорганизмы: физических, химических и микробиологических. Значение микроорганизмов в сыроделии, развитие соответствующих процессов при производстве конечного продукта, этапы созревания.
реферат [45,3 K], добавлен 22.06.2014Микробиологические стандарты питьевой воды и методы её очистки. Характеристика кишечных бактериофагов, их значение как санитарно-показательных микроорганизмов. Основные пищевые инфекции. Влияние сушки и замораживания рыбных продуктов на микроорганизмы.
контрольная работа [84,8 K], добавлен 06.08.2015Роль дрожжей в природных экосистемах, перспективы их использования в различных разработках. Морфология и метаболизм дрожжей, вторичные продукты. Методы приготовления препаратов микроорганизмов. Биотехнологии, промышленное использование дрожжей.
курсовая работа [1,5 M], добавлен 26.05.2009Исследование основных типов микроорганизмов: бактерий, грибов и водорослей. Анализ условий, необходимых для роста микроорганизмов. Механизм образования микробиологических отложений. Изучение методов микробиологического тестирования и приборов мониторинга.
презентация [707,5 K], добавлен 23.10.2013
