Комбинированное действие ионизирующего излучения и других факторов окружающей среды на живые организмы: новые закономерности и перспективы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Комбинированное действие ионизирующего излучения и других факторов окружающей среды на живые организмы: новые закономерности и перспективы

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

КОМАРОВА Людмила Николаевна

Обнинск 2009

Работа выполнена в отделе исследования комбинированных воздействий ГУ-Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук.

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор Петин Владислав Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Осипов Андриян Николаевич

Доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник Иванник Борис Петрович

Ведущая организация: Объединенный институт ядерных исследований (г. Дубна)

Защита диссертации состоится 24 февраля 2009 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН по адресу: 249036, Обнинск Калужской обл., ул. Королева, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ-МРНЦ РАМН.

Автореферат разослан «____» ________________ 2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Комбинированное действие различных агентов является отличительной чертой современной жизни. Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с радиационными авариями, увеличением производства химических веществ, синтетических лекарств, использованием удобрений, повышением фона ультрафиолетового (УФ) излучения из-за образования озоновых дыр, а также в результате комбинированного действия этих факторов друг с другом и ионизирующими излучениями. Основным следствием взаимодействия ионизирующего излучения с другими физическими и химическими агентами является ингибирование способности клеток восстанавливаться от радиационных повреждений, формируемых в условиях комбинированных воздействий. Некоторые проблемы восстановления клеток после комбинированных воздействий не нашли отражения в научной литературе: изучение механизма ингибирования процесса восстановления после воздействия негативных факторов различной природы и их комбинаций; влияние модификаторов радиочувствительности на параметры, описывающие и характеризующие процесс восстановления. Следовательно, количественная оценка параметров восстановления после комбинированных воздействий различных факторов окружающей среды и химических ингибиторов восстановления является актуальной задачей.

Синергическое взаимодействие факторов окружающей среды представляет особую опасность и привлекает внимание многих исследователей. Многообразие загрязняющих агентов обусловливает необходимость экспериментально-теоретического исследования общих закономерностей синергического взаимодействия физических и химических факторов окружающей среды, прогнозирования и оптимизации эффектов, индуцируемых при комбинированных воздействиях. Представляется актуальным оценить возможность синергического взаимодействия вредных факторов окружающей среды при малых интенсивностях загрязняющих агентов в биосфере. Принципиальное значение представляет малоисследованное направление изучения явление радиационного гормезиса при действии малых доз ионизирующего излучения в комбинации с другими факторами внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является теоретическое обоснование и экспериментальная проверка механизма взаимодействия ионизирующего излучения с физическими и химическими агентами окружающей среды для разработки новой концепции синергического взаимодействия и прогнозирования биологических эффектов при комбинированных воздействиях.

Для реализации этой цели необходимо решить следующий комплекс задач.

Экспериментально исследовать динамику пострадиационного восстановления простейших эукариотических клеток после различных режимов комбинированного действия ионизирующего или ультрафиолетового излучений с гипертермией.

Количественно оценить параметры восстановления клеток (необратимый компонент и константа восстановления) после комбинированных воздействий различных агентов. Выяснить, какой из этих параметров оказывает большее влияние на эффективность синергического взаимодействия.

Применить математическую модель пострадиационного восстановления, описывающую процесс восстановления в терминах уменьшения эффективной дозы, для интерпретации механизма действия ингибиторов восстановления, используемых в комбинации с ионизирующим излучением для повышения радиочувствительности клеток высших эукариот.

Предложить математическую модель для описания и прогнозирования способности клеток восстанавливаться от потенциально летальных повреждений при комбинированных воздействиях различных физических и химических факторов окружающей среды.

Выяснить, является ли ингибирование восстановления, регистрируемое после комбинированных воздействий различных факторов на эукариотические клетки, причиной синергического взаимодействия или следствием формирования необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Изучить закономерности комбинированного действия малых доз ионизирующего излучения с другими поражающими факторами на отмирание дрожжевых клеток, выдерживаемых в непитательной среде после облучения.

Научная новизна работы. Научная новизна работы заключается в экспериментально-теоретическом исследовании взаимодействия ионизирующего излучения с физическими и химическими агентами окружающей среды для прогнозирования синергических эффектов. Следующие новые факты, положения и сформулированные на их основе концепции о механизмах проявления эффектов комбинированных воздействий, имеющие принципиальный характер, впервые получены в настоящей работе.

Экспериментально изучена динамика пострадиационного восстановления диплоидных дрожжевых клеток после различных режимов комбинированного действия ионизирующего излучения и гипертермии. Продемонстрировано, что скорость и объем восстановления постоянно уменьшаются с увеличением инактивирующей температуры и продолжительности ее действия.

Показано, что механизм синергического взаимодействия ионизирующего излучения с гипертермией не связан с нарушением процесса восстановления, как это традиционно предполагалось, а обусловлен формированием большей доли повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Подавление же процесса восстановления является следствием формирования необратимых повреждений.

Получены новые экспериментальные данные о динамике пострадиационного восстановления диплоидных дрожжевых клеток, подвергшихся одновременному действию ультрафиолетового излучения (254 нм) и гипертермии. Выяснено, что скорость и объем восстановления постоянно уменьшаются с увеличением температуры, при которой происходило облучение.

Показано, что механизм синергического взаимодействия одновременного применения ультрафиолетового излучения и гипертермии связан с формированием большей доли повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Уменьшение скорости и объема восстановления является следствием формирования необратимых повреждений. эукариотический клетка восстановление пострадиационный

Выяснено, что механизм повышения радиочувствительности клеток млекопитающих при терморадиационном воздействии не связан с нарушением самого процесса восстановления, а объясняется формированием большей доли необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Впервые оценены параметры восстановления разрывов ДНК культивируемых клеток млекопитающих. Показано, что константа восстановления не зависит от условий комбинированных воздействий, а уменьшение скорости и объема восстановления разрывов ДНК клеток млекопитающих является следствием образования необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Показано, что нарушение процессов восстановления, регистрируемое после комбинированных воздействий различных факторов на дрожжевые клетки и культивируемые клетки млекопитающих, не является причиной радиосенсибилизации или синергического взаимодействия, а лишь вполне ожидаемым и прогнозируемым следствием формирования при комбинированных воздействиях большей доли необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Доказана возможность использования математической модели синергизма для описания и прогнозирования объема восстановления клеток от потенциально летальных повреждений при комбинированных воздействиях различных физических и химических факторов окружающей среды.

Выявлены новые закономерности комбинированного действия малых доз ионизирующего излучения с другими поражающими факторами на отмирание дрожжевых клеток, выдерживаемых в непитательной среде после облучения.

Фундаментальная и практическая значимость. Результаты диссертационных исследований имеют фундаментальную значимость для понимания механизмов комбинированного взаимодействия различных факторов и повышения радиочувствительности клеток химическими ингибиторами восстановления. Результаты данной работы имеют несомненное теоретическое значение с точки зрения понимания механизмов синергического взаимодействия и путей оптимизации воздействующих агентов. Практическая значимость результатов диссертации определяется возможностью сочетанного использования многофакторных воздействий, дифференциально влияющих на сам процесс восстановления клеток от радиационных повреждений и на формирование необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Помимо фундаментальной важности этой работы, ее результаты будут полезны для ряда практических применений в области биомедицинских технологий и исследований окружающей среды.

Данные этой работы могут использоваться для прогностической оценки потенциальной опасности реально встречающихся в биосфере малых мощностей доз ионизирующего излучения и интенсивностей других агентов. Полученные приоритетные данные будут способствовать разработке новых принципов нормирования комбинированных воздействий вредных факторов окружающей среды, учитывающих их синергическое и антагонистическое взаимодействие.

Положения, выносимые на защиту.

1. Уменьшение скорости и объема восстановления при комбинированных воздействиях ионизирующего излучения с различными факторами физической и химической природы на дрожжевые клетки и клетки млекопитающих объясняется формированием необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться, а не нарушением самих процессов восстановления.

2. Новая концепция синергического взаимодействия ионизирующего излучения, в соответствии с которой причиной синергического взаимодействия являются формирование невосстанавливаемых повреждений. Сформулированная на этой основе математическая модель позволяет не только прогнозировать коэффициент синергического усиления, его максимум и условия его достижения, но и объем восстанавливающихся клеток.

3. Хроническое облучение дрожжевых клеток при малых мощностях доз приводит к значительной задержке отмирания диплоидных дрожжевых клеток по сравнению с отмиранием клеток при естественном радиационном фоне. Это положительное действие радиации отмечается для диплоидных, а не для гаплоидных дрожжевых клеток, что подчеркивает роль процессов восстановления в проявлении радиационного гормезиса.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на следующих международных и отечественных конференциях:

Международная конференция «International Conference on Radiation and Health», Beer Sheva (Israel) - 1996 г.; IV съезд по радиационным исследованиям, 2001; III Международная конференция «Электромагнитные излучения в биологии», Калуга - 2005; Международная конференция БИОРАД-2006 «Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды», Сыктывкар - 2006; V съезд по радиационным исследованиям, 2006; Международная конференция «International Conference “20 years after Chernobyl: strategy for recovery and sustainable development of the affected regions», Gomel, 2006; Четвертая международная конференция «4th International Workshop on Space Radiation Research and 17^th Annual NASA Space Radiation Health Investigators Workshop», Dubna, 2006; Международная конференция «Autumn meeting of Korean society of environmental biology. - Korea Ocean Research & Development Institute», South Sea Institute, 2006; Вторая международная конференция “The Second Asian and Oceanic Congress for Radiation Protection», Beijing, China, 2006; Международная конференция «International conference on radiation biology and 5^th LOW RAD conference», India, 2006; Международная конференция «Spring Meeting of Korean Society of Environmental Biology. Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology», Daejeon, 2007; Международная конференция «LOW RAD conference», Portugal, 2008; Международная конференция «International conference on radiation biology», India, 2008.

Диссертация апробирована на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН 25.06.2008 г. (протокол № 230).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 45 работ, в том числе монография - 1, статей - 27, тезисов докладов - 17.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 365 страницах, включает введение, обзор данных литературы, описание материалов и методов исследования, результаты экспериментальных и теоретических исследований, обсуждение, выводы и список использованной литературы. Иллюстрирована 92 рисунками и 24 таблицами, список цитируемой литературы включает 115 работ на русском языке и 241 на иностранных языках.

Результаты исследования и обсуждение

Восстановление дрожжевых клеток после комбинированных воздействий ионизирующего излучения и гипертермии

Были проведены экспериментальные исследования восстановления дрожжевых клеток после последовательного и одновременного терморадиационного воздействия.

На рис. 1А представлены кривые выживаемости диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces ellipsoideus (vini), штамм Мегри 139-В, облученных различными дозами г-квантов ⁶⁰Со без тепловой обработки (кривые 1, 1') и с предварительной тепловой обработкой (60 єС) в течение 3 (кривые 2, 2'), 6 (кривые 3, 3') и 12 (кривые 4, 4') мин.. Клетки были высеяны на питательную среду как сразу после облучения (кривые 1, 2, 3, 4), так и после выдерживания их в режиме пострадиационного восстановления в течение 80 ч в непитательной среде (кривые 1', 2', 3', 4'). Видно, что предварительное нагревание клеток в течение 3, 6 и 12 мин. заметно повышало их чувствительность к последующему действию ионизирующего излучения. В условиях описанного опыта предварительное нагревание не индуцирует повышенную радиоустойчивость, эффект этот проявлялся при более низких температурах. Как видно из данных, представленных на рис. 1А и 1Б, гипертермия вызывает существенное ингибирование восстановления дрожжевых клеток после облучения ионизирующим излучением. При нагреве клеток при 60 єС восстановления после 80 ч выдерживания в непитательной среде не наблюдали совсем. Из представленных данных, очевидно, что степень ингибирования восстановления гипертермией зависит от продолжительности ее воздействия.

Рис. 1 Изменение объема и скорости восстановления диплоидных дрожжевых клеток S. ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В) от дозы г-квантов и от продолжительности действия температуры (последовательное действие, пояснения в тексте)

Для описания кинетики пострадиационного восстановления дрожжевых клеток было предложено (Корогодин В.И., 1966; Капульцевич Ю.Г., 1978) следующее уравнение:

D_eff(t) = D₁[K + (1 - K) e^-t], (1)

Это уравнение показывает, что для количественного описания процесса пострадиационного восстановления необходимо знание двух параметров - K и . Здесь K - значение необратимого компонента лучевого поражения клеток, выраженное в долях начальной дозы, определяется по формуле:

K = K(?) = D_eff(?) / D₁. (2)

A(t) = [D_eff(t) - D_eff(?)] / [D₁ - D_eff(?)] (5)

и

= -[lnA(t)] / t. (6)

Из данных, приведенных на рис. 1, мы рассчитали необратимый компонент К, который составил 0.42, 0.57, 0.76 и 1.00 без нагрева и при нагреве в течение 3, 6 и 12 мин., соответственно. Это означает, что нагревание при 60 єС как до, так и после облучения приводит к постоянному уменьшению объема восстановления с увеличением продолжительности теплового воздействия. Если продолжительность теплового воздействия составляла 12 мин., то восстановление после последовательного применения ионизирующего излучения и тепла отсутствовало полностью (К = 1). На рис. 1Б представлены кривые изменения выживаемости в зависимости от продолжительности восстановления после последовательного воздействия гипертермией и ионизирующим излучением на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) штамм Мегри 139-В. Клетки были облучены без нагрева (кривые 1) и с предварительным нагревом (60 єС) в течение 3 мин. (кривые 2), 6 мин (кривые 3) и 12 мин. (кривые 4) и высеяны на питательную среду в разное время после воздействия тепла и радиации. Видно, что число выживших клеток, увеличивающееся со временем, достигало плато через трое суток. Предварительный нагрев клеток при 60 єС в течение 3 и 6 мин. замедлял скорость восстановления, определяемую углом наклона кривых восстановления к оси абсцисс. Более того, 12-минутный нагрев клеточной суспензии при 60 єС полностью подавлял процесс пострадиационного восстановления.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований показывают, что при последовательном действии гипертермии (60 єС) и ионизирующего излучения (⁶⁰Со) с увеличением продолжительности действия гипертермии эффективность комбинированного воздействия прогрессивно возрастала. При этом как объем, так и скорость восстановления уменьшались с увеличением тепловой нагрузки. Эти данные подтверждают наиболее распространенную точку зрения об участии процессов восстановления в механизме синергического взаимодействия. Из литературы известно, что наибольшая эффективность взаимодействия имеет место при одновременном применении агентов. Поэтому представляет интерес провести исследования по одновременному действию гипертермии и ионизирующего излучения.

Такие данные получены для диплоидных дрожжевых клеток S. ellipsoideus (vini) после одновременного действия г-квантов ⁶⁰Со и гипертермии. Мы оценили параметры, характеризующие процесс пострадиационного восстановления дрожжевых клеток после действия одного ионизирующего излучения и его комбинации с гипертермией.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2 Зависимость относительной доли необратимо пораженных клеток от продолжительности воздействия гипертермии (60°С) при последовательном действии и от температуры при одновременном воздействии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3 Определение константы восста-новления. А: Предварительное нагревание при 60 °С в течение 0 (кружки), 3 (треугольники) и 6 мин. (квадраты). Б: Одновременное терморадиационное воз-действие: 20 °С (темные кружки), 45 °С (светлые кружки), 50 °С (темные треугольники) и 55 °С (светлые треугольники)

На рис. 2 представлено изменение необратимого компонента от продолжительности нагрева (60 єС) при последовательном воздействии (рис. 2А) и от температуры, при которой происходило облучение при одновременном терморадиационном воздействии (рис. 2Б). Очевидно, что необратимый компонент постоянно растет при повышении термической нагрузки.

Для количественного описания процесса восстановления нам необходимо знание еще одного параметра - константы восстановления в. На рис. 3 приведены зависимости функции А(t) для последовательного действия тепла и ионизирующего излучения (рис. 3А) и для одновременного воздействия (рис. 3Б) этих факторов. Видно, что эта функция экспоненциально убывает с увеличением продолжительности восстановления и не зависит от продолжительности предварительного воздействия повышенной температуры или температуры, при которой происходило облучение клеток. Используя уравнение (5), получаем, что в = 0,07 ч^-1 при последовательном действии тепла и ионизирующего излучения и в = 0,067 ч^-1 для всех температур при одновременном воздействии. Это означает, что около 7% оставшихся репарируемых радиационных повреждений восстанавливается каждый час для обоих типов комбинированных воздействий.

Аналогичные данные были получены для диплоидных дрожжевых клеток, подвергавшихся одновременному воздействию УФ излучения (254 нм) и гипертермии. Показано, что необратимый компонент непрерывно возрастает с увеличением термической нагрузки, а константа восстановления не зависит от условий комбинированных воздействий и составляет во всех случаях 0,06 ч^-1.

Совокупность этих данных показывает, что ингибирование восстановления клеток после комбинированного действия гипертермии с ионизирующим или УФ излучениями и синергическое взаимодействие этих агентов не связано с нарушением самого процесса восстановления, а объясняется формированием повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Эти данные имеют кардинальное значение для выявления механизма синергического взаимодействия разных агентов, включая ионизирующее излучение. Поэтому представляет интерес выяснить, сохраняются ли эти закономерности для высших эукариот.

Восстановление культивируемых клеток млекопитающих после терморадиационных воздействий

В работе (Raaphorst et al., 1988) приведены кривые выживаемости и восстановления легочных фибробластов китайского хомячка (линия V79-S171). Клетки восстанавливались от потенциально летальных повреждений после облучения одним рентгеновским излучением (250 кВ, 3 Гр/мин.) и после последовательного действия сначала гипертермии (42,5 єС) в течение 30 мин., а затем облучения в дозе 8 Гр. Данные, представленные в работе (Raaphorst et al., 1988), позволили нам рассчитать долю K(t) невосстановленных радиационных повреждений (уравнение 3), а также долю A(t) восстанавливаемых повреждений (уравнение 5), в зависимости от продолжительности пострадиационного восстановления при различных условиях терморадиационного воздействия. Результаты наших расчетов приведены на рис. 4.

Рис. 4 Зависимость доли K(t) невосстановленных радиационных повреждений (А), а также доли A(t) восстанавливаемых радиационных повреждений (Б), от продолжительности пострадиационного восстановления клеток легочных фибробластов китайского хомячка (линия V79-S171) после облучения одним рентгеновским излучением (8 Гр, кривые 1), а также после последовательного применения сначала гипертермии (42,5 єС в течение 30 мин., кривые 2), а затем рентгеновского излучения (8 Гр)

Эти данные позволили нам рассчитать необратимый компонент лучевого поражения и, используя формулу (6), - константу восстановления в, которая составила 0,019 мин.^-1. Видно, что комбинированное применение гипертермии и ионизирующего излучения по-разному влияют на параметры, описывающие процесс пострадиационного восстановления. Так, необратимый компонент лучевого поражения возрастает, а константа восстановления остается постоянной при любых условиях терморадиационного воздействия. На основании приведенных результатов можно сделать вывод, что ингибирование восстановления при комбинированном действии тепла и ионизирующего излучения на легочные фибробласты китайского хомячка (линия V79-S171) могло реализовываться через повышение доли необратимо пораженных клеток, в то время как сам процесс восстановления оставался не нарушенным.

Аналогичные результаты получены нами при анализе опубликованных другими авторами экспериментальных результатов по выживаемости и восстановлению клеток китайского хомячка (Li, Evans, Hahn, 1976; Hahn, 1982), клеток глиомы человека (Raaphorst et al., 1991) и саркомы молочной железы мышей (Fu et al., 1975) после последовательного воздействия ионизирующего излучения и гипертермии.

Таким образом, при анализе кинетики восстановления клеток млекопитающих различного происхождения после комбинированного воздействия ионизирующего излучения и гипертермии показано, что с возрастанием термической нагрузки существенно увеличивался необратимый компонент радиационного повреждения при незначительном изменении константы восстановления. Это означает, что механизм синергического терморадиационного взаимодействия при лечении опухолей в большей степени реализуется через формирование необратимых повреждений, а не через повреждение самих процессов молекулярного восстановления.

Восстановление клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующих излучений и химических агентов

Хорошо известно, что цитотоксическое действие ионизирующего излучения на клетки млекопитающих контролируется ферментативными процессами, посредством которых клетки могут восстанавливаться от индуцированных радиацией повреждений ДНК. Поэтому большой интерес представляют ингибиторы процессов восстановления ДНК, так как они могут значительно усиливать летальное действие ионизирующего излучения. В работе (Little et al., 1989) проанализированы действия нескольких классов ингибиторов восстановления от потенциально летальных повреждений на двух клеточных линиях человека и двух линиях клеток грызунов. В экспериментах были использованы клетки китайского хомячка (СНО), мышиные клетки С3Н 10Т1/2, диплоидные фибробластные клетки человека, штамм AG1522, и опухолевые клетки человека линия SCC-61. Были испытаны химические ингибиторы с различными механизмами действия. 9--D-арабинфуранозиладенин (ara-A) и 1--D-арабинфуранозилцитозин (ara-C) являются ингибиторами синтеза ДНК, которые замедляют как цепь инициации, так и элонгацию (Bell, Fridland, 1980). Гидроксимочевина действует как ингибитор альфа-полимеразы (Huberman, 1981), а 3-аминобензамид (3-AB) является ингибитором ADP рибосиляции (Purnell, Wish, 1980). Ингибиторы восстановления вводили в суспензию клеток за 18-24 ч до облучения, они присутствовали и в процессе восстановления клеток от потенциально летальных повреждений.

Так, для клеток китайского хомячка CHO, облученных одним рентгеновским излучением и в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида, нами были рассчитаны параметры восстановления (необратимый компонент и константу восстановления). Результаты наших расчетов приведены на рис.5. Видно, что необратимый компонент лучевого поражения возрастает с 0,82 при действии одного рентгеновского излучения до 0,89 при облучении и восстановлении клеток в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида, в то время как константа восстановления в не зависела от условий облучения и равнялась 0,53 ч^-1. Аналогичные данные получены нами и для культивируемых клеток человека после различных типов комбинированного воздействия рентгеновского излучения и химических ингибиторов восстановления.

Рис. 5 Зависимость относительной доли необратимых повреждений K(t) = D_eff(t)/D₁ и относительной доли восстанавливаемых повреждений, определяемой функцией A(t) = [D_eff(t) - D_eff(?)]/[D₁ - D_eff(?)], от продолжительности восстановления клеток китайского хомячка CHO. Клетки были облучены рентгеновским излучением и восстанавливались от потенциально летальных повреждений без препарата (кривые 1) и в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида (кривые 2)

В целом, полученные данные указывают на то, что сам процесс восстановления не был нарушен при изученных комбинированных воздействиях. Однако с увеличением концентрации большинства испытанных химических препаратов отмечено возрастание доли необратимого компонента, т.е. доли необратимых повреждений, от которых клетки не были способны восстанавливаться. На основании этих данных можно придти к заключению, что наблюдавшееся экспериментах ингибирование восстановления обусловлено в большинстве случаев не нарушением самих процессов восстановления, а увеличением доли необратимо пораженных клеток. Следовательно, ингибирование восстановления клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующего излучения и различных химических агентов не является причиной их синергического взаимодействия, как это традиционно предполагалось, а может быть вполне ожидаемым и прогнозируемым следствием формирования в условиях комбинированных воздействий повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Ранее была предложена математическая модель, проверенная главным образом на микроорганизмах (Петин В.Г., Комаров В.П., 1989; Petin, Komarov, 1997). В соответствии с этой моделью синергизм обусловлен взаимодействием субповреждений, не эффективных при применении каждого агента в отдельности. Эта модель была апробирована в исследованиях с дрожжевыми клетками (Petin et al., 1997; Петин В.Г. и др., 1998, 1999). Главным недостатком этой модели является отсутствие доказательства, что наиболее распространенная точка зрения на механизм синергического взаимодействия, связанная с ингибированием восстановления, не является достаточно обоснованной. Как было показано в предыдущих разделах, для многих объектов и воздействующих агентов ингибирование восстановления не является причиной синергизма, а может быть вполне ожидаемым следствием образования необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Поэтому представляло интерес адаптировать математическую модель синергического взаимодействия различных агентов к этим новым данным и продемонстрировать ее способность прогнозировать не только эффективность синергического взаимодействия, но и долю необратимых повреждений, формируемых после комбинированных воздействий различных факторов окружающей среды и от которых клетки не способны восстанавливаться.

Прогнозирование восстановления после комбинированных воздействий

При комбинированном действии двух факторов на инактивацию клеток образуются три типа повреждений: N₁ - летальные повреждения, индуцированные, например, ионизирующим излучением; N₂ - летальные повреждения, индуцированные вторым фактором, например гипертермией; min{р₁N₁;р₂N₂} - летальные повреждения, обусловленные взаимодействием субповреждений, индуцированных двумя факторами. Каждый из трех типов летальных повреждений можно охарактеризовать своей величиной необратимого компонента: K₁ - доля повреждений, вызванных ионизирующим или ультрафиолетовым излучением; K₂ - доля повреждений, вызванных фактором, модифицирующим чувствительность клеток к ионизирующему или ультрафиолетовому излучению; K₃ - доля повреждений, вызванных взаимодействием субповреждений, индуцированных обоими факторами. В соответствии с определением, необратимый компонент представляет собой отношение числа необратимых повреждений к общему числу повреждений в клетке. Тогда можно записать

, (7)

где K₁ и K₂ - соответственно, доли необратимых повреждений, вызванных первым и вторым фактором; K₃ - доля необратимых повреждений, вызванных взаимодействием субповреждений, индуцированных обоими факторами. Можно предположить, что летальные повреждения, индуцированные каждым из факторов в условиях комбинированного воздействия, восстанавливаются в том же объеме и с той же скоростью, что и с применением каждого из факторов в отдельности. Таким образом, из экспериментов с раздельным действием факторов можно определить K₁ и K₂. Величину K₃ в соответствии с данными, представленными в предыдущих разделах, можно принять равной 1, поскольку повреждения, ответственные за синергизм и формируемые за счет взаимодействия субповреждений носят необратимый характер. Для удобства расчета уравнение (7) можно переписать в виде:

. (8)

Представляло интерес проверить возможность предсказания необратимого компонента радиационного поражения при комбинированных воздействиях ионизирующего излучения и гипертермии с помощью описанной модели (уравнение 8). В этом уравнении содержатся параметры модели р₁ и р₂ - числа субповреждений, индуцированных ионизирующим излучением (р₁) и гипертермией (р₂) на одно эффективное повреждение от этих агентов. Эти параметры находятся из реальных экспериментов, в которых в одном случае выполняется условие р₁N₁<р₂N₂, т.е. клетки гибнут преимущественно от гипертермии, а в другом случае - р₁N₁>р₂N₂, т.е. инактивация клеток в большей степени обусловлена ионизирующим излучением. Первоначально мы проверили возможность предсказания модели для одновременного терморадиационного действия на дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В). Было предположено, что необратимый компонент, индуцируемый одним ионизирующим излучением, K₁ = 0.41 (облучение при комнатной температуре). Поскольку во всех наших экспериментах дрожжевые клетки не восстанавливались после действия одной гипертермии, мы полагаем, что K₂ = 1.0, т.е. термические повреждения носили необратимый характер. Более того, как было показано выше для одновременного действия гипертермии с ионизирующим излучением, дополнительные повреждения, ответственные за синергизм и формируемые в этих условиях, также носят необратимый характер, т.е. K₃ = 1.0. Следовательно, все параметры, содержащиеся в уравнении (2), нам известны, поэтому можно рассчитать теоретически предсказываемые значения необратимого компонента радиационного поражения для различных условий облучения. Результаты расчетов для p₁ = 3.07 и p₂ = 2.54 приведены в табл. 1.

Таблица 1

Необратимый компонент радиационного поражения (K) после одновременного действия ионизирующего излучения и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В)

Видно, что теоретически ожидаемые значения необратимого компонента хорошо соответствуют экспериментальным данным.

Совокупность данных, представленных в данной таблице, показывает, что предложенная модель предсказывает долю необратимых радиационных повреждений, формируемых при одновременном действии ионизирующего излучения и температуры и от которых клетки не способны восстанавливаться.

Приведенные результаты показывают, что восстановление дрожжевых клеток прогнозируется математической моделью, основанной на предположении, что дополнительные летальные повреждения, ответственные за синергизм, носят необратимый характер. Следовательно, механизм синергического взаимодействия ионизирующего излучения с гипертермией связан с формированием повреждений, от которых клетка не способна восстанавливаться. Тогда ингибирование восстановления при комбинированных терморадиационных воздействиях не может рассматриваться в качестве причины синергического взаимодействия, как это традиционно предполагается многими авторами, а может быть прямым следствием образования при комбинированных воздействиях необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Представляет интерес провести аналогичные исследования о прогнозировании объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия УФ излучения и гипертермии.

Для диплоидных дрожжевых клеток в данной работе было показано, что синергическое взаимодействие ультрафиолетового излучения с гипертермией обусловлено не нарушением самих процессов восстановления, как это традиционно предполагалось, а связано с формированием большей доли повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. В связи с важностью этих фактов для понимания механизмов синергического взаимодействия мы экспериментально изучили зависимость объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия ультрафиолетового излучения и гипертермии, а также возможность прогнозирования синергизма и объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия УФ-излучения и гипертермии. Используя экспериментальные результаты и уравнение (8), были получены экспериментальные значения необратимого компонента для одновременного действия УФ-излучения и гипертермии (таблица 2). Эти данные показывают, что необратимый компонент возрастает с увеличением температурной нагрузки. Это означает, что способность клеток восстанавливаться от повреждений, индуцированных УФ-светом, обратно пропорциональна темпе-ратуре, при которой происходило облучение. Дрожжевые клетки, облученные при 57 єС, полностью утратили способность к восстановлению (K = 1).

Таблица 2

Необратимый компонент радиационного повреждения после одновременного действия УФ-излучения (254 нм) и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae (штамм XS800)

Оценим способность описанной математической модели прогнозировать необратимый компонент после одновременного действия УФ-излучения и гипертермии (уравнение 8). Можно предположить, что необратимый компонент, индуцируемый одним УФ-излучением, K₁ = 0,56 (облучение при комнатной температуре). Поскольку во всех наших экспериментах дрожжевые клетки не восстанавливались после действия одной гипертермии, мы полагаем, что K₂ = 1, т.е. термические повреждения носят необратимый характер. Как было показано выше для одновременного действия гипертермии с УФ-излучением, дополнительные повреждения, ответственные за синергизм и формируемые в этих условиях, также носят необратимый характер, т.е. K₃ = 1. Следовательно, все параметры, содержащиеся в уравнении (8), нам известны и можно рассчитать теоретически предсказываемые значения необратимого компонента для различных условий одновременного действия УФ-излучения и гипертермии. Результаты расчетов, проведенные по уравнению (8) для р₁ = 1,56 и р₂ = 3,48, представлены в таблице 2. Видно, что теоретически ожидаемые значения хорошо соответствуют экспериментальным данным для всех условий одновременного воздействия УФ-излучения и гипертермии. Следовательно, описанная математическая модель синергизма и полученное на ее основе математическое уравнение (8) позволяют прогнозировать восстановление дрожжевых клеток после действия УФ-излучения и гипертермии, т.е. количественно предсказывать долю необратимых повреждений. Это означает, что предложенная модель описывает и прогнозирует не только эффективность синергического взаимодействия гипертермии с ионизирующим излучением и УФ-светом, но и предсказывает долю необратимых повреждений, формируемых при одновременном действии гипертермии с ионизирующим излучением (табл. 1) и УФ-светом (табл. 2).

На основе полученных результатов можно обсудить механизм синергического взаимодействия тепла с ионизирующим и УФ-излучениями. Рассмотренная в данной работе математическая модель синергизма основывалась на предположении, что механизм синергического взаимодействия обусловлен формированием дополнительных летальных повреждений, возникающих в результате взаимодействия субповреждений, индуцированных обоими факторами. Приведенные результаты показывают, что восстановление дрожжевых клеток прогнозируется моделью, основанной на предположении, что дополнительные летальные повреждения, ответственные за синергизм, носят необратимый характер. Тогда ингибирование восстановления при комбинированных воздействиях УФ-света с другими агентами не может рассматриваться в качестве причины их синергического взаимодействия, как это предполагается многими авторами, а может быть прямым следствием образования при комбинированных воздействиях необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Комбинированное действие гипертермии и ионизирующего излучения при малых мощностях доз

Данный раздел диссертации посвящен изучению особенностей отмирания дрожжевых клеток в стационарной фазе роста в непитательной среде, исключающей их размножение. Анализ литературы указывает на слабую изученность данного вопроса для одноклеточных организмов. Слабо изучен феномен замедления отмирания клеток после острого и хронического облучения в различных дозах, снижающих выживаемость клеток популяции. Представляет интерес изучение проблемы замедления отмирания как на клетках диких штаммов, для которых возможно нормальное протекание процессов репарации сублетальных и потенциально летальных повреждений, так и на клетках штаммов, мутантных по локусам, отвечающим за восстановление от радиационных повреждений. Вклад репарационных механизмов в увеличение продолжительности жизни клеток популяции может быть также проанализирован при культивировании клеток при температурах, снижающих вероятность пострадиационного восстановления. Для выяснения этих задач в работе были использованы диплоидные штаммы дикого типа Т1 и XS800 (RAD/RAD), мутантный по репарации радиационных повреждений диплоидный штамм XS1898 (rad52-1/rad52-1) и двойной диплоидный мутант Т4 (rad2/rad2 rad54/rad54) с мутациями в локусах, отвечающих за устойчивость клеток к УФ-излучению и ионизирующей радиации, а также гаплоидный штамм S288C дикого типа (RAD). Многосуточное инкубирование контрольных и облученных клеток проводили при температурах 30, 37 и 40 ^оС.

Рис. 6 А - зависимость отмирания контрольных (кривая 1) и облученных в дозе 130 Гр (кривая 2) дрожжевых клеток штамма Т1 в непитательной среде при 37 ^оС. Б - та же зависимость при нормировании выжившей после облучения части популяции к 100 %

На рис. 6 приведены кривые отмирания контрольных и облученных в дозе 130 Гр диплоидных клеток Saccharomyces cerevisiae дикого типа (штамм Т1) в непитательной среде при температуре инкубации 37 єС. Из рис. 6А видно, что отмирание выживших после острого облучения дрожжевых клеток в дозе, снижающей выживаемость клеток до 75 %, приводило к значительному замедлению скорости отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с необлученным контролем. Это видно как по увеличению «плеча» на кривых отмирания, т. е. времени накопления субповреждений, так и с уменьшением наклона экспоненциальных участков этих кривых. Более наглядно эта закономерность видна на рис. 6Б, где выживаемость облученных клеток нормирована к 100 %. Известно, что в радиобиологии для количественной оценки степени изменения радиочувствительности клеток под влиянием химических радиопротекторов или радиосенсибилизаторов используют фактор изменения дозы (ФИД). По аналогии с фактором (коэффициентом) изменения дозы, мы ввели коэффициент замедления отмирания клеток (k), определяемый отношением продолжительности отмирания облученных и контрольных клеток, рассчитанным для некоторого изоэффективного уровня (например, для выживаемости клеток, равной 10%): k = t₂/t_1. Пример нахождения этого коэффициента приведен на рис. 6Б с помощью стрелок. Для данных, представленных на рис. 6Б, коэффициент замедления отмирания k = 1,9 ± 0,2. Это означает, что облученные клетки отмирали почти в два раза медленнее, чем контрольные.

В таблице 3 суммированы итоги серии опытов по выяснению роли дозы в проявлении эффекта снижения отмирания клеток облученных популяций по сравнению с интактными. Коэффициент замедления отмирания клеток в таблице приведен для выживаемости клеток 10 %.

Таблица 3

Зависимость отмирания клеток штамма Т1 в непитательной среде от величины дозы при температуре 37 ^оС

Анализируя результаты экспериментов, сведенные в табл. 3, можно отметить, что никакого закономерного изменения параметра k с дозой не отмечено. Не исключено, что полученные значения этого коэффициента отражают статистическую вариабельность коэффициента замедления отмирания. Усредняя все полученные значения этого коэффициента, получаем k_сред. = 1,9 ± 0,3. Таким образом, отклонение всех найденных значений коэффициента замедления старения от среднего значения находится в пределах вариабельности биологических экспериментов.

Результаты, приведенные в табл. 3, показывают, что гормезисные эффекты дрожжевых клеток, проявляющиеся в замедлении отмирания выживших после облучения клеток, могут быть выявлены не только в области малых доз, как это традиционно предполагалось (Кузин А.М., 1991, 1995; Luckey, 1991), но и в области больших доз ионизирующего излучения, снижающих выживаемость клеток в популяции до 20 - 5 %.

Механизм проявления радиационных гормезисных эффектов часто связывают с индуцированием процессов восстановления от радиационных повреждений (Lucke-Huhle et al., 1986; Филиппович И.В., 1991; Boucher et al., 2004). Известно, что процессы восстановления могут быть реализованы не только после облучения различными видами ионизирующего излучения, но и после воздействия других повреждающих агентов, обеспечивая надежность функционирования живых систем при действии различных повреждающих факторов окружающей среды. Представляло интерес провести эксперименты по отмиранию диплоидных дрожжевых клеток не способных к пострадиационному восстановлению. Было выявлено, что клетки радиочувствительного мутанта (Т4, rad2/rad2 rad54/rad54) также показывали замедление старения и отмирания при выдерживании их в пострадиационный период в непитательной среде при 37°С. При этом коэффициент замедления старения равнялся 1,5 ± 0,2.

Помимо экспериментов по старению и отмиранию дрожжевых клеток после острого радиационного воздействия были проведены исследования старения и отмирания дрожжевых клеток после хронического воздействия ионизирующего излучения.