Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Аденилатциклазный сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных

Биохимия 03.00.04

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Плеснёва Светлана Александровна

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, Российской Академии наук (зав. лабораторией д.б.н., проф. М.Н. Перцева)

Научный консультант доктор биологических наук, профессор, Перцева М.Н.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, Аврова Н.Ф.

Доктор биологических наук, Пучкова Л.В.

Доктор биологических наук, Авдонин П.В.

Ведущее учреждение Физиологический Институт им. А.А. Ухтомского Санкт-Петербургского Государственного Университета

Защита состоится 23 октября 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.127.01 по присуждению ученой степени доктора наук при Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

Автореферат разослан _____сентября 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 002.127.01 доктор биологических наук, профессор М.Н. Маслова

аденилатциклазный регуляторный инсулин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (G-белки) стимулирующего (Gs) или ингибирующего (Gi) типа, состоящие из трех субъединиц - б, , г и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника - циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).

К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992).

К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использовали эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - крысы, птицы и беспозвоночные - моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.

Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз.

Задачи исследования

1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.

2. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а) установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-3-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.

3. Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000).

4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии - сахарный диабет 1-го и 2-го типов.

Научная новизна.

Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков (Gi) и (Gs) типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС - ПКС и возможно ПКСе.

В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клетке следующей сигнальной цепью: рецептор тирозинкиназного типа Gi-белок (г-димер) ФИ-3-К ПКС (позвоночные) или ПКСе (беспозвоночные) Gs-белок АЦ цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) эффекторные системы. Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного в клетке следующей цепью: рецептор серпантинного типа G-белок (Gi или Gs) АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы.

Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКСж, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, - ПКСе.

Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке. Показано участие АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток.

Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии (сахарный диабет 1-го и 2-го типов).

Теоретическое и практическое значение работы.

Теоретическое и практическое значение работы определяется важной ролью инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных. Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР-1, расширяет современные представления о спектре сигнальных систем, участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства.

Применение эволюционного подхода (изучение ряда эволюционно-родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных) позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы.

Данные, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека (сахарный диабет) в рамках нового направления - «эволюционная биомедицина» (Перцева, 2006).

Полученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских ВУЗах как в России, так и за рубежом.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарного диабета, а также в создании новых подходов для диагностики этого заболевания. Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме действия инсулина.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных.

2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (вг-димер) ФИ-3-К ПКС Gs-белок АЦ.

3. С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз.

4. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.

5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности.

Апробация работы

Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн, Германия, 2002); 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона, 1997); XXXIII Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997); 2-й съезд Биохимического Общества РАН (Москва, 1997); XVII съезд физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 1998); Съезд Биохимического общества Университета Глазго (Глазго, Великобритания, 1999); 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000); 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004); XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Международная Европейская конференция (Люксембург, 2002); Вторая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвященная 80-летию со дня рождения М.Г. Колпакова. (Новосибирск. Октябрь, 2002); 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005);

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях.

Личный вклад автора - Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar; 2) куры породы русская белая «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea; 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и E1A+E1B (клетки, не впадающие в апоптоз).

Методы. В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов:

- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);

- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);

- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).

- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - [б³²P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некоторыми модификациями);

- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [³H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);

- электрофорез в ПААГ

- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКСж;

- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [¹⁴C] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);

- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavin et.al., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003);

- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras (Плеснёва и др., 2003);

- определение активности цАМФ-зависимой ПКА (Кузнецова, Плеснева, 2001);

- определение активности ферментов углеводного метаболизма - гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);

- определения содержания белков методом Лоури;

- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина.

- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova).



РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.

Основные этапы работы состояли в исследовании:

- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo;

- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов;

- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем);

- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии;

Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки.

Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10^-8М и для сравнения эпидермального ростового фактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987). Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236%. Эффект менее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска +124% (Рис. 1; Таблица 1).

Рис. 1 Концентрация пептидов - 10-8М Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05).

Таблица 1 Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс.

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	71.2±4.8 (100 %)	85.11±3.3 (100%)	101.20±9.24 (100%)
+ ИФР-1	214.31±12.1 (301%)	136.16±5.2 (160%)	96.14±4.6 (95%)

Примечание: В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в %) при действии ИФР-1.

В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис. 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5 мин составляет +256%, по сравнению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+236 %) (рис. 1).

В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сравнению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис 3; Таблица 2). Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2; Рис 3).

Рис. 2 Концентрация инсулина 10-8М. Различия достоверны (р<0.05)

Таблица 2 Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска.

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	110.21±10.8 (100 %)	125.31±9.3 (100%)	106.04±6.6 (100%)
+ ИФР-1	259.92±11.4 (269%)	229.31±5.2 (183%)	103.81±5.8 (98%)

Примечание - как в таблице 1.

Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия. Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с максимальным эффектом через 2.5 мин. АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий порядок: инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин.

Рис. 3 Концентрация пептидов - 10-8 М Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05).

Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки.

Обнаружив в опытах in vitro стимулирующее влияние пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ, мы исследовали влияние инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo. Эксперименты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных эмбрионов и моллюсков после введения инсулина (внутрибрюшинно или внутрижелточно) в дозах 0.05 нг/г-10нг/г веса тела (вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов in vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина (+222%) выявляется через 5 мин после введения гормона (1 нг/г), а через 15 мин он снижается почти в три раза (67%) (Рис. 4). При более высокой дозе инсулина (10 нг/г), стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее (+124%), а через 15 мин отсутствовал.

Рис. 4 Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)

В экспериментах in vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5 мин, более четко выражен через 15 мин, а через 30 мин не проявлялся (рис. 5).

Рис. 5 Различия достоверны (р<0.05)

У 17-дневных куриных эмбрионов выявлено дозозависимое активирующее действие инсулина на активность АЦ через 5 минут (Рис. 6), которое ослабевает через 15 и 30 мин после введения гормона.

Рис. 6 Различия достоверны (р<0.05)

При введении моллюскам инсулина (0.5нг/г и 5.0 нг/г) активность АЦ возрастала через 5 мин после введения гормона на +49% и +381%, соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 100%. Через 20 мин влияние гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ снижается (+22%) и практически исчезает (+6%) через 40 мин (Рис. 7). При введении инсулина (5 нг/г) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мин составлял +110%, а через 40 мин +50% (рис. 7).

Рис. 7 Светлые столбики - базальная активность АЦ. Заштрихованные столбики - инсулин-стимулированная активность АЦ при разных дозах гормона. Различия достоверны (р<0.05).

Из полученных нами данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Рис. 7) выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1-подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ (Шпаков и др., 2005).

Следует отметить, что проявление АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах in vitro и in vivo. АЦ активирующий эффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида (2,5 и 5 мин) при физиологических концентрациях (10^-9-10^-8М), с увеличением времени действия эффект пептидов ослабевает или отсутствует.

АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro.

Установив оптимальное время действия пептидов инсулинового суперсемейства, при котором происходит активация АЦС (2.5 мин), необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов наиболее выражен. В разных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичные рецепторы, отличающиеся по сродству к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях.

Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2.5 мин при разных концентрациях (10^-12-10^-6М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов.

В мембранной фракции скелетных мышц крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП обнаруживается при концентрациях - 10^-11-10^-7М (Рис. 8). Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет: для инсулина +250% при 10^-8М; для ИФР-1 +91% при 10^-9М; для ИПП +111% при 10^-8М; для ЭФР +190% при

10^-10М. (Рис. 8).

Можно отметить, что в диапазоне концентраций 10^-10-10^-7М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях (10^-11-10^-10М).

Рис. 8 Базальная активность АЦ принята за 100 %. Время действия пептидов 2.5 мин

Таблица 3 Влияние in vitro разных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят.

Объекты (возраст)	10-сут Эмбрионы	13-сут Эмбрионы	16-сут Эмбрионы	Цыплята 3-сут
Воздействия	Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка) В скобках - Активность АЦ (в %) в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100 %.
Без Инсулина	14.021.10 (100 %)	3.900.45 (100 %)	2.010.09 (100 %)	8.520.41 (100 %)
+инсулин 10-11 М	16.341.35 (117 %)	4.210.34 (108 %)	4.810.46 (239 %)	10.110.55 (119 %)
+ инсулин 10-10 М	39.141.93 (279 %)	10.330.89 (265 %)	5.280.30 (263 %)	11.240.48 (132 %)
+ инсулин 10-9 М	48.252.21 (344 %)	15.921.24 (408 % )	10.240.62 (509 %)	14.540.82 (171 %)
+ инсулин 10-8 М	19.871.44 (142 %)	9.840.56 (252 %)	9.920.47 (494 %)	19.551.13 (238 %)
+ инсулин 10-7 М	17.130.98 (122 %)	4.930.45 (126 %)	7.510.33 (374 %)	22.211.37 (261 %)
+ инсулин 10-6 М	17.901.12 (128 %)	5.120.21 (131 %)	1.950.22 (97 %)	24.391.62 (286 %)

Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты. Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10^-11М-10^-6М обнаруживается у куриных эмбрионов (10, 13, 16 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10^-9М, и составляет у 10-суточных эмбрионов +244%, у 13-суточных +308%, у 16-суточных +409% (Таблица 3), а у 3-х суточных цыплят (+186%) при более высокой концентрации 10^-6М, что может быть связано с переходом эмбрионов в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки заканчиваются.

Проведенные нами исследования действия инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й день развития) показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+352%) выявляется при концентрации 10^-9М, а ИФР-1 (+289%) при концентрации 10^-10М (данные в диссертации).

В мембранной фракции мышц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях - 10^-11-10^-8М (Рис. 9). Инсулин и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10^-8М (+63% и +54%, соответственно), а ИПП и ЭФР при 10^-9М (+415% и +223%, соответственно).

Рис. 9 Базальная активность АЦ принята за 100 %. Время действия пептидов - 2.5 мин

Таким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Следует отметить видоспецифичность действия пептидов. Действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска A.cygnea, является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных.

Участие ц-АМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Уровень цАМФ в клетке зависит не только от АЦ - фермента, осуществляющего его синтез, но и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) - фермента, обеспечивающего его деградацию. Исследована динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мышц кур. Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Houslay, 1985). Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2.5 и 5.0 мин после действия инсулина, увеличивается на +115% через 10 мин и на +179% через 20 мин, по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100% (Таблица 4).

Таблица 4 Влияние инсулина (10^-8М) на активность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времени

Воздействия	Активность цАМФ-ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5.0 мин	10.0 мин	20.0 мин
Без инсулина	3.37±0.5 (100%)	3.70±0.33 (100%)	3.56±0.61 (100%)	3.21±0.28 (100%)
+ инсулин	3.06±0.21 (91%)	4.07±0.18 (110%)	7.65±0.23 (215%)	8.95±0.44 (279%)

Примечание: в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в %) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100%



При исследовании действия разных концентраций инсулина (10^-9М-10^-7М) обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона (+115%) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10^-8М (данные в диссертации).

Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулина на клетку является важным моментом в понимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы.

При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА. Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ.

Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ четко разделены во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин. Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном. Таким образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит свое активирующее действие на ПКА, а затем и на эффекторные системы (Ткачук, 1983), что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы.

В связи с этим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного действия пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы.

Использование анти-инсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина.

Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка (АИС), выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ. При добавлении нормальной сыворотки (без инсулина) к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет +68% у крыс и +41% у моллюсков. При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+7%) и моллюсков (-5%) (Табл. 5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным при действии этого гормона.

Таблица 5 Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии анти-инсулиновой сыворотки.

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	Нормальная сыворотка	Анти-инсулиновая сыворотка
Гладкие мышцы моллюска Anodonta cygnea
Без инсулина	111.186.13 (100%)	148.294.31 (100%)
Инсулин 10-8М	156.768.54* (141%)	158.678.16 (107%)
Скелетные мышцы крысы
Без инсулина	97.344.58 (100%)	115.826.49 (100%)
Инсулин 10-8М	163.496.17* (168%)	110.037.12 (95%)

Примечание: приведены данные из трех независимых экспериментов, повторенных три раза. Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны (р< 0.05 (*). В скобках - активность АЦ в %. Базальная активность принята за 100%.



Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего действия инсулина и ИФР-1.

В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов, начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала.

Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства.

Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы, использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы. Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15 мин после чего в пробу добавляли пептиды (время действия 2.5 мин) при концентрации, вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект. Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных), которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной ткани крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков.

У крыс в присутствии тирфостина 47 (1.25-5.0 мкМ) активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50%, при ИФР-1 до 65 %, при ЭФР до 50 % по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 100% (Рис. 10). В присутствии генистеина (1.25-5.0 мкМ) снижение АЦ стимулирующих эффектов всех используемых пептидов у крыс было более выражено. Эффект инсулина снижался до 40%, эффект ИФР-1 до 10 %, эффект ЭФР - до 18 % (рис. 11). В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (10^-6М) практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ).

Рис. 10 По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100 %) в присутствии тирфостина 47

Рис. 11 По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100 %) в присутствии генистеина

В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис. 12) и генистеин (данные представлены в диссертации) ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43% и 38%, соответственно. Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось (р < 0.05). Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы.

Рис. 12 Ппо оси ординат - снижение стимулирующего эффекта инсулина и изопротеренола на АЦ (принятого за 100 %) в присутствии тирфостина 47.

Рис. 13 По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и серотонина на АЦ (принятого за 100 %)

Рис. 14 По оси абсцисс - концентрация генистеина в мкМ; по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100 %) в присутствии генистеина.

У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2.5 мкМ). Эффект инсулина уменьшался до 20 %, эффект ЭФР до 30-35%. (Рис 13). В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25 % в случае инсулина (1.25 мкМ генистеин), и до 50-75% в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис. 14).

Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков A.cygnea активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренола, а в присутствии серотонина, реализующего свое действие также через рецепторы серпантинного типа (Pertseva et al., 1992). Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ.

Таким образом, в мембранной фракции крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее влияние исследуемых пептидов на АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис. 10-14).

Стимулирующее действие изопротеренола (крысы, куры) или серотонина (моллюски) на АЦ, реализуемое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах (см. Рис. 10-14).

Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих (крысы), птиц (куры), культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов. (Pertseva et al., 1996; Plesneva et al., 2003).

Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина

Для доказательства участия G-белков в действии инсулина на активность АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать ГТФ-азную активность G-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФгS, ГИДФ и тем самым активировать АЦ, либо ингибировать ГТФ-азную активность G-белка в присутствии ГДФвS.

Таблица 6 Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска

Воздействия	Животные
	Крыса	Моллюск
	Активность АЦ (%)
Контроль	100±1.01 %	100±1.3 %
Инсулин (10-8М)	222±1.3% (+122%)	186±1.8% (+86%)
ГТФгS (10-5М)	242±1.4% (+142%)	470±9.4% (+370%)
ГИДФ (10-5М)	236±1.8% (+136%)	269±4.9% (+169%)
ГТФ (10-5М)	135±1.05% (+35%)	163±5.1%(+63%)
ГДФвS (10-5М)	95±1.2% (-5%)	92±2.4% (-8%)
Инсулин + ГТФгS	473±2.5% (+373%) [109%]	726±20.3% (+626%) [170%]
Инсулин + ГИДФ	399±8.2% (+299%) [41%]	441±12.3% (+341%) [86%]
Инсулин + ГТФ	277±10.1% (+177%) [20%]	279±8.4% (+179%) [30%]
Инсулин + ГДФвS	102±5.4% (+2%) [-17%]	105±4.3% (+5%) [-86%]

Примечание: в круглых скобках - активирующий АЦ эффект используемых агентов в % по отношению к базальной активности, принятой за 100%. В квадратных скобках - потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %.

Согласно представленным данным, ГТФгS, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФгS, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на +170%, 86% и 30% у моллюсков (табл. 6). ГДФвS же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков.

Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФгS, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФвS свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Таблица 7 Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea

	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
Воздействия	Скелетные мышцы крысы	Гладкие мышцы моллюска
	Без КТ	+КТ	Без КТ	+КТ
Без пептидов	39.7±3.4	48.5±2.0	63.2±4.1	69.1±9,6
	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)
Инсулин	67.9±3.6	48.2±2.7	200.5±14.4	74.2±7.6
10-9М	(171%)	(99%)	(317%)	(108%)
ИФР-1	57.4±2.1	43.1±1.6	139.2±12.4	76.8±7.3
10-9М	(145%)	(89%)	(220%)	(111%)
	Без ХТ	+ХТ	Без ХТ	+ХТ
Без пептидов	39.6±2.6	79.7±2.7	47.4±3.0	94.3±5.6
	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)
Инсулин	69.3±2.8	105.8±7.4	151.7±9.8	134.0±7.5
10-9М	(175%)	(133%)	(320%)	(142%)
ИФР-1	56.7±4.2	106.2±6.5	100.0±5.4	122.6±8.8
10-9М	(143%)	(133%)	(210%)	(130%)

Примечание: В скобках - активность АЦ в %. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.

Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют б-субъединицы Gi и Gs белков.

Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование бi-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что вг-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на бi-субъединицу и вг димер в условиях действия коклюшного токсина.

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через вг-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.

Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности бs-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l.

Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1.

Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10^-9-10^-7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10^-9-10^-7М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10^-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.



Таблица 8 Влияние вортманнина (10-⁹М-10-⁷М) на стимуляцию ИФР-1 (10-⁸М) и инсулином (10-⁸ М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
объекты		Крысы			Моллюски
воздействия	без пептида	ИФР-l	инсулин	без пептида	ИФР-l	инсулин
без ворманнина	21±1.6	38.2±1.0*	41.4±2.3*	17.8±1.0	41.1±2.6*	24.5±1.0*
+вортманнин 10-9М	17.9±2.0	9.4±1.3	9.7±1.4	15.8±2.0	14.6±1.3	14.2±0.4
+вортманнин 10-8М	16.5±2.3	8.6±1.3	8.4±1.3	14.6±2.3	13.9±0.8	11.6±1.0
+вортманнин 10-7М	13.2±1.9	6.3±0.9	6.8±0.8	14.3±0.9	13.8±1.8	7.4±0.5

Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.

Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС - кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (10^-10-10^-8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10^-8М. В присутствии кальфостина

(10^-8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации).

Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКСж, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.

Таблица 9 Влияние антител к ПКСж на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10^-8М) и инсулина (10^-8М) в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea

	Активность АЦ (
Объекты		Крысы			Моллюски
Воздейтсвия	Без пептида	ИФР-1	Инсулин	Без пептида	ИФР-1	инсулин
без антител	100±4.4	253±17	247±24	100±12	307±24	255±18
АТ 1:1000	104±9.5	102±14	108±16	166±25	251±21	254±12
АТ 1:100	98±8.2	95±12	103±5	163±18	327±27	237±20
АТ 1:10	94±6.8	68±3.6	88±8	145±5	403±33	238±25

Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%.

Антитела к ПКСж почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9). Таким образом, использование моноклональных антител к ПКСж показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et а1., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКСе из мозга позвоночных.

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (вг-димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.

Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы

Таблица 10 Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)	Стимулирующий АЦ эффект в %
Базальная	30.59±1.41	100% (базальная)
NaF 10-2 М	178.91±4.15	585% (+485%)
форсколин 10-5 М	99.26±3.21	324% (+224%)
ГИДФ 10-6 М	111.20±3.48	364% (+264%)
ГТФ 10-5 М	82.98±2.92	271% (+171%)
ЭФР 10-9 М	168.31±4.75	550% (+450%)
ИФР-1 10-9 М	102.14±3.34	334% (+224%)
Инсулин 10-9 М	74.89±2.11	245% (+145%)

В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в %), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%.

Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10).

Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3 присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.

Влияние инсулина, ИФР-1, ЭФР на включение [14C]тимидина в ДНК

Подобные документы

• Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

  Ферменты обмена регуляторных пептидов. Методы определения концентрации вещества P, активности КПN, активности ангиотензинпревращающего фермента и лейцинаминопептидазы. Роль регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе.
  
  дипломная работа [143,7 K], добавлен 25.06.2009
  

• Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

  Опиоидные пептиды и физиолого-биохимические аспекты их действия. Обмен регуляторных пептидов. Ферменты обмена нейропептидов при стрессе. Схема введения предшественника лей-энкефалина. Тканевое распределение КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у самцов крыс.
  
  диссертация [132,5 K], добавлен 15.12.2008
  

• Основы биохимии

  Функции биологически активных пептидов. Формы витаминов биотина и В12. Орнитиновый цикл мочевинообразования. Механизм действия адреналина и глюкагона на липидный обмен. Определение активности амилазы сыворотки крови и мочи. Схема строения антител.
  
  шпаргалка [4,0 M], добавлен 01.05.2009
  

• Апоптоз

  Морфологические проявления апоптоза. Сжатие клетки и конденсация хроматина. Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец. Механизм и регуляция апоптоза. Значение апоптоза в развитии организма и патологических процессах, снижение и ускорение.
  
  реферат [1,1 M], добавлен 02.05.2009
  

• Нарушения микроциркуляторного русла

  Классификация патологии микроциркуляторного русла. Внутрисосудистые и внесосудистые нарушения. Исследование основных факторов, повреждающих микроциркуляторное русло. Механизм действия гистамина. Последствия действия периваскулярных факторов на русло.
  
  презентация [663,4 K], добавлен 30.05.2017
  

• Гормоны

  Химическая природа и классификация гормонов. Биороль простагландинов и тромбоксанов. Регуляция секреции гормонов. Гормональная регуляция углеводного, липидного, белкового и водно-солевого обмена. Роль циклазной системы в механизме действия гормонов.
  
  курсовая работа [769,0 K], добавлен 18.02.2010
  

• Т-лимфоциты. Принципы клеточного иммунитета

  Формы, механизмы, органы, регуляция иммунитета. Субпопуляции Т-лимфоцитов, их функции. История открытия регуляторных Т-клеток. Эффективность микробиологической диагностики. Иммунная регуляторная система. Будущее трансплантологии, технические трудности.
  
  контрольная работа [1,7 M], добавлен 11.05.2016
  

• Регуляция активности ферментов

  Локализация ферментов в клетке и изменение его количества. Протеолитические ферменты пищеварительного тракта. Закон действия масс. Сохранение сбалансированности катаболических и анаболических процессов. Химическая модификация и аллостерическая регуляция.
  
  презентация [142,2 K], добавлен 15.03.2014
  

• Активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента в сыворотке крови у онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии

  Механизм образования активных форм регуляторных пептидов. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента. Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных при химиотерапевтическом воздействии.
  
  дипломная работа [74,0 K], добавлен 25.06.2009
  

• Гормоны. Регуляция обмена веществ. Биохимия гормонов

  Понятие о гормонах, их основных свойствах и механизме действия. Гормональная регуляция обмена веществ и метаболизма. Гипоталамо-гипофизарная система. Гормоны периферических желез. Классификация гормонов по химической природе и по выполняемым функциям.
  
  презентация [5,9 M], добавлен 21.11.2013
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам