49

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние низкоинтенсивных электромагнитных излучений на функциональную активность биологических объектов разного уровня организации

03.00.13 - физиология

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Малиновская Светлана Львовна

Нижний Новгород

2008

Работа выполнена в Нижегородской государственной медицинской академии и Нижегородском государственном университете им.Н.И. Лобачевского.

Научные консультанты:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ,

профессор Крылов Василий Николаевич

доктор биологических наук, профессор Монич Виктор Анатольевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Гелашвили Давид Бежанович

Доктор биологических наук, профессор Ерлыкина Елена Ивановна

Доктор медицинских наук, профессор Перетягин Сергей Петрович

Ведущая организация

Российский федеральный ядерный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной физики (РФЯЦ - ВНИИЭФ, г. Саров)

Защита состоится "23" октября 2008г. в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им.Н.И. Лобачевского по адресуУ 603950, Н. Новгород, пр. Гагарина, д.23, корп.1, биологический факультет.

Факс (831) 465-85-92

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им.Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан "_____" ___________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, доцент А.С. Корягин

Общая характеристика работы

клетки донорской крови.

2. Изучить действие низкоинтенсивного широкополосного видимого света (красного и зеленого диапазонов) на функциональное состояние структур головного мозга кошек.

3. Исследовать влияние НИЛИ и ШКС на структуру и функцию ишемизированного сердца крыс (изолированного и in situ) в реперфузионный период.

электромагнитное излучение биологический объект

4. Определить изменения уровня супероксиддисмутазы (СОД) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в постишемическом миокарде крыс после воздействия на него НИЛИ и ШКС.

5. Оценить эффективность влияния НИЛИ и ШКС на показатели гомеостаза, а также на восстановление вегетативных функций организма крыс, перенесших клиническую смерть в результате острой массивной кровопотери.

Научная новизна работы. Впервые изучено влияние ЭМИ различных диапазонов на рост E. сoli М - 17. Выявлено сходство и различие действия ШКС и НИЛИ на микроорганизмы в зависимости от длительности воздействия.

Впервые изучено влияние низкоинтенсивного широкополосного видимого света различных диапазонов и НИЛИ на резистентность эритроцитов и фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов крови человека. Установлено, что воздействие ШКС и НИЛИ в одинаковой степени повышают осмотическую резистентность эритроцитов донорской крови и стимулируют фагоцитарную активность нейтрофилов.

Впервые показано изменение электрической активности зрительной коры головного мозга кошек при воздействии на ретикулярную формацию среднего мозга широкополосным видимым светом разного диапазона. Выявлено, что наибольшую эффективность воздействия оказывает широкополосный красный свет по сравнению с зеленым. В тоже время показано, что воздействие видимым светом на кору головного мозга менее эффективно по сравнению с действием на ретикулярную формацию.

Впервые показано наличие порогового уровня интенсивности НИЛИ при восстановлении функций изолированного сердца крыс после ишемии. Превышение указанного порога вызывает фибрилляцию, препятствует восстановлению сердечной деятельности, приводящее в дальнейшем к полной остановке сердца.

Впервые изучены эффекты воздействия НИЛИ и ШКС на миокард крыс in situ в постишемическом периоде. Выявлено, что ШКС, в отличие от НИЛИ, сокращает время восстановления сердечной деятельности, нормализует микроциркуляцию и предотвращает деструктивные изменения митохондрий и СПР в кардиомиоцитах, снижая уровень продуктов ПОЛ и повышая уровень СОД в тканях миокарда.

Впервые изучено влияние НИЛИ и ШКС на показатели гомеостаза, а также восстановление вегетативных функций организма крыс, перенесших клиническую смерть в результате острой массивной кровопотери. Выявлено, что обработка реинфузируемой крови крыс НИЛИ приводит к улучшению ее функциональных характеристик, а обработка реинфузируемой крови ШКС более эффективно, чем НИЛИ, повышает содержание гемоглобина и осмотическую резистентность эритроцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представление о применении ШС и НИЛИ в физиологической и медицинской практике. В результате исследования установлены особенности влияния ШС и НИЛИ на микробные популяции, цельную кровь, функциональное состояние нервной ткани, миокард в постишемическом периоде, показатели гомеостаза и восстановление вегетативных функций лабораторных животных, перенесших клиническую смерть в результате острой массивной кровопотери.

Установленные зависимости влияния ЭМИ СВЧ-диапазона, НИЛИ и широкополосного света на микроорганизмы, могут быть использованы в лабораторной и клинической практике.

Экспериментальные данные, полученные при исследовании воздействия широкополосным светом разного диапазона на цельную донорскую кровь, доказывают перспективность использования данного излучения в клинической практике, в процессе физиотерапевтических процедур, с целью повышения стимуляции фагоцитарной активности нейтрофильных лейкоцитов и резистентности эритроцитов.

Выявленное действие видимого света на различные отделы головного мозга позволяет использовать полученные результаты для разработки новых способов фототерапии и методик нейрофизиологических исследований.

Полученные результаты исследований обосновывают возможность применения низкоинтенсивного широкополосного излучения в медицинской практике с целью предупреждения и предотвращения ишемических повреждений миокарда, а также с целью восстановления функционального состояния тканей миокарда в постишемическом периоде. Полученные результаты могут быть использованы для нормированного ограничения применения гелий-неонового лазера в медицине.

Результаты, полученные при исследовании влияния НИЛИ и ШКС на показатели гомеостаза и восстановление вегетативных функций организма крыс после клинической смерти в результате острой массивной кровопотери, обосновывают перспективность использования ШКС в качестве физического агента, стабилизирующего кровь перед процедурой реинфузии в реаниматологии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изученные низкоинтенсивные ЭМИ: ШКС и НИЛИ, в отличие от СВЧ оказывают стимулирующее действие на рост популяций E. сoli М - 17, причем основной механизм эффекта различных диапазонов имеет фотохимическую, а не тепловую природу.

2. ШКС и НИЛИ стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов донорской крови человека и вызывают повышение осмотической резистентности эритроцитов.

3. Воздействие ШКС на ретикулярную формацию среднего мозга кошек вызывает существенные сдвиги функционального состояния головного мозга, более выраженные по сравнению с зеленым светом этой же мощности. Эффекты воздействия ШС на кору больших полушарий головного мозга менее выражены по сравнению с эффектами воздействия на мезэнцефалическую ретикулярную формацию.

4. Облучение ШКС синусного узла сердца крыс в реперфузионном периоде после ишемии способствует более быстрому, по сравнению с НИЛИ, восстановлению сократительной функции миокарда, повышает силу и скорость сокращений, нормализует скорость расслабления изолированного сердца крыс. При воздействии ШКС на миокард крыс in situ в постишемическом периоде, происходит восстановление и стабилизация ритмической активности, уменьшение интервала времени между возобновлением коронарного кровотока и восстановлением сердечной деятельности.

5. ШКС и НИЛИ снижают уровень процессов перекисного окисления липидов в миокарде крыс после ишемии в период реперфузии. Эффекты воздействия ШКС и НИЛИ имеют одинаковую направленность как в опытах на изолированном органе, так и in situ.

6. ШКС и НИЛИ модифицируют ультраструктуру миокарда. Выявлена существенная разница в морфологических эффектах воздействия данных излучений. При воздействии НИЛИ наблюдается сужение просветов капилляров, гиперплазия митохондрий и их полиморфизм, в то время, как ШКС обеспечивает восстановление микроциркуляции, значительное увеличение количества митохондрий и их гетерогенность.

7. ШКС, более эффективно по сравнению с НИЛИ, обеспечивает ускорение восстановления вегетативных функций организма лабораторных животных после клинической смерти (по сравнению с контрольной группой), в том числе нормализацию артериального давления и сокращение периода восстановления внешнего дыхания животных, повышая содержание гемоглобина и осмотическую резистентность эритроцитов.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на Всероссийской конференции ”Медицинская физика 93” (Москва, 1993), на научной конференции с международным участием “Медицинская Физика-95" (Москва, 1995), на II симпозиуме " Неинвазивные методы диагностики" (Москва, 1995); на конференции "Медицинская физика-97. Новые технологии в радиационной онкологии" (Обнинск, 1997); на II съезде биофизиков России (Москва, 2000); на Республиканской научно-практической конференции “Здоровье (проблемы теории и практики) ” (Ставрополь, 2000); на конференции Bios (Вена, 1996; Стокгольм, 1997, 1998); на XVIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); на конференции "Новые инновационные методы в медицине" (Саров, 2006); на II международной конференции "Человек и электромагнитные поля" (Саров, 2007; 2008).

По материалам диссертации опубликовано 53 работы в отечественных и зарубежных изданиях, получено 2 патента РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, выводов, библиографического указателя. Список цитируемой литературы содержит 290 источников, из которых 165 на русском и 125 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами и 43 рисунками.

Материалы и методы исследования

В работе использовались: штаммы микроорганизмов Escherichia coli M-17, донорская кровь, белые нелинейные крысы массой 250-300 г., кошки массой от 2,5 до 3,0 кг. Общий объем исследований приведен в табл.1.

Таблица 1. Объекты и их распределение по этапам исследований

На первом этапе работы проведено сравнительное исследование действия низкоинтенсивных ЭМИ на Esherichia coli - М 17. Облучение суспензии клеток проводили в тефлоновых кюветах, помещенных в волноводную ячейку сечением 35Ч15 мм. Облучение культуры проводилось при следующих условиях: несущая частота 9,372 ГГц, плотность потока мощности от 3,4 до 27,2 мВ/см², время экспозиции 60 минут. Контрольные опыты проводились в режиме ложного облучения. Воздействие производилось непрерывным (НМ) и амплитудно-импульсно-модулированными полями (АИМ) с длительностью сигнала 5 мкс, частотой модуляции 9 кГц и с пилообразной формой модуляции.

Действие тепла в диапазоне от 37° до 40°С определялось в кювете, помещенной в термостат. Эффект воздействия лазерным излучением и видимым светом определялся в тех же условиях, при температуре 37°С.

В экспериментах регистрировали следующие величины:

общее количество бактерий в суспензии, по калибровочной кривой, на основе измерения оптической плотности культуры на ФЭК-56М (светофильтр л_max=540 нм);

количество жизнеспособных бактерий, способных формировать колонии на стандартной среде Эндо.

Выживаемость клеточных популяций в опытах по СВЧ воздействию определялась по формуле N/N₀, где N - количество жизнеспособных клеток, или инфекционных единиц в культуре, после повышения температуры среды в течение 10 минут, N₀ - количество жизнеспособных клеток, или инфекционных единиц в культуре, при начальной температуре. Оценка влияния ШС и НИЛИ на рост клеток E. coli М-17 проводилась путем подсчета колоний.

Фагоцитарная активность нейтрофилов оценивалась по стандартным показателям фагоцитоза (Меньшиков, 1987). Контрольными служили образцы, находящиеся в режиме ложного облучения.

В опытах на кошках под хлоралозо-нембуталовым наркозом (50 мг/кг и 25-35 мг/кг, соответственно) изучались эффекты воздействия ШС видимого диа-пазона (красного л = 600-680 нм, зеленого л = 500-580 нм, мощность = 0,02 мВт) на зрительную и вестибулярную зоны коры головного мозга. Анализировались изменения вызванных потенциалов (ВП) на зрительное, слуховое и электрокожное раздражения, а также фоновой биоэлектрической активности указанных выше зон. Голову животного укрепляли в стереотаксическом аппарате и проводили трепанацию черепа. Используемые в опытах световоды, диаметром 0,3 мм, пропускающие красный или зеленый свет, заключали в жесткую стальную оболочку, а свободные их участки подсоединяли к устройству, служившему источником света. Иглу со световодом укрепляли в держателе стереотаксического аппарата и вводили в зону мозга с координатами, соответствующими местоположению мезенцефалической ретикулярной формации. Фоновую и вызванную электри-ческую активность отводили от зрительной области неокортекса (зона VII) биполярными серебряными электродами. Зрительные стимулы - вспышки белого света - подавали на контралатеральный глаз с частотой 0,3 имп/с. Слу-ховые стимулы-щелчки подавались в контралатеральное ухо. Электрокожное раздражение передней контралатеральной лапы осуществлялось импульсами прямоугольной формы, длительностью 0,3 мс от стимулятора ЭСУ-1 через изолирующую приставку. Все стимулы подавались с частотой 0,2 - 0,3 имп/с.

Корковые потенциалы усиливали (УБП-I-02) и фотографировали с экрана осциллографа (СI-18) методом суперпозиции 3 - 5 пробегов пучка с помощью фоторегистратора ФОР-2. После введения световода и установки корковых электродов регистрировали вызванный потенциал (ВП) от корковых структур. Через 10 минут регистрацию повторяли и, если ответы оказывались стабиль-ными, начинали световое воздействие на ретикулярную формацию. Регист-рацию ВП осуществляли на 1, 5 и 10-й минутах светового воздействия на ретикулярную формацию, после чего источник света выключали и повторяли регистрацию ВП на 1, 5 и 10-й минутах после отключения. По завершении эксперимента на срезах мозга контролировали положение световода в структурах мозга.

В экспериментах по изучению действия НИЛИ и ШКС на ишемизи-рованный миокард при реперфузии в постреанимационном периоде были про-веды исследования на модели изолированного сердца по Лангендорфу-Фалену (Fallen, 1967; Долгих, 1991). Изолированное сердце подключалось к перфузионной установке. Для перфузии использовался раствор Кребса-Хензелайта, рН=7,4, оксигенированный газовой смесью 95% О₂: 5% СО_2.

В ходе опыта измерялись следующие параметры сократимости: макси-мальная скорость развития (+dP/dt) и падения (-dP/dt) давления в левом желу-дочке, частота сердечных сокращений (ЧСС), конечное диастолическое давление в левом желудочке (КДД), интервал времени до первого самостоя-тельного сокращения после начала реперфузии, а также отток перфузата из коронарных сосудов (КК, мл/мин).

Уровень процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивался по содержанию в тканях миокарда продуктов пероксидации: диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), оснований Шиффа (ОШ) (Ланкин и др., 1979; Fletcher, 1983).

Состояние антиоксидантной защиты клеток определялось по активности ферментов СОД и каталазы (Aebi, 1970; Nishicimi, 1972).

Моделирование ишемии сердца осуществлялось путем окклюзии левой коронарной артерии крыс in situ. После трахеотомии и торакотомии животное подключалось к аппарату искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ). Под левым ушком сердца накладывалась лигатура на левую ветвь венечной артерии. Окклюзия осуществлялась в течение 5 минут. В результате развивалась острая ишемия, признаки которой наблюдались на ЭКГ. Световое облучение НИЛИ или ШКС области синусного узла в опытных группах начиналось сразу после снятия лигатуры и продолжалось 10 минут.

Морфологический анализ структурных изменений клеток, обусловленных световым воздействием, проводился с помощью электронного микроскопа. Образцы ткани брали из левого желудочка в области сосочковых мышц, затем их фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) в течение 60 минут, постфиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере в течение 2 часов. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заключали в смесь эпон-аралдит (Уикли, 1975). После обезвоживания спиртами возрастающей концентрации ткани заливали в эпоксидные смолы - смесь аралдита и эпона 812. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Ultracut (Reichert-yung), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Reynolds. Просмотр проводили на электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI.

Клиническую смерть у крыс продолжительностью 10 минут вызывали свободным кровопусканием из общей сонной артерии (Крылов, 1990). Объем изъятой крови во всех случаях превышал 30% объема циркулирующей крови. По окончании 10 мин клинической смерти начинали реанимационные мероприятия. Для быстрого кровонаполнения реинфузию крови производили внутриартериально. Одновременно с этим подключали аппарат искусственной вентиляции легких (ИВЛ). При необходимости проводили закрытый массаж сердца. Регистрацию изучаемых параметров в постреанимационный период проводили в течение 40 минут. Аутокровь первой опытной группы подвергали воздействию НИЛИ, второй опытной группы - ШКС. Облучение проводили в течение 10 минут. Контрольная серия экспериментов заключалась в инфузии аутокрови без ее облучения.

В процессе эксперимента у животных велась регистрация ЭКГ, артериального давления и реограммы конечностей. Фиксировался момент наступления первого самостоятельного вдоха во время реанимации и смертность животных, о которой судили по отсутствию самостоятельного дыхания на 40-ой минуте реанимации. Во всех экспериментах проводили исследование общего количества и осмотической резистентности эритроцитов, количества гемоглобина. Анализ исследуемых параметров проводили до кровопускания, на 1-ой и 40-ой минутах после начала реанимации.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью статистической диалоговой системы "Stadia" 4.51 (Кулаичев, 1991). Соответст-вие опытных данных нормальному распределению проверяли по критерию Колмогорова - Смирнова. Достоверность различий между значениями сравниваемых групп определяли с использованием t-критерия Стьюдента. При множественных сравнениях вводили поправку Бонферрони (Гланц, 1999).

Результаты и Обсуждение

Влияние ШКС, НИЛИ и СВЧ - излучения на микроорганизмы.

Результаты проведенных исследований выявили наличие эффекта при воздействии ШКС и НИЛИ на E. coli M-17 in vitro. Оба излучения, при 10 - минутном облучении, оказали стимулирующее воздействие на рост кишечной палочки. При более длительном воздействии (40 минут) зарегистрирован различный эффект этих воздействий, а именно при облучении микроорганизмов ШКС выявлен стимулирующий эффект, а при действии НИЛИ - бактериостатический. Зеленый свет не оказал воздействия на рост кишечной палочки. СВЧ-излучение, в отличие от светового, вызвало статистически значимое бактериостатическое воздействие на рост E. coli M-17 в процессе всего периода облучения (рис.1).

Рис.1. Влияние низкоинтенсивного ЭМИ различного диапазона на рост E. coli М-17;

* - статистически достоверные различия в сравнении с контрольной серией (р < 0,05).

Установлено, что СВЧ - воздействие и нагрев вызывают сходный бактериостатический эффект на рост кишечной палочки. В течение 10 минут выживаемость (относительная доля) микроорганизмов при СВЧ облучении уменьшалась с 0,92?0,08 до 0,041?0,025, а при увеличении температуры на 2,7° С наблюдалось снижение с 0,75?0,10 до 0,025?0,010.

В отличие от СВЧ и нагрева, полученные с использованием ШС и НИЛИ результаты свидетельствуют в пользу предположения о стимулирующем фотохимическом механизме воздействия света на живые ткани, обусловленного поглощением фотонов молекулами, имеющими спектральные линии поглощения в диапазоне используемого в экспериментах ЭМИ. В частности, при поглощении красного света молекулами СОД может происходить изменение их активности. Различный эффект, а, следовательно, и различный механизм при длительном воздействии различными ЭМИ, может быть вызван изменением скорости потока электронов внутри оксидазных комплексов, что приводит к значительным изменениям в клеточной мембране. Возможно, что видимый свет, адсорбированный хромофорами в дыхательной цепи, усиливает дыхательный метаболизм возбудимой клетки и воздействует на электрогенные свойства ее мембраны. Полученные данные совпадают с данными Кару (Кару, 2003; 2005), где показано, что видимое и ближнее инфракрасное излучение поглощается в дыхательной цепи митохондрий (например, цитохром-с-оксидазой). Это приводит к усилению обмена веществ, ведущего к передаче сигнала другим частям клетки, в том числе клеточным мембранам, и, в конечном итоге, к стимулированию роста.

Изучение эффектов воздействия ШС и НИЛИ на клетки крови.

Выявлено, что в образцах крови, облучаемых НИЛИ, а так же широко-полосным светом красного и оранжевого диапазонов наблюдается повышение осмотической резистентности эритроцитов. Облучение зеленым светом не привело к значимым изменениям (Табл 2.).

Таблица 2. Влияние видимого света различного диапазона на осмотическую резистентность эритроцитов донорской крови

* - р< 0,05 по отношению к контрольному образцу.