Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС КАК ОТРАЖЕНИЕ АДАПТАЦИОННЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОРГАНИЗМА РЫБ

Волынкин Ю.Л.

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии

ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Маслова Неонила Ивановна

доктор биологических наук, профессор

Головина Нина Александровна

доктор биологических наук

Кляшторин Леонид Борисович

Ведущая организация:

Московский государственный университет технологий и управления

Защита диссертации состоится «_____»______________2008 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.220.043.09 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49, ученый совет РГАУ-МСХА, тел. (факс): (495) 976-24-92.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Ученый секретарь диссертационного совета А.А. Ксенофонтова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Морфофизиологический статус, как совокупность морфологических и гематологических показателей, объективно отражающих физиологическое состояние рыб, может эффективно использоваться для решения теоретических и практических вопросов рыбохозяйственной науки.

Проблемы аквакультуры требуют дальнейшего развития теории и практики применения морфофизиологических индикаторов (Шварц С.С. и др., 1968), показателей красной (Коржуев А.П., 1964) и белой (Головина Н.А., Тромбицкий И.Д., 1989) крови.

Несмотря на фундаментальные исследования, проведенные в области ихтиогематологии (Иванова Н.Т., 1970, 1983, 1995; Fange R., 1968; Ellis A.E., 1977), уровень знаний о методе морфологического анализа крови рыб и эффективность его практического использования все еще недостаточны по сравнению с применением их в клинической и военной медицине (Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970; Козинец Г.И. и др., 2004). Имеющиеся сведения о составе, способах идентификации, морфологических особенностях и количественной динамике лейкоцитов и тромбоцитов у пресноводных и морских рыб не позволяют эффективно использовать показатели белой крови в качестве морфофизиологического индикатора, поэтому изучение морфологии клеток крови у рыб остается актуальным.

Исследование морфофизиологического статуса рыб имеет большое значение для создания новых технологических приемов выращивания: для прогнозирования количества сеголетков в выростных прудах, оперативного нормирования кормления сеголетков и товарной рыбы, а также для оценки состояния здоровья рыбы. Известно, что аэромоноз и ботриоцефалез относятся к особо опасным болезням в списке Минсельхоза РФ (2005), поэтому разработке способов их профилактики мы уделили особое внимание.

В последние годы, после десятилетнего перерыва в зимовальных прудах хозяйств Белгородской области зафиксированы случаи гибели рыбопосадочного материала. Причины гибели молоди точно не установлены, а средства борьбы не разработаны, чем обусловлена актуальность исследования клинических, морфологических и гематологических изменений у зимующей в прудах молоди карпа.

Гибель трехлетков карпа в мае объясняется бактериальным заболеванием - аэромонозом (Бычкова Л.И., Юхименко Л.Н., 2001). Профилактику и лечение аэромоноза осуществляют с помощью лечебных кормов, содержащих препараты нитрофуранового ряда, антибиотика антибак, иммунопротектора субалин, новейших отечественных вакцин. Несмотря на это, в ряде случаев развитие выраженной клинической картины аэромоноза и гибель рыб в весенний период все же имеют место (Борисова М.Н., 2005). Недостаток данных о развитии симптомов аэромоноза сдерживает разработку методов ранней диагностики болезни, а также средств и способов предупреждения возникновения аэромоноза, адекватных опасности болезни. Изучение патогенеза аэромоноза, морфофизиологических изменений у карпа на разных стадиях развития болезни остается актуальным.

В промысловой ихтиологии, среди множества направлений исследований, особое значение имеет краткосрочное прогнозирование положения и путей перемещения внутрипопуляционных группировок рыб (Кузнецов В.Н., Колпиков Ю.Е., 1981). Актуальным является выяснение и теоретическое обоснование морфофизиологических критериев миграционного и нагульного состояния рыб.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - на основе изучения морфофизиологического статуса дать научное обоснование адаптационных возможностей организма рыб в периоды нагула, зимовки, миграции: путей решения вопросов выращивания карпа, профилактики патологий (псевдомоноза, аэромоноза и ботриоцефалеза), идентификации нагульного и миграционного физиологического состояния у морских рыб. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- выявить особенности морфологии клеток крови карпа в норме и при бактериальных патологиях, выяснить клеточный состав крови у ряда морских рыб, дать сравнительную характеристику клеток крови пресноводных и морских рыб;

- изучить сезонную динамику морфофизиологических показателей у карпа и обосновать методику прогнозирования количества сеголетков карпа в выростных прудах;

- исследовать изменения морфофизиологических показателей сеголетков карпа при инфекционных патологиях (на примере псевдомоноза), теоретически обосновать и разработать способ их профилактики;

- изучить патогенез аэромоноза карпа, выявить последовательные стадии развития болезни, дать гематологическую характеристику рыб по стадиям ее развития, теоретически обосновать и разработать (с помощью морфофизиологических методов) способы применения эффективных лечебных комбикормов для профилактики бактериальных болезней (на примере аэромоноза);

- установить влияние кормления карпа зерном на морфофизиологические показатели, выявить комплекс морфофизиологических индикаторов для оперативного нормирования кормления при смешанной посадке карпа, оценить действие гашеной извести и корма «Циприноцестин-2» на морфофизиологические показатели карпа;

- определить морфофизиологические индикаторы нагульного и миграционного состояния у путассу, сравнить влияние активизации пластического обмена в период нагула у карпа и у путассу на их морфофизиологические показатели.

Научная новизна и теоретическая значимость. У морских и пресноводных рыб отрядов карпообразных, трескообразных и окунеобразных установлено сходство морфологии и закономерностей количественной динамики эритроцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. Состав и тинкториальные свойства других клеточных типов крови отличаются на уровне отрядов и даже на уровне семейств.

Впервые у карпа под воздействием патогенных аэромонад и псевдомонад зафиксировано необратимое изменение структуры ядер эритроцитов - конденсация ядерного хроматина вблизи мембраны. После снятия с помощью лечебных средств негативного воздействия в периферической крови рыб появляются полихроматофильные и постепенно накапливаются зрелые эритроциты с неповрежденными ядрами.

Установлено, что голоядерные клетки рыб по морфологии близки к лимфоцитам, а типичные тромбоциты представлены округлыми, овальными и вытянутыми формами. При созревании и старении тромбоциты «вытягиваются» подобно эритроцитам, поэтому в качестве морфофизиологического индикатора целесообразно выражение соотношения округлых, овальных и вытянутых тромбоцитов у рыб в процентах - тромбоцитарная формула.

В осенний период у сеголетков карпа (сначала у крупных, а затем у мелких) наблюдается кратковременное переходное от летнего к зимнему физиологическое состояние, которое характеризуется увеличением скорости переноса кровью протеина и лейкоцитозом.

Выявлено увеличение оснащенности гемоглобином и объема крови у карпа в течение зимовки, особенно сильно выраженное при псевдомонозе и связанное с накоплением пигмента в крови и тканях, поскольку при зимнем голодании затрудняется его выведение из организма с желчью.

Выяснено, что псевдомоноз осложняется бактериальным поражением покровов, что приводит к преждевременному истощению, патологическому ожирению и гибели рыб. Первопричиной возникновения зимних бактериальных инфекций карпа является нарушение функционирования системы иммунитета при хроническом токсическом воздействии на рыб пестицидного загрязнения водоемов.

Аэромоноз у трехлетних карпов весной протекает подостро с шестью последовательными стадиями развития болезни, со специфическими особенностями морфофизиологического статуса. Установлено, что для развития иммунитета у карпа требуется взаимодействие с «местными» штаммами аэромонад в течение не менее десяти лет. Яркой картины клинических признаков аэромоноза при этом не наблюдается, но адаптация к болезни приводит к остановке роста в мае и в июне, к задержке становления летнего типа белой крови.

Показано, что при умеренном кормлении искусственными кормами объем пищевого комка у товарного карпа остается относительно постоянным, поэтому коэффициент упитанности по Фультону объективно отражает соотношение скорости линейного и весового роста рыб.

В прудовых биоценозах, как и у наземных позвоночных животных, действует «принцип доминантности» в питании, согласно которому группы мелких рыб допускаются к корму в последнюю очередь, поэтому определение суточной дозы корма проводится по показателю ожирения внутренностей карпа группы «мелкие».

Установлено, что у путассу в нагульный период активный пластический обмен происходит при низкой концентрации гемоглобина, а различия этого показателя при миграции и в состоянии нагула сохраняются, несмотря на высокий уровень обловного стресса. Благодаря этому концентрация гемоглобина служит индикатором индивидуальной миграционной активности.

В период нагула у путассу закономерные изменения в составе белой крови менее выражены, чем у карпа. Мы связываем эти отличия с различиями в составе корма.

Выяснено, что для оценки физиологического состояния рыб (карпа и путассу) главным является концентрация гемоглобина в периферической крови, а другие показатели красной крови имеют второстепенное значение.

Практическая значимость работы. Изучение морфофизиологического статуса рыб позволяет судить о количестве сеголетков в выростных прудах (что необходимо для нормирования кормления и прогнозирования осенних результатов выращивания), обеспечить профилактику (снижение) массовой гибели рыбопосадочного материала в зимовальных прудах от псевдомоноза, разработать эффективные лечебные гранулированные комбикорма и способ их применения для профилактики аэромоноза карпа.

Выявлено, что изучение максимального числа показателей у отдельных рыб позволяет характеризовать физиологическое состояние их группы по ограниченной выборке (10 - 15 особей).

Предложенная нами методика ранней диагностики псевдомоноза, осложненного вторичным бактериальным поражением покровов, предусматривает проведение профилактической обработки рыб в зимовальных прудах гипохлоритом кальция. Создана ветеринарная инструкция по борьбе с псевдомонозом рыбопосадочного материала.

Нами разработаны лечебные корма ЛКФ (лечебный комбикорм с фурацилином, авторское свидетельство №1751880) и ЛГК (лечебный гранулированный комбикорм с фуразолидоном, патент № 2281768). На основе морфофизиологических показателей доказана их эффективность для профилактики аэромоноза и безвредность для рыб, подготовлены и утверждены ветеринарные инструкции по использованию этих кормов.

Для профилактики кишечных цестодозов карпа предлагается лечебный комбикорм «Циприноцестин-2». Нами установлена его эффективность при однократном применении и безопасность для организма рыб. Негашеная известь не обладает достаточным терапевтическим действием.

Разработан способ контроля роста карпа, позволяющий оценивать адекватность суточной дозы корма в период времени за 5 - 7 дней до исследования и устанавливать оптимальную суточную дозу корма на 7 - 10 дней вперед, даже если количество рыбы в пруду не известно.

В настоящее время лечебные корма ЛКФ и ЛГК используются для профилактики аэромоноза в рыбхозах Белгородской области, что подтверждается актами об их внедрении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оценка степени физиологического благополучия карпа в зависимости от условий содержания и кормления с помощью морфофизиологических показателей.

2. Адаптационные возможности организма рыб в условиях зимовки в прудах зависят от степени воздействия биотических факторов, в частности бактериального прессинга.

3. Воздействие бактериальной инфекции (на примере аэромоноза) на морфофизиологический статус и разработка способа повышения неспецифической резистентности организма рыб при использовании специальных кормов.

4. Использование в качестве индикаторов нагульного и миграционного состояния морских рыб интенсивности накопления и расходования питательных веществ и динамики гематологических показателей.

Апробация результатов исследования. Основные материалы диссертации доложены на 69-й сессии Международного совета по изучению моря ИКЕС (Калининград, 1981); на VI Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Вильнюс, 1985); на Всесоюзном совещании «Современное состояние и перспективы развития прудового рыбоводства» (Москва, 1987); на Второй чешской ихтиогематологической конференции [2. celostatni ichthyohematologicka conference] (Litomysl, 1989); на Международной научно-технической конференции, посвященной 70-летию основания Калининградского государственного технического университета (Калининград, 2000); на Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2003» (Калининград, 2003); на Международной научной конференции, посвященной 10-летию КГТУ, «Инновации в науке и образовании - 2004» (Калининград, 2004); на Международной научной конференции «Физиология, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006); на IX Международной научно-практической экологической конференции «Современные проблемы популяционной экологии» (Белгород, 2006); на конференции «Ихтиологические исследования на внутренних водоемах» (Саранск, 2007).

Публикация результатов работы. По теме диссертации опубликованы 42 работы, среди них 3 изобретения и 10 статей в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Рукопись диссертации состоит из введения, 8 глав, выводов и библиографического списка. Работа изложена на 319 страницах, содержит 20 таблиц, 28 рисунков. В библиографическом списке 497 источников, в том числе 455 отечественных и 42 - на иностранных языках. В приложение вынесены список сокращений, основные классификации клеток крови рыб, ветеринарные инструкции по проведению зимней обработки рыбы в прудах гипохлоритом кальция и по применению лечебных кормов, некоторые акты внедрения изобретений и патента.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для изучения морфологии клеток послужили препараты периферической крови рыб, полученные нами в разные годы (1974-2005) от 17 ви-

дов пресноводных и морских рыб, причем для восьми видов морских рыб такие исследования проводились впервые.

Морфофизиологические исследования выполнялись преимущественно на карпе и на путассу. Изучение влияния плотности посадки на темп роста, морфофизиологические показатели сеголетков карпа проводили на материале, полученном в Железногорском (1984-1987 гг.) и Новооскольском (1987 г.) зональных рыбопитомниках. Наблюдение за течением зимовки карпа вели в течение двух сезонов (1982-1984 гг.). Расширенные морфофизиологические исследования зимующих карпов с определением показателя оснащенности гемоглобином (г/кг) выполняли в условиях Белгородской живорыбно-сбытовой базы (1987-1988 гг.). Клинические, паразитологические и морфофизиологические наблюдения за развитием псевдомоноза с сопутствующей ему массовой гибелью годовиков карпа и растительноядных рыб в зимовальных прудах, вели в Новооскольском рыбопитомнике и Губкинском рыбхозе (1982-1989 гг.). Здесь же отрабатывали методику профилактики псевдомоноза рыб гипохлоритом кальция в прудах.

Клинические наблюдения за состоянием здоровья товарных карпов проводили в рыбхозах Белгородской области при каждом контрольном облове с периодичностью один раз в 10 дней (1992-2005 гг.). На основе результатов собственных исследований выявлены последовательные стадии развития аэромоноза в весенний период и соответствующие гематологические изменения, которые проследили в прудах Грайворонского рыбхоза (1989 г.), выведенного на карантин. Морфофизиологические исследования при испытании лечебных кормов ЛКФ и ЛГК проводили в аквариумных опытах на сеголетках карпа (1991 г.) и в производственных условиях на товарных карпах (2003 г.).

Показатели роста товарных карпов изучали в хозяйствах Белгородской области (1988-1991, 1995-2005 гг.), систему лабораторного контроля над выращиванием рыбы апробировали в Нагульном пруду площадью 200 га (ЗАО «Рыбхоз Ураевский»). Проведен сравнительный анализ морфофизиологических изменений карпа и морского мигранта Северо-Восточной Атлантики (1979 - 1981 гг.) на основе результатов собственных исследований.

При изучении морфологии клеток крови рыб учитывали руководства М.Г. Абрамова (1979), З.М. Калашниковой (1981), Н.Т. Ивановой (1983).

Размерно-весовые и гематологические показатели определяли по общепринятым методам (Лиманский В.В. и др., 1984; Щербина М.А. и др., 1992). В качестве одного из морфофизиологических индикаторов изучали индекс средней почки карпа. Ожирение внутренностей рыб оценивали по четырехбалльной шкале в соответствии с инструкцией «Запрыбпромразведки» (1977).

Объем крови и оснащенность организма гемоглобином у карпа определяли методом экстрагирования (Глазова Н.Т., 1981) в нашей модификации: концентрацию гемоглобина в крови и в экстракте находили с помощью фотоэлектроколориметра.

Основное окрашивание мазков крови рыб выполняли по Паппенгейму, препараты жаберной ткани и слизи окрашивали по Май-Грюнвальду (Бокуняева Н.И. и др., 1975). Для идентификации нейтрофилов рыб применяли пероксидазную реакцию, для отдифференцировки тромбоцитов от лимфоцитов использовали метод окрашивания Альтгаузена и метод Фонио (Haider G., 1967).

Площадь поверхности клеток крови определяли по формуле Е.А. Веселова (1959). У эритроцитов и вытянутых тромбоцитов дополнительно вычисляли индекс вытянутости - отношение ширины клетки к ее длине (Волынкин Ю.Л, Аминева В.А., 1990).

Для установления приблизительного количества лейкоцитов и тромбоцитов на части материала использовали показатель «отношение количества лейкоцитов (Л) и тромбоцитов (Тр) к количеству эритроцитов (Эр)» (Остроумова И. Н., 1972; Житенева Л.Д., Гориславская М.М., 1986), который вычисляли по формуле: 100*(Л+Тр)/Эр (%), а также отношение количества лейкоцитов к количеству тромбоцитов (Ellis A.E., 1976) или «Индекс Л/Тр».

Наблюдение за состоянием здоровья рыб включало осмотр всей пойманной рыбы, клиническое исследование, патологоанатомическое вскрытие в каждой размерно-весовой группе рыб (около 10 особей), изучение эктопаразитов на препаратах слизи и жабр (Гончаров, 1973). Для оценки бактериальной обсемененности покровов рыб использовали метод микроскопии окрашенных препаратов соскобов с жабр и слизи рыб (Волынкин Ю.Л. и др., 1991).

У рыб, изученных одновременно, вычисляли основные статистические характеристики показателей. Материалы обрабатывали с помощью пакета анализа «Excel» с использованием статистических критериев tст. - Стьюдента, F - Фишера, ч2 - «хи-квадрат», дисперсионного анализа, а также устанавливали корреляционные связи (Плохинский Н.А., 1970; Боровиков В., 2001). Различия изученных показателей считали достоверными при р 0,05 (Урбах Ю.Б., 1964).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфологические аспекты идентификации клеток крови рыб

У эритроцита карпа при созревании от базофильного к полихроматофильному уменьшается его ширина; при развитии до стадии зрелого эритроцита форма клетки не изменяется. При старении происходит дальнейшее «сужение» клетки. Разрушение эритроцита начинается в периферической крови и происходит в трех морфологических формах: клетки с разрушенным ядром, клетки с разрушенной цитоплазмой и «ядерные тени». В нормальной крови присутствуют до трех процентов мелких, наиболее «суженных» эллипсоидных эритроцитов с темной цитоплазмой - микроцитов. При развитии псевдомоноза наблюдается снижение резистентности эритроцитов, анизоцитоз, пикноз ядра, сдвиг ядра к краю клетки, малиновая грануляция в цитоплазме, появление эритропластидов. Отмечается наличие бактерий в плазме.

При зимнем псевдомонозе молоди и при весеннем аэромонозе трехлетков карпа обнаружено массовое нарушение структуры ядер эритроцитов: оно проявлялось в расположении хроматиновых нитей по контуру ядра и в просветлении его центральной части (рис. 1).

Полная замена эритроцитарного пула у зимующей молоди карпа происходит в течение около 20 дней. Следовательно, описанная патология - кольцевое расположение хроматина в ядре эритроцитов рыб - необратима и обусловлена действием токсинов как вырабатываемых бактериями, так и поступающих в организм рыб из внешней среды.

Единообразие в развитии клеток крови у исследованных видов рыб относится к эритроцитам, к их созреванию, старению и разрушению. В составе клеток белой крови у изученных рыб лимфоциты и нейтрофильные гранулоциты идентичны по морфологии и по отношению к красителям, поэтому их динамика в лейкоцитарной формуле с учетом созревания позволяет судить о физиологическом состоянии рыб.

Развитие большинства нейтрофилов у рыб в периферической крови заканчивается на стадии метамиелоцита, после чего они мигрируют в ткани (Калашникова З.М., 1976), тогда как у млекопитающих оно продолжается до сегментоядерных форм. У карпа доля старших возрастных категорий нейтрофилов увеличивается при выполнении ими функциональной нагрузки в пределах сосудистой системы (при псевдомонозе в период выздоровления и при развитии симптомов аэромоноза).

Рис. 1. Морфология эритроцитов крови карпа в норме (А) и при патологических изменениях структуры ядра (Б):

1 - зрелый эритроцит, 2 - зрелый патологический эритроцит, 3 - полихроматофильный эритроцит

Состав других гранулоцитов рыб различается на уровне отрядов и даже между некоторыми семействами. Среди лейкоцитов путассу встречаются специфические для ее крови гранулоциты с базофильной зернистостью, отличающиеся от гранулоцитов других рыб небольшими размерами и ядром, которое лежит эксцентрично, как бы вне клетки, имеет вид перевернутой чашки.

У морских окунеобразных рыб из семейства Спаровых (Sparidae): пагра, зубана, пагелла (в отличие от рыб семейства Скумбриевых - Scombridae) - нейтрофилы почти всегда отсутствуют. Одновременно в примерно эквивалентном количестве у этих рыб встречаются клетки сходных размеров и формы, но имеющие в цитоплазме темно-синие, до черного цвета гранулы, средней величины и мелкие многочисленные темно-фиолетовые, фиолетовые или малиново-фиолетовые зерна. При окраске на пероксидазу в цитоплазме этих клеток выявляются темно-бурые или почти черные гранулы. По-видимому, зернистые гранулоциты спаровых являются аналогом нейтрофилов крови остальных изученных морских и пресноводных окунеобразных.

Морфология моноцитов рыб по форме клетки и ядра сходна с классически описанной (Козинец Г.И. и др., 2004), но отличается, особенно у морских рыб, более выраженной негомогенностью и базофилией цитоплазмы (Иванова Н.Т., 1983; Волынкин Ю.Л., 1986). Следовательно, не может быть единой классификации лейкоцитов для всех рыб.

Тромбоциты рыб дифференцируются по форме клетки на округлые, овальные и вытянутые клетки с большим, центрально лежащим ядром и гомогенной бесцветной или слегка розоватой цитоплазмой, имеющей ровный край. Тромбоциты путассу различаются также по виду цитоплазмы. Она может иметь форму эллипса, а также при движении быть вытянутой в острие с одной стороны или выглядеть в виде язычков, расположенных по полюсам клетки. Неправильная форма клетки характерна только для стареющих тромбоцитов, которые по тинкториальным свойствам резко отличаются от голоядерных клеток.

У морских окунеобразных рыб тромбоциты наиболее дифференцированы. Кроме типичных тромбоцитов у них встречаются «голоядерные тромбоциты». Клетки имеют округлую, каплевидную (когда плотное темно-фиолетовое ядро заострено с одной стороны и закруглено с другой), или веретеновидную (у которых ядро заостряется с обоих концов) форму, или же края вытянутого ядра закруглены. Цитоплазма отсутствует или же клетки могут иметь один - два язычка цитоплазмы фиолетового или бледно-голубого цвета. У карпа и путассу такие клетки не встречаются или же единичные.

Существенные различия между морскими и пресноводными окунеобразными рыбами заключаются также в количественном соотношении клеточных типов белой крови. В крови пресноводных окунеобразных увеличено количество лимфоцитов (61,1 %) и «голоядерных тромбоцитов» (29,9 %), и понижено содержание типичных тромбоцитов (3,7 %), тогда как у морских рыб доля названных клеточных элементов крови составляет 16,2, 54,0, 27,3 % %, соответственно. Высокое содержание голоядерных клеток в крови морских окунеобразных при низком количестве лимфоцитов также позволяет предположить родственное положение этих клеточных типов.

Влияние плотности посадки на морфофизиологические показатели сеголетков карпа

Изучение морфофизиологического статуса сеголетков карпа при выращивании в прудах подтверждает известные закономерности: летнее физиологическое состояние характеризуется интенсивным линейным и весовым ростом, умеренно высокой концентрацией гемоглобина, повышенным содержанием лейкоцитов, а среди них - лимфоцитов, усиленной продукцией нейтрофилов и интенсивной их миграцией из кровяного русла в ткани, преобладанием среди тромбоцитов клеток округлой формы.

У сеголетков карпа коэффициент упитанности по Фультону хорошо отражает соотношение линейного и весового роста: он временно увеличивается в июле, когда в период привыкания сеголетков к искусственным кормам тормозится линейный рост, и значительно снижается в августе - при интенсивном линейном росте рыб. В июле у сеголетков возрастает доля базофильных эритроцитов, в дальнейшем онтогенезе среди незрелых клеток красного ряда преобладают полихроматофильные эритроциты. В августе у карпа индексы печени и селезенки сравнительно низкие, концентрация гемоглобина умеренно высокая, среди лейкоцитов доля нейтрофилов снижается в пользу лимфоцитов, отражая летнюю норму лейкоцитарной формулы (Тугарина П.Я., Рыжова Л.И., 1970; Глаголева Т.П., 1977).

В сентябре наблюдается переходное (от летнего к зимнему) физиологическое состояние сеголетков карпа. При замедлении линейного роста увеличиваются упитанность, индекс печени, индекс селезенки, повышается содержание белка в плазме, а также количество лейкоцитов, резко снижается концентрация гемоглобина. В лейкоцитарной формуле значительно и достоверно увеличивается доля малых лимфоцитов, понижается содержание нейтрофилов (как и ранее, среди них преобладают нейтрофильные миелоциты), но количество клеток всех стадий равномерно сокращается, резко замедляется как нейтрофилопоэз, так и миграция нейтрофилов в ткани. Наряду с этим в сентябре отмечается наибольшая доля в крови псевдоэозинофилов.

С сентября по ноябрь концентрация гемоглобина в периферической крови карпа остается почти неизменной. Снижение скорости переноса белка кровью, усиление эритропоэза, понижение количества лейкоцитов и скорости их поэза, накопление в крови зрелых нейтрофилов отражают постепенный переход карпов от летнего к зимнему физиологическому состоянию.

Величина концентрации гемоглобина крови карпа летом и ранней осенью связана с условиями обитания, определяется различиями в затратах энергии на адаптацию к химическому составу воды, к негативному влиянию метаболитов рыб. При интенсивном росте рыб она уменьшается (до 55 г/л), при ухудшении качества воды - возрастает (до 108 г/л) (Волкова С.И., 1982). Эти данные согласуются со сведениями о низкой оснащенности гемоглобином быстрорастущих рыб (Попов О.П., 1975).

Средняя навеска карпа, выращенного в одинаковых условиях кормления, находится в строгой обратной зависимости от конечной плотности посадки, вычисленной по результатам облова (табл. 1).

Результаты выращивания сеголетков карпа в выростных прудах

Выростной пруд, группа рыб	1	2	3	4
Происхождение	местный	кросс	кросс	местный
Средняя навеска, г	10,0	22,5	27,6	28,1
Плотность, тыс. шт. /га	84	61	33	28
Рыбопродуктивность, т/га	0,84	1,37	0,90	0,79
Площадь пруда, га	10	10	20	7

При выращивании кросса местного и румынского карпа достигаются более высокая масса и рыбопродуктивность, чем у местного карпа, как при плотной, так и при разреженной посадке. Помесь отличается увеличенным коэффициентом упитанности вследствие высокоспинности родительской формы - карпа «Фресинет» (рис. 2).

Индекс печени и содержание белка в плазме отличаются у рыб из разных прудов. Низкая концентрация гемоглобина осенью может еще более существенно понижаться и варьирует независимо от изменений содержания белка и индекса печени.

Осенью у сеголетков отсутствуют корреляционные связи (r = 0,00 - 0,07) между длиной, упитанностью, белком плазмы и количеством разрушенных эритроцитов. Слабая корреляционная связь (r = -0,25 - -0,34) отмечена между количеством незрелых эритроцитов и показателями: длина, концентрация гемоглобина, количество разрушенных эритроцитов. Отмечено, что концентрация гемоглобина и содержание белка в плазме варьируют независимо (r = 0,12).

В осенний период у сеголетков карпа четырех групп отмечено (отличающееся по времени) существенное увеличение концентрации белка в крови и индекса печени, что свидетельствует о кратковременном периоде резкой активизации метаболизма. При этом процесс белковой перестройки у малоупитанных рыб первой группы еще не начался, у рыб второй группы он протекает с умеренной скоростью, в четвертой группе перестроечные процессы достигают высокой интенсивности, а в третьей группе они уже закончились. Эти изменения укладываются в рамки сезонных физиологических процессов; они происходят не у всех рыб одновременно: сначала у крупных, а затем у мелких карпов (сначала в прудах с низкой, затем - с высокой плотностью посадки рыбы).

Установлена положительная корреляционная зависимость (r = 0,35 - 0,45) между концентрацией гемоглобина, количеством эритроцитов, гематокритом и отрицательная связь ее с количеством незрелых эритроцитов и индексом селезенки. При осенней белковой перестройке (вторая группа) увеличиваются упитанность, объем жидкости в тканях и в крови, поэтому концентрация гемоглобина понижается, что стимулирует умеренное новообразование эритроцитов в селезенке.

Количество лейкоцитов и тромбоцитов у карпов в сентябре очень высокое, при этом не выявлено четкой зависимости этого показателя от породной группы рыб и плотности посадки. В лейкоцитарной формуле, которая у сеголетков из четырех выростных прудов не отличается, преобладают лимфоциты.

Особенности физиологического состояния обусловливаются различиями во времени прохождения закономерных биологических процессов отдельными рыбами. Поэтому морфофизиологические показатели отражают, во-первых, физиологическое состояние каждой из рыб; во-вторых, влияние совокупности абиотических факторов и, в-третьих, зависимость их от плотности биомассы рыб в прудах.



Рис. 2. Морфофизиологические показатели сеголетков карпа в зависимости от породной группы и плотности посадки (обозначения как

в таблице 1: 1 - местный карп, 2 - кросс, 3 - кросс, 4 - местный):

А - длина, Б - масса, В - упитанность, Г - относительная масса печени,

Д - белок плазмы, Е - концентрация гемоглобина в периферической крови,

Ж - количество эритроцитов, З - количество лейкоцитов и тромбоцитов,

И - гипотетические линии темпа роста сеголетков карпа при различной плотности рыбы в пруду

Дисперсионный анализ подтвердил существенное влияние на концентрацию гемоглобина фактора плотности посадки рыбы, а опосредованно - условий содержания в прудах и индивидуальной массы карпа.

Результаты анализа темпа весового роста сеголетков при различных плотностях посадки и затратах комбикорма (32 пруда, собственные данные) позволили установить зависимость между темпом роста сеголетков карпа и плотностью биомассы рыбы в пруду. Выявлен определенный «оптимальный прирост биомассы рыбы в пруду» для каждого отрезка рыбоводного сезона. Он реализуется в диапазоне плотности сеголетков карпа между 20 и 40 тыс. шт. /га и связан с наличием естественного корма как биологически активной добавки к искусственным кормам. Превысить «оптимальный прирост биомассы» в некоторой степени можно за счет увеличения интенсивности кормления рыбы. Но при этом отмечено увеличение кормовых затрат. При высоких плотностях посадки также происходят угнетение роста и увеличение дифференциации по массе. Это можно объяснить отрицательным влиянием на темп роста сеголетков повышения объема экзометаболитов карпа, выделяемых в пруд при интенсивном прудовом выращивании.

Выявлена обратно пропорциональная зависимость массы рыбы и темпа весового роста от плотности рыбы в пруду. Так, с каждой десятидневкой, с началом регулярного кормления, темп роста сеголетков в прудах с низкой плотностью рыбы начинает опережать скорость роста карпа в плотно зарыбленных прудах. С первой декады августа по навеске карпа можно с достаточной точностью определить количество рыбы в пруду и сделать прогноз по выходу сеголетков.

Динамика морфофизиологических показателей молоди карпа в зимний период в норме и при заболевании псевдомонозом

Под зимовкой в настоящей работе понимается период годового цикла рыб, сопряженный с низкой и постоянной температурой воды (0,1-0,3оС). Зимнее физиологическое состояние характеризуется незначительным постепенным понижением упитанности (с 2,95 - 3,00 до 2,70 - 2,90) и индексов печени, селезенки и средней почки; снижением содержания общего белка крови; динамическим постоянством концентрации гемоглобина, высоким количеством эритроцитов (1,40 - 1,50 *1012 шт. /л), умеренным эритропоэзом (0,2 - 4,0 %) и деструкцией (1,0 - 12,3 %) эритроцитов; снижением содержания лейкоцитов до количественного преобладания тромбоцитов, повышением доли гранулоцитов в лейкоцитарной формуле. Увеличение доли нейтрофилов к середине зимовки происходит за счет накопления в крови зрелых клеток. Весной, при незначительных изменениях в красной крови существенно возрастает количество лейкоцитов и тромбоцитов (с 15-20*109 шт. /л до 50-60*109 шт. /л), усиливается лимфопоэз и миелопоэз, повышается уровень миграции нейтрофилов в ткани, а в лейкоцитарной формуле - содержание лимфоцитов (до 80 - 85 %).

Установлено, что в феврале и марте объем крови, вытекающей при ее отборе, оказывается значительно больше, чем в декабре и январе. Концентрация гемоглобина при этом не изменяется. Для выяснения причин отмеченного явления провели эксперимент на фоне спонтанного бактериального заражения, расширив набор контролируемых показателей за счет индексов органов, белка плазмы и сыворотки, оснащенности гемоглобином (г/кг) и объема крови.

Коэффициент упитанности годовиков в течение зимовки существенно не изменяется, относительная масса печени постепенно возрастает (рис. 3). Содержание белка в плазме, количество лейкоцитов и тромбоцитов, а также незрелых эритроцитов снижаются до февраля, а в марте - повышаются. Концентрация гемоглобина при стабильной низкой температуре воды 0,1оС не изменяется, количество эритроцитов постепенно уменьшается до 1,04-1,10*1012 шт./л, что может рассматриваться как отклонение от нормы. Оснащенность гемоглобином у зимующих рыб с декабря по март постепенно и достоверно повышается с 2,48±0,09 до 3,50±0,15 г/кг массы тела. Объем крови также увеличивается с 3,5±0,3 до 4,9±0,3 %.

Эти данные сравнили с показателями годовиков, зимовавших в прудах, у которых в марте произошло нарушение нормального течения зимовки, рыбы образовывали стаи на притоке, у многих обнаружен экссудат в полости тела, фиксировалась зеленоватая окраска печеночной ткани. Эти рыбы отличаются существенно пониженными упитанностью, индексом печени и количеством эритроцитов - при неизменной концентрации гемоглобина, увеличенным содержанием незрелых эритроцитов и белка плазмы, но оснащенность гемоглобином 5,22±0,34 г/кг и объем крови - 7,8±0,5 % у них оказываются существенно и достоверно выше, чем у экспериментальных карпов.

Около половины гемоглобина крови карпа находится в циркуляции, другая половина депонируется в параллельных сосудах органов и тканей (в почках, селезенке и в печени, поскольку желчный пузырь предварительно удаляется).

О.П. Попов (1986) отмечал повышенный уровень оснащенности гемоглобином (г/кг) карпов весной в сравнении с осенними данными. Нами показано постепенное нарастание оснащенности гемоглобином в течение зимовки одноразмерных карпов, а также у рыб, больных псевдомонозом.

Для уточнения закономерностей физиологических изменений в зимний период в организме карпа были изучены корреляционные связи важнейших морфофизиологических индикаторов: упитанности, индекса печени, индекса селезенки, концентрации гемоглобина между собой и со всеми остальными изученными показателями (табл. 2).



Рис. 3. Динамика морфофизиологических показателей зимующей молоди карпа (1 - ноябрь, 2 - декабрь, 3 - январь, 4 - февраль, 5 - март,

6 - март, прудовый карп):

А - длина, Б - масса, В - упитанность, Г - индекс печени, Д - белок плазмы,

Е - лейкоциты и тромбоциты, Ж - концентрация гемоглобина,

З - количество эритроцитов, И - незрелые эритроциты, К - разрушенные

эритроциты, Л - оснащенность гемоглобином, М - объем крови

Между концентрацией гемоглобина, с одной стороны, индексом селезенки и индексом средней почки, объемом крови и количеством незрелых эритроцитов - с другой обнаруживается отрицательная связь средней силы. Увеличение интенсивности новообразования эритроцитов в кроветворных органах происходит при умеренной анемии и увеличении объема крови. Коэффициент корреляции между концентрацией гемоглобина и количеством эритроцитов составляет только 0,53±0,05, это связано с различиями содержания гемоглобина в эритроците и среднего объема эритроцита у отдельных рыб. Примечательно, что концентрация гемоглобина и оснащенность гемоглобином варьируют независимо, подтверждая представление об относительном постоянстве (гомеостазировании) концентрации гемоглобина у рыб.

Корреляционные связи морфофизиологических показателей молоди карпа в зимний период (коэффициент корреляции и его ошибка - r±mr )

Показатели	Упитанность по Фультону	Индекс печени, %	Индекс селезенки, %	Гемогло-бин, г/л	Оснащенность гемогл., г/кг
Длина, см	0,11	-0,09	-0,15	0,04	-0,73±0,04
Масса, г	0,39±0,06	-0,07	-0,18	0,05	-0,74±0,03
Упитанность		0,08	-0,02	0,04	-0,44±0,06
Индекс селезенки, %	-0,02	-0,07		-0,47±0,06	0,13
Индекс средней почки, %	0,12	0,20	0,36±0,07	-0,36±0,07	0,02
Индекс полостного жира, %	-0,11	0,33±0,08	-0,09	0,17	-0,01
Гемоглобин, г/л	0,04	-0,01	-0,47±0,06		0,04
Эритроциты, *1012 шт./л	0,19	-0,04	-0,18	0,53±0,05	-0,15
Незрелые эритроциты, %	0,09	0,12	0,32±0,07	-0,42±0,06	0,01
Оснащенность гемоглобином, г/кг	-0,44±0,06	-0,07	0,13	0,04
Объем крови, %	-0,43±0,06	-0,09	0,40±0,06	-0,48±0,06	0,82±0,03

Примечание: корреляционные связи отмечены жирным шрифтом, отсутствие связи - обычным шрифтом.

Установлена корреляционная связь (r = 0,82±0,03) между оснащенностью гемоглобином и объемом крови как косвенное свидетельство стабильности индивидуальной концентрации гемоглобина в крови. Отрицательная корреляционная связь обнаруживается между оснащенностью гемоглобином и размерно-весовыми показателями, отражая известную закономерность об уменьшении относительной массы органов и тканей с увеличением длины рыб.

Для решения вопроса о причинах и механизме повышения оснащенности гемоглобином и объема крови изучили морфофизиологические показатели в группах одноразмерных (10,1±0,1см) рыб с высокой (4,38±0,16 г/кг) и низкой (2,50±0,15 г/кг) оснащенностью гемоглобином. Высокая оснащенность гемоглобином свойственна рыбам с увеличенными содержанием белка в плазме и объемом крови. Концентрация гемоглобина в периферической крови у низкооснащенных гемоглобином рыб оказывается равной 73±4 г/л, у рыб с высокой оснащенностью гемоглобином она увеличивается только до 85±5 г/л (недостоверно).

Следовательно, в течение зимовки происходят медленный эритропоэз и постепенное накопление гемоглобина в организме рыб, а выведение продуктов его разложения из организма с желчью через кишечник оказывается невозможным, вследствие отсутствия пищеварения (Пегель В.А., 1950; Калиман П.А., Беловецкая И.В., 1985; Агаджанян Н.А. и др., 2001). Для обеспечения постоянства концентрации гемоглобина требуется увеличение объема крови, отмечается корреляция последнего с оснащенностью гемоглобином.

Поскольку концентрация гемоглобина в периферической крови рыб гомеостазируется, то степень ее отклонения от среднего уровня в сторону увеличения пропорционально отражает затраты энергии организма (интенсивности потребления кислорода), направленной на противодействие неблагоприятным воздействиям (болезнетворным агентам). Длительное негативное влияние приводит организм к гибели от истощения. Снижение концентрации гемоглобина означает развитие болезненного состояния организма - анемии, которое тоже приводит к гибели. У каждой особи с помощью механизмов гомеостаза активно поддерживается концентрация гемоглобина на определенном уровне, обусловленном кислородным запросом ее организма на адаптацию (к негативному воздействию).

Как сезонная норма показателей физиологического состояния животных (Трахтенберг И.М. и др., 1978), а также границы нормы любых гематологических параметров у здоровых рыб (Головина Н.А., Тромбицкий И.Д., 1989), так и оптимальные границы индивидуальной концентрации гемоглобина у карпа в течение зимовки находятся в пределах значений от M - tст.*m до M + tст.*m, то есть от 76,7 до 85,7 г/л (рис. 4).

Рис. 4. Оптимальные и пессимальные границы индивидуальной изменчивости концентрации гемоглобина у зимующих сеголетков карпа (М - среднее значение, m - ошибка среднего значения)

Повышение концентрации гемоглобина отражает попадание организма в зону пессимума и связано с повышением энергозатрат на адаптацию к действию неблагоприятного фактора. Например, для нейтрализации токсинов бактерий, населяющих слизь карпа, или при ухудшении абиотических условий зимовки (Дьяконов Ю.Н., 1980). Понижение показателя за пределы нормы встречается в крови почти у 10 % карпов при нормальном течении зимовки. Эти рыбы имеют увеличенные размеры печени, селезенки, средней почки, повышенное содержание белка и количество лейкоцитов в крови, обнаруживают интенсивный лимфопоэз, не характерный для зимнего периода, и высокое содержание тромбоцитов вытянутой формы.

Выявленные нами признаки расстройства функций организма дают основание в качестве причины анемии предположить нарушение механизмов гомеостаза вследствие активизации бактерий (псевдомонад), контаминирующих внутренние органы рыб. Активизация бактерий может происходить только у некоторых менее резистентных рыб, это приводит к перечисленным изменениям их физиологического состояния: возможно, анемичные рыбы в течение зимовки незаметно элиминируют.

Считается, что нестандартные карпы (массой менее 25 г) плохо переносят зимовку, при этом увеличивается вероятность их заболевания. По нашим данным, группа нестандартных карпов (масса 6,7±0,5 г) отличается от основной группы повышенной упитанностью, а также более высоким содержанием незрелых и разрушенных эритроцитов, увеличенными количеством лейкоцитов и тромбоцитов, долей лимфоцитов и округлых тромбоцитов. Это отражает известную закономерность - снижение уровня метаболизма с увеличением длины рыб, которая проявляется у карпа и в зимнее время. Характер наблюдаемых особенностей, отсутствие значительных негативных изменений показателей, в том числе стабильность концентрации гемоглобина, доказывают, что механизмы гомеостаза у нестандартных карпов способны к эффективной работе, поэтому эти рыбы могут успешно переносить зимовку в прудах наравне с более крупными особями. клетка кровь карп бактериальный

В осенний и зимний периоды коэффициент упитанности у молоди карпа в норме и у больных псевдомонозом рыб изменяется по-разному, поэтому следует с осторожностью относиться к осеннему коэффициенту упитанности как критерию зимостойкости (Лиманский В.В., 1986).

Заболевание псевдомонозом может возникать у молоди прудовых рыб с декабря по март. Оно начинается с единичного появления рыб в контрольных прорубях и на притоке. Первыми поражаются рыбы, ослабленные ботриоцефалезом, диплостомозом, постодиплостоматозом. Постепенно движение рыб становится все более массовым, они медленно и неотвратимо погибают от истощения, упитанность карпов понижается до 2,37±0,07, отход достигает 80-90 %.

Среди немногочисленных симптомов болезни отмечены слабо выраженный сероватый налет по бокам тела, каплевидные образования слизи на окончаниях плавников, редко появляются участки ерошения чешуи и экссудат в полости тела. На отпечатках слизи с поверхности тела и жабр эктопаразиты немногочисленные или отсутствуют, но на тех же препаратах, окрашенных по методу Д.Л. Романовского, в большем или меньшем количестве обнаруживаются бактерии различной формы, в том числе псевдомонады (Волынкин Ю.Л. и др., 1991). Наблюдается снижение эффективности иммунной защиты; слизь рыб, обладающая высокой бактерицидной активностью (Солтани М.М. и др., 2003), становится субстратом для развития микроорганизмов - открываются ворота инфекции. Бактериотоксины вызывают изменения в тканях и в составе крови рыб (в частности, нарушение морфологии эритроцитов и лейкоцитов), подобные патологическим проявлениям, возникающим под действием экзотоксинов. Ответ организма рыб на бактериальное поражение покровов заключается в усиленной секреции слизи, беспокойстве и непрерывном движении рыб. Эти воздействия приводят организм к истощению и гибели.

При интенсивном развитии бактерий в слизи они распределяются мозаично, находятся только в отдельных полях зрения в плотных скоплениях, содержащих сотни и тысячи организмов. Если организм борется с инфекцией (или проведена лечебная обработка), то микроорганизмы встречаются почти в каждом поле зрения, лежат беспорядочно, иногда в группах по 5 - 20 шт.

У больных и погибающих карпов показатели красной крови умеренно высокие, возрастает количество тромбоцитов, среди них повышается доля клеток вытянутой формы, а в лейкоцитарной формуле отмечается нехарактерное для зимнего периода увеличение содержания малых лимфоцитов.

При снятии пресса на организм бактерий, населяющих слизь рыб, после обработки зимующей молоди в прудах гипохлоритом кальция (в концентрации 1 г/м3 три дня подряд без прекращения проточности) гибель ее прекращается сразу, в течение 10 дней постепенно снижается интенсивность движения рыбы, замедляются расход питательных веществ и похудание, процесс зимовки нормализуется. Через 20 дней после проведения обработки увеличивается упитанность (до 2,52±0,06), фиксируются лейкоцитоз, нейтрофилия со сдвигом ядра вправо, среди тромбоцитов повышается доля округлых форм. Все гематологические показатели при выздоровлении рыб приближаются к норме.

Анализ собственных результатов и литературных источников позволяет заключить, что массовая гибель молоди рыб в зимовальных прудах не связана с действием предельно низкой температуры (Остроумова И.Н., 1972) или неполноценным кормлением рыбы (Федотенков В.И., 2000). Она обусловлена негативным действием бактерий, населяющих слизь, в противодействие которым организм рыб синтезирует большое количество слизи, содержащей факторы иммунной защиты (Вихман А.А., 2002), постепенно истощается и неотвратимо погибает.

В первые послеперестроечные годы с прекращением внесения на поля удобрений и пестицидов гибель молоди в зимовальных прудах белгородских хозяйств неожиданно прекратилась. Следовательно, основная причина гибели заключалась в нарушении функционирования системы иммунной защиты рыб под влиянием хронического пестицидного загрязнения рыбоводных водоемов, даже если концентрация загрязнителей в воде не превышала ПДК. Наиболее чувствительны к загрязнению рыбы первого года жизни - их несовершенная иммунная система в связи с молодым возрастом уязвима, особенно в период зимнего голодания. В самые последние годы случаи заболевания и гибели рыбы вновь фиксируются в зимовальных прудах, поэтому разработанная нами методика ранней диагностики и лечения псевдомоноза рыб является актуальной.