Микробные сообщества карстовых пещер Средней Сибири

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Микробные сообщества карстовых пещер Средней Сибири

03.00.16 - биология

доктора биологических наук

Хижняк Сергей Витальевич

Красноярск, 2009

Работа выполнена на кафедре экологической генетики и биотехнологии в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», г. Красноярск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Машанов Александр Иннокентьевич

доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична

доктор биологических наук, профессор Суховольский Владислав Григорьевич

Ведущая организация Красноярский государственный педагогический университет им. В. П. Астафьева

Защита состоится « 9 » октября 2009 г. в 9⁰⁰ часов на

заседании диссертационного совета Д 220.037.01 при Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049, г.Красноярск, пр.Мира,90.

Тел/факс: 8(3912)2278-652

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан «____»________________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Полонская Д.Е.

Актуальность проблемы. Карстовые пещеры представляют собой особую среду обитания живых организмов, характеризующуюся отсутствием света, стабильностью условий на протяжении геологически значимых промежутков времени, высокой степенью изолированности от наземных экосистем. Масштабы распространения и размеры карстовых пещер таковы, что позволяют выделять их в особую оболочку Земли - карстосферу (Маруашвили, 1970). По состоянию на 2004 г. известно о 1628 крупных (протяжённостью более 3000 м) карстовых пещерах с суммарной протяженностью ходов около 17,4 тыс. км (World Cave Database, 2006). Реальное же число пещер на нашей планете, по оценкам специалистов, может достигать 10⁵ (Дублянский, 1998).

В первой половине ХХ века в пещерах были начаты активные биологические исследования, которые привели к обнаружению уникальных подземных экосистем, в состав которых входят представители практически всех крупных таксонов живых организмов, и формированию отдельного научного направления - биоспелеологии.

В конце 60-х годов ХХ века в пещерах были начаты целенаправленные микробиологические исследования, которые в начале 90-х привели к убеждению об исключительно важной роли бактерий и грибов как в функционировании подземных экосистем, так и в протекающих в пещерах геохимических процессах. Несмотря на научные достижения в данном направлении, вопрос о составе, биологических особенностях и экологической роли микробных сообществ подземных карстовых полостей в настоящее время далёк от своего разрешения. Между тем, пещерные микробные сообщества представляют исключительно большой интерес в плане изучения биологического разнообразия обитающих на нашей планете организмов, в качестве модельного объекта для понимания процессов в наземных экосистемах, а в последние годы - и в качестве полигона для отработки технологии поиска жизни на других планетах (Boston, 2001).

Подавляющее большинство исследований подземной микробиоты выполнено за рубежом, в пещерах, резко отличающихся по своим климатическим и геохимическим особенностям от расположенных на территории нашей страны. Настоящее исследование призвано восполнить существующий пробел в знаниях о составе и экологических особенностях микробиоты сухогалерейных карбонатных пещер умеренной климатической зоны на основе десятилетнего (1998-2008 г.г.) изучения микробных сообществ карстовых пещер Средней Сибири. Работа выполнена при частичной поддержке Красноярского краевого фонда науки и научно-образовательного центра «Енисей» (грант М0041 от 2000 г.).

Цель - изучение численности, разнообразия и экологических особенностей микроорганизмов в карстовых пещерах Средней Сибири и выявление факторов, определяющих состав микробных сообществ холодных карбонатных пещер сухогалерейной стадии развития.

Основные задачи:

1. Изучение численности и пространственного распределения микроорганизмов в грунте и воде пещер и спелеосистем, различающихся по местоположению, геологическому строению и уровню антропогенной нагрузки.

2. Изучение биологического разнообразия обитающих в сибирских пещерах микроорганизмов.

3. Изучение биологических особенностей обитающих в сибирских пещерах микроорганизмов.

4. Выявление факторов, влияющих на состав пещерных микробных сообществ.

5. Разработка модели формирования и классификации микробных сообществ холодных карбонатных пещер сухогалерейной стадии развития.

6. Оценка перспектив практического использования микроорганизмов, входящих в состав микробных сообществ сибирских пещер.

Защищаемые положения:

· В карстовых пещерах Средней Сибири присутствуют специфические микробные сообщества, по численности и биологическому разнообразию входящих в них микроорганизмов сопоставимые с микробными сообществами наземных экосистем. Эти сообщества представлены бактериями и грибами с различной степенью адаптации к низкотемпературным условиям пещер умеренной климатической зоны

· Основными факторами, определяющими состав пещерных микробных сообществ Средней Сибири, являются историческая длительность притока экзогенного органического вещества в подземную полость, а также современный уровень антропогенного загрязнения и присутствие троглофилов.

· Классификация микробных сообществ сухогалерейных карбонатных пещер умеренной климатической зоны.

· Карстовые пещеры умеренной климатической зоны, находящиеся на сухогалерейной стадии развития, являются природным источником психрофильных и психротолерантных штаммов микроорганизмов, представляющих интерес для использования в биотехнологии.

Научная новизна. Впервые на территории бывшего СССР изучены естественные микробные сообщества холодных карстовых пещер сухогалерейной стадии развития. Показано, что эти сообщества включают в себя психрофильные и психротолерантные формы, отсутствующие в наземных экосистемах. Впервые изучены факторы, определяющие состав микробных сообществ холодных сухогалерейных карбонатных пещер.

Впервые для пещер данного типа предложены модели формирования и классификация микробных сообществ.

Впервые показано, что микробные сообщества карстовых пещер умеренной климатической зоны являются природным источником перспективных для использования в биотехнологии психрофильных и психротолерантных штаммов.

Впервые показана возможность использования психрофильных и психротолерантных микроорганизмов в качестве основы безопасных для теплокровных и эффективных в условиях низких температур начала вегетационного периода биофунгицидов.

Практическая значимость. Разработаны рекомендации по нормализации экологического состояния карстовых полостей Красноярского края и Хакасии, используемых в рекреационных целях. Результаты исследований использованы в работе первого подземного музея Средней Сибири - памятника природы краевого значения пещеры Караульная-2 (Акт внедрения №56 от 15.05.2005 г.), Результаты исследований используются в организации просветительской работы в спелеоклубах и детских спелеолагерях (Акты внедрения №34 от 02.02.2007 г. и №2 от 03.04.2007 г.). Коллекция выделенных в пещерах Сибири психрофильных и психротолерантных микроорганизмов используется в преподавании дисциплин "Микология" и "Защита растений" для специальностей 110102, 110203 и 110201М на кафедре экологической генетики и биотехнологии ФГОУ ВПО КрасГАУ (Акты внедрения №5 от 15.10.2008 и №12 от 27.11.2008). Выделенные в пещерах психрофильные и психротолерантные штаммы антагонистов возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых проходят полевые испытания в ОПХ «Минино» (КрасНИИСХ) в качестве биологических агентов в борьбе с гельминтоспориозной корневой гнилью и альтернариозом (Справка о производственных испытаниях от 15.05.2009).

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены в 40 работах, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 7.

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на научных и практических конференциях: Всероссийская научно-практическая конференция "Проблемы экологии и развития городов" (Красноярск, 2000); II Всероссийская научная конференция студентов и молодых ученых "Агроэкология и устойчивое развитие регионов" (Красноярск, 2000); X International Symposium "Concept of Homeostasis: Theory, Experiments and Application" (Krasnoyarsk, 2000); 2-я Всероссийская научно-практическая конференция "Проблемы экологии и развития городов" (Красноярск, 2001); Всероссийская школа-семинар "Региональные особенности организации научной деятельности молодежи в современных условиях" (Красноярск, 2001); 1-я Общероссийская научно-практическая конференция "Проблемы экологии и охраны пещер: теоретические и прикладные аспекты" (Красноярск, 2001); Всероссийская научно-методическая конференция "Экологическое образование для сохранения биоразнообразия" (Барнаул, 2003); International Geological Correlation Programme of the UNESCO Project 448 meeting (USA, 2003); Всероссийская очно-заочная научно-практическая и научно-методическая конференция с международным участием "Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития" (Красноярск, 2008); 3-rd International Workshop on Ice Caves (Perm, 2008); 37th COSPAR Scientific Assembly (Canada, 2008); Международная научно-практическая конференция "Агроэкологическая роль плодородия почв и современные агротехнологии" (Уфа, 2008); Научно-практическая конференция "Пещеры: охрана, история исследований, культура, туризм, современное состояние и перспективы научных исследований в пещерах на территории бывшего СССР" (Красноярск, 2008).

По результатам исследований под руководством автора защищена одна кандидатская диссертация (Нестеренко, 2007), и одна кандидатская диссертация подготовлена к защите (Кимм, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 334 страницах, включает введение, 10 глав, выводы и практические рекомендации, библиографический список и приложения. Рукопись содержит 25 таблиц, 130 рисунков. Библиографический список включает 444 источника, в т.ч. 236 на иностранных языках.

Личный вклад автора. Все полевые исследования в пещерах выполнены при непосредственном участии автора в качестве руководителя экспедиций и подземных маршрутов. Представленная работа является обобщением научных исследований, проведенных автором лично и в качестве научного руководителя, в том числе - формулировка идеи, планирование и координация экспериментов, получение и обработка первичных материалов, анализ, систематизация и интерпретация результатов научных исследований, а также написание работы.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность д-ру биол. наук, профессору Е.Я. Мучкиной, д-ру биол. наук, профессору Д.Е. Полонской за помощь в работе над диссертацией, председателю Красноярского краевого клуба спелеологов И.Н. Бурмаку за организацию общероссийских научно-практических конференций "Проблемы экологии и охраны пещер: теоретические и прикладные аспекты" и "Пещеры: охрана, история исследований, культура, туризм, современное состояние и перспективы научных исследований в пещерах на территории бывшего СССР", руководству и участникам Красноярского городского клуба спелеологов и МУ "Центр путешественников" за предоставленные картографические материалы, коллективу научно-аналитического форума SciLog.ru за плодотворное участие в обсуждении диссертации.

Содержание работы

Глава 1. Карстовые пещеры как компонент биосферы

В главе 1 приводится обзор современного состояния изученности карстовых пещер и пещерных экосистем. На основе анализа источников литературы делается вывод, что микробные сообщества в карстовых пещерах на сегодняшний момент остаются малоизученными. Работы общебиологической и экологической направленности, за небольшим исключением, являются описательными и носят фрагментарный и случайный характер. Подавляющее большинство исследований выполнено в тропических и субтропических пещерах, резко отличающихся по своим микроклиматическим и геохимическим особенностям от пещер умеренной климатической зоны. Микологические исследования пещер, расположенных на территории бывшего СССР, ограничиваются всего несколькими публикациями (Лисина-Кулик, 1967, 1968, 1969; Semikolennykh, 1997; Иванова, 2002; Семиколенных, 2004). Немногочисленные бактериологические исследования имеют узкоспециальную санитарно-микробиологическую направленность (Симионка, 1988; Файнбург, 1999). Единственной работой экологической направленности на территории бывшего СССР является работа А.А. Семиколенных по изучению почвоподобных тел в пещере "Кап-Кутан", Восточный Туркменистан (Семиколенных, 2006).

Глава 2. Организация исследований

Объектами исследования являлись микробные сообщества 18 пещер, относящихся к девяти различным карстовым участкам и различающихся по размерам, степени посещаемости и геологическому строению (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1. Морфологическая характеристика изучаемых пещер

Название пещеры	Протяженность, м	Амплитуда, м	Глубина, м	Тип системы	Карстовый участок
Айдашинская	41	25	25	Вертикальная	I
Баджейская	6000	170	170	Комбинированная	II
Большая Орешная	43470	247	215	Горизонтальная	II
Ручейная	1300	85	85	Горизонтальная	II
Тёмная	2500	55	55	Горизонтальная	II
Торгашинская	2965	176	176	Комбинированная	III
Ледяная	720	32	32	Горизонтальная	III
Водораздельная	нет данных	143	143	Вертикальная	III
Песчаная	270	29	26	Комбинированная	III
Караульная-2	540	34	34	Горизонтальная	IV
Женевская	6020	130	90	Комбинированная	V
Кубинская	3000	274	274	Вертикальная	V
Партизанская	6649	125	125	Горизонтальная	VI
Маячная	1100	60	60	Комбинированная	VII
Ледопадная	589	188	188	Вертикальная	VIII
Ящик Пандоры	10000	195	195	Комбинированная	IX
Кашкулакская	820	49	49	Комбинированная	IX
Парлагольская	600	34	34	Горизонтальная	Кемеровская обл.

Исследуемые пещеры образованы в известняках и доломитах, являющихся отложениями морских бассейнов позднего рифея, венда, кембрия. Время формирования пещер датируется в неогеновым и четвертичным периодами (Цыкин, Цыкина, 1978; Цыкин, 1993). В настоящее время пещеры находятся на сухогалерейной стадии развития и характеризуются отсутствием постоянных и временных водотоков, олиготрофными условиями и низкими температурами (+2..+5°С в зависимости от морфологии и глубины залегания полости) при отсутствии сезонной температурной динамики. Относительная влажность воздуха близка к 100%. Грунт представлен обвальными, хемогенными и остаточными (пещерная глина) отложениями. Из представителей троглофильной и троглобионтной фауны отмечены летучие мыши, а также беспозвоночные (преимущественно Collembola). Начиная с 60-х..80-х г.г. ХХ века в большинстве пещер наблюдается антропогенное загрязнение, степень которого сильно варьирует в зависимости от времени географического открытия, местоположения и доступности конкретной карстовой полости или спелеосистемы.



Рисунок 1. Схема района исследований: I- Аргинский участок, II- Баджейский участок, III- Торгашинский участок, IV - Карауленский участок, V- Бирюсинский участок, VI- Верхне-Базаихский участок, VII- Казанчежский участок, VIII- Столбовский участок, IX- Ефремкинско-Сыйский участок

При планировании исследований использовали опыт ведущих зарубежных биоспелеологов, а также собственный опыт. Изучение культивируемых микроорганизмов проводили методом сбора образцов (sampling) с последующим высевом на питательные среды. В качестве микроорганизмов, способных к росту в условиях пещеры, учитывали только те, которые формировали колонии при +4°С. В экспериментах in situ использовали метод пробных площадок. При изучении антибиотической активности пещерных микроорганизмов в качестве тест-культур использовали фитопатогенные грибы р.р. Bipolaris и Alternaria, выделенные из поражённых органов ячменя и пшеницы.

Глава 3. Численный состав и распространенность микромицетов в пещерах Средней Сибири

Установлено, что микромицеты являются обычными представителями пещерной микробиоты. При этом в распределении грибов в пределах конкретной пещеры, спелеосистемы или грота наблюдается исключительно высокая гетерогенность. Даже в близко расположенных участках численность грибов может варьировать от менее чем 10³ до 10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г. грунта. Не обнаружено статистически значимых связей между удаленностью от входа и численностью пещерных микромицетов (коэффициент корреляции r= -0,137). В наибольшем количестве (10⁵-10⁶ КОЕ на 1 г. грунта) грибы присутствуют в районах с высоким уровнем антропогенного загрязнения, в первую очередь - вблизи подземных стоянок спелеотуристов, а так же вдоль подземных троп (10⁴-10⁵ КОЕ на 1 г. грунта). При наличии подходящего субстрата грибы формируют макроскопические колонии и "плесневые ковры" площадью до нескольких сотен см². Основным фактором, определяющим численность микромицетов в грунте сибирских пещер, в настоящее время является уровень антропогенной нагрузки. Это проявляется в статистически значимых (p<0,01) различиях в численности грибов между посещаемыми и малопосещаемыми пещерами, а также в статистически значимых (p<0,01) различиях в численности грибов между посещаемыми и малопосещаемыми участками в пределах индивидуальной пещеры (рис. 2). При этом спелеотуристы не только обеспечивают приток необходимой для развития микромицетов органики, но и участвуют в распространении спор и конидий по пещере. В пещерах и спелеосистемах, не посещавшихся человеком до проведения наших исследований, микромицеты не обнаружены.



Рисунок 2. Влияние уровня антропогенной нагрузки на пещеру (слева) и на спелеосистему в пределах индивидуальной пещеры (справа) на численность микромицетов в грунте

Таким образом, для пещер Сибири (за исключением труднодоступных и малопосещаемых спелеосистем) характерна численность микромицетов, не уступающая их численности в лесных почвах и почвах агроценозов, либо превосходящая этот показатель на 1-2 порядка. Это можно объяснить относительно низкой конкуренцией за субстрат в подземной экосистеме, где отсутствуют такие потребители органики, как копро- и некрофаги. Основными субстратами для микромицетов в пещерах являются свечной парафин, обрывки бумаги, древесина, фекалии, волосы, шерсть и другие высокомолекулярные субстраты, на которых грибы, как правило, выигрывают конкуренцию у бактерий. Другим объяснением высокой численности грибов в пещерном грунте является их способность образовывать споры (конидии), которые накапливаются и сохраняются до следующего благоприятного периода.

Глава 4. Биологическое разнообразие микромицетов в пещерах Средней Сибири

В результате проведенных исследований установлено, что в сибирских пещерах присутствует достаточно разнообразная в таксономическом отношении микобиота. Среди распространенных в исследуемых пещерах грибов обнаружены представители 15 родов, относящиеся к пяти отделам: р.р. Pythium, Mucor, Mortierella, Thamnidium, Paecilomyces, Cryptococcus, Rhodotorula, Penicillium, Chrysosporium, Fusarium, Verticillium, Periconia, Trichoderma, Doratomyces, Echinobotryum. В пещере Женевская были отмечены плодовые тела макромицетов р. Coprinus.

Основное число выделенных изолятов приходится на представителей отдела Deuteromycota. Доминирующее положение занимает род Penicillium (34,5% от общего числа изолятов), что характерно для комплексов почвенных микромицетов арктических территорий (Смирнова, 1978; Егорова, 1986; Кирцидели, Томилин, 1997). Широко распространен р. Chrysosporium, который не только входит в комплексы микромицетов 8 из 16 исследованных пещер, но и является преобладающим в пещерах Тёмная и Торгашинская. Обычные для почв Сибири и Дальнего востока представители р.р. Verticillium и Paecilomyces в пещерах встречаются относительно редко. Грибы р. Verticillium обнаружены в трех (Торгашинская, Большая Орешная и Парлагольская), а р. Paecilomyces - в четырех (Торгашинская, Кубинская, Айдашинская и Парлагольская) пещерах. Doratomyces stemonitis и его синанаморфа Echinobotryum atrum представлены в четырех пещерах региона (Караульная, Ледяная, Парлагольская и Маячная). Представители р. Fusarium выделены только из привходовых участков пещер Айдашинская и Ручейная. Широко распространенные в почвах Сибири грибы р. Thriсhoderma в обнаружены только в грунте пещеры Кашкулакская, что может быть связано с длительным использованием пещеры в качестве культового места.

Между карстовыми участками наблюдаются статистически достоверные (p<0,05) различия в таксономической структуре сообществ пещерных микромицетов (рис. 3). Эти различия обусловлены не особенностями участков, а спецификой конкретных карстовых полостей. При этом между отдельными пещерами, в том числе - расположенными в пределах одного карстового участка, наблюдаются значительные и статистически достоверные (p<0,05) расхождения в составе микофлоры, определяемые разнообразием и количеством попадающего в них экзогенного субстрата. В целом, родовой состав микромицетов пещер Сибири соответствует составу микромицетов в прилегающих почвах. Однако для подземных микоценозов характерно пониженное биоразнообразие, а также другое соотношение представителей различных родов по сравнению с микоценозами наземных экосистем.

Рисунок 3. Различия в таксономическом составе пещерных микромицетов между карстовыми участками (вверху), и между отдельными пещерами в пределах карстового участка (внизу, на примере пещер Торгашинская и Ледяная Торгашинского карстового участка)

Кластерный анализ показал, что по частоте совместной встречаемости в пещерах региона микромицеты образуют следующие ярко выраженные группы (кластеры): 1) Penicillium, Chrysosporium, Mucor; 2) Paecilomyces, Verticillium, Doratomyces, Thamnidium, Fusarium; 3) Periconia, Pythium, Echinobotryum, Mortierella, Cryptococcus, Rhodotorula (рис. 4).

Рисунок 4. Результаты объединения микромицетов по частоте совместной встречаемости в сибирских пещерах (метод Варда)

Попадание представителей р.р. Penicillium, Chrysosporium и Mucor в общий обособленный кластер объясняется тем, что представители этих родов являются убиквистами и встречаются практически во всех исследованных пещерах. На их долю приходится 95% всех выделенных изолятов. При этом представители р. Penicillium преобладают в пещерах с высоким уровнем заноса почвы и органического вещества из наземных экосистем, р. Chrysosporium - в пещерах и спелеосистемах с относительно редким поступлением органического вещества и почвы с поверхности, р. Mucor характерен для пещер и спелеосистем с высоким уровнем фекального загрязнения. Кластер, объединяющий представителей р.р. Paecilomyces, Verticillium, Doratomyces, Thamnidium и Fusarium, отражает тот факт, что данные грибы встречаются лишь в пещерах, для которых характерен достаточно высокий занос разнообразной экзогенной органики как природного, так и антропогенного происхождения. Наконец, представители р.р. Periconia, Pythium, Rhodotorula, Cryptococcus обнаружены только в пещере Караульная-2, являющейся уникальной по уровню испытываемой антропогенной нагрузки.

Глава 5. Экологические особенности микромицетов карстовых пещер Средней Сибири

Основным абиотическим фактором в сибирских пещерах является стабильная низкая температура (см. Главу 2). По отношению к температуре встречающиеся в пещерах Сибири грибы можно разделить на три группы: облигатные психрофилы, не способные к росту при температуре выше +22..+24 єС (14% выделенных изолятов), мезофилы, способные к росту при температуре +4єС (46%), а также промежуточные между мезофилами и психрофилами формы, отнесённые нами к психротолерантным (40%) (рис. 5). Эти группы выявлены среди представителей всех обнаруженных в пещерах отделов, за исключением отдела Oomycota. По нашему мнению, различия в температурных оптимумах и температурных пределах роста свидетельствуют о разной степени эволюционной адаптации микромицетов к низким температурам сибирских пещер. Более подробно данный вопрос обсуждается в Главе 9.

численность антропогенный микробный пещера



Рисунок 5. Температурные кривые роста облигатно психрофильных (слева) и психротолерантных (справа) изолятов на примере одноклеточных грибов р. Cryptococcus, выделенных из грунта пещеры Караульная-2.

Между различными пещерами исследуемого региона обнаружены статистически достоверные различия (р<0,01) по относительной встречаемости мезофильных, психротолерантных и психрофильных микромицетов (рис. 6).

Рисунок 6. Примеры различий относительной встречаемости мезофильных, психротолерантных и психрофильных микромицетов в различных пещерах

Температуры, близкие к верхнему температурному пределу роста облигатно психрофильных изолятов пещерных микромицетов (+24єС …+26єС) останавливают их развитие на стадии набухания спор (конидий) либо на стадии образования проростковых трубок. После этого происходит необратимая гибель спор (конидий), и их способность к росту не восстанавливается даже после длительной инкубации при оптимальной температуре (+10єС … +15єС). При сублетальных температурах может отмечаться прорастание спор (конидий) с последующей необратимой остановкой роста на стадии первичного мицелия. При более низких температурах может формироваться разветвленный мицелий. Однако такой мицелий несет ряд дегенеративных изменений: аномально утолщенные и искривленные гифы, сильная вакуолизация клеток. Данный мицелий не способен к формированию органов размножения даже при переносе в благоприятные условия. У психротолерантных изолятов летальные для психрофильных форм температуры вызывают лишь задержку в прорастании спор (конидий) и развитии мицелия. Все выделенные в пещерах мезофильные микромицеты способны к осуществлению полного цикла развития вплоть до образования органов размножения либо покоящихся структур при температуре +4єС, хотя время прохождения цикла при низкой температуре может увеличиваться в 5-10 раз.

Статистически достоверное (p < 0,01) большинство изолятов, выделенных из сибирских пещер, образуют внеклеточные протеазы и амилазы и только 7% не обладают данными ферментами (рис. 7).

Рисунок 7. Распределение пещерных микромицетов по способности к образованию амилолитических и протеолитических ферментов

По мере снижения температурного оптимума наблюдается закономерное (p<0,05) увеличение доли изолятов, не обладающих амилазной и протеазной активностью (рис. 8).

Рисунок 8. Распределение мезофильных, психротолерантных и психрофильных пещерных микромицетов по способности к образованию амилолитических и протеолитических ферментов

Можно предположить, что в связи с олиготрофностью пещерных местообитаний и нерегулярностью поступления высокомолекулярной органики с поверхности, часть микромицетов в процессе адаптации к условиям пещер начинает постепенно переходить к использованию альтернативных субстратов, не требующих наличия амило- и протеолитических ферментов, что ведёт к наблюдаемой нами потере способности к синтезу данных ферментов частью психротолерантных и психрофильных изолятов. Между представителями разных таксономических групп также выявлены статистически достоверные (p<0,01) различия по встречаемости амилолитических и протеолитических изолятов. Так, среди представителей отд. Zygomycota чаще встречаются амилолитические изоляты, не обладающие протеолитической активностью, а среди представителей отд. Ascomycota и Deuteromycota - изоляты, способные одновременно к синтезу и амилаз, и протеаз.

Эксперименты по оценке роли микромицетов в биологическом самоочищении пещер показали, что скорость микробной деструкции высокомолекулярных субстратов, моделирующих различные виды отходов антропогенного происхождения, относительно невысока. Наиболее быстро в условиях пещеры утилизируются целлюлозосодержащие субстраты: бумага, окурки. Убыль массы указанных субстратов после 60 суток экспозиции в пещере может достигать 28-23%. Несколько медленнее разлагается льняная ткань - максимальная потеря массы за 60 суток не превышает 10%. Практически не разлагается за указанный срок образцы парафина (убыль массы < 5%), древесина (убыль массы < 1%).

Скорость микробной деструкции высокомолекулярных субстратов в условиях пещеры статистически значимо (p<0,01) зависит от площади контакта субстрата с пещерным грунтом и влажности грунта. Наблюдаются статистически достоверные (p<0,01) различия между разными участками пещеры по скорости утилизации экзогенных субстратов (рис. 9).

Рисунок 9. Удельная убыль (%) различных субстратов в результате микробной деструкции за 3 года в разных участках пещеры (на примере пещеры Караульная-2)

В ряде случаев пещерные микромицеты находятся в основании пищевых цепей. Среди основных потребителей грибов в сибирских пещерах следует выделить клещей, и, возможно, коллембол. Это было доказано лабораторными экспериментами, в ходе которых выделенные из пещеры Караульная-2 панцирные клещи в течение длительного времени культивировали в лаборатории на колониях плесневых грибов, изолированных из той же пещеры. Исследования in situ также показали, что клещи в заметном количестве (2-3 особи на см² поверхности грунта) присутствуют только в местах, где наблюдаются сплошные "ковры" плесневых грибов.

Глава 6. Численный состав и распространённость бактерий в пещерах Средней Сибири

Во всех изученных пещерах нами обнаружены способные к росту при +4°С бактерии основных эколого-трофических групп, встречающихся в водных и почвенных экосистемах. Численность представителей разных эколого-трофических групп, а также суммарная численность культивируемых бактерий в подземных местообитаниях варьирует в широких пределах, в ряде случаев приближаясь к аналогичным показателям для наземных экосистем (табл. 2).

Таблица 2. Численность бактерий, способных к росту при +4°С, в грунте посещаемых пещер на примере пещеры Караульная-2, тыс. КОЕ/г

Место отбора пробы	МПА	среда Чапека	КАА	Олиготрофная среда
Грот Очарование (район подземной спелеостоянки)	1400083	95092	11900125	38600250
Грот Грязный (тропа)	1700095	42080	115030	125032
грот Грязный (труднодоступное место)	2100121	Не выявлены	7500100	600075
Среднее	11033,3	456,7	6850	15283,3

Высокая численность бактерий в пещерах частично может быть объяснена действием антропогенного фактора, заключающегося в привнесении в пещеры органического вещества спелеотуристами. Так, максимальные численности культивируемых бактерий в пещерном грунте (до 57000 тыс. КОЕ/г) отмечаются в участках с высоким уровнем антропогенного воздействия, в первую очередь - в пещерах, имеющих подземные спелеостоянки. Влияние антропогенного фактора на численность бактерий в пещерах доказано статистическим анализом (p<0,01).

Тем не менее, высокая (до 10⁶ КОЕ/г грунта) численность бактерий наблюдается и в малопосещаемых пещерах, а также в пещерах (Водораздельная) и спелеосистемах (система Экологическая в пещере Партизанская), ранее не посещавшихся человеком. В таких пещерах максимальная численность бактерий отмечается в районах колоний летучих мышей, а в пещерах-ловушках - также в районах скопления костных остатков позвоночных (табл. 3). Полученные данные говорят о том, что основным субстратом для развития гетеротрофных бактерий в посещаемых пещерах служит органическое вещество антропогенного происхождения, а в малопосещаемых - троглофилы, троглоксены и случайно попавшие в пещеру животные, а также продукты их жизнедеятельности.

Таблица 3. Численность бактерий бактерий, способных к росту при +4°С, в грунте малопосещаемых пещер на примере Ледопадной и Водораздельной

Описание (в скобках показана глубина от поверхности)	Тыс. КОЕ/г
Пещера Ледопадная (малопосещаемая)
Грот "Музей", район колонии летучих мышей и естественная ловушка для позвоночных (-90 м)	4000 63
Грот "Дивногорский", нижняя часть пещеры (-188 м)	1100 55
Пещера Водораздельная (ранее не посещалась человеком)
Верхняя часть входного колодца с заносом почвы и органического материала с поверхности	440 10
Нетронутый грунт за входным завалом (-30 м)	460 10
Водобойный "котёл" с костными остатками, естественная ловушка для мелких позвоночных (-40 м)	1680 32
Средняя часть пещеры (-70 м)	232 8
Нижняя часть пещеры (-120 м)	13,2 2,8

Среди сапротрофных (эвтрофных) бактерий в целом статистически достоверно (p<0,001) преобладают формы, использующие органический азот, хотя это справедливо главным образом для участков с высоким уровнем антропогенного загрязнения либо местах скопления троглофилов, троглоксенов и продуктов их жизнедеятельности (рис. 10). Среди бактерий, способных к росту при низких температурах, в отдельных пробах грунта обнаружены также азотфиксаторы и олигонитрофилы, учитываемые на среда Эшби, в количестве 10³-10⁵ КОЕ/г грунта.

Рисунок 10. Соотношение бактерий, использующих в качестве источника азота органический и минеральный азот: 1 - в среднем по пещерам (по совокупности проанализированных проб); 2 - в районе колонии летучих мышей (п. Маячная); 3 - в труднодоступном участке (п. Партизанская)

В пробах уплотненного грунта тропы из пещеры Караульная-2 обнаружены факультативно-анаэробные денитрифицирующие бактерии. В грунте с высоким уровнем антропогенного загрязнения (Караульная-2 и Ледяная) обнаружены также нитрифицирующие бактерии (до 14 х 10³ КОЕ/г грунта), однако низкая скорость нитрификации при температуре +4°С говорит в пользу аллохтонного происхождения данных бактерий. Другие группы хемоавтотрофных бактерий в сибирских пещерах не выявлены.

В ряде пещер (Караульная-2, Маячная, Ледяная и др.) в районах с длительным притоком экзогенной органики нами отмечены ранее не описанные в литературе тёмные "почвоподобные" плёнки в форме пятен площадью от нескольких десятков до сотен см² на поверхности пещерных глинистых отложений. По комплексу своих микробиологических и химических характеристик "почвоподобные" плёнки занимают промежуточное положение между пещерными грунтами и почвами региона (рис. 11). Это позволяет рассматривать данные плёнки как свидетельство первичного почвообразования.

Рисунок 11. Распределение образцов пещерного грунта, "почвоподобных" плёнок и почв по комплексу микробиологических характеристик по осям дискриминации; данные по почвам региона - по (Сорокина, 2006)

Численность культивируемых бактерий в водоемах пещер варьирует в пределах 0,12 - 350,0 тыс. КОЕ/мл. Как правило, максимальная численность бактерий в источниках воды наблюдается вблизи наиболее посещаемых мест пещеры и подземных стоянок спелеотуристов. Антропогенный фактор оказывает статистически достоверное (p<0,01) влияние не только на численность, но и на состав водной микробиоты посещаемых пещер. Так, из 11 проанализированных источников питьевой воды в наиболее посещаемых пещерах Красноярского края 8 не соответствуют санитарным требованиям, предъявляемым к питьевой воде по общему числу гетеротрофных бактерий, способных к росту при температуре человеческого тела. В четырех из перечисленных источников обнаружены бактерии группы кишечной палочки в количестве, превышающем предельные допустимые нормы в 18 тыс. .. 4,8 млн. раз. Факт повышенной концентрации бактерий группы кишечной палочки в районах подземных спелеостоянок и троп спелеотуристов отмечен и зарубежными авторами, которые полагают, что заносимые человеком бактерии могут играть существенную роль в формировании микробного пула пещеры (Northup et al., 1999). Тем не менее, по нашим данным, бактерии антропогенного происхождения во всех изученных водоёмах составляют меньшинство. Об этом говорит преобладание изолятов, не способных к росту при температуре человеческого тела, на долю которых приходится от 57 до 99% общего числа культивируемых бактерий даже в антропогенно загрязнённых подземных водоёмах.

Отношение численности олиготрофных бактерий к эвтрофным (коэффициент олиготрофности) в пещерных грунтах варьирует в пределах 0,07 .. 3,19 при среднем значении 1,22, и в целом уступает аналогичному показателю для лесных почв региона. Сходная ситуация наблюдается и в отношении исследованных нами пещерных водоёмов, где коэффициент олиготрофности (0,42 .. 3,81) соответствует аналогичному показателю для эвтрофных наземных водоёмов. Это противоречит теоретическим представлениям зарубежных авторов о ярко выраженной олиготрофности водо- и сухогалерейных пещер (Cunningham, 1995; Streever, 1996; Turin, 2000; Boston 2001; Graening, 2001; Northup, 2003; Barton, 2006). Возможные причины данного феномена обсуждаются в Главе 7. Прямой учёт на стёклах обрастания показал наличие вертикального распределения численности бактерий в подземных водоёмах (рис. 12). Максимальная численность наблюдается в поверхностном или приповерхностном слое, минимальная - на дне водоёма (p<0,01).



Рисунок 12. Примеры вертикального распределения численности бактерий в подземных водоёмах: 1,2 - пещера Женевская, 3,4 - пещера Партизанская; пунктиром обозначен уровень дна

Кроме подземных водоёмов, культивируемые бактерии основных эколого-трофических групп (см. табл. 2) в количестве 0,3х10³..25х10³ КОЕ/мл обнаружены в инфильтрационно-капельной влаге. Численность бактерий в пробах "лунного молока" (белые пастообразные отложения из микрокристаллических агрегатов кальцита), определённая методами высева на различные среды и прямой микроскопией, не превышает 0,7 тыс. КОЕ/г. Низкая бактериальная обсеменённость и низкая биохимическая активность, определённая методом мультисубстратного тестирования, свидетельствует против гипотезы (Gradzinski, 1994) о биогенном происхождении "лунного молока".

С помощью стёкол обрастания установлено, что бактерии в подземных местообитаниях размножаются in situ с минимальным зафиксированным временем генерации 63 часа. Это позволяет приблизительно оценить максимальную биологическую продукцию в пещерах региона. Так, для пещеры или спелеосистемы с протяжённостью ходов в 10²..10³ м суммарная бактериальная продукция может составить от 0,01 до 2 г в сутки.

Глава 7. Факторы, определяющие численность бактерий и наблюдаемое соотношения представителей разных эколого-трофических групп в пещерах региона

Как отмечено в Главе 6, несмотря на отсутствие в изучаемых пещерах автотрофной продукции, численность культивируемых бактерий в воде и грунте в ряде случаев достигает значений, характерных для наземных сообществ. Частично это можно объяснить отсутствием конкуренции со стороны копро- и некрофагов (см. Главу 3) и отсутствием таких потребителей бактерий, как простейшие (Хижняк, Гладкова, 2004). Другим объяснением высокой численности бактерий может быть повышение доступности органического вещества за счёт сорбции бактериальных клеток и растворённой органики на поверхности частиц пещерной глины. Подобный эффект показан для наземных водоёмов (Щур и др., 2004) и подтверждается зафиксированными нами фактами развития микроколоний бактерий in situ преимущественно вокруг минеральных частиц.

Для объяснения низкого коэффициента олиготрофности в воде и грунте пещер региона нами предложена модель, предусматривающая характерный для пещер периодический залповый вброс концентрированного органического вещества в микробное сообщество, состоящее из двух конкурирующих за субстрат групп бактерий - эвтрофной и олиготрофной. Удельная скорость роста обеих групп зависит от концентрации субстрата согласно модели Моно - Холдейна, параметры модели подобраны в соответствии с реальными данными. Анализ модели показал, что при низкой частоте вброса субстрата наблюдается снижение биопродуктивности и эвтрофикация сообщества, поскольку из-за низкой общей численности бактерий снижение концентрации органики происходит медленно, что не позволяет развиваться олиготрофам (рис. 13).



Рисунок 13. Компьютерного анализ модели: 1 - разовое поступление субстрата; 100 и 500 - стационарное состоянии соответственно при частых и редких вбросах субстрата; справа - связь между частотой и суммарным поступлением субстрата в экосистему, суммарной биопродукцией и отношением олиготрофы/эвтрофы

В то же время при частом поступлении субстрата микробный пул поддерживается на уровне, обеспечивающим быстрое снижение концентрации органики до благоприятной для олиготрофов концентрации. Эти выводы подтверждаются отмеченными нами повышенными коэффициентами олиготрофности сообществ в пещерах с высоким уровнем антропогенного загрязнения (0,07.. 2,86 против 0,24.. 0,76 в малопосещаемых пещерах). Относительно низкая численность олигонитрофилов, очевидно, связана с низким отношением C_орг:N (2,1ч11,3) в пещерных местообитаниях.

Глава 8. Разнообразие и экологические особенности бактерий в карстовых пещерах Средней Сибири

Биологическое разнообразие культивируемых бактерий в изучаемых пещерах относительно невелико и уступает таковому в наземных экосистемах. Методами культивирования в пробах воды и грунта удаётся обнаружить от 5 до 20 изолятов, различающихся по культурально-морфологическим признакам, однако доминирующими обычно является 1-5 изолятов, среди которых идентифицированы представители р.р. Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Actinomyces. Применение стёкол обрастания даёт более высокое морфологическое разнообразие бактерий, что говорит о присутствии в подземных местообитаниях некультивируемых форм. Для индивидуальных пещер обнаружена статистически значимая положительная связь между морфологическим разнообразием и численностью бактерий на стёклах обрастания и численностью культивируемых бактерий (рис. 14).

Рисунок 14. Разнообразие бактерий, учитываемых на стёклах обрастания (1) и связь между морфологическим разнообразием и численностью бактерий на стёклах обрастания и численностью культивируемых бактерий на примере пещеры Женевская (1) и в целом по пещерам (2)

Однако при сравнении всего массива проб по разным пещерам существенной связи между числом бактерий на стёклах обрастания и их морфологическим разнообразием не выявляется (r = +0,411) (см. рис. 14).

Как и микромицеты, пещерные бактерии представлены мезофилами, способными к росту при +4°С (32% проанализированных изолятов), а также психротолерантными (51%) и психрофильными (17%) изолятами. Соотношение мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в различных пещерах статистически достоверно (р<0,01) различается (рис. 15). Наблюдаемые различия, как и для микромицетов, не связаны с принадлежностью пещеры к конкретному карстовому участку.

Рисунок 15. Типичная температурная кривая роста психрофильных бактерий на примере изолята р. Bacillus, выделенного в пещере Караульная-2 (слева) и примеры соотношения мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в разных пещерах

Среди изолятов, способных к образованию внеклеточных амилаз и протеаз, статистически достоверно (p<0,01) преобладают протеолитические штаммы (рис. 16). Преобладание протеолитических изолятов над амилолитическими, как и отмеченная в главе 6 высокая встречаемость аммонификаторов, свидетельствует о том, что основным субстратом для бактерий в пещерах Сибири служат субстраты животного происхождения.

Рисунок 16. Относительная встречаемость изолятов, способных и не способных к образованию внеклеточных амилаз и протеаз, среди пещерных бактерий

Глава 9. Пути формирования и классификация пещерных микробных сообществ Средней Сибири

Как было показано выше, микробные сообщества пещер Сибири представлены бактериями и грибами, находящимися на разных стадиях адаптации к низким температурам - от психрофилов до мезофилов. При этом психрофильные формы (за исключением неспорообразующих бактерий и одноклеточных грибов в холодных водотоках) в наземных экосистемах региона не обнаружены (Березикова и др. 2005; Воробьёва, Хижняк, 2008). Для объяснения данного феномена нами предложена две альтернативные модели - "эволюционная" и "экосистемная". Согласно "эволюционной" модели, подземные сообщества формируются за счёт способных к росту при +4єС мезофильных микроорганизмов, поступающих из наземных экосистем. В процессе формирования сообщества происходит размножение и эволюционная адаптация микроорганизмов к низкотемпературным условиям (рис. 17).

Рисунок 17. Схема формирования микробного сообщества по эволюционной модели (слева) и поведение модели при разных скоростях притока аллохтонной микробиоты (справа): 1 - низкая скорость притока, 2 - высокая скорость притока

Адаптация к низким температурам заключается в повышении удельной скорости роста при низкой температуре в ряду "мезофилы > психротолеранты > психрофилы" (соответственно µM, µPf и µ Pt на рис. 17); скорости адаптации к низкой температуре (коэффициенты k1 и k2 на рис. 17) малы по сравнению со скоростями притока и размножения. Компьютерный анализ модели показал, что в ходе формирования сообщества в условиях субстратного лимитирования будет наблюдаться всплеск относительной встречаемости "промежуточных (психротолерантных) форм с последующим их вытеснением. В эволюционно зрелом сообществе микроорганизмы будут представлены только автохтонными психрофильными и аллохтонными мезофильными формами. При этом, варьируя скорость притока аллохтонной микробиоты и время формирования сообщества, можно получить все наблюдаемые на практике соотношения численности мезофильных, психротолерантных и психрофильных форм в пещерном сообществе.

В качестве альтернативной модели нами рассмотрена "экосистемная". В данной модели психрофильные и психротолерантные формы рассматриваются в качестве реликтовых со времён оледенений, а их одновременное присутствие в пещерах объясняется разделением ресурсов согласно оптимизационной модели (Суховольский, 2004). Однако против данной модели свидетельствует тот факт, что распределение психрофильных, психротолерантных и мезофильных грибов в индивидуальных пещерах и в целом по пещерам региона отличается от распределения Парето (рис. 18). Аналогичное распределение бактерий по отдельным пещерам и в целом по массиву пещер соответствует Парето. Однако среди бактерий, как и среди грибов, преобладающими формами являются психротолерантные, которые показали пониженную конкурентоспособность +4єС по сравнению с психрофилами в модельных экспериментах.



Рисунок 18. Распределение психрофильных (Пф), психротолерантных (Пт) и мезофильных форм в пещерах региона в логарифмических координатах

На основе полученных данных и "эволюционной" модели нами предложена классификация микробных сообществ сухогалерейных карбонатных пещер умеренной климатической зоны. В основу классификации положены факторы, определяющие состав сообщества (табл. 4).

Таблица 4. Классификация микробных сообществ холодных карбонатных пещер сухогалерейной стадии развития

Преобладающий источник органического вещества	Стадия формирования сообщества
	Начальная	Промежуточная	Финальная
Прилегающие почвы	1A	1B	1C
Троглоксены	2A	2B	2C
Колонии летучих мышей	3A	3B	3C
Антропогенный	4A	4B	4C
Автохтонный	5A	5B	5C

Сообщества 1A-1C присутствуют в привходовых частях пещер, куда осуществляется занос почвы, растительных остатков и микробного пула из прилегающей наземной экосистемы. Представлены комплексом мезофильных почвенных микроорганизмов, способных к росту при низких температурах. Численность и качественный состав микроорганизмов близки к аналогичным показателям для прилегающих почв. В сообществах 1B и 1C присутствуют психрофильные формы, однако их относительная численность мала. Сообщества 2А-2C и 3А-3С присутствуют в основной части пещеры. Представлены гетеротрофными бактериями с преобладанием аммонификаторов. Численность культивируемых бактерий в сообществах 2A-2C составляет 10⁵..10⁶ КОЕ/г, в сообществах 3A-3C - 10⁶ КОЕ/г. В сообществах 2B и 3B преобладают психротолерантные, а в сообществах 2C и 3C - психрофильные формы. Сообщества 4A-4C отличаются максимальной численностью и разнообразием входящих в них микроорганизмов. Представлены аллохтонными и автохтонными бактериями и грибами. Численность грибов достигает 10⁶, численность культивируемых бактерий - 10⁷ КОЕ/г. Соотношение представителей различных эколого-трофических групп определяется характером антропогенного загрязнения. В сообществах 4B преобладают психротолерантные, а в сообществах 4C - психрофильные бактерии и грибы. При наличии в пещере сообществ 1B-1C, 2B-2C, 3A-3C психротолерантные и психрофильные формы могут преобладать и в сообществах 4A. Сообщества 5A-5C по составу близки к сообществам 2А-2C и 3А-3С, но отличаются меньшими численностями (10³..10⁴ КОЕ/г) и меньшим разнообразием бактерий. В пещерах Средней Сибири нами обнаружены сообщества всех перечисленных типов, с преобладанием 1B-5B.

Глава 10. Перспективы практического использования пещерных микроорганизмов

В последнее десятилетие в мире наблюдается растущий интерес к использованию психрофильных микроорганизмов в биотехнологии (Russell, 1998; Lettinga et al., 2001; Margesin et al., 2008). Наши исследования показали, что карстовые пещеры Средней Сибири являются уникальным природным источником психрофильных и психротолерантных микроорганизмов, в том числе - перспективных для использования в сельскохозяйственной биотехнологии в качестве безопасных для теплокровных и способных к функционированию в низкотемпературных условиях начала вегетационного периода биофунгицидов.

Так, среди выделенных в пещерах психрофильных бактерий и грибов обнаружена высокая встречаемость изолятов, подавляющие развитие фитопатогенных грибов р. Bipolaris, являющихся одними из наиболее распространённых и вредоносных возбудителей заболеваний зерновых, а также фитопатогенных грибов р. Alternaria. По частоте встречаемости антагонистов пещерные сообщества статистически достоверно (p<0,01) превосходят сообщества почв региона, и даже превосходят по этому показателю к микробным сообществам почвоподобных субстратов, получаемых в результате биоконверсии соломы и характеризующихся высокой антифунгальной активностью (Хижняк и др., 2008; Nesterenko et al., 2009).