Экологический полиморфизм и территориальная значимость различных вирусных патогенов

Размещено на http://allbest.ru

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Экологический полиморфизм и территориальная значимость различных вирусных патогенов

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Шестопалов Александр михайлович

Новосибирск - 2010

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАСХН Донченко Александр Семенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич, доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Ирза Виктор Николаевич, доктор биологических наук, профессор Глотова Татьяна Ивановна

Ведущая организация: ФГУН Омский научно-исследовательский институт природноочаговых инфекций Роспотребнадзора

Защита состоится « 16 » ноября 2010 г. в «________» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск-1, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» _______________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Стеблева Г.М.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Изучение инфекционной патологии животных и человека на популяционном уровне неизбежно связано с эпизоотическим и/или эпидемическим процессами. Оно сводится к изучению процесса взаимодействия популяций паразита и хозяина, механизмов функционирования систем паразит-хозяин или паразитарных систем.

Устойчивость паразитарных систем очень велика. Их полная ликвидация весьма проблематична и сомнительна (В.Ю. Литвин, 1986; С.И. Джупина, 1991; Г.П. Сомов, 1994; О.В. Бухарин, 1997; А.С. Донченко, 1998; В.В. Макаров, 1998 и др.).

Основными факторами, обеспечивающими высокую устойчивость паразитарных систем (О.В. Бухарин с соавт., 1997), являются их иерархическая организация, гибкость, гетерогенность популяций паразита и хозяина, резервация паразита, многочисленность хозяев и полигостальность паразита, неоднозначная зависимость паразита от хозяев.

В.Д. Беляковым с соавт. (1964-1994 гг.) разработана теория саморегуляции паразитарных систем и сформулировано одно из понятий эпизоотического процесса - процесс взаимодействия популяции возбудителя-паразита и популяции животных, проявляющийся при определенных социальных и (или) природных условиях единичными и (или) множественными заболеваниями животных, а также бессимптомными формами инфекций.

Многим инфекционным болезням свойственна природная очаговость (Е.Н. Павловский, 1960; Э.И. Коренберг, 1979; В.Ю. Литвин, 2003; Э.И. Коренберг, 2010). Поэтому в практической противоэпизоотической и противоэпидемической работе применительно к природно-очаговым инфекциям важно знать:

- механизмы формирования и функционирования эпизоотических очагов, возможность расширения границ, взаимосвязь с другими территориями, популяциями животных и людей;

- способность конкретных природно-очаговых патогенов вызывать болезнь у животных и людей, механизмы формирования такой способности.

В.В. Макаров с соавт. (2005), анализируя эпизоотический процесс, вызываемый природно-очаговыми патогенами, важную роль отводят их экологическому полиморфизму, который, как известно, проявляется как генотипическая и фенотипическая неоднородность конкретного вида в той или иной экосистеме и имеет важное эволюционное значение для выживаемости и распространения живых организмов, включая вирусные и бактериальные патогены, в новых экологических условиях.

В этой связи важное значение имеет изучение экологического полиморфизма и потенциала территориального распространения актуальных в эпизоотологическом, эпидемиологическом и экономическом отношении вирусных патогенов способных формировать природные очаги на той или иной территории.

Цель: обосновать и изучить эволюционные принципы экологического полиморфизма и территориального распространения некоторых актуальных в эпизоотологическом, эпидемиологическом и экономическом отношении вирусных патогенов.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Теоретически обосновать эволюционные принципы экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов.

2. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса бешенства с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.

3. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса Западного Нила с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.

4. Изучить эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики вируса гриппа птиц с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости в условиях юга Западной Сибири.

Научная новизна. Теоретически и практически обосновано, что основой критериев, определяющих степень эпизоотологической, эпидемиологической и экономической значимости тех или иных патогенов для конкретного региона, является их способность в резервационном и/или эпизоотическом вариантах циркулировать в природных экосистемах у максимума хозяев, распространяться на другие территории с реальными возможностями заболеваемости и гибели диких животных и птиц, «выхода» на сельскохозяйственных, домашних животных (птиц) и человека c их заболеваемостью и гибелью.

На территории юга Западной Сибири подтверждена ведущая роль диких плотоядных, прежде всего лисиц, в качестве основного резервуара вируса бешенства, обеспечивающих периодичность эпизоотий и служащих основным источником распространения возбудителя болезни за пределы природных эпизоотических очагов.

Молекулярно-генетическими методами показана возможность циркуляции вируса бешенства внутри конкретной популяции одного вида животных, «взаимопроникновения» из популяции одного вида животных в популяцию другого вида как внутри природного очага, так и за его пределами, в том числе без манифестации болезни.

Установлена различная эпизоотическая и/или эпидемическая значимость основных резервуаров бешенства в зависимости от принимаемых на конкретных территориях антирабических мер (в частности, иммунизации).

Показано наличие в лесостепной и степной зонах юга Западной Сибири природных очагов вируса Западного Нила (ВЗН) с различной степенью активности, во многом зависящей от численности комаров-переносчиков.

Молекулярно-генетическими методами доказана, наряду с оригинальностью сибирских вариантов ВЗН в результате адаптации к местной экосистеме, их высокая гомологичность (более 97-99% гомологии нуклеотидной последовательности) с высокопатогенными для человека штаммами этого вируса, выделенного ранее в Волгоградской области.

Показана важная роль территории юга Западной Сибири в распространении вируса гриппа типа А в популяциях диких птиц, в возникновении и развитии эпизоотий среди домашних птиц на различных территориях РФ.

У диких птиц, гнездующихся летом на юге Западной Сибири, установлено наличие различных субтипов вируса гриппа типа А, имеющих филогенетическое родство с вирусами гриппа, выделенными у диких птиц в Европе и Южной Азии.

В период эпизоотии вируса гриппа H5N1 в 2005 году среди диких и домашних птиц на территории юга Западной Сибири, а также в постэпизоотический период (2006-2007 гг.) отмечена циркуляция вирулентных вариантов вируса гриппа субтипа H5N1 c филогенетическим родством с вирусами, выделенными в Северном Китае в мае 2005 года (озеро Цинхай). Выделенные в этот период вирусы гриппа H5N1 обладали различной степенью патогенности для мышей.

Получены 2 патента РФ «Набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса бешенства в образцах» (№ 2340673) и «Штамм вируса гриппа птиц А/ Goose / Krasnozerskoye/ 627/ 05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов» (№ 2366709).

Теоретическая и практическая значимость. Использование доказанных в настоящей работе эволюционных принципов экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов в процессе разработки оптимальных систем противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий позволит, при их практической реализации, эффективно купировать развитие инфекций в природных очагах и обеспечить защиту от них сельскохозяйственных, домашних животных и людей.

Внедрение полученных результатов. Созданная коллекция из 37 штаммов вируса гриппа типа А, в том числе из 16 высокопатогенного H5N1-субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг., принята на патентное депонирование в Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

По результатам работы 386 нуклеотидных последовательностей полных генов вируса бешенства, вируса Западного Нила и вируса гриппа типа А зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить основой для конструирования праймеров и филогенетических исследований этих вирусов.

Кроме того, результаты, полученные при выполнении настоящей работы, были использованы для подготовки методических указаний «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей», утвержденных Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 09.11.2006 г; методических рекомендаций «Организация мониторинга заносов и распространения гриппа птиц в природных условиях на территории Российской Федерации», утвержденных Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 26.12.2008; «Эпизоотологический мониторинг гриппа типа А среди диких птиц в местах их обитания на территории полуострова Таймыр» (прот. № 5 от 28.05.2008 г.), «Система противоэпизоотических и профилактических мероприятий при бешенстве в Новосибирской области» (прот. №4 от 14.10.2008 г.) и «Профилактика заражения представителей семейства кошачьих вирусом А/H5N1 в период эпизоотии гриппа птиц» (прот. № 5 от 30.12.2009 г.), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на 68 Российских и международных конференциях, в том числе на: Международной научно-производственной конференции «Современные проблемы охотничьего собаководства» (Киров, 2004); III Российской конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, 2008); Бангкокской международной конференции по птичьему гриппу «Интеграция от знаний к управлению» (Бангкок, Таиланд, 2008); Третьей европейской конференции по гриппу (Виламора, Португалия, 2008); X международном симпозиуме по респираторным инфекциям (Сингапур, 2008); 3-ем Международном Симпозиуме по вопросам Интегративной Зоологии (Пекин, Китай, 2009); Первом всемирном конгрессе по вакцине WCV-2008 (Гуанджоу, Китай, 2008); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); 7-ом Международном Симпозиуме по птичьему гриппу: Птичий грипп у домашних и диких птиц (Афины, Джорджия, США, 2009); 8-ом Азиатско-Тихоокеанском конгрессе медицинской вирусологии (САР Гонконг, Китай, 2009); Международной конференции «Зоонозные инфекции и туризм» (Улан-Батор, Монголия, 2009).

Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы была опубликована 61 научная статья, 35 из которых опубликованы в изданиях, рекомендованных ВАК для соискания степени доктора наук, получено 2 патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 306 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы, содержащий 475 работ отечественных и зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и 32 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое обоснование эволюционных принципов экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов.

2. Результаты изучения эколого-эпизоотологических и молекулярно-биологических свойств некоторых актуальных вирусных патогенов с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости (в условиях юга Западной Сибири).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в 1998-2010 годах в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Для лабораторной диагностики и выделения вируса бешенства использовали образцы головного мозга диких, домашних и сельскохозяйственных животных. Для диагностики и выделения вируса Западного Нила использовали комаров, клещей, органы птиц и млекопитающих, а также сыворотку крови и кровь от больных людей. Вирус гриппа диагностировали и выделяли из органов и клоакальных смывов диких и домашних птиц.

Для сбора материала было организованно и проведено более 120 экспедиционных выездов в различные регионы юга Западной Сибири.

Исследования на наличие вируса бешенства проводили согласно ГОСТу 26075-84. Выборочные пробы материала тестировали в ОТ-ПЦР с использованием праймеров на районы генов нуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства.

Все пробы, исследуемые на вирус Западного Нила, тестировали методом иммуноферментного анализа и ОТ-ПЦР. Для 8 образцов у полученных ПЦР-продуктов были определены нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности фрагмента гена белка Е.

Все работы по выделению и идентификации вируса гриппа проводились в соответствии с рекомендациями ВОЗ и Международных Центров, сотрудничающих с ВОЗ по гриппу: (The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. - Harbin, China (May 20 - 26, 2001). - Harbin, 2001 - 79 p.; WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance World Health Organization WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1.)

Определение нуклеотидной последовательности выделенных ПЦР фрагментов вирусов проводили на «Beckman CEQ2000XL DNA Analysis System» («Beckman Coulter, Inc.»). Нуклеотидные и выведенные аминокислотные последовательности были анализированы с использованием программы MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США).

Для статистической обработки данных были использованы общепринятые методы описательной статистики с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel (Microsoft Office Professional Edition, 2007) и STATISTICA 6,0.

Личный вклад автора в исследования, вошедшие в диссертацию, был определяющим. Он состоял в постановке задач, участии в полевых работах и планировании экспериментов. Автор принимал участие в экспериментах, обработке и обсуждении экспериментальных данных, написании статей. Часть исследований была выполнена совместно с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» А.В. Зайковской, Ю.В. Кононовой, Ю.В. Разумовой и К.А. Шаршовым, и сотрудником ГНУ ИЭВСиДВ Ю.Г.Юшковым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Теоретическое обоснование эволюционных принципов экологического полиморфизма и территориального распространения вирусных патогенов

Сущность эпизоотического и эпидемического процессов, как известно, заключается в механизмах функционирования систем паразит - хозяин или паразитарных систем (И.А. Бакулов, 1986, 1991, 1998; В.Д. Беляков с соавт., 1987; С.И. Джупина, 1994, 2004; В.А. Бриттов, 1998; С.К. Димов, 1998; В.В. Макаров, 1998; Д.Д. Новак, 1998; В.П. Урбан, 1998; Б.Л. Черкасский, 2003 и др.). бактериальный вирусный паразитарный патоген

Структурно паразитарные системы могут быть двучленными (возбудитель - носитель) и трехчленными (возбудитель - переносчик - носитель), простыми и сложными в зависимости от количества носителей и переносчиков (по одному и более).

Предложено различать три типа паразитарных систем, каждый из которых отражает определенную категорию паразитизма микроорганизмов у наземных животных.

1 - замкнутая паразитарная система, характерная для облигатных паразитов, общее свойство которых - обязательная связь с организмом хозяина (хозяев) и принципиальная невозможность существования вне наземной паразитарной системы (во «внешней среде»);

2 - полузамкнутая паразитарная система связана со спецификой, заключающейся в сочетании «замкнутой» схемы циркуляции возбудителя внутри паразитарной системы с «открытой» схемой циркуляции, предполагающей выход из паразитического цикла, и передачу паразита новому хозяину нетрансмиссивными путями;

3 - открытая паразитарная система, свойственная только случайным паразитам теплокровных, поскольку они являются нормальными обитателями почв и водоемов, причем объекты внешней среды служат для них основной средой обитания.

Основными факторами, обеспечивающими высокую устойчивость паразитарных систем (О.В. Бухарин с соавт., 1997) являются:

1. Иерархическая организация паразитарных систем. Различают три уровня организации паразитарных систем:

а) организменный - элементарная паразитарная система, состоящая из организмов паразита (паразитов) и хозяина (инфекционный процесс);

б) биоценотический - паразитарная система надорганизменного уровня, в которой межпопуляционные взаимодействия паразита и хозяина представлены эпидемическим, эпизоотическим или эпифитотическим процессами;

в) биостроматический - паразитарная система надорганизменного уровня, в которой связи предыдущего (биоценотичекого) уровня интегрируются на уровне биосферы, образуя пандемический, панзоотический или панфитотический процессы.

2. Гибкость паразитарных систем в структурном отношении обеспечивается экологической пластичностью паразита, его способностью к использованию разных хозяев и замещению одного хозяина другим при изменении по каким-то причинам их видового состава.

3. Гетерогенность популяций паразита и хозяина - важнейшая движущая сила эпизоотического и эпидемического процессов.

Гетерогенность популяции паразита, в частности, по признакам вирулентности и антигенной структуры, обеспечивает наиболее полную его адаптацию к различным условиям в организме хозяев, а по температурной устойчивости, питательным потребностям и пр. - к резко отличным от организма абиотическим условиям внешней среды.

Не менее важна и гетерогенность популяции хозяина, в частности, по его чувствительности к возбудителю.

Гетерогенность обеих популяций расширяет возможности, как циркуляции возбудителя, так и его сохранения в межэпидемические (межэпизоотические) периоды, что имеет важное значение для устойчивости паразитарных систем.

4. Резервация паразита обеспечивает сохранение паразитарной системы в условиях, когда активная циркуляция возбудителя по каким-то причинам затруднена или временно исключена.

5. Многочисленность хозяев и полигостальность паразита обеспечивает устойчивость паразитарных систем за счет интенсивной циркуляции возбудителя в условиях высокой численности и разнообразия хозяев в различных экосистемах.

6. Неоднозначная зависимость паразита от хозяев, наиболее выраженная в открытых паразитарных системах, ограничивает влияние хозяина на паразита при межпопуляционных взаимодействиях.

В то же время, абиотические и биотические условия среды нередко поддерживают устойчивое существование паразита в почвенных и водных экосистемах.

Поэтому ликвидация возбудителей зоонозных и сапронозных инфекций неизмеримо сложнее, нежели антропонозных, требует искоренения всех возможных резервуаров возбудителя и блокирования разных каналов его циркуляции в очаге.

Очевидно, что такая задача не выполнима. Реально лишь предотвращение заболеваемости животных и людей.

В этой связи весьма актуально знать механизмы регуляции паразитарных систем.

Регуляция паразитарных систем в широком смысле может быть двух типов: внутренняя (саморегуляция) и внешняя (регуляция факторами, внешними по отношению к паразитарной системе), хотя такое разделение носит весьма условный характер.

В.Д. Беляков с соавт. (1964-1994 гг.) в теории саморегуляции паразитарных систем саморегулирующие механизмы обосновали четырьмя положениями:

- генотипическая и фенотипическая гетерогенность популяций паразита и хозяина;

- взаимообусловленная изменчивость биологических свойств взаимодействующих популяций;

- фазовая самоперестройка популяций паразита, определяющая неравномерность развития эпидемического и/или эпизоотического процессов;

- регулирующая роль социальных и природных условий в фазовых преобразованиях эпидемического и/или эпизоотического процессов.

Согласно этой теории, искусственно вмешиваясь в механизмы внутренней регуляции эпидемического и/или эпизоотического процессов, можно добиться эффективного управления ими. При этом важно, чтобы такие вмешательства носили оптимальный характер.

Общеизвестным является экологический феномен природной очаговости, заключающийся в приуроченности различных заразных болезней к определенным биогеоценотическим условиям (природные очаги), где возбудители циркулируют в природных резервуарах без участия сельскохозяйственных и домашних животных, и людей, но могут передаваться им разными путями (Е.Н. Павловский, 1960; Э.И. Коренберг, 1979; В.Ю. Литвин, 2003; Э.И. Коренберг, 2010).

С позиций природной очаговости весьма актуальны предложенные В.В. Макаровым (1998, 2005) 9 эволюционно-экологических аксиом эпизоотологии:

1. Эпизоотический процесс непрерывен; неизбежны встречи паразита с хозяином для поддержания его биологического вида и жизненного цикла.

2. Возбудители и хозяева существуют в виде популяций с подчинением их взаимодействий биоценотическим закономерностям; их микроэволюция как динамика живых систем происходит под влиянием общих для всего живого движущих сил.

3. Популяция восприимчивого хозяина служит средой обитания возбудителя-паразита, а восприимчивость организма определяется как его способность функционировать на популяционном (видовом) уровне в качестве биологически узнаваемого соактанта соответствующей паразитарной системы.

4. Популяции возбудителей генетически гетерогенны за счет случайного и ненаправленного процесса возникновения мутации и рекомбинаций; новые генотипы, случайно оказавшиеся приспособительными и имеющими селективные преимущества, могут подвергаться отбору.

5. В процессе эволюции возбудителей выработано большое число адаптаций.

К ним относятся: приспособления к образу жизни хозяина, механизмы накопления и рассеивания во внешней среде, переход на новых хозяев по путям экологических, естественных связей последних с внешним миром в процессе реализации физиологических функций (дыхание, пищеварение, размножение), способность к избыточной репродукции.

6. В обеспечении жизнестойкости биосистемы возбудитель-хозяин на популяционном уровне участвуют общие для всего живого механизмы приспособительного балансирования; такие системы динамически устойчивы.

7. Явления инфекционной патологии, как частный случай паразитизма, имеют биологическую природу и ни в коем случае не могут быть рассмотрены как антагонистические, как межвидовая борьба за существование.

Это чрезвычайно развитое естественное явление, сохраняющееся в результате отбора симбиотическое взаимодействие эволюционно приспособленных популяций возбудителей и восприимчивых организмов с вовлечением дополнительных компонентов системы, совместно регулирующих свои отношения с изменяющейся окружающей средой.

8. Эпизоотический процесс - это реальное экологическое явление с материальной основой в виде взаимодействующих популяций микро- и макроорганизмов.

Сущность эпизоотического процесса заключается в экологии возбудителя в популяции восприимчивых организмов в пределах соответствующей паразитарной системы.

9. Понятие «окружающая среда» в ее экологической сущности предусматривает размерную и временную детерминированность инфекционных паразитарных систем как важнейшее условие их саморегуляции.

Нами предлагаются критерии, определяющие степень эпизоотологической, эпидемиологической и экономической значимости тех или иных вирусных патогенов для конкретного региона (природно-географической зоны).

Вариант 1. При циркуляции в природных экосистемах изучаемого региона резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов:

- способность циркулировать в резервационном и/или эпизоотическом вариантах у максимума хозяев в природных экосистемах;

- способность распространяться в резервационном и/или эпизоотическом вариантах на другие территории у максимума хозяев;

- возможность вызывать заболеваемость и гибель хозяина в природных экосистемах;

- возможность «выхода» на сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а также человека;

- возможность циркуляции у сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а также человека;

- возможность вызывать заболеваемость и гибель домашних животных (птиц) в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами;

- возможность вызывать заболеваемость и гибель людей в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами.

Вариант 2. При отсутствии циркуляции на изучаемой территории в природных экосистемах резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов:

- возможность заноса резервационных и/или эпизоотических вариантов вирусов извне в природные экосистемы изучаемого региона;

- способность распространиться в резервационном и/или эпизоотическом вариантах на другие территории у максимума хозяев в природных экосистемах;

- реальная возможность вызывать заболеваемость и гибель животных (птиц) в природных экосистемах;

- возможность «выхода» на сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а также человека;

- возможность циркуляции у сельскохозяйственных и домашних животных (птиц), а также человека;

- возможность вызывать заболеваемость и гибель домашних животных (птиц) в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами;

- возможность вызывать заболеваемость и гибель людей в результате их прямого или опосредованного контакта с эпизоотическими очагами.

По этим критериям для юга Западной Сибири актуальными можно признать вирусы бешенства, Западного Нила и гриппа птиц.

2. Эколого-эпизоотологические и молекулярно-биологические характеристики актуальных вирусных патогенов с эволюционных позиций их экологического полиморфизма и территориальной значимости (в условиях юга Западной Сибири)

2.1 Вирус бешенства

2.1.1 Эколого-эпизоотологические характеристики

Согласно официальной статистике, бешенство среди животных разных видов в период с 1997 по 2009 год было зарегистрировано более чем в 2/3 субъектов РФ.

Эпизоотическая ситуация бешенства на юге Западной Сибири всегда определялась функционированием Западно-Сибирско-Казахстанского природного очага с циркуляцией в нем возбудителя среди диких животных и активным вовлечением в эпизоотический процесс домашних и сельскохозяйственных животных.

В Западной Сибири в восьмидесятые годы в динамике проявления эпизоотического процесса бешенства отмечали достаточно резкие колебания. Наивысший подъем эпизоотии наблюдали в 1987-1988 годах. Период до 1997 года характеризовался депрессией очага.

Эпизоотическая ситуация бешенства резко осложнилась в конце 1997 года. В течение 1998 года в Новосибирской области бешенство среди диких плотоядных было зарегистрировано в 90 населенных пунктах. В 1999 году - среди диких плотоядных было зарегистрировано в 22 пунктах, среди сельскохозяйственных животных - в 12 и среди домашних животных - в 8 пунктах.

В 1999 году, по сравнению с 1998 годом, произошло снижение числа неблагополучных пунктов по бешенству животных, в том числе и среди диких плотоядных.

Если в 1998 году в целом по области было зарегистрировано 162 неблагополучных пункта по бешенству, то в 1999 году - только 45 пунктов. Следует отметить, что в Новосибирской области в 1998-99 годах практически во всех неблагополучных районах была проведена пероральная иммунизация против бешенства диких плотоядных (вакцины "Лисвульпен" и "Синраб").

По итогам 2000 года эпизоотическая ситуация по бешенству в Новосибирской области продолжала улучшаться: было зарегистрировано всего 10 неблагополучных пунктов в 4 районах.

Однако с 2001 года эпизоотическая ситуация обострилась. В 2001 году было зарегистрировано уже 34 неблагополучных пункта в 7 районах, в 2002 году - 163 неблагополучных пункта в 25 районах. В 2003 году в области было зарегистрировано 87 неблагополучных по бешенству пунктов (в 23 районах), в 2004 - 130 (в 27 районах), в 2005 - 49 (в 15 районах), в 2006 - 70 (в 17 районах) и в 2007 - 119 (в 20 районах). В 2008 и 2009 годах эпизоотическая ситуация бешенства оставалась напряженной. Было зарегистрировано 48 неблагополучных по бешенству пунктов.

Таким образом, в период 1997-2009 гг. в Новосибирской области наблюдалось волнообразное изменение уровня заболеваемости с преобладанием бешенства диких животных, но, в целом, сложившуюся ситуацию можно оценить как закономерное проявление эпизоотии, характеризующееся 3-5 летней цикличностью.

Периодичность проявления бешенства, в первую очередь, связана с экологией животных - носителей вируса. Биологический цикл их активности и особенности мест обитания обусловливают сезонные колебания заболеваемости бешенством среди животных.

Контакт с больными дикими животными является причиной заражения домашних и сельскохозяйственных животных. Вспышкам бешенства в животноводческих хозяйствах часто предшествовали случаи появления в этих пунктах диких лисиц.

В Новосибирской области в период 1997 - 2009 годов в эпизоотический процесс, наряду с дикими, были вовлечены домашние и сельскохозяйственных животные (рис. 1).

Рисунок 1 - Распределение заболевших бешенством сельскохозяйственных и диких животных, собак и кошек за 1997-2009 годы по Новосибирской области.

Анализ эпизоотических данных показал, что на долю городского бешенства приходится 18,5% от общего количества случаев болезни, зарегистрированных в Новосибирской области за изучаемый период. В городе бешенство было диагностировано у кошек и собак.

Особо следует отметить значительный удельный вес бешенства кошек в 1998 - 1999 годы. На долю животных этого вида пришлось 11,15% от общего количества случаев бешенства животных за изучаемый период. В настоящее время все домашние животные подлежат обязательной вакцинации против бешенства. Возможно, благодаря таким мероприятиям (увеличение объемов вакцинации в три раза), удалось добиться заметного снижения удельного веса бешенства среди домашних животных.

Спонтанная зараженность вирусом бешенства лисиц без видимых признаков болезни на стационарно неблагополучной территории. Показатель спонтанной зараженности лисиц в Западной Сибири в разные периоды колебался от 0,0 до 5,6%.

В связи с этим особый интерес для нас представляло исследование популяции диких лисиц, которые являются основным резервуаром вируса бешенства в природе, на наличие возбудителя данной болезни. Было проведено исследование 302 образцов головного мозга лисиц, добытых на территории Алтайского края. Спонтанная зараженность диких лисиц, добытых на стационарно неблагополучной по бешенству территории, была подтверждена различными диагностическими методами более чем у 2,3% особей из числа обследованных.

Изучение носительства лиссавирусов у летучих мышей, обитающих на юге Западной Сибири. Исследованию на носительство лиссавирусов были подвергнуты рукокрылые, обитающие как в горной, так и в степной части юго-востока Западной Сибири. Всего было собрано и обследовано 288 проб от летучих мышей 9 видов. При исследовании материала методом ОТ-ПЦР в 34 образцах (18,27%) удалось выявить фрагменты РНК, специфичные для лиссавирусов. У трех полученных ПЦР-продуктов были определены нуклеотидные и выведены аминокислотные последовательности.

Филогенетический анализ показал, что все выделенные фрагменты относятся к генотипу 1 лиссовирусов, что характерно для летучих мышей Американского континента. В Евразии от летучих мышей в основном выделяют European bat lyssavirus 1 (EBLV1) и 2 (EBLV2). Что касается Сибири, ранее здесь регистрировались лишь единичные случаи изоляции лиссавирусов от этих животных без изучения генотипа.

Используя материал, положительный в ПЦР-анализе, было проведено 3 пассажа на беспородных белых мышах. На 5-21 день после заражения у 1-2 мышей из группы развивалось заболевание с паралитическими проявлениями. Однако все эти проявления с каждым пассажем были выражены слабее и исчезали к третьему пассажу. Выделить изоляты вируса бешенства от летучих мышей нам не удалось.

Таким образом, нами было показано наличие РНК лиссавирусов генотипа 1 у летучих мышей, обитающих в Новосибирской области и Алтайском крае.

2.2 Молекулярно-биологические характеристики вируса бешенства

Изучение молекулярно-генетических характеристик лиссавирусов, циркулирующих у различных видов животных на территории юга Западной Сибири, с позиций их эпизоотологической значимости. Для молекулярно-генетических исследований были выбраны образцы материала от различных видов диких и домашних животных, полученные в период 2002-2008 гг., а также от человека, умершего от бешенства. Всего с помощью ПЦР было исследовано 166 проб.

После подтверждения диагноза методом ОТ-ПЦР, для 31 пробы были определены нуклеотидные последовательности гена, кодирующего NP белок, и выведены аминокислотные последовательности. При филогенетическом анализе было выявлено, что все вирусы бешенства, выделенные нами на юге Западной Сибири, группируются в одну филогенетическую группу (рис. 2), но полученные изоляты можно разделить на два основных кластера. Первый из них формируют лиссавирусы от летучих мышей, барсука, лисицы и человека (BAT-YN1, BAT-BN1, BAT-BА, BAT-PА, BADG-4983, MAN-44, FOX-3728) и фиксированные штаммы вирусов бешенства CVS и HEP-Flury. Второй кластер представлен изолятами вирусов бешенства, выделенными в 2004 году от трех собак, лошади и быка (DOG-33650, DOG-35093, DOG-49142, HOR-19549, COW-38442). Эти два кластера имеют достоверный индекс поддержки.



Рисунок 2 - Филогенетическое дерево, построенное на основании фрагмента гена нуклеопротеина (572-776 п.н.) изолятов лиссавирусов, выделенных нами на ЮЗС (выделены жирным шрифтом) со штаммами, представленными в базе данных GenBank

Формально, можно сгруппировать и третий кластер, в который можно отнести вирусы, выделенные от животных, заболевание которых произошло в 2003 и 2008 годах. Но третий кластер не имеет достоверного индекса поддержки. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена нуклеопротеина со штаммами, представленными в базе данных GenBank, показал, что на юге Западной Сибири циркулируют близкородственные генетические варианты вируса бешенства, относящиеся к генотипу 1.

Итогом работы по изучению вируса бешенства явилось подтверждение главной роли диких плотоядных (53,0%) в резервации и распространении рабической инфекции в природных очагах на юге Западной Сибири. Кроме диких плотоядных установлено наличие вируса бешенства у барсуков, косуль, зайцев, сурков, бобров и мышевидных грызунов. Установлено, что периодичность эпизоотий бешенства на юге Западной Сибири в течение 1997-2008 годов составила 3-5 лет. Была установлена зависимость эпизоотологической роли основных резервуаров вируса бешенства от направленности и интенсивности антирабических мероприятий.

Увеличение в 3 раза объемов иммунизации домашних животных обеспечило снижение на 46,0% случаев бешенства у этой категории животных. Ежегодная пероральная иммунизация диких лисиц в природных эпизоотических очагах эффективно снижала проявление эпизоотии бешенства на 36,0%. Выявлены фрагменты гена нуклеопротеина лиссавирусов генотипа 1 у насекомоядных летучих мышей, обитающих на территории юга Западной Сибири. Показано близкое генетическое родство лиссавирусов, циркулирующих на территории юга Западной Сибири в популяциях животных разных видов, которые формируют две основные филогенетические группы в пределах генотипа 1.

2.2 Вирус Западного Нила

2.2.1 Эколого-эпизоотологические характеристики

В настоящей главе диссертационной работы экосистемы юга Западной Сибири были рассмотрены с точки зрения существования в них условий, благоприятных для поддержания циркуляции ВЗН, не связанной с сезонным заносом вируса. При рассмотрении биотических сообществ основное внимание уделялось животным, способным вовлекаться в трансмиссивный цикл ВЗН (птицы, мелкие млекопитающие, кровососущие комары и клещи). Из абиотической компоненты рассматривались физические факторы, влияющие на видовой состав, численность и активность членистоногих переносчиков - температура, влажность и скорость ветра, а также температурный диапазон, определяющий эффективность репликации вируса в их организме. Наличие вирусных маркеров у позвоночных животных и кровососущих членистоногих, участвующих в трансмиссивном цикле ВЗН, а также существование благоприятных условий для репликации вируса свидетельствуют о циркуляции ВЗН в цепочке птица-комар (клещ)>другое позвоночное животное в пределах определенных биотопов.

Вовлечение в трансмиссивный цикл ВЗН случайных хозяев вируса, не являющихся компонентами природных экосистем - сельскохозяйственных животных, людей - приводящее к развитию заболевания и (или) формированию иммунитета, является косвенным доказательством циркуляции вируса в местных популяциях кровососущих членистоногих и формирования сезонных очагов циркуляции. При составлении характеристики биотопов, выбранных для сбора полевого материала, учитывалось наличие перелетных птиц, мелких млекопитающих и членистоногих кровососущих, способных вовлекаться в трансмиссивный цикл ВЗН, а также антропогенная нагрузка, влияющая на численность и видовой состав животных, участвующих в циркуляции ВЗН. Для большинства выбранных биотопов было характерно присутствие диких перелетных птиц и кровососущих членистоногих, способных вовлекаться в циркуляцию ВЗН. В то же время, биотопы различались по экологическим условиям, влияющим на обитание и активность участников трансмиссивного цикла, а это, в свою очередь, может влиять на циркуляцию вируса в конкретном биотопе.

Подавляющее большинство добытых во всех ландшафтных зонах птиц относились к воробьеобразным, т.е. к ВЗН-восприимчивым. Сравнение распределения вирусных маркеров по сезонам и местам сбора материала выявило определенные различия. При сопоставлении сезонов 2003-2004 гг. в Северной Кулунде было отмечено увеличение степени инфицирования птиц в сезоне 2004 г. Степень инфицирования птиц, добытых в южной лесостепи в разные периоды сезона 2004 г. оказалась различной как при сравнении между периодами сборов, так и при сравнении с тем же сезоном в Северной Кулунде. Среди птиц, добытых летом, доля особей, позитивных по наличию одного из главных маркеров ВЗН белка Е, была выше, чем у птиц, добытых весной. В целом, по выявлению гликопротеина и вирусной РНК процент инфицированных птиц в 2004 г. в южной лесостепи был меньше, чем у птиц, добытых в Северной Кулунде. РНК ВЗН не была выявлена ни в одном образце внутренних органов, вирусный белок Е не был обнаружен ни в одном образце головного мозга птиц, добытых в сезоны 2006 и 2007 гг. С большой частотой гликопротеин Е обнаруживался в печени птиц, а в сезоне 2006 г. - в селезенке у одной птицы. Суммарная частота выявления этого маркера составила в сезоне 2006 г. 43,2%, в сезоне 2007 г. - 42,4%.

Отдельно можно отметить особенности распределения гликопротеина Е и РНК ВЗН в разных группах птиц. В группе грачей, добытых в начале мая на юге Барабинской лесостепи, выявление белка Е совпадало с выявлением вирусной РНК, в то время как в головном мозге большей части птиц, добытых там же в летние месяцы, выявлялся гликопротеин Е, а процент птиц с двумя маркерами был в несколько раз меньше. Высокий процент совпадения по обоим маркерам отмечался и у птиц 2004 г. в Северной Кулунде. Большая частота выявления гликопротеина и вирусной РНК у этих птиц свидетельствует о том, что в организме птиц имела место продуктивная ВЗН-инфекция с попаданием вируса в ЦНС и последующей репликацией в головном мозге. В пользу этого говорит тот факт, что часть грачей с положительными находками гликопротеина и РНК ВЗН были найдены мертвыми, хотя нами за время сборов не было отмечено больших эпизоотий среди этих птиц.

Таким образом, по результатам анализа маркеров ВЗН, большинство обследованных птиц как мигрирующих, так и оседлых видов ранее имели контакт с вирусом Западного Нила. Результатом этого у части птиц стало развитие продуктивной ВЗН-инфекции с попаданием вируса в ЦНС, которая могла стать причиной их гибели; у другой части птиц имела место абортивная инфекция, ограниченная внутренними органами. В таком случае, при различном исходе инфекции у птиц, эффективность передачи вируса от них другим участникам трансмиссивного цикла (как позвоночным, так и членистоногим) также должна различаться и коррелировать с распределением в организме этих животных вирусных маркеров. Для проверки этого предположения был проведен анализ внутренних органов млекопитающих на наличие и особенности распределения маркеров ВЗН.

Млекопитающие: Из отловленных мелких млекопитающих в степной зоне большую часть составили мышевидные грызуны. Распределение маркеров ВЗН у зверьков степных и лесостепных биотопов отличалось от такового для подзоны осиново-березовых лесов. Наиболее часто гликопротеин Е и вирусная РНК встречались в головном мозге животных лесостепных биотопов, причем вирусный антиген был обнаружен во всех образцах головного мозга. Почти полное совпадение в выявлении гликопротеина Е и РНК наблюдалось у грызунов, отловленных во влажном колке с действующей колонией грачей, далее по частоте встречаемости маркеров следовали животные, отловленные на остепненном лугу и прибрежной полосе р. Чулым. Этот факт свидетельствует о протекании в организме всех обследованных животных продуктивной ВЗН-инфекции с попаданием вируса в ЦНС.

В Северной Кулунде чаще всего вирусные маркеры встречались у зверьков, отловленных на заросшем поле у оз. Кротово. На втором месте по частоте встречаемости маркеров следовали животные, отловленные на участке полынно-злаковой степи, несмотря на отсутствие в этих биотопах благоприятных условий для активности комаров. Этот факт можно объяснить как перемещением животных в биотопы, где активны комары, так и возможным участием в передаче вируса преимагинальных стадий клещей рода Dermacentor. В целом, частота встречаемости обоих вирусных маркеров (белок Е/РНК) у мелких млекопитающих Северной Кулунды составила 40,0%/12,7%. Таким образом, среди мелких млекопитающих Северной Кулунды доля животных с протеканием продуктивной ВЗН-инфекции заметно меньше по сравнению с животными южной лесостепи.

Кровососущие членистоногие:

Комары. Хотя маркеры ВЗН у комаров нами выявлены не были, в Северной Кулунде и на юге Барабинской лесостепи имеются виды комаров, способные участвовать в трансмиссивном цикле ВЗН и для которых характерна высокая численность в некоторых биотопах. Это создает предпосылки для поддержания циркуляции вируса в период их активности.

Клещи. Результат анализа на распределение маркеров ВЗН у иксодовых клещей из разных биотопов в сезоне 2006 г. показали, что наиболее часто белок Е и РНК ВЗН встречались у имаго Ix. рersulcatus и Ix. pavlovskyi с участием всех возрастных стадий.

2.2.2 Молекулярно-биологические характеристики вариантов ВЗН

Из части образцов, в которых были выявлены вирусные маркеры, с помощью ОТ-ПЦР были получены фрагменты кДНК, соответствующие участку гена белка Е ВЗН, которые были секвенированы. Секвенированные образцы имели следующее происхождение: два образца от серых ворон из Северной Кулунды 2003 г. (ChCorvus10-03, ChCorvus31-03), три образца от грачей из южной лесостепи 2004 г. (ChRook7-04, ChRook14-04, ChRook27-04), образец от красной полёвки из южной лесостепи 2004 г. (ChRodent-04), два образца от заболевших людей (Пациенты №1 и №3, ChiWS-04 и HumWS-04 соответственно) и два пула имаго клещей Ix. persulcatus и Ix. pavlovskiy из подзоны осиново-березовых лесов 2006 г. (Tomsk-1, Tomsk-2).

Генотипирование исследуемых нуклеотидных последовательностей позволило идентифицировать эти последовательности как относящиеся к генотипу Ia вируса Западного Нила. Западносибирские варианты ВЗН 2003-2004 гг. и 2006 г. оказались высоко гомологичными (не более 1-3% расхождения) с волгоградским штаммом VLG-4 ВЗН. При анализе филогенетического дерева (рис.3) можно видеть, что исследованные варианты характеризуются невысоким уровнем генетических отличий. Можно также видеть, что исследованные западносибирские варианты ВЗН не имеют гостальной специфичности.

Филогенетический анализ показал, что выявленные в 2003-2004 гг. и 2006 г. последовательности ВЗН кластеризуются вместе с другими современными российскими изолятами ВЗН. Это говорит о том, что эти варианты вируса генетически связаны со штаммами ВЗН, изолированными на юге Европейской части России. В отношении вариантов, выделенных от птиц, полученные результаты согласуются с орнитологическими данными, и это может служить доказательством заноса ВЗН перелётными птицами на юг Западной Сибири с эндемичных территорий на юге РФ.

Поскольку для клещей Ix. persulcatus и особенно Ix. pavlovskiy, птицы являются прокормителями, выявление вариантов ВЗН в клещах свидетельствует об участии птиц в заносе вируса и передаче членистоногим переносчикам. Генетическая близость исследуемых вариантов с патогенными для людей штаммами ВЗН юга России позволяет предполагать, что западносибирские варианты ВЗН обладают эпидемическим потенциалом и могут быть причиной заболевания ВЗН людей на юге Западной Сибири.

Из филогенетического дерева можно видеть, что варианты ВЗН от серых ворон и грача (ChRook27-04) образуют одну группу. По сравнению с прототипным штаммом VLG-4, они характеризуются общей консервативной заменой Arg₉₄Lys, которая также свойственна вариантам ВЗН, выделенным в различных регионах мира и относящимся к генотипам Ib, II, III и IV, но не выявлена у чирков и грачей юга Западной Сибири в 2002 году (генотип Ia).

Каждый вариант от серых ворон имеет индивидуальные консервативные уникальные замены - у одного обнаружена Ala₇₃Thr, у другого - Pro₈₉Ala, также не встречавшиеся ранее у других вариантов вируса. В целом эта группа характеризуется консервативной уникальной заменой Pro₇₆Ala и значимой заменой Leu₆₉Hys, выявленной у грача и вороны, также являющейся уникальной. Эти замены выявлены в вариантах ВЗН от птиц, принадлежащих к видам с разным миграционным статусом, добытых в разное время и в разных ландшафтных зонах, что может указывать на общий источник инфицирования птиц ВЗН, а также на возможное участие организма хозяина в воздействии на изменчивость вируса.

Таким образом, генотипирование позволило характеризовать западносибирские варианты ВЗН как генетически близкие между собой и патогенным для людей штаммам ВЗН, изолированным на юге России. Сравнительный аминокислотный анализ выявил замены только в вариантах от восприимчивых к ВЗН врановых птиц, несмотря на значительную генетическую близость этих вариантов ВЗН с вариантами от других хозяев. Полученные результаты свидетельствуют о способности вируса адаптироваться к разным хозяевам в различных ландшафтно-экологических условиях, а также об эпидемическом потенциале ВЗН, циркулирующего на юге Западной Сибири.



Рисунок 3 - Филогенетическое дерево полевых изолятов и штаммов ВЗН, построенное на основании сравнения нуклеотидных последовательностей фрагмента гена белка Е (322 нуклеотида) со штаммами, представленными в базе данных GenBank .

Итогом по изучению циркуляции вируса западного Нила на территории юга Западной Сибири явилось выявление циркуляции ВЗН среди воробьеобразных птиц (Passeriformes), мигрирующих и оседлых видов, в степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-березовых лесов юга Западной Сибири. Также было установлено, что в циркуляцию ВЗН в степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири вовлекаются мелкие млекопитающие - грызуны, насекомоядные и мелкие хищники. Среди комаров-эудоминантов выявлены эпидемиологически значимые виды, способные принимать участие в трансмиссивном цикле ВЗН. Показано вовлечение в циркуляцию ВЗН имагинальных и преимагинальных стадий иксодовых клещей Ix. persulcatus и Ix. pavlovskiy в подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири. В степной, лесостепной зонах и подзоне осиново-берёзовых лесов юга Западной Сибири показано формирование природных очагов ВЗН, не связанных с сезонным заносом. Было установлено вовлечение в трансмиссивный цикл ВЗН на юге Западной Сибири случайных участников - сельскохозяйственных животных и людей.