Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Сахаров Андрей Валентинович

Саранск 2009

Введение

Актуальность темы. Осевой скелет позвоночных всех классов закладывается в принципиально одинаковом виде, и принципиальное сходство его строения сохраняется во взрослом состоянии (Smitt H., 2004; Gilberg G. 2005). Однако развитие каждого из структурных элементов осевого скелета на общем фоне тесной структурной взаимосвязи под влиянием формообразующих факторов и генетического контроля происходит относительно самостоятельно (Carrol F., 2000; Серов О.Л., 2006). Морфогенетические закономерности развития осевого скелета у различных видов млекопитающих, включая человека, изучены недостаточно. В первую очередь это касается хрящевой пластинки роста тела позвонка, функциональная активность клеток которой определяет рост позвоночного столба (Glorieux F.H., 2000; Malemud C.J., 2007). Данные о возрастных особенностях формирования пластинки роста человека и животных необходимы для понимания патогенеза аномалий и пороков развития позвоночного столба, как врожденных, так и возникающих, в постнатальном периоде онтогенеза.

Следует отметить, что актуальность исследования морфогенеза структурных компонентов тела позвонка человека и животных во многом продиктована запросами практической медицины. В настоящее время клеточная и тканевая инженерия находят всё более широкое применение при травматических повреждениях хрящевой ткани (Hu J.C., 2005; Cai D.Z., 2007). Дефицит клеток для пересадки делает настоятельной необходимость поиска альтернативных источников донорского материала (Подгорный О.В., 2004, Репин В.С., Сухих Г.Т. 2007; Ярыгин В.Н., 2007). Известная близость многих физиологических показателей человека и свиньи открывает новые перспективы для изучения возможности использования клеток и тканей свиньи в клеточных технологиях (Шумаков В.И., 2007, 2008). Очевидно, что технологии трансплантации фетальных клеток должны основываться на современных представлениях о структурно-функциональной организации хрящевой ткани и закономерностях ее развития в онтогенезе. В этой связи исследование морфофункциональных характеристик клеток хондрогенного дифферона пластинки роста человека и свиньи в динамике возрастных изменений представляется актуальной проблемой.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональных взаимоотношений клеток и матрикса пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в возрастном аспекте, а также разработка научно обоснованных принципов оптимального выбора клеточного материала для тканевой инженерии.

Задачи исследования:

1. Выявить общие закономерности морфогенеза пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза.

2. Изучить особенности структурно-функциональной организации пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза.

3. Оценить роль активированных кислородных метаболитов в морфогенезе пластинки роста тела позвонка.

4. Определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани у человека и свиньи для её использования в качестве источника клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций.

5. Определить морфологические критерии выбора оптимального пассажа первичной культуры клеток, выделенных из фетальной хрящевой ткани зоны роста тела позвонка для создания тканеинженерных конструкций.

6. Изучить возможность ксенотрансплантации клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в условиях хирургического повреждения хрящевой ткани у лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые выявлены общие закономерности развития пластинки роста у человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза. Впервые получены новые сведения о возрастных особенностях развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, связанные с неравномерной пролиферацией и дифференцировкой клеток, а также пространственно-упорядоченной организацией межклеточного вещества в переднем и заднем отделах пластинки роста у человека, а у свиньи - в её вентральном и дорсальном отделах. Впервые установлены периоды неравномерного развития зоны роста тела позвонка, которые морфологически определяются у человека с 12 недель пренатального развития до 12 лет, а у свиньи - в период с 6 до 12 недель гестации. Впервые определены морфологические критерии выбора фетального гиалинового хряща зоны роста тела позвонка человека и свиньи для использования в качестве источника клеточного материала в тканевой инженерии. Впервые исследованы морфофункциональные характеристики фетальных клеток хондрогенного дифферона in vitro, которые могут быть использованы для оценки клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций. Впервые предложена концепция отбора клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций. В эксперименте на лабораторных животных впервые осуществлена ксенотрансплантация фетальных хондробластов человека для замещения дефекта гиалинового хряща.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Выявленные возрастные закономерности структурно-функциональной организации зоны роста тела позвонка человека и свиньи отражают сходство морфогенетических процессов у этих видов млекопитающих и могут быть использованы для уточнения границ критических периодов развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи. Установленная неравномерность пролиферации и дифференцировки клеток хондрогенного дифферона в переднем и заднем отделах пластинки роста тела позвонка человека, а у свиньи - в её дорсальном и вентральном отделах, обусловливает асимметрию роста тела позвонка, что может рассматриваться в качестве одного из патогенетических факторов развития деформаций позвоночника.

Выявленные особенности морфофункциональной организации клеток и матрикса гиалинового хряща зон роста позволяют определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани человека и свиньи в качестве источника клеточного материала для тканеинженерных конструкций. Определены морфологические критерии оценки и выбора клеточного материала для трансплантации в реконструктивной хирургии.

Предложенная экспериментальная модель дифференцировки хондробластов пластинки роста человека in vitro обеспечивает возможность прямого подхода к изучению изменений пластинки роста человека и животных, а также может быть использована для оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств на клетки хондрогенного дифферона in vitro.

Результаты данного исследования используются в учебном процессе при преподавании дисциплины «Гистология и эмбриология» в Новосибирском государственном медицинском университете, при изучении курса дисциплин «Анатомия» в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарёва и «Биология свиньи» в Биолого-технологическом институте Новосибирского государственного аграрного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В развитии позвоночного столба человека и свиньи наблюдаются структурно-временные параллели.

2. Асимметрия роста и развития хрящевых пластинок роста тел позвонков грудного отдела человека и свиньи в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза является возрастной особенностью.

3. Фетальные хондробласты человека и свиньи, выделенные из гиалиновой хрящевой ткани зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации являются оптимальным источником клеточного материала для разработки тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Международном симпозиуме (Чолпон-Ата, 2003), III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), VIII съезде травматологов-ортопедов России (Самара, 2006), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007), Международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК на 2008-2012 гг.»» (Оренбург, 2008), Международной научно-практической конференции «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях» (Волгоград, 2009), IX Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 12 - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.

Работа выполнена в Новосибирском государственном педагогическом университете (НГПУ) в рамках научно-технического сотрудничества и при участии сотрудников ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») - отдел микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов, НИИ инновационных медицинских технологий Новосибирского государственного медицинского университета (НГМУ), Научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (НИИТО), Биолого-технологического института Новосибирского государственного аграрного университета (НГАУ). Автор приносит искреннюю благодарность коллегам из указанных учреждений.

Особую признательность за консультативную помощь автор выражает директору НИИТО д-ру мед. наук, проф. М.А. Садовому и заведующей теоретическим отделом вертебральной патологии НИИТО д-ру мед. наук, проф. А.М. Зайдман, которые привлекли его внимание к проблеме нарушений структурно-функциональной организации пластики роста тела позвонка, а также предоставили возможность проведения исследований структурных компонентов тела позвонка человека в норме и при патологии. Автор признателен директору НИИ инновационных медицинских технологий, канд. мед. наук В.А. Валеевой, директору Биолого-технологического института НГАУ д-ру биол. наук, проф. К.В. Жучаеву, директору Института химии антиоксидантов НГПУ канд. хим. наук, проф. А.Е. Просенко и ректору НГПУ д-ру биол. наук, проф. А.Д. Герасеву за техническую и организационную поддержку на всех этапах выполнения диссертационного исследования. Искренне признателен, за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту - д-ру биол. наук, проф. Е.И. Рябчиковой.

клетка позвонок свинья человек

1. Материал и методы исследования

Объектом исследования служили тела грудных позвонков свиньи и образцы зон роста тел позвонков грудного отдела человека, которые получали из абортивного материала, а также от погибших людей, не имевших признаков патологии опорно-двигательного аппарата. Хондробласты выделяли из абортивного материала, полученного из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан, в соответствии с современными этическими нормами и с подписанием Информированного согласия. Характеристика материала приведена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика исследуемого материала

Фрагменты тел позвонков грудного отдела эмбрионов, а также плодов человека и свиньи породы Сибирская мясная (СМ-1) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и в 4%-ном растворе параформа, приготовленного на растворе Хенкса. Позвонки плодов декальцинировали в забуференном растворе ЭДТА. Материал обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм и монтировали на предметные стекла.

Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Коллаген выявляли по Маллори в модификации Б. Ромейса (1954). Локализацию кальция в клетках выявляли по Коссу (Пирс Э., 1962). Гликоген и гликопротеины определяли в реакции с реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Реакцию на суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) ставили с альциановым синим по С. Стидмену. Локализацию кератансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС), гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе, а также их пространственно-упорядоченную организацию в межклеточном веществе хрящевой ткани пластинки роста (ПР) изучали в реакции с толуидиновым синим при рН 1,5; 2,5 и 5,0. Пространственную организацию коллагена в межклеточном веществе определяли по Эбнеру и в реакции с пикросириусом красным (Дедух Н.В. 1988). Интенсивность рефракции оценивали на срезах в поляризованном свете. Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ, отдела микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ГНЦ ВБ «Вектор», кафедры свиноводства НГАУ.

Экспрессию белков генов р-53 и Bcl-2 определяли методом иммуногистохимического анализа в реакции с вторичными антителами. Индекс апоптоза рассчитывали по отношению числа клеток в состоянии апоптоза к общему количеству клеток в препарате и выражали в процентах (Аrcher C.D., 1998).

Интенсивность реакции на активированные кислородные метаболиты (АКМ) в образцах нативной хрящевой ткани ПР тел позвонков новорожденных поросят, а также поросят в возрасте 7 - 40-а суток оценивали в реакции с нитротеразолиевым синим (Hill K.S., 1978). Дифференциальное определение свободнорадикального оксида азота в хрящевой ткани ПР оценивали по локализации его селективного маркера - фермента NO-синтазы (Mayer B., 1995).

Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ и кафедры свиноводства НГАУ.

Для получения первичной культуры клеток использовали хрящевые тела позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации непосредственно после медицинского аборта от клинически здоровых женщин. Полученную первичную культуру клеток культивировали в концентрации 3х10⁵ кл/мл в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 20% фетальной сыворотки крови плодов коровы при 37⁰С в течение 4 пассажей на протяжении 12 дней. Каждые 3 дня клетки снимали с подложки смесью трипсина с версеном, четыре равные части центрифугата отбирали для проведения исследований, оставшиеся клетки пересевали. Исследования проводили на базе НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ, лаборатории морфологии НГПУ.

Для морфологических и цитохимических исследований клетки в суспензии и монослое на стекле фиксировали в метиловом спирте. Для получения обзорных препаратов и морфометрии клетки окрашивали гематоксилином и эозином. Распределение гликогена и гликопротеидов изучали посредством ШИК-реакции и проведения контроля с амилазой. Суммарные кислые ГАГ выявляли альциановым синим. Для дифференцированного выявления КС, ХС и гиалуроновой кислоты ставили реакцию с толуидиновым синим при значениях рН раствора красителя 1,5; 2,5 и 5,0. Для иммуноцитохимического определения коллагена II типа ставили реакцию с вторичными антителами (Novocastra Laboratories ltd., UK) к коллагену II типа.

Для проведения ультраструктурного анализа клетки снимали с поверхности монослоя смесью трипсина (0,02%) и версена (0,025%) в соотношении 1:1. Взвесь клеток центрифугировали, осадок фиксировали в 4%-м растворе параформа, дофиксировали 1%-м раствором OsO₄, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заливали в смесь эпон - аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Raichert (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе Н-600 (Hitachi, Япония). Ультраструктурные исследования проводили на базе отдела микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Все манипуляции в ходе ксенотрансплантации фетальных хондробластов человека в суставной дефект крыс проводили в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. У всех крыс - самцов линии Вистар массой 250 граммов в области межмыщелковой ямки дистального эпифиза бедренной кости стоматологическим бором диаметром 2,5 мм производили дефект суставного хряща на глубину до субхондральной кости.

У крыс группы I (15 особей) дефект оставляли свободным; у животных группы II (15 особей) - заполняли хитозановым гелем; у крыс группы III (15 особей) - тканеинженерной конструкцией на основе хитозанового геля и первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа в количестве 3х10⁵ клеток. Рану послойно ушивали шелком. В течение двух недель послеоперационного периода один раз в сутки внутримышечно вводили антибиотик линкомицин в дозе 5 мг. На 60-е сутки животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента и выделяли фрагменты дистального эпифиза бедренной кости для проведения морфогистохимического анализа. Данный фрагмент исследований проводили на базе лаборатории морфологии НГПУ и НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ.

Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ AxioVision. Статистическую обработку данных осуществляли по общепринятым методикам с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при р ? 0,05.

2. Результаты исследования и их обсуждение

1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе

Позвоночный столб человека на сроке 8 недель, а свиньи на сроке 4 недели гестации представлен мезенхимными телами позвонков, разделенными клетками формирующихся межпозвонковых дисков. Мезенхимные клетки имеют уплощенную или полигональную форму. Ядро округлое с большим количеством гетерохроматина. Цитоплазма обильная, умеренно базофильная, содержит пылевидный ШИК-позитивный материал, исчезающий после предварительной обработки срезов амилазой, а также следовые количества суммарных ГАГ. Межклеточное вещество выражено слабо и бледно окрашивается на коллаген по Маллори. Окрашивание толуидиновым синим при значении рН раствора красителя 5,0 позволяет наблюдать слабо выраженную реакцию в цитоплазме и межклеточном веществе на гиалуроновую кислоту. Реакция с толуидиновым синим при рН 1,5 и 2,5 на ХС и КС отрицательна. Рефракция макромолекул несульфатированных ГАГ в поляризованном свете в препаратах позвоночника человека и свиньи в этот период не выявляется.

Хрящевая модель тела позвонка человека на 12-й неделе и свиньи на 6-й неделе гестации представлена мелкими клетками округлой формы, располагающимися в одиночных округлых или овальных лакунах. Слаборазвитый матрикс бледно окашивается на коллаген по Маллори и характеризуется невысоким содержанием кислых ГАГ, которые по данным поляризационно-оптического анализа присутствуют в низкополимерной форме. Полученные результаты позволяют характеризовать эти клетки как низкодифференцированные, для которых характерно мелкое, интенсивно базофильное ядро округлой формы, расположенное в центре клетки, и высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А).

Степень дифференцировки клеток возрастает от периферии хрящевой модели тела позвонка к центру оссификации, что находит свое отражение в увеличении объема хрящевого матрикса и усилении клетками синтеза его компонентов. С повышением степени дифференцировки хондробластов изменяется их морфология. Хондробласты располагаются в овальных лакунах и принимают уплощённую форму. Снижается их ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А), ядро становится овальным или приобретает бобовидную форму, увеличивается коэффициент формы ядра (рис. 1 В). Уплощение ядра и цитоплазмы нарастает ближе к центру оссификации.

Рис. 1. Морфометрические показатели клеток зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель гестации: А - ядерно-цитоплазматическое отношение; В - коэффициент формы ядра; С - содержание низкодифференцированных клеток в хрящевой ткани зоны роста тела позвонка свиньи.

Примечание: различия показателей достоверны (* р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).

На границе с центром оссификации располагаются наиболее дифференцированные хондробласты, представляющие собой самые крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением (рис. 1 А). Их цитоплазма и территориальный матрикс обильно заполнены сульфатированными ГАГ. Ядро располагается в центре клетки и имеет самый высокий показатель коэффициента формы ядра (рис. 1 В). На срезах, выполненных под углом к сагиттальной плоскости, отчетливо видна дисковидная форма ядра. Уплощенное с двух полюсов округлое ядро при изменении плоскости его расположения в клетке дает картину круга или овала, либо вытянутого профиля.

Полученные морфофункциональные характеристики позволяют использовать в качестве критериев дифференцировки клеток хондрогенного дифферона не только площадь клетки и ядерно-цитоплазматическое отношение, но и предложенный нами новый параметр - коэффициент формы ядра. Эти критерии могут быть использованы для анализа клеточного материала, выделенного из зон роста тел позвонков человека и свиньи при культивировании in vitro с целью последующего использования в тканевой инженерии.

Сравнение формирующихся хрящевых тел позвонков 12-недельного плода человека и 6- недельного плода свиньи выявило различия в развитии переднего и заднего отделов зоны роста (ЗР) у человека, а у свиньи вентрального и дорсального отделов соответственно, обусловленные степенью дифференцировки хондробластов и зрелости матрикса гиалинового хряща. Смещенный к передней (вентральной) продольной связке центр оссификации определяет неравномерное распределение клеток разной степени дифференцировки в теле позвонка. Преобладание в заднем (дорсальном) отделе хрящевого тела позвонка низкодифференцированных хондробластов (рис. 1 С) и слабо выраженный синтез клетками компонентов межклеточного вещества, имеющего достоверно низкий показатель рефракции по сравнению с передним (вентральным) отделом, указывают на отставание в развитии заднего (дорсального) отдела по сравнению с передним (вентральным). Следует отметить, что в переднем (вентральном) отделе тела позвонка отмечается начало формирования колонковых структур, в то время как со стороны заднего (дорсального) отдела клетки не имеют строго определенной векторной направленности. Таким образом, у человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации впервые определяется асимметрия в развитии хрящевого тела позвонка, обусловленная расположением в переднем (вентральном) отделе полюса высокой метаболической активности, а в заднем (дорсальном) отделе - полюса низкой активности.

У человека в период от новорожденности до 1 года, а у свиньи - до 8 недель пренатального развития происходит формирование пластинки роста (ПР) тела позвонка. На сагиттальных срезах тело позвонка новорожденного имеет овальную форму и выполнено хрящевой тканью. В центре тела позвонка расположена зона остеогенеза, в которой определяются сосуды и примитивные костные балки с включениями хрящевой ткани. Вокруг зоны остеогенеза располагаются хрящевые клетки, которые формируют зону роста. Следует подчеркнуть, что на данном этапе развития типичное строение, характерное для ПР, отсутствует. Морфологически идентифицируются зоны резервного, пролиферирующего и гипертрофического хряща. Одиночные клетки резервной зоны лежат в овальных лакунах. Крупное округлое ядро занимает практически весь объем цитоплазмы, в которой выявляются мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. При окрашивании толуидиновым синим при рН 5,0 в цитоплазме этих клеток отмечается резко положительная реакция на гиалуроновую кислоту. Межтерриториальный матрикс бледно окрашивается альциановым синим.

Овальные клетки пролиферирующей зоны располагаются попарно или по 3-4 в одной лакуне и формируют изогенные группы. Плоскость их деления не имеет строгой направленности. Цитоплазма и межтерриториальный матрикс бледно окрашиваются на суммарные ГАГ альциановым синим. В цитоплазме выявляются редкие мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. Одиночно лежащие клетки этой зоны имеют округлое ядро, цитоплазма и территориальный матрикс интенсивно окрашиваются альциановым синим. В межтерриториальном матриксе альцианпозитивное вещество выявляется в виде крупных гранул. В зоне гипертрофированного хряща клетки располагаются группами в крупных лакунах округлой или овальной формы и формируют кластеры. Матрикс вокруг лакун неравномерно окрашивается альциановым синим.

Вышеописанные морфофункциональные характеристики свидетельствуют, что процессы пролиферации хондробластов в данный возрастной период опережают созревание хрящевой ткани. Подтверждением невысокой степени дифференцировки клеток является наличие низкополимерных ГАГ в матриксе и особенности морфологии хондробластов. В данный возрастной период рост направлен, прежде всего, на увеличение хрящевой модели тела позвонка, что обусловливает асинхронность пролиферации клеток и их дифференцировки. Отражением процесса увеличения хрящевой модели преимущественно за счет активной пролиферации хондробластов, а не их синтетической активности, является несовершенный остеогенез. Разобщение пролиферации и синтеза клетками специфических для хряща биополимеров может быть связано с отсутствием компрессии как одного из важнейших регуляторов дифференцировки хондробластов.

Следует отметить неравномерное развитие ЗР тела позвонка человека и свиньи в переднем (вентральном) и заднем (дорсальном) отделах. Колонковые структуры начинают формироваться только в переднем (вентральном) отделе ЗР, плоскость расположения хондробластов параллельна продольной оси тела позвонка. Межклеточное вещество хорошо выражено, характеризуется умеренной реакцией на кислые ГАГ. Мелкие альцианпозитивные гранулы равномерно распределены в межтерриториальном матриксе. В заднем (дорсальном) отделе клетки гипертрофического слоя локализуются группами и не имеют строгой векторной направленности. Межклеточное вещество слабо выражено. При реакции на суммарные кислые ГАГ наблюдаются интенсивно альцианпозитивные крупногранулярные структуры. Степень рефракции макромолекул ХС, КС, гиалуроновой кислоты и коллагена в межклеточном веществе переднего отдела ЗР тела позвонка человека превышает соответствующий показатель заднего отдела (табл. 2). Содержание низкодифференцированных клеток в заднем отделе ЗР тела позвонка превышает этот показатель на 22,55 % по сравнению с передним отделом. Указанные признаки могут указывать на замедление дифференцировки клеток в заднем отеле ЗР по сравнению с передним.

У человека в возрасте 1 года, а у свиньи на сроке 8 недель гестации ПР представлена гиалиновым хрящом, в котором отчетливо идентифицируются 5 зон: резервная, пролиферации, созревания, гипертрофическая и зона остеогенеза. Клетки резервной зоны имеют овальную форму, крупное округлое ядро и хорошо развитую цитоплазму. По направлению от резервной зоны к зоне созревания происходит уплощение хондробластов, меняется и морфология ядра. В клетках верхних отделов колонковых структур ядро образует инвагинаты и по мере приближения к зоне гипертрофии принимает уплощенно-вогнутую форму.

Таблица 2. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества зоны роста тела позвонка новорожденного

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).

Неравномерность развития тел позвонков в заднем (дорсальном) и переднем (вентральном) отделах отчетливо иллюстрируется гистохимическим и поляризационно-оптическим анализом. В переднем (вентральном) отделе ПР альцианпозитивный материал располагается в межклеточном веществе в виде мелких гранул, а матрикс заднего (дорсального) отдела ПР окрашивается гомогенно. В препаратах и человека, и свиньи интенсивность рефракции макромолекул гиалуроновой кислоты, ХС, и коллагена в межклеточном веществе ПР переднего (вентрального) отдела превышает данные показатели заднего (дорсального) отдела (табл. 3, 4). Костные балки со стороны передней (вентральной) поверхности тела позвонка мощные и содержат незначительные включения хрящевой ткани по сравнению с задним (дорсальным) отделом. В зоне энхондрального остеогенеза сосуды инвазируют лишь матрикс, прилежащий к гипертрофическим клеткам, что является следствием интенсивного роста тела позвонка и проявлением динамичного единства процессов хондрогенеза и остеогенеза. В данный период развития вся совокупность морфогенетических процессов, в том числе и несовершенный остеогенез, являются отражением увеличения массы тел позвонков и активного замещения их хрящевой модели на костную. Ширина ПР свиньи в вентральном отделе превышает соответствующий показатель дорсального отдела на 13,74 %.

Таблица 3. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества пластинки роста тела позвонка годовалого ребенка

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).

Таблица 4. Показатели рефракции биополимеров межклеточного вещества хрящевой ткани пластинки роста тела позвонка 8-недельного плода свиньи

Примечание: различия степени рефракции между дорсальным и вентральным отделами достоверны (р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).

У человека в возрасте 3-7 лет неравномерность развития переднего и заднего отделов ПР тела позвонка становится менее заметной. Степень рефракции основных биополимеров хрящевого матрикса - гиалуроновой кислоты, ХС, КС и коллагена в препаратах ПР переднего отела тела позвонка превосходит эти показатели по сравнению с задним отделом (табл. 5). У свиньи на сроке 12 недель гестации и до рождения неравномерность развития дорсального и вентрального отделов ПР гистохимическими методами анализа не определяется. Ширина ПР в вентральном отделе на 4,45% статистически достоверно превышает данный показатель дорсального отдела.

Структурная организация ПР человека и свиньи в этот возрастной период не имеет принципиальных различий. Отчетливо определяются все зоны, характерные для сформированной ПР. Развитая зона созревающего и гипертрофического хряща, с одной стороны, и глубокая инвазия кровеносными сосудами матрикса хряща до клеток зоны созревания - с другой, свидетельствуют об активном росте тела позвонка. Динамическое единство процесса роста, обусловленного пролиферацией хрящевых клеток и остеогенезом, в данный возрастной период смещено в сторону последнего.

У детей в возрасте 11 лет, а у свиньи в течение 7 - 20 суток постнатального периода онтогенеза структурная организация ПР претерпевает существенные изменения.

Таблица 5. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества пластинки роста тела позвонка человека 3-7 лет

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (р ? 0,05; ** р ? 0,01; *** р ? 0,001).

Резервная зона у человека по ширине занимает 1/3 объёма ПР, что особенно хорошо видно на срезах, окрашенных альциановым синим на суммарные ГАГ. Клетки резервной зоны вытянутой формы, с продолговатым ядром, содержащим преимущественно гетерохроматин. Цитоплазма умеренно базофильная. В более глубоких слоях резервная зона без четкой границы переходит в зону пролиферации. Образовавшиеся в результате деления клетки изменяют свою морфологию. Ядро молодых клеток бобовидной формы. Более зрелые клетки пролиферирующей зоны имеют уплощенное ядро. Скопления из двух-трех клеток уплощенной формы образуют изогенные группы, переходящие в колонковые структуры зоны пролиферирующего и созревающего хряща. В толще зоны пролиферации в плоскости, параллельно продольной оси тела позвонка, отмечается перфорация хрящевого матрикса кровеносными сосудами.

Зоны созревающего и гипертрофического хряща узкие, толщиной в 3-5 клеток овальной формы с округлым ядром, или в форме двояковогнутого диска. Матрикс хряща имеет фибриллярную структуру и неравномерно окрашивается гематоксилином. Особенностью этой зоны является присутствие клеток с признаками апоптоза и крупных бесклеточных лакун. Следует отметить, что в зоне остеогенеза костные балки вплотную прилежат к матриксу хряща. Широкие резервная зона и зона пролиферации, а также узкие зоны созревания и гипертрофии (которая остаётся перекрытой костными балками в зоне остеогенеза) позволяют заключить, что в данный возрастной период рост тела позвонка обусловлен главным образом преобладанием хондрогенеза, а не сопряжением хондро- и остеогенеза.

У человека в возрасте 11 лет сохраняется неравномерное развитие клеток и матрикса в области переднего и заднего отделов ПР тела позвонка. Со стороны передней продольной связки межклеточное вещество хрящевой ткани вокруг изогенных групп клеток окрашивается альциановым синим в виде мелких гранул, в отличие от гомогенной окраски в заднем отделе ПР. В препаратах, где морфогистохимическими методами неравномерность развития не определяется, она выявляется топо-оптическими реакциями на сульфатированные и несульфатированные ГАГ. Уровень рефракции, отражающий степень пространственно-упорядоченной организации макромолекул гиалуроновой кислоты, КС и ХС межклеточного вещества ПР в переднем отделе выше, чем в заднем. Уровень рефракции макромолекул коллагена не имеет достоверных различий.

У свиньи в возрасте 7-20 суток, как и у человека 11-летнего возраста, четко прослеживаются особенности морфогенетических преобразований, приводящих к структурному обособлению ПР и замыкательной пластинки (ЗП) тела позвонка. В ПР 7-суточного поросенка отмечается формирование сосудистых каналов в матриксе, которые проходят в плоскости, параллельной продольной оси тела позвонка. У поросят в возрасте 14 суток в ПР отмечается расширение сосудистых каналов за счет деструкции матрикса хрящевой ткани. Цитоплазма клеток эндотелия кровеносных сосудов и хондробластов зоны пролиферации характеризуется умеренной реакцией на АКМ и интенсивной реакцией на NO-синтазу, что свидетельствует об интенсивном синтезе свободного радикала - NO. Можно полагать, что локализация в матриксе хряща вокруг сосудистых каналов кластеров из 4 и более клеток в одной лакуне является реакцией хондробластов на повреждение свободнорадикальным NO. В цитоплазме данных клеток выявляется также высокое содержание Са²⁺, который может повышать активность конститутивной формы NO-синтазы (Mayer B., 1995). Иммуногистохимическая реакция показывает высокий уровень экспрессии белка р53 в хондробластах зоны пролиферации, тогда как белок Bcl-2 регистрируется лишь в единичных клетках. Повышение в клетках активности АКМ, концентрации ионов Са²⁺ и экспрессии белка р53 могут указывать на их участие в свободнорадикальном повреждении матрикса хрящевой ткани и гибели хондробластов зоны пролиферации по механизму апоптоза. При этом одним из ведущих свободнорадикальных соединений выступает NO.

В возрасте 20 суток в центре зоны пролиферации ПР свиньи, как в вентральном, так и дорсальном отделах, четко идентифицируются два центра деструкции хрящевого матрикса. Лакуны клеток разрушены. Ядра - с признаками пикноза, а цитоплазма - в состоянии плазморексиса. В межтерриториальном матриксе отчетливо видны оксифильные демаскированные фибриллы. Несмотря на отсутствие морфологических и гистохимических различий в структурной организации матрикса хрящевой ткани дорсального и вентрального отделов ПР, процесс оссификации осуществляется более интенсивно в первом, что может свидетельствовать как о более низкой степени дифференцировки клеток, так и более низкой структурной организации межклеточного вещества дорсального отдела ПР по сравнению с вентральным. Индекс апоптоза в клетках зоны пролиферации дорсального отдела ПР статистически достоверно превышает таковой вентрального отдела на 12,06%.

В препаратах тел позвонков человека 12-летнего возраста и свиньи в возрасте 30-суток, в толще зоны пролиферации в плоскости, перпендикулярной продольной оси тела позвонка, отмечается активная инвазия межклеточного вещества хрящевой ткани кровеносными сосудами. В образцах ПР 30-суточных поросят в клетках эндотелия сосудов отмечается резко положительная реакция на NO-синтазу. В цитоплазме хондробластов, локализованных на периферии сосудистых каналов определяется повышение внутриклеточного содержания Са²⁺ и экспрессии белка р53. Данные клетки характеризуются отсутствием экспрессии белка Bcl-2, что возможно является особенностью хондробластов провизорного хряща, поскольку деление клеток в зоне пролиферации происходит достаточно быстро и обеспечение длительного «выживания» клеток в данном компартменте ПР не является обязательным. Индекс апоптоза в хондробластах зоны пролиферации ПР свиньи в её дорсальном отделе статистически достоверно превышает соответствующий показатель вентрального отдела на 8,73%. Дистрофия клеток и матрикса вокруг сосудистых каналов приводит к оссификации и остеогенезу.

Неравномерность развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР определяется более широким фронтом остеогенеза в зоне пролиферации ПР в её заднем отделе у человека, и дорсальном у свиньи.

В более поздний интервал постнатального периода онтогенеза (у человека старше 14-лет, а у свиньи старше 40-суток) неравномерность морфогенетических процессов в заднем (дорсальном) и переднем (вентральном) отделах ПР доступными методами не определяется.

Объяснение механизма структуризации ПР человека и свиньи может быть следующим. У человека в возрасте 11-12 лет, а у свиньи в период 7-30 суток ПР в зоне энхондрального остеогенеза плотно перекрыта костной тканью, и её рост осуществляется за счет увеличения зоны пролиферации. Расположенные в толще гиалинового хряща хондробласты пролиферирующей зоны оказываются удаленными от источников трофики - сосудов зоны энхондрального остеогенеза с одной стороны, а с другой - межпозвонкового диска. Вследствие этого клетки подвергаются дистрофии и гибнут. Именно в этой плоскости происходит инвазия хрящевого матрикса сосудами. Наличие крупных кровеносных сосудов в зоне пролиферации приводит к увеличению напряжения кислорода, повышенной генерации АКМ эндотелиальными клетками и хондробластами, свободнорадикальному повреждению компонентов хрящевого матрикса на периферии сосудистых каналов и апоптозу хондробластов.

Асимметричное расположение центра оссификации в теле позвонка человека и свиньи изначально является фактором, обусловливающим неравнозначность трофики и влияния регулирующих факторов (гормонов, факторов роста, цитокинов) на хондробласты переднего и заднего отделов ПР тела позвонка человека, а у свиньи - её дорсального и вентрального отделов, что предполагает существование морфофункциональных различий клеток в соответствующих отделах ПР и различной ответной реакции на регулирующие воздействия. В итоге это приводит к асимметрии роста ПР в переднем и заднем отделах тела позвонка человека, а у свиньи в дорсальном и вентральном отделах.

Анализ полученных результатов позволяет заключить: у человека, начиная с 12 недель (плодный период), а затем в первую (от рождения и до 6-7 лет), а также вторую фазы развития позвоночника (от 7 до 12 лет) морфогенетические процессы, обеспечивающие увеличение массы тел позвонков и структуризацию их элементов, происходят неравномерно. Эта закономерность характерна и для свиньи, с той лишь разницей, что соответствующие фазы развития тел позвонков реализуются с 6 недель пренатального периода онтогенеза до 30 суток постнатального периода онтогенеза. Неравномерность развития структурных элементов тела позвонка в более поздние периоды онтогенеза доступными методами не определяется. Полученные данные об особенностях структурно-функциональной организации ПР тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе позволили провести параллели и выделить общие закономерности её гистогенеза (табл. 7).

Таблица. 7. Структурно-временные параллели формирования пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе

Неравномерность роста и развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР тела позвонка в период её формирования и структуризации, является морфологической основой развития возможных деформаций тел позвонков как у человека, так и свиньи. Очевидно, что при одинаковых воздействиях гормонов, цитокинов, факторов роста на клетки ПР, например, во время гормонального пика в период интенсивного роста и полового созревания, реакция клеток разной степени дифференцировки неодинакова. С этой точки зрения, возрастные особенности формирования ПР могут рассматриваться как морфологическая основа такой классической ортопедической патологии позвоночного столба человека, как идиопатический сколиоз. Наши данные согласуются с предложенной М.Г. Дудиным (2003) концепцией этиопатогенеза идиопатического сколиоза, которая постулирует, что при нарушении гормонального фона, например, при высоком содержании кальцитонина и соматотропина, передние отделы тела позвонка опережают в развитии задние на уровне суставных отростков. Компенсация этого состояния происходит за счёт торсии удлиненных передних отделов вокруг относительно укороченных задних.

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать параметры отбора и оценки клеточного материала для использования в клеточных технологиях. Так, оптимальным периодом отбора хрящевой ткани в качестве источника клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций является у человека срок 12 недель, а у свиньи - 6 недель гестации, поскольку содержание низкодифференцированных клеток в гиалиновом хряще зоны роста составляет более 70%. Для оценки степени дифференцировки клеток целесообразно использовать совокупность параметров: коэффициент формы ядра, площадь клетки, ядерно-цитоплазматическое отношение. Вместе с тем, широкому внедрению ксенотрансплантации в практику должны предшествовать комплексные исследования по изучению закономерностей пролиферации и дифференцировки клеток в динамике их развития in vitro.

2. Структурно-функциональная характеристика первичной культуры клеток, выделенных из зоны роста тела позвонка плода человека на 12 неделе гестации

Первичная культура клеток, выделенная из хрящевой зоны роста тела позвонка плода человека, на первом пассаже выглядит разреженной и представлена тремя типами клеток. Клетки всех типов имеют округлую или овальную форму и статистически достоверные различия площади клетки, коэффициента формы ядра и ядерно-цитоплазматического отношения (рис. 2). Мелкие клетки обозначены как клетки 1-го типа, среднего размера - как клетки 2-го типа и самые крупные - клетки 3-го типа.

Округлые клетки 1-го типа площадью 60,90±3,72 мкм², являются преобладающими на первом пассаже, их содержание достигает 78,93%. Округлое ядро содержит преимущественно гетерохроматин и занимает значительный объем клетки. Цитоплазма слабо выражена, умеренно базофильная.

Клетки 2-го типа преимущественно овальные, площадью 98,5 ± 2,31 мкм², составляют 18,03 % клеточной популяции. Ядро лежит эксцентрично и, в зависимости от плоскости расположения в клетке, имеет бобовидную, овальную или форму уплощенного диска. Цитоплазма обильная, умеренно оксифильная.

Клетки 3-го типа содержат крупное овальное ядро с небольшим количеством эухроматина. В цитоплазме выявляются мелкие оксифильные гранулы. Это самая малочисленная группа клеток на данном пассаже, составляющая 3,05%.

При постановке ШИК-реакции в цитоплазме клеток 1-го типа выявляется пылевидный интенсивно окрашенный материал. Предварительная инкубация клеток в растворе амилазы полностью подавляет реакцию. Клетки 2-го и 3-го типов содержат гранулярное, интенсивно окрашенное реактивом Шиффа вещество, заполняющее весь объем цитоплазмы. Гранулы в цитоплазме клеток 3-го типа крупнее, чем в клетках 2-го типа и локализованы преимущественно на периферии. Обработка срезов амилазой значительно понижает интенсивность ШИК-реакции.

Клетки всех типов различаются как по интенсивности окрашивания альциановым синим на кислые ГАГ, так и по морфологии альцианпозитивных гранул. В клетках 1-го типа мелкодисперсное вещество заполняет весь объем цитоплазмы. Клетки 2-го и 3-го типов, напротив, содержат крупные гранулы альцианпозитивного вещества, расположенные диффузно. В реакции с толуидиновым синим на КС в цитоплазме клеток 1-го типа отмечается незначительное количество пылевидного бледно окрашенного вещества. Клетки 2-го и 3-го типов характеризуются накоплением мелких, умеренно окрашенных в лиловый цвет гранул, диффузно расположенных в цитоплазме. При постановке реакции на ХС в клетках 1-го типа интенсивность окрашивания и распределение толуидинпозитивного материала аналогичны таковым при выявлении КС. В клетках 2-го и 3-го типов содержатся многочисленные крупные гранулы, воспринимающие толуидиновый синий при значении рН 2,5 раствора красителя, которые сливаются и заполняют всю цитоплазму.

Рис. 2. Морфометрические показатели клеток 1, 2 и 3-го типов первичной культуры. А - площадь клетки; В - ядерно-цитоплазматическое отношение; С - коэффициент формы ядра.

Примечание: различия между клетками 1, 2 и 3 типов достоверны (* р ? 0,05; ** р ?0,01; *** р ? 0,001).

Анализ величины ядерно-цитоплазматического отношения всех типов клеток свидетельствует о статистически достоверном снижении этого показателя от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа, что говорит об увеличении степени дифференцировки клеток, равно как и изменения коэффициента формы ядра (рис. 2 В, С). Наименее дифференцированными являются клетки 1-го типа, а наиболее - клетки 3-го типа, что подтверждается усложнением ультраструктурной организации клеток по направлению от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа. В цитоплазме более дифференцированных клеток 2-го и 3-го типов отмечаются морфологические признаки повышения синтетической активности: увеличивается протяженность цистерн шероховатого ЭПР, в их полости накапливается тонкогранулярный материал, электронная плотность которого несколько выше, чем плотность цитоплазмы. По мере дифференцировки клеток нарастает количество элементов аппарата Гольджи, усложняется его организация. На срезах наблюдается формирование пузырьков с гомогенным (в отличие от зернистого содержимого цистерн ЭПР) содержимым низкой электронной плотности. Многочисленные гладкомембранные и «опушенные» везикулы в зоне аппарата Гольджи свидетельствуют об интенсивном внутриклеточном транспорте компонентов, синтезируемых в этом органоиде, а также об активных процессах гликозилирования, которые свойственны хондробластам. Лизосомальные структуры в хондробластах первого пассажа немногочисленны.

Таким образом, клетки первичной культуры фетальных хондробластов человека на 1-ом пассаже представляют собой популяцию активно дифференцирующихся клеток с признаками нарастающей синтетической активности. Клетки всех типов синтезируют специфические биополимеры хрящевой ткани - сульфатированные и несульфатированные ГАГ, а также коллаген II типа, выявляющийся при постановке иммунохимической реакции с вторичными антителами. Цитохимические свойства позволяют определить три типа клеток как низкодифференцированные, среднедифференцированные и высокодифференцированные хондробласты.

Первичная культура клеток на 2-ом пассаже образует равномерный плотный монослой, сформированный тремя типами клеток. Морфометрический анализ выявил изменение соотношения между клетками трех типов: содержание 1-го типа снизилось до 59,21%, а содержание клеток 2-го и 3-го типов возросло до 34,06% и 6,73%, соответственно. Морфология клеток 1-го и 3-го третьего типов не отличалась от таковой на 1-ом пассаже.