Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

03.00.08 - зоология

ФЕОКТИСТОВА Наталья Юрьевна

Москва 2008

Работа выполнена в Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Научный консультант: доктор биологических наук Чернова Ольга Федоровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Жигарев Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор, Никольский Александр Александрович

доктор биологических наук Полетаева Инга Игоревна

Ведущая организация Институт экологии растений и животных Уральского отделения РАН

Защита предположительно состоится 18 мая 2009 г. на заседании Диссертационного Совета Д212.154.20 при Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129164, Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 5, ауд. 304

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1.

Ученый секретарь Диссертационного Совета С.П. Шаталова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Адаптации животных к условиям обитания - одна из ключевых, фундаментальных проблем биологии. Для ее решения особенно перспективно сопоставление адаптивных возможностей видов с их генетическим разнообразием, так как среди многочисленных факторов, определяющих жизнеспособность популяций, именно генетическое разнообразие является одним из ведущих и наиболее значимых. На этот принципиальный момент обращали внимание как генетики (Avis 1994, 2000; Алтухов, 2003, 2005 и др.), так и экологи (Шварц, 1960, Шилов, 1977, 2001; Мошкин, Шилова, 2008). Известно, что снижение генетического разнообразия в популяциях сопровождается общим уменьшением адаптивных возможностей составляющих их особей, что проявляется в разных уровнях устойчивости к стрессорным воздействия (как абиотическим, так и биотическим), инфекционным и паразитарным заболеваниям, в снижении успеха размножения, выживаемости и приспособленности потомства и т.д. (Leding, 1986; Rall et al., 1988; Белоусова, 1999; Mauget et al., 2001; Jewel et al., 2005; Холодова, 2006; Плошница и др., 2007). Утрата генетического разнообразия, безусловно, ведет к глубоким последствиям для эволюции видов и их выживания в целом. Исследование филогеографической структуры и специфики ее формирования у разных видов имеет существенное значение для познания процессов микро - и макроэволюции и стратегии сохранения биоразнообразия. В этом аспекте наиболее интересны таксоны, которые предположительно находятся в состоянии биологического регресса и характеризуются пониженными темпами эволюции. К таким, по мнению ряда авторов, относятся представители п/сем. Cricetinae (А.Н. Северцов, 1931; С.А. Северцов, 1936; Воронцов, 1960, 1982). Для оценки эволюционных процессов, происходящих в п/сем. Cricetinae нами выбран наиболее эволюционно древний (базальный) таксон подсемейства - род мохноногих хомячков (Phodopus). Можно ожидать, что естественным следствием биологического регресса этой группы является снижение биологического разнообразия и адаптивных возможностей составляющих ее видов.

Нами проанализированы эколого-морфологические, эколого-физиологические, поведенческие адаптивные возможности выбранной группы в контексте общих путей адаптаций грызунов, выделенных Н.В. Башениной (1977). В работе применен комплексный подход, сочетающий оценку генетического разнообразия с анализом адаптивных особенностей морфологии, физиологии и поведения представителей рода Phodopus.

Цель работы: выявить связи эколого-морфологических, эколого-физиологических и этологических адаптивных возможностей модельных видов (хомячков рода Phodopus) c особенностями исторического формирования их генетического разнообразия и филогеографической структуры.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Основываясь на данных о полиморфизме митохондриальной ДНК (мтДНК) дать оценку уровня генетического разнообразия трех видов рода Phodopus в сравнении c более «прогрессивными» видами грызунов. Проанализировать структуру филогенетических отношений у представителей рода Phodopus и реконструировать историю ее формирования.

2. Сравнить характер адаптивных особенностей, присущих разным филогенетическим линиям одного из модельных видов - хомячка Кэмпбелла.

3. На основании оригинальных и литературных данных проанализировать морфологические и физиологические адаптации модельных видов к существованию в аридных условиях с резкими колебаниями внешних температур.

4. Выявить адаптивные особенности стратегий размножения видов рода Phodopus. 5. Оценить поведенческие, в частности хемокоммуникативные, адаптации, позволяющие видам рода Phodopus поддерживать устойчивую пространственно-этологическую структуру без резких колебаний численности и существовать в непосредственной близости от мест поселения хищников.

Научная новизна. На основании исследования полиморфизма мтДНК впервые проанализировано генетическое разнообразие и филогеографическая структура видов рода Phodopus - базального в п/сем. Cricetinae. Дана реконструкция истории формирования современной структуры рода, оценены темпы и характер микроэволюционных процессов для каждого из исследованных видов.

Впервые оценен характер морфологических, физиологических, поведенческих адаптаций, а также особенности воспроизводства хомячков рода Phodopus в контексте приспособленности этой группы к обитанию в экстремальных условиях засушливого и резкоконтинентального климата.

Впервые показано отсутствие зимней спячки у всех исследованных видов и оценен характер сезонных гормональных изменений, которые позволяют мохноногим хомячкам размножаться практически круглогодично, что способствует стабилизации численности популяций.

Впервые проанализированы сезонные особенности изменения роли хемокоммуникативных сигналов в организации половых и территориальных взаимоотношениях у видов рода Phodopus.

Впервые обнаружены морфофизиологические компенсаторные адаптации, позволяющие видам рода Phodopus выживать и успешно размножаться даже в непосредственной близости от мест поселения хищников.

Отвергнута гипотеза о биологическом регрессе у видов со стабильно-низкой динамикой численности и сформулирована концепция о прогрессивной эволюции рода Phodopus, виды которого характеризуются значительным генетическим разнообразием и широким спектром адаптивных возможностей. Теоретическая и практическая значимость. Впервые для анализа модельной группы был использован комплексный подход, сочетающий оценку генетического разнообразия с глубоким анализом адаптивных возможностей исследуемых видов, который мы предлагаем в качестве нового перспективного направления исследований.

Оценка уровня генетического разнообразия, темпов и характера микроэволюционных процессов в пределах каждого из модельных видов, а также присущих им морфофизиологических и поведенческих адаптаций позволили выдвинуть положение об отсутствии биологического регресса и замедления темпов эволюции у видов с преимущественно одиночным образом жизни и стабильно низким уровнем динамики численности, что дополняет представления о критериях прогресса в биологии (см. например, А.Н. Северцов, 1925).

Два из трех видов выбранной модельной группы: джунгарский хомячок (Ph. sungorus) и хомячок Кэмпбелла (Ph. campbelli) - широко используются в качестве лабораторных животных, в частности в исследованиях связанных с изучением сезонных изменений состояния организма. Хомячки служат модельными объектами для изучения онкологических заболеваний, в том числе рака молочной железы (Guimont, Wynne-Edwards, 2006). Мы предлагаем мохноногих хомячков в качестве удобной модели для изучения детского энтероколита (Феоктистова, 1994; Феоктистова и др., 2004). Кроме того, бактерии их кожных желез могут служить основой для разработки пробиотических препаратов (Ушакова и др., 2004).

Верная трактовка полученных в лаборатории результатов невозможна без знаний характерных особенностей биологии подопытных животных. Наши исследования продемонстрировали наличие у хомячка Кэмпбелла в пределах вида двух ярко выраженных филогенетических групп, значительно различающихся по целому ряду морфологических, физиологических и поведенческих особенностей. Таким образом, лабораторные результаты, полученные для данного вида ранее, требуют корректировки с учетом принадлежности экспериментальных животных к той или иной группе. Важным практическим результатом работы является комплексное исследование наименее изученного вида рода - хомячка Роборовского (Ph. roborovskii), который включен в Красную книгу Казахстана и в Приложение III Красной книги Российской Федерации как вид со слабо изученной экологией. Исследования, представленные в данной работе, позволят частично заполнить имеющийся пробел в знаниях по филогеографии, физиологии, экологии и коммуникации этого вида и должны быть учтены при разработке мер его охраны.

Материалы диссертации используются в лекционных и практических курсах, при проведении полевых практик на кафедре зоологии (факультет ВЗО и ДО) РГГУ МСХА им. К.А. Тимирязева, на кафедре зоологии и экологии биолого-химического факультета МПГУ и в других вузах Российской Федерации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Данные о полиморфизме мтДНК позволяют оценить общий уровень генетического разнообразия и выявить узловые события в эволюционной истории видов. У эволюционно более молодого вида - джунгарского хомячка - показатели генетического разнообразия ниже, чем у хомячка Роборовского и Кэмпбелла - видов с более длительной эволюционной историей. Однако у всех трех видов рода Phodopus показатели генетического разнообразия свидетельствуют о благополучном состоянии изученных популяций.

2. Для представителей модельной группы (хомячков рода Phodopus) характерен целый ряд высокоспециализированных морфофизиологических адаптаций, позволяющих им успешно выживать в экстремальных условиях существования.

3. Модельные виды обладают целым рядом адаптивных комплексов, обеспечивающих высокую эффективность воспроизводства. Одним из важнейших является ускорение онтогенеза, особенно его ранних стадий, связь сроков полового созревания с сезоном года, наличие зимнего размножения. 4. У исследованных видов выявлены специфические адаптации, связанные с поддержанием популяционной структуры за счет изменения информационной значимости химических сигналов в зависимости от сезона года.

5. Для хомячков рода Phodopus характерно наличие поведенческих и морфофизиологических адаптивных комплексов, обеспечивающих возможность успешного выживания и размножения в непосредственной близости от мест поселения хищников.

6. Высокий уровень генетического разнообразия, темпы и характер микроэволюционных процессов в пределах рода Phodopus, а также комплекс присущих исследованным видам морфофизиологических и поведенческих адаптаций опровергают гипотезу о биологическом регрессе и замедлении темпов эволюции у видов базальной группы п/сем. Cricetinae и расширяют представление о биологическом прогрессе отдельных таксонов грызунов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 25 международных и 13 всероссийских конференциях и совещаниях, в том числе: на съездах Всероссийского Териологического общества (Москва, 1990; 1999), международном совещании «Териофауна России и сопредельных территорий» (Москва, 2003; 2007); V, VII и XI международных конференциях «Грызуны и пространство» (Rabat, Morocco, 1995; Lublin, Poland, 2004, Мышкин, Россия, 2008); II, III, IV Европейских конгрессах по млекопитающим (Southampton, England, 1995; Jyvaskyla, Finland, 1999; Brno, Czech Repablic, 2003); XII международной конференции по запаху и вкусу (San Diego, USA, 1997); на XIII и XIV и XVI международной конференции ECRO (Siena, Italy, 1998; Erlangen, Germany, 2002; Dijon, France, 2004); II, III европейском конгрессе по «Управлению позвоночными животными» (Braunshweig, Germany, 1999; Kibbutz Ma'aleh Hachamisha, Israel, 2001); VIII Европейском Экологическом конгрессе (Halkidiki, Greece, 1999); VII, VIII, X международных конференциях по химическим сигналам млекопитающих (Tubingen, Germany, 1994; Ithaca, USA, 1997; Oregon State University, USA, 2003); XXVII международном этологическом конгрессе (Tubingen, Germany, 2001); Российской конференции «Научные исследования в наукоградах Московской области» (Черноголовка, 2001); Всероссийской конференции, посвященной 250-летию Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и 90-летию Звенигородской биологической станции им. С.Н. Складовского (Москва, 2001); Конференции молодых сотрудников и аспирантов ИПЭЭ им. А.Н. Северцова (2004; 2006); XIX международной конференции по зоологии (Beijing, China, 2004); IV международной конференции «Химическая коммуникация животных. Фундаментальные проблемы» (Москва, 2006); международной конференции «Адаптации и биоэнергетика, онтогенетические, эволюционные и экологические аспекты», посвященной 80-летию со дня рождения профессора А.И. Зотина (Москва, 2006); конференции «Современные проблемы биологической эволюции» (Москва, 2007); поведенческой конференции (Москва, 2007); II международном конгрессе по Интегративной зоологии (Пекин, 2007); IV всероссийской конференции по поведению животных (Москва, 2007); объединенном коллоквиуме лабораторий, входящих в научную школу по эволюционной морфологии (Москва, 2008)

Публикации: по теме диссертации опубликовано 79 научных работ, включая монографию, учебное пособие, 23 статьи, опубликованные в журналах из списка ВАК, 17 статей в русских и иностранных журналах и сборниках, не входящих в список ВАК и 37 тезисов (всего 52.6 п.л.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 8 глав, введения, заключения, выводов и библиографического списка, приложения. Текст диссертации изложен на 451 странице, в ней содержится 75 таблиц и 83 рисунка. Список литературы включает 459 наименований, в том числе 227 на русском и 232 иностранных языках. В приложение состоит из 84 фотографий.

адаптационный стратегия хомячок генетический

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава посвящена анализу существующих классификаций адаптаций и адаптивных стратегий животных. Отмечается, что все данные стратегии в конечном итоге основаны на распределении ресурсов организма между различными сторонами его жизнедеятельности и направлены на поддержание стабильного состояния системы организма при различных масштабах изменения внешних по отношению к этой системе условий. Общим свойством адаптационных процессов является «расплата энергией» за приспособленность к среде, что вполне естественно, учитывая универсальный характер реакции энергообеспечения. Конкретные адаптивные механизмы невозможно даже перечислить, так как их количество соответствует числу адаптаций, однако И.А. Шиловым (1977) в наиболее общем виде выделены две группы адаптивных механизмов: 1) обеспечивающие приспособительный характер общего уровня стабилизации к наиболее генерализованным и устойчивым параметрам среды обитания; 2) поддерживающие относительное постоянство этого уровня путем включения компенсаторных адаптивных реакций при отклонении условий среды от средних значений. Взаимодействие этих механизмов в конечном итоге обеспечивает устойчивое существование системы в условиях сложной и динамичной среды (Корниенко и др., 1965; Шилов, 1977). Отмечена исключительно важная роль разнокачественности составляющих популяцию особей (по генетическим, морфофизиологическим свойствам, поведенческим параметрам) в формировании популяционных адаптаций.

В главе приводится анализ литературных данных о систематическом положении, кариологических особенностях, распространении и различных сторонах биологии модельных видов. Современные хомяки п/сем. Cricetinae представляют собой отдельную филетическую линию, достаточно однородную как морфологически, так и экологически. Подсемейство представлено семью родами: Cricetus, Cricetulus, Allocricetulus, Mesocricetus, Tscherskia, Cansymus, Phodopus (Павлинов, 2006). По современным представлениям, род Phodopus является наиболее эволюционно древним в п/сем. Cricetinae (Neumann et al., 2006; Romanenko et al., 2007). Время обособления этой клады от основной ветви Cricetinae оценивается в 8.5-12.2 млн лет (Neumann et al., 2006), хотя ископаемые остатки этого рода не известны до четвертичного периода (Falhbush, 1969; Shaohua, 1984; Shaohua, Cai, 1991).

Род Phodopus включает три вида: хомячка Роборовского (Ph. roborovskii), хомячка Кэмпбелла (Ph. campbelli), джунгарского хомячка (Ph. sungorus) (Павлинов, 2006). Разделение хомячков Кэмпбелла и джунгарского произошло около 1 млн лет назад (в Плейстоцене), тогда как отделение предковой формы хомячка Роборовского от ветви рода Phodopus произошло гораздо раньше (около 5 млн лет назад, в среднем Плиоцене, Neumann et al., 2006).

Более эволюционно древнее происхождение хомячка Роборовского отражает и его более примитивный кариотип (Spyropoulus et al., 1982).

Видовая самостоятельность хомячка Роборовского никогда не вызывала сомнений, тогда как хомячка Кэмпбелла начиная с 1930-х годов обычно рассматривали в качестве подвида джунгарского хомячка. Окончательно видовой статус Ph. campbelli был восстановлен после проведения тщательного гибридологического анализа (Сафронова и др., 1992, 1999; Соколов, Васильева, 1993; Сафронова, Васильева, 1996; Черепанова, 2001), хотя еще ранее подвидовой статус данной формы был подвергнут сомнению Н.Н. Воронцовым с соавторами (Воронцов и др., 1967). А несколько позже, С.К. Раджабли и Е.П. Крюкова (1971) отметили стерильность самцов - гибридов этих двух хомячков.

Виды модельной группы обитают в суровых условиях континентального климата с жарким и засушливым летом, характеризующимся большими перепадами температур от дня к ночи и морозной, зачастую малоснежной зимой. Большая часть ареала джунгарского хомячка расположена на территории «настоящих» (разнотравно-дерновинно-злаковых и дерновинно-злаковых) степей Центр. и Вост. Казахстана. На севере ареал Ph. sungorus совпадает с территориями лесостепной зоны Сев. Казахстана и юга Зап. Сибири, на юге включает и участок, относящийся к зоне полупустынь. Анализ климатических особенностей ряда точек на территории ареала Ph. sungorus свидетельствует об относительно однородном климате, в котором обитает данный вид. Естественно, в более южных районах климат оказывается более теплым и сухим, однако эти различия являются значительно меньшими, чем те, которые характеризуют территории распространения двух других видов рода (Мещерский, 1992а, б). Основная часть ареала хомячка Кэмпбелла лежит в пределах зоны настоящих степей (Сев. и Сев.-Вост. Монголия, Сев. Китай и прилегающие районы Забайкалья) и сухих (опустыненных) степей и полупустынь (Юго-Вост. и Внутренняя Монголия, Сев. Ордос, а также р-ны Сев.-Зап. Монголии - Котловина Больших Озер и Убсунурская котловина). В целом вид характеризуется как представитель фауны сухих и пустынных степей (Конева, 1983; Подтяжкин, Орлов, 1986) и способен заселять достаточно разнообразные биотопы (Флинт, 1977). Анализ климатических особенностей свидетельствует о значительно большем разнообразии режимов температуры и влажности в пределах ареала хомячка Кэмпбелла, чем у джунгарского хомячка. Большая часть ареала все же характеризуется значительно более низкими средними температурами, чем это характерно для Ph. sungorus. Ряд участков на территории ареала хомячка Кэмпбелла отличаются значительно большей аридностью, чем на территории ареала джунгарского хомячка. Величина индекса аридности на значительной части ареала хомячка Кэмпбелла не превышает аналогичных значений для территории распространения джунгарского хомячка. Хомячок Роборовского обитает в пустынях и полупустынях Монголии и Сев. Китая, на юге Вост. Казахстана (в р-не оз. Зайсан), а на территории России - в Южной Туве. Хомячку Роборовского присуща четко выраженная псаммофильность. Этот вид, приуроченный к зоне пустынь и опустыненных степей (Млекопитающие Казахстана, 1977; Ван Сибо, Ян Ганьюань, 1983; Подтяжкин, Орлов, 1986), в своем распространении сталкивается с высоким уровнем аридности, а также с наиболее высокими значениями температур (Мещерский, 1992а, б).

Все исследованные виды имеют относительно неглубокие норы (наиболее примитивно устроенные у хомячка Роборовского) и преимущественно ночную активность (Flint, 1966).

Основу рациона хомячков модельной группы составляют семена. Однако и другие виды корма, в первую очередь, животная пища, играют существенную роль, так что виды могут характеризоваться как имеющие смешанный тип питания (Бобринский и др. 1965; Flint, 1966; Соколов, Орлов, 1980 и др.). Однако, на основании литературных (Роговин и др., 1987), и собственных данных нами сделано заключение о значительной насекомоядности хомячка Роборовского по сравнению с двумя другими видами рода (Мещерский, Феоктистова, 1999).

Для всех представителей п/сем. Cricetinae, в том числе для видов рода Phodopus, характерна невысокая численность и относительно устойчивая ее динамика (Flint, 1966; Флинт, 1977; Воронцов, 1982). Наши данные, полученные в результате отловов в 2005-2008 гг. в разных точках ареалов модельных видов (см. гл. 2), также подтверждают это положение. Показатель численности является характеристикой вида и его приспособлением к внешним условиям. Устойчивый тип динамики численности, по мнению ряда авторов (А.Н. Северцов, 1931; С.А. Северцов, 1936; Воронцов, 1960, 1982), соответствует слабой интенсивности отбора и медленным темпам эволюции. Однако другие авторы (Флинт, Головкин, 1964; Флинт, 1977) считают, что подобный тип динамики численности - исторически сложившаяся форма экологической адаптации к условиям существования в полупустынях. Подтвердить то или иное предположение можно, по нашему мнению, только при комплексном подходе к решению данной проблемы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Полевые данные (в том числе образцы для молекулярно-генетического анализа) собирались нами в 2005-2008 гг. Р-ны работ: Новосибирская обл.; Читинская обл.; Республика Хакасия, Республика Алтай (Чуйская и Курайская степи); Сев. и Вост. Казахстан; Юго-Вост. Монголия (стационар в р-не самона Баян-Унжул). В работе были использованы также образцы из других районов, предоставленные нашими коллегами.

В природе были проведены наблюдения с использованием радиотелеметрии (объекты и количество часов наблюдений см. в табл. 1). За зверьком наблюдали визуально, фиксируя особенности поведения и определяя местоположения и передвижение с помощью навигатора GPS. Траектории движения обрабатывались при помощи модуля «Animal movement» к программе Arcview 3.2.

В условиях содержания в вольерах (размером 2.20Ч1.90Ч1.50 м) при естественном световом и температурном режимах, наблюдения проводили в течение 13 месяцев (с июля 2005 г. по август 2006 г.). Количество часов наблюдений указано в табл.1. Регистрировали маркировочную активность: аногенитальную и маркировку среднебрюшной железой (СБЖ), умывания, чистки, чесания, кормовое поведение, все социальные взаимодействия (как агрессивные, так и мирные контакты, включая половое поведение). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0.

Лабораторные животные и их содержание. Работа была проведена на джунгарских хомячках, полученных от разведения особей, привезенных в 1986-1989 гг. из Минусинской котловины; хомячках Роборовского -- потомках зверьков, добытых в 1988-1989 гг. в Тувинской АССР и хомячках Кэмпбелла -- потомках особей, пойманных в 1986-1989 гг. в р-не г. Чойбалсан (юго-вост. Монголия). Эксперименты по изучению особенностей зимней биологии хомячков Кэмпбелла были проведены на особях, полученных от разведения пар, привезенных в 2004 г. из Центральной Монголии (р-он оз. Угий-Нур).

Зверьков содержали парами, а перед проведением ряда поведенческих экспериментов рассаживали в индивидуальные клетки. Световой режим (12С: 12Т) в помещении был инвертирован. Эксперименты проводили в течение первых 5 часов темной фазы. Зверьков кормили по стандартному рациону, разработанному в виварии ИПЭЭ РАН.

Эксперименты при естественных световом и температурном режимах проводили на экспериментальной базе Черноголовка (ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН) с 1994 по 2008 г. круглогодично. Животных содержали парами в помещении, защищенном от дождя и снега. Все поведенческие эксперименты выполняли в вечерние часы, в период максимальной активности животных в естественных условиях. Хомячки получали те же корма, что и при стандартном содержании в лаборатории.

Проведение молекулярно-генетического анализа. Всего проанализированы образцы от 79 особей трех видов, 68 зверьков были отловлены в природе, а 11 получены из лабораторных колоний ИПЭЭ РАН и Института зоологии при Университете Мартина Лютера (Галле, Германия). Нами были проанализированы образцы фактически со всей территории ареала хомячка Кэмпбелла и большей части джунгарского. Образцы тканей хомячка Роборовского были получены со значительной территории северной и центральной частей ареала вида.

В качестве основных молекулярных маркеров для изучения генетической изменчивости и филогеографии хомячков использовали последовательности генов цитохрома b (1143 н.п.) и тРНК треонина (67 н.п.), а также контрольный регион (860-862 н.п. для Ph. roborovskii и 938-944 н.п. для Ph. sungorus и Ph. campbelli) мтДНК. Образцы (мышечная ткань, ткани почки или печени, а для живых животных - ткани уха), фиксировались в 96%-м этаноле. Анализ выполнен на базе оборудования Кабинета методов молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН.

Для выделения ДНК применяли набор реагентов Diatom DNA Prep (OOO «Лаборатория Изоген», Россия) по инструкции производителя. Постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием наборов GenePak^TM PCR Core (OOO «Лаборатория Изоген») и Master Mix 2025 (ПКЗАО Диалат Лтд, Россия) согласно инструкциям производителя. Для амплификации генов цитохрома b и тРНК треонина (1) использовали праймеры glu_L14728 (Lebedev et al., 2007) и H15985 (Ohdachi et al., 2001; Lebedev et al., 2007); контрольного региона (2) - DL2 (Xie J., Zhang Z.,2005) и H00651 (Kocher et al., 1989; Xie J., Zhang Z., 2005). Условия реакции: I - 94 С: 3 мин; II - (94 °С: 45 с, отжиг праймеров -1 мин 20 с, 72 °С: - 1 мин 30 с) х 30 циклов; III - 72 °С: 3 мин; температура отжига: - 54 °С для (1) и 58 °С для (2). Очистку ПЦР продукта проводили высаживанием этанол-ацетатной смесью. Последовательность нуклеотидов определяли на анализаторах ABI Prism310 и AB 3130; набор реагентов и инструкция - BigDye Terminator v.3.1. (Applied Biosystems^TM).

Для каждого из двух амплифицированных участков определение проводили дважды - с постановкой реакции с прямым и обратным праймером. Совмещение полученных индивидуальных последовательностей и их выравнивание проводили с помощью программы BioEdit v.7.0.1 (Hall, 1999) с коррекцией вручную. Границы участков определяли выравниванием с представленными в базе данных GenBank последовательностями полного мтДНК генома ряда видов грызунов (Cricetulus, Mus, Rattus).

Для тех особей, для которых были получены последовательности обоих указанных участков (гены cyt b и tRNA-Thr и контрольный регион), эти последовательности объединяли и анализировали как единый локус. Математическую обработку результатов, включающую оценку гаплотипического (Н) и нуклеотидного (р) разнообразия, межгрупповые генетические дистанции, построение дендрограмм и медианных сетей гаплотипов проводили с помощью программ MEGA 3 (Kumar et al., 2004), Arlequin 2.000 (Schneider et. al., 2000), Network 4.500 (Bandel et al., 1999), PAUP*version 4.ob.10 (Swofford, 1998), MrBayes 3.04 (Huelsenbeck and Robquist, 2001). Для оценки отношений между гаплотипами были применены дистантные методы - Neighbor-Joining с использованием двухпараметрической модели Кимуры (NJ, K2P), метод максимальной экономии (maximum parsimony, MP) и анализ на основе Байесова подхода (Baysian phylogenetic analysis).

Все уникальные нуклеотидные последовательности (гаплотипы) депонированы в базе данных GenBank (№№ EF025538-EF025540; EU677431-EU677465).

Изучение тонкой структуры волос, кожи и кожных желез. Пробы волос брали с холки, СБЖ и подошв лап у представителей всех трех видов мохноногих хомячков (табл. 1). Их тщательно отмывали в шампуне, промеряли под микроскопом и бинокулярной лупой. Часть волос и вибриссы были изучены в сканирующем электронном микроскопе JSM 554-840 A (Япония), снабженном программно-аппаратным комплексом «MicroCapture/061016» (EDAX Inc.), что дало более полное представление об их структуре и позволило сопоставлять структуры при разных увеличениях (см. подробное описание методики -- Соколов и др., 1988). Микроскопирование фрагментов волос проводили под световым микроскопом «Ампливал» (VEB Carl Zeyss, Jena), а также «Leica DMLS с цифровой видеокамерой «Leica DMLS» (Германия) c использованием окуляра х10 и объективов х10; х40; х63. Изучали поверхность кутикулярного слоя, а также сердцевинный и корковый слои на поперечных и продольных срезах волос. Пробы специфических кожных желез брали у виварных особей, фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, окрашивали гематоксилин-эозином, по методу Ван-Гизона и Суданом черным B. Полученные препараты изучали под световым микроскопом, делали стандартные промеры и описывали структуру желез в сравнительном аспекте (см. подробное описание методик -- Соколов и др., 1988).

Определение массы специфических комплексов в углах рта (СЖК) в онтогенезе и бактериального состава секрета. Для характеристики развития СЖК нами проведены: 1) оценка общего вида и характера строения дополнительного мешочка (ДМ) СЖК (Ph. campbelli, Ph. sungorus) и секреторного поля СЖК (у трех видов); 2) взвешивание ДМ, секреторного поля и секрета СЖК (табл. 1).

Секрет СЖК собирали как от взрослых размножающихся и не размножающихся хомячков Кэмпбелла и джунгарских, так и от детенышей разного возраста Ph. campbelli. Секрет брали стерильной петлей и высевали «штрихом» на чашки Петри с питательной средой (см. методику по: Соколов и др., 1995; Ушакова и др., 2004; Феоктистова и др., 2004). Выросшие бактерии выделяли в чистом виде и идентифицировали стандартными методами (Bergey's Manual., 1984, 1986). Бактерии Microbacterium oxydans были выявлены по культурально-морфологическим свойствам, а также на основании данных филогенетического анализа последовательности гена 16S рРНК мтДНК и анализа состава клеточной стенки (Ушакова и др., 2004). Для определения процентного соотношения основных видов бактерий в секрете ДМ пробы секрета собирали стерильной петлей из ДМ животных и наносили тонким слоем на поверхность предметного стекла, мазок фиксировали над пламенем спиртовки и окрашивали карболовым генцианвиолетом в течение 2-3 мин. Краситель смывали водопроводной водой и высушивали мазок на воздухе. Исследование мазка проводили при увеличении х1250, а подсчет различных видов бактерий - в 10 полях зрения микроскопа (табл. 1).

Наблюдения за динамикой массы тела, особенностями размножения в разные сезоны года при содержании животных в условиях естественного светового и температурного режимов. Работа проводилась на научно-экспериментальной базе «Черноголовка» с 1994 по 2006 гг. Ежемесячно хомячков взвешивали на электронных весах с точностью до 0.1 г, регистрировали их общее состояние, изменения в шерстном покрове и интенсивность функционирования специфических кожных желез. Отмечали факт размножения животных, рост, развитие, созревание и уровень смертности детенышей (табл. 1).

Анализ гормональных изменений у взрослых животных и детенышей -самцов при содержании в условиях естественного светового и температурного режимов. Забор крови у взрослых самцов всех трех видов осуществляли один раз в месяц. У детенышей-самцов, рожденных в разные сезоны года, забор крови осуществляли в возрасте 35 дней (табл. 1). Кровь брали в одно и то же время суток, во избежание влияния суточных ритмов секреции гормонов на полученные результаты: объем 0.4-0.5 мл крови собирали из подъязычной вены по методике, разработанной в ИПЭЭ РАН (Graievskaya et al., 1986). Кровь центрифугировали 20 мин при 6000 об/мин. Плазму замораживали и хранили при - 18 С. Концентрацию тестостерона и кортизола определяли методом иммуноферментного анализа на твердых полистироловых пластинках с использованием наборов реагентов ИФА-тестостерон и ИФА-кортизол компании «Иммунотех» (Москва). Перекрестная реакция антител к тестостерону с другими стероидами составила 9% для 5-дигидротестостерона, 1% Ї для 11-гидрокситестостерона, 1% Ї для 5-андростан-3,17-диола, для всех остальных протестированных стероидов Ї менее 0.1%. Перекрестная реакция антител к кортизолу составила 6% для преднизолона, 0.9% Ї для 11-дезоксикортизола, 0.6% Ї для кортикостерона и менее 0.1% Ї для остальных стероидов. Все измерения проводили в парных вариантах для определения коэффициента вариации. Для анализа полученных данных использовали программу Statistica 6.0 (критерий Манна-Уитни).

Наблюдения за поведением животных в лабораторных условиях. Методы предъявления обонятельных сигналов. Использовали несколько методик предъявления образцов запаховых стимулов. В индивидуальных пластиковых или стеклянных трубочках, запаянных с одного конца; в камере типа «открытое поле»; в клетке, оборудованной для обучения животных (тест на определение порогов обонятельной чувствительности); в «домашней» клетке. Предъявления были одиночные и групповые. При предъявлении пахучих веществ анализировали различные формы поведения (см. Соколов и др. 1988; Васильева, 1990; Феоктистова 1994). Для определения гормонального ответа у экспериментальных особей через 30 мин после предъявления запахового сигнала собирали образцы крови (табл. 1).

Индивидуальное распознавание. Для экспериментального подтверждения возможности участия запаха секрета ДМ в индивидуальном распознавании у двух видов мохноногих хомячков нами использована методика, основанная на угасании исследовательского поведения при неоднократном предъявлении («знакомого») запахового стимула и восстановлении этой формы поведения при предъявлении нового («незнакомого») запаха (методика «habituation-discrimination») (Halpin, 1974). Тест проводили в течение 2 мин с момента первого подхода зверька к источнику запаха (подробнее см. также Феоктистова, 1994; Соколов, Феоктистова, Васильева, 1994) (табл. 1). Определение порогов обонятельной чувствительности. У взрослых самцов трех модельных видов определяли пороги обонятельной чувствительности к конкретным, значимым для этих животных запахам Ї запаху мочи эстральных самок. Методика и количество проведенных тестов указано в табл. 1. Сбор экскретов для предъявления в поведенческих тестах. Количество доноров для поведенческих тестов указано в табл.1. Физиологическое состояние самок определяли по картине вагинального мазка и в поведенческих тестах при ссаживании с самцами. Секрет СБЖ и ДМ собирали непосредственно перед предъявлением тестируемым хомячкам. Техника сбора была следующей: чистым ватным тампоном секрет собирали от 3-4 особей-доноров (в целях сведения к минимуму влияния индивидуальных характеристик на поведенческую реакцию реципиентов). Полученные 3-4 мг секрета разводили в 1 мл дистиллированной воды. Мочу для предъявления собирали накануне проведения эксперимента и хранили в холодильнике. Для сбора мочи особей-доноров помещали в индивидуальные метаболические клетки с сетчатым полом, под которыми находились листы чистого полиэтилена. Moчy собирали сразу после выделения. Для предъявления смешивали образцы, полученные от 3-4 особей-доноров, чтобы исключить возможного влияния индивидуального запаха. Анализ характера изменения внутренних органов после долговременной экспозиции запаха хищника. Самцов каждого вида делили на три группы (хомячков Роборовского - на две). Клетки с самцами хомячков первой подопытной группы (по 10 особей каждого вида, за исключением хомячков Роборовского) были размещены на расстоянии 1-1.5 м от клеток, в которых находились содержащиеся на мясной диете черные хори (Mustela putorius). Такое размещение обусловливало восприятие хомячками летучих компонентов естественных экскретов этих хищников. Клетки второй опытной группы размещали аналогично, но при этом на подстилку животным ежедневно наносили с помощью автоматической пипетки по 200 мкл мочи, собранной непосредственно перед предъявлением от двух-трех хорей. Таким образом, в дополнение к восприятию летучих компонентов всех экскретов, животным предъявляли нелетучие компоненты мочи хоря. (Для исключения влияния самой экспериментальной процедуры в клетки с хомячками первой опытной и контрольной групп ежедневно вносили эквивалентное количество воды). Клетки с животными контрольной группы были размещены на расстоянии 1.5 км от территории проведения опыта, что исключало влияние на них запаха хорей.

В процессе эксперимента зверьков еженедельно взвешивали. На 29 день у хомячков брали образцы крови, умерщвляли с помощью эфира и проводили взвешивание СБЖ, селезенки, тимуса, семенников, эпидидимиса и надпочечников с точностью 0.001 г. В Плазме крови определяли содержание гормонов Ї кортизола и тестостерона (см. выше) (табл. 1).

Таблица. 1. Общий объем исследованного материала и примененные методики

Глава 3. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЛОГЕОГРАФИЯ МОДЕЛЬНЫХ ВИДОВ - ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ П/СЕМ. CRICETINAE, РОДА PHODOPUS. РЕКОНСТРУКЦИЯ ИСТОРИИ ФОРМИРОВАНИЯ СОВРЕМЕННОЙ СТРУКТУРЫ РОДА

В соответствии с первой из поставленных в работе задач, основываясь на данных о полиморфизме мтДНК, нами было проведено исследование филогеографической структуры видов рода Phodopus. Кроме того, нами были сопоставлены два основных показателя разнообразия - генное (гаплотипическое) (H), дающее общую информацию о количестве и частоте встречаемости разных гаплотипов, независимо от уровня их различия между собой, и нуклеотидное () - взвешенной величины дивергенции между гаплотипами (уникальными последовательностями нуклеотидов) данной группы.

Характеристика гаплотипического и нуклеотидного разнообразия является одним из подходов при изучении демографической истории видов и популяций. (Avise, 2000).

Внутривидовая структура хомячка Роборовского. Для 19 особей хомячка Роборовского, отловленных в природе, и 3 особей из вивария ИПЭЭ РАН были получены данные о нуклеотидной последовательности гена цитохрома b и контрольного региона мтДНК, проанализированных как единый локус.

Все особи из вивария оказались идентичными по проанализированному участку и были исключены из оценки генетического разнообразия вида в естественных условиях. Для особей, отловленных в природе, было отмечено 17 гаплотипов.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Кладограмма гаплотипов объединенного участка мтДНК (2003 - 2004 н.п.) хомячка Роборовского. В узлах - значения индексов бутстреп поддержки по методам NJ, K2P (первое значение) и Мaximum Рarsimony (второе значение), после косой черты - значения вероятности, определяемые Байесовым подходом.

Топология полученных разными методами кладограмм отношений между гаплотипами хомячка Роборовского для объединенного участка мтДНК практически идентична и демонстрирует относительно высокую поддержку (вероятность существования) двух клад, объединяющих, 4 и 3 зверьков из разных точек ареала (гаплотипы OrN056, Idz002, BoN271, Alb006 - точки поимок 44є58'с.ш./100є38'в.д., 44є48'с.ш./97є19'в.д., 45є31'с.ш./99є10'в.д., 46є05'с.ш./95є36'в.д. и XaN003, Gob306, Chi305 - 48є17'с.ш./96є05'в.д., 43є30'с.ш./108є00'в.д., 43є57'с.ш./116є03'в.д. соответственно) и высокую поддержку клады, объединяющей особей из Зайсанской котловины (гаплотипы с обозначением «Zai») - рис. 1.

Последняя является крайней сев.-зап. точкой ареала вида, и ожидать наличия у обитающих здесь хомячков определенных генетических особенностей, связанных с пространственной удаленностью от основного ядра популяций, было бы естественно. Действительно, генетическая дистанция между группой хомячков из Зайсана и совокупностью особей из остальной части ареала довольно высока - 0.92%. Однако при этом на долю межгрупповых отличий приходится 46% общей видовой изменчивости, а на долю внутригрупповой, соответственно - 54%.

Следовательно, даже положение этой («Зайсанской») клады в общей системе вида также не является обособленным. Характер кладистических отношений между гаплотипами хомячка Роборовского по гену цитохрома b и контрольному региону, проанализированных отдельно и для большего числа животных, является практически идентичным таковому, отмеченному для объединенной нуклеотидной последовательности. Выраженной связи между положением остальных гаплотипов хомячка Роборовского на кладограмме и их географическим происхождением не обнаруживается.

Длина ветвей соединяющих отдельные гаплотипы пропорциональна количеству мутационных шагов. Обозначение гаплотипов: особи из Зайсанской котловины - серые круги, остальные - незакрашенные. В узлах с маркировкой «mv» расположены гипотетические гаплотипы, через которые мог происходить переход от одного гаплотипа в другой.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Медианная сеть расстояний между гаплотипами хомячка Роборовского по объединенному участку мтДНК (2003-2004 н.п.).

Медианная сеть гаплотипов, построенная методом median joining, также на основе объединенной последовательности мтДНК (рис. 2), наглядно демонстрирует отсутствие в рассмотренной выборке базальных, наиболее древних последовательностей, что позволяет предполагать заселение исследованной части ареала в относительно недавнее время потомками нескольких генетических линий хомячков, двигавшихся с юга (из Китая).

Сравнивая максимальную генетическую дистанцию между гаплотипами объединенного участка хомячка Роборовского (1.31%) и аналогичный параметр для гаплогрупп других видов рода, время независимого эволюционного развития (дивергенции) материнских линий хомячка Роборовского, ныне заселяющих исследованную часть ареала, можно оценить как 650-600 тыс. лет.

Показатели гаплотипического (H) и нуклеотидного () разнообразия данной выборки, по объединенному участку, по гену цитохрома b и контрольному региону мтДНК приведены в таблице 3. Подобное соотношение данных показателей, по современным представлениям (Avise, 2000), свидетельствует, что рассмотренные нами популяции в течение относительно короткого времени произошли от предковой с низким значением эффективной численности и в дальнейшем восстановили через мутации гаплотипическое разнообразие, но для восстановления высокого значения нуклеотидного разнообразия этого времени оказалось недостаточно. Высокий уровень гаплотипического разнообразия доказывает благополучное состояние популяций хомячка Роборовского на исследованной территории.

Внутривидовая структура хомячка Кэмпбелла. Для 25 особей хомячка Кэмпбелла получены данные о составе всех трех указанных выше участков мтДНК, проанализированных как по отдельности, так и как единый локус.

Всего в выборке животных, для которых получены данные последовательности (25 особей) отмечено 23 гаплотипа, из них 22 - у 24 особей, отловленных в природе.

Топология кладограмм отношений между гаплотипами хомячка Кэмпбелла, полученных разными методами и для разных участков, практически идентична. В первую очередь она показывает существование в пределах вида двух крупных гаплогрупп - клад с высоким уровнем поддержки (рис. 3). В одну из них - «Восточную», входят последовательности мтДНК хомячков, отловленных в востоку от горной системы Хангай, а во вторую («Западную») - пойманных, за единственным исключением, к западу от нее. В состав «Восточной» группы вошел и единственный гаплотип (Hp01Cvi), отмеченный у зверька из колонии ИПЭЭ, среди основателей которой были особи из Вост. Монголии (окр. г. Чойбалсан). Дистанция между двумя этими группами составляет более половины значения, характеризующего отличия двух видов рода Phodopus друг от друга (табл. 1). Принимая время межвидовой дивергенции в 0.8-1.0 млн лет (Neumann et al., 2006), время расхождения предковых форм двух данных филогенетических линий хомячка Кэмпбелла можно предположительно оценить как 450-550 тыс. лет. Третью группу («Кош-Агачскую») составляют два гаплотипа (KAg015 и KAg030), отмеченные у 3 из 7 особей, пойманных в Чуйской степи, и образующие кладу с высокой поддержкой и неопределенным положением на кладограмме (рис. 3). Дистанционно эти гаплотипы ближе к «Западной» группе (табл. 2), и метод NJ при некоторых алгоритмах расчета поддерживает их объединение в единый кластер с индексом бутстреп-поддержки 50-80. Другие использованные методы не подтверждают такое объединение. Однако факт существования этой линии, длительное время (предположительно 340-420 тыс. лет) эволюционировавшей независимо, на наш взгляд, сомнения не вызывает. В настоящее время зверьки, являющиеся носителями «Западной» и «Кош-Агачской» митохондриальных линий, образуют на территории Чуйской степи единую популяцию (рис. 4).

Указанные временные периоды дивергенции гаплогрупп хомячка Кэмпбелла приходятся на ледниковую эпоху. В это время на территории ареала вида сменяли друг друга ландшафтообразующие события, с высокой вероятностью приводившие к возникновению и исчезновению изолирующих географических барьеров. Район Чуйской степи заселялся хомячками Кэмпбелла - представителями ранее разделенных популяций - по крайней мере дважды.