Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Молекулярно-генетический анализ генофондов редких и исчезающих видов растений Пермского края

03.00.15 - генетика

Боронникова Светлана Витальевна

Уфа, 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермском государственном университете

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор Драгавцев Виктор Александрович, Агрофизический НИИ РАСХН

доктор биологических наук, профессор Янбаев Юлай Аглямович, Сибайский институт-филиал Башкирского государственного университета

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Путенихин Валерий Петрович, Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН

Ведущее учреждение: Институт общей генетики имени Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится «____»_______________200___г. в «___» часов на заседании Диссертационного совета ДМ 002.133.01 по адресу: г.Уфа, 450054, пр. Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН и на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН

Автореферат разослан «____»______________2009г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сохранение биологического разнообразия занимает особое место среди глобальных проблем современности (Вахрамеева, 1988; Конвенция о биологическом разнообразии..., 1992; Алтухов, 2004). Основой биологического разнообразия является его генетическая компонента. Сокращение видового и генетического разнообразия представляет реальную угрозу для биосферы, поскольку устойчивость воспроизводства природных экосистем и агроэкосистем непосредственно связана с их генетически обусловленным потенциалом к адаптациям к меняющимся условиям окружающей среды (Мэгарран,1992; Глазко, 1998; Лебедева и др., 1999, Жученко, 2001, Динамика популяционных генофондов..., 2004). К середине текущего столетия прогнозируется увеличение числа видов растений, исчезающих, с 7 до 60 тысяч (Frankel, 1995; Стратегия сохранения ..., 2004).

Впервые концепция о необходимости контроля и мобилизации мировых растительных ресурсов была разработана Н.И.Вавиловым, что легло в основу планомерной работы по созданию банков растительных ресурсов в разных странах. К настоящему времени в них собраны миллионы образцов, однако до сих пор нет универсальных принципов их отбора (Жученко, 2001). При изучении редких и исчезающих видов растений не всегда учитывается необходимость сохранения внутривидовой изменчивости, как на межпопуляционном, так и на внутрипопуляционном уровнях (Тихонова, 1985). Популяционный подход остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений, поскольку до сих пор отсутствуют общепринятые методы идентификации не только популяционных, но даже видовых особенностей генофондов. Анализ молекулярно-генетических маркеров полиморфизма белков и различных участков геномной ДНК позволил выявлять внутривидовое генетическое разнообразие, оценить гетерозиготность, реконструировать филогенетические взаимоотношения между видами и пространственные взаимосвязи между популяциями (Алтухов, 1975, 1995; Янбаев, 2007; Политов, 2007). В то же время, эффективность использования традиционных молекулярно-генетических маркеров (структурных генов, мини- и микросателлитных локусов) для исследований генофондов до сих пор остается достаточно низкой из-за ограниченности количества локусов, доступных для одновременного генотипирования особей. Это требует поиска новых подходов одновременного молекулярного маркирования многих геномных участков, которые могли бы позволить создавать «геномный портрет» каждого отдельного индивидуума и, таким образом, наиболее объективно оценивать своеобразие генофондов популяций. Особую важность разработка таких методов имеет для решения главной проблемы в поддержании биоразнообразия - отбора наиболее типичных представителей популяций и создания генетически обоснованных программ по их сохранению. К настоящему времени у редких эндемичных видов растений Урала изучен ряд характеристик внутривидовой изменчивости (Кучеров и др., 1987; Янбаев, 2007), но практически не исследована генетическая изменчивость травянистых реликтовых редких видов растений, в том числе и в Пермском крае.

Актуальность диссертационной работы обусловлена:

а) недостаточной теоретической разработанностью молекулярно-генетических подходов к изучению геномов дикорастущих редких видов растений, представленных популяциями с малой численностью;

б) важностью определения молекулярно-генетических основ генетического разнообразия редких и исчезающих видов растений на популяционном уровне;

в) отсутствием экспериментальных методов молекулярного маркирования многих участков геномов редких видов растений, пригодных для массового анализа;

г) недостатком методов для оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Цель работы - разработать принципы множественного молекулярно-генетического геномного маркирования и технологию идентификации и паспортизации генофондов редких реликтовых видов растений Пермского края в качестве модельной системы оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Подобрать наиболее полиморфные стабильные ДНК-маркеры и разработать методы оценки мультилокусного полиморфизма ДНК с целью оптимизации исследования генофондов популяций редких и исчезающих видов растений.

2. Исследовать генетическое разнообразие популяций некоторых редких реликтовых видов растений, распространенных на территории Пермского края.

3. Определить общую и эффективную численность популяций, способ размножения и семенную продуктивность некоторых редких реликтовых видов растений.

4. Установить популяции с типичными и специфическими характеристиками генофондов.

5. Разработать методику и провести молекулярно-генетическую паспортизацию (ключевого звена технологии идентификации генофондов популяций редких и исчезающих видов растений), на модельных редких реликтовых видах растений Пермского края.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее эффективным для оценки генетического разнообразия популяций редких и исчезающих видов растений является использование ДНК-фингерпринтинга (анализа полилокусных спектров) высоко полиморфных и стабильных ISSR- и IRAP-маркеров.

2. Оптимизация cохранения генофондов редких и исчезающих видов растений возможна с учетом показателей генетического разнообразия, установленных по результатам молекулярного маркирования множественных геномных участков, а также с обязательным учетом уровней внутри- и межпопуляционного разнообразия.

3. Для сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений рекомендуются отбор в природных условиях популяций и их групп как с наиболее типичными так и со специфичными характеристиками генофондов.

4. Для оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне необходима молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация генофондов редких и исчезающих видов растений, позволяющая на основании оценок полилокусного сочетания моно- и полиморфных участков ДНК составить молекулярно-генетическую формулу, штрих-код популяций и обобщить данные в виде генетического паспорта.

Научная новизна полученных результатов. Впервые разработана концепция идентификации генофондов редких и исчезающих видов растений с использованием оценок геномного распределения повторов, таких как микросателлиты и ретротранспозоны. Впервые получены и систематизированы данные о генетическом разнообразии популяций ряда редких реликтовых видов растений, произрастающих на территории Пермского края: адониса весеннего Adonis vernalis L., адониса сибирского Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., бубенчика лилиелистного Adenophora lilifolia (L.) A.DC., пиона уклоняющегося Paeonia anomala L., наперстянки крупноцветковой Digitalis grandiflora Mill. Впервые оценена эффективность в исследованиях генофондов редких видов растений IRAP-метода, основанного на использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве праймеров терминальных последовательностей ретротранспозонов. С целью анализа геномов редких реликтовых видов растений были клонированы и секвенированы последовательности ДНК 5 редких видов растений Пермского края. Нуклеотидные последовательности LTR ретротранспозонов изученных редких видов растений были секвенированы и включены в мировую базу генетических данных «GenBank» NCBI под номерами: EF191000-EF191012 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

С целью изучения взаимосвязи генетического разнообразия с показателями численности выявлены общая и эффективная численность популяций и изучены биологические особенности модельных реликтовых редких видов растений, такие как преимущественный способ опыления, способ и эффективность размножения. Даны характеристики изученных популяций с определением степени антропогенного воздействия в соответствии с рекомендациями, разработанными автором диссертационной работы. С целью оптимизации сохранения генофондов редких и нуждающихся в охране видов растений разработана методика молекулярно-генетической паспортизации на популяционном уровне, которая включает в себя анализ полиморфизма стабильных ISSR- и IRAP-маркеров, выявление идентификационных мономорфных (родовых и видовых) и полиморфных и уникальных ДНК-маркеров, составление молекулярно-генетической формулы, штрих-кода и генетического паспорта. На основании полученных данных рекомендованы научно обоснованные меры сохранения генофондов изученных редких реликтовых видов растений и разработаны подходы оптимизации сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений.

Практическая значимость и реализация результатов исследований. Использование ретротранспозонов для анализа геномов открывает новые возможности изучения организации и функционирования геномов редких и исчезающих видов растений, являющихся наиболее уязвимым звеном в растительных сообществах, выявления механизмов их устойчивости. Поддержание исторически сложившегося уровня генетического разнообразия популяций как основы сохранения их адаптационного потенциала в естественно колеблющейся и антропогенно трансформированной среде является необходимым условием их существования и развития. Изучение генетической изменчивости природных популяций, оценка их состояния позволяют рекомендовать научно обоснованные меры сохранения популяций редких видов растений.

Разработанная технология идентификации генофондов и ее ключевое звено (методика молекулярно-генетической паспортизации) позволяют оптимизировать сохранение генофондов растений, включая редкие и исчезающие виды растений. Научные выводы работы и рекомендации непосредственно используются при проведения мониторинга популяционного разнообразия редких и исчезающих видов растений Пермского края, так как автор диссертационной работы является куратором 5 редких реликтовых видов растений от Управления по охране окружающей среды Пермского края. На основании анализа динамики показателей численности и генетического разнообразия бубенчик лилиелистный (Adenophora lilifolia (L.)А.DC.) внесен в Красную книгу Пермского края (2008). Результаты и выводы исследований могут быть использованы для сохранения генофондов редких и исчезающих видов растений и оптимизации сохранения генетического разнообразия на популяционном уровне и в других регионах страны.

Теоретические и практические результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам Новосибирского, Уральского, Челябинского и Пермского государственных университетов, а также Калининградского технического университета, что подтверждено справкой и 4 актами внедрения результатов исследований в учебный процесс.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнялась в ходе подготовки и реализации ПГУ приоритетного инновационного национального проекта «Образование» в части «Молекулярная генетика». Популяционно-генетические исследования были частично связаны с последовательным циклом программ Управления по охране окружающей среды Пермской области (2006 г): гос. контракты № 6/2006 от 03.04.2006, № 90203 от 10.04.2006, № 90202 от 01.06.2006, № 90211 от 01.06.2006; а также Министерства градостроительства и развития инфраструктуры Пермского края: гос. контракты № 65-О от 20.06.2007, № 56/1-О от 13.06.2007, № 11-О от 18.02.2008, № 43-О от 17.03.2008.

Часть исследований проводились в связи с тематикой гранта РФФИа_2006урал № 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2006-2009 гг.), гранта РФФИа_2006урал №07-04-96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2006-2009 гг.), гранта РФФИ АНФ_з №08-04-92673 «Участие в российско-австрийском семинаре «Молекулярно-генетические маркеры, филогеография и популяционная генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская перспектива» (2008-2009 гг.).

Личный вклад автора. Разработка подходов и программы молекулярно-генетических исследований; выбор типов молекулярных маркеров и объектов исследований; планирование, организация и проведение полевых и лабораторных исследований; обработка, обобщение и интерпретация представленных в диссертационной работе результатов, их сопоставление с литературными сведениями, разработка теоретических положений; подготовка практических рекомендаций и публикаций, написание и оформление текста диссертации проведены лично автором работы. Идея создания концепции идентификации генофондов, разработка методики молекулярно-генетической паспортизации, выявление мономорфных и полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, а также составление молекулярно-генетической формулы и молекулярно-генетического паспорта единолично принадлежат автору диссертационной работы. Для гетерогенных природных популяций растений диссертантом предложена запись молекулярно-генетической формулы в виде штрих-кода. Автор диссертационной работы является инициатором и одним из соавторов обоснования внесения Adenophora lilifolia (L.) А.DC. в Красную книгу Пермского края (2008) с категорией угрожаемого состояния 3 (R) - редкий вид. Результаты части исследований, проведенных совместно с соискателями и аспирантами диссертанта, опубликованы. Ссылки на них приведены в соответствующих разделах работы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на Втором республиканском совещании семинаре «Содержание и формы экологического образования в педвузе» (Пермь, 1990), IX Всесоюзном совещании по семеноведению интродуцентов «Репродуктивная биология интродуцированных растений» (Умань, 1991), межвузовской научной конференции «Охраняемые природные территории. Проблемы выявления, исследования, организации систем» (Пермь, 1994), 2 Международной научно-практической конференции «Экология и охрана окружающей среды» (Пермь, 1995), симпозиуме «Проблемы репродуктивной биологии растений» (Пермь, 1996), V научной конференции памяти проф. А.А.Уранова «Популяции и сообщества растений: экология, биоразнообразие, мониторинг» (Кострома, 1996), популяционном семинаре «Жизнь популяций в гетерогенной» (Йошкар-Ола, 1998), XI съезде Русского ботанического об-ва «Ботанические исследования в азиатской России» (Барнаул, 2003), Proceedings of the IV Balkan Botanical Congress (Sofia, 2006), YII Международном симпозиуме «Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования» (Белгород, 2006), Всероссийской научной конференции «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале» (Саратов, 2006), Международной конференции «Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН» (Москва, 2006), Международной научно-практической конференции «Антропогенная динамика природной среды» (Пермь, 2006), IY Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008), Международной научно-практической конференции «Нанобиотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008), Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации. Диссертантом по теме диссертации опубликовано 64 научные работы, в их числе 12 статей в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК, 10 статей в других журналах, 29 статей в материалах конференций, 1 учебно-методическое пособие и 2 монографии, в одной из которых диссертант является соавтором. Общий объем публикаций 562 страницы, из которых лично автору диссертационной работы принадлежат 349 страниц.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав - обзор проблемы, объекты и методы исследований, 5 глав результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы включает 306 источников, в том числе 163 отечественных и 143 иностранных. Диссертационная работа изложена на 366 машинописных страницах, содержит 45 таблиц, 50 рисунков и приложения.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность за помощь при обучении, повышении квалификации, освоении современных методов молекулярно-генетического анализа, подготовке диссертационной работы и консультации с.н.с. лаборатории гетерозиса растений ИЦиГ СО РАН В.И. Коваленко и зав. лабораторией академику РАН В.К. Шумному, академику РАЕН, РАСХН (иностранный член) В.И. Глазко и проф. Т.Т. Глазко; проф. каф. ботаники и генетики растений ПГУ В.А.Верещагиной, Н.В. Москвиной, зав. кафедрой ботаники и генетики растений ПГУ проф. С.А. Овеснову; сотрудникам группы проф. С.А. Гостимского (особенно с.н.с. З.Г. Кокаевой) и всей кафедре генетики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проф. А.Х. Шульману и доц. Р.Н. Календарю; зав. лабораторией популяционной генетики ИОГен имени Н.И.Вавилова РАН д.б.н. Д.В. Политову. Выражается искренняя благодарность соавторам по публикациям, а также всем, кто поддерживал и поддерживает развитие молекулярно-генетических исследований в ПГУ.

Основное содержание работы

1. Состояние проблемы охраны генофондов редких видов растений

Представлен обзор существующих проблем охраны генофондов редких, в том числе реликтовых видов растений. Показано значение генетического разнообразия как одного из основных компонентов биологического разнообразия. Проанализировано использование изоферментных и ДНК-маркеров в популяционно-генетических исследованиях редких и исчезающих видов растений, при этом особое внимание уделено исследованиям сохранения генофондов редких реликтовых травянистых видов растений. Проведен анализ проблемы выявления объектов сохранения генетического разнообразия и методик генетической паспортизации организмов. Особое внимание уделено штрих-кодированию живых организмов, включая подход, разработанный в Институте биохимии и генетики УНЦ РАН (Чемерис и др., 1999). На основании анализа литературных данных разработаны цель, основные задачи и программа исследований.

2. Объекты и методы исследований

В качестве основных объектов исследований избраны 5 реликтовых редких видов растений, произрастающих в Пермском крае: адонис весенний Adonis vernalis L. и адонис сибирский Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. из семейства Ranunculaceae, наперстянка крупноцветковая Digitalis grandiflora Mill. из семейства Scrophulariaceae, пион уклоняющийся Paeonia anomala L. из семейства Paeoniaceae, бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC. из семейства Campanulaceae с категорией угрожаемого состояния 3 (R) (Горчаковский и др., 1982; Красная книга Среднего Урала, 1996; Красная книга Пермского края, 2008). Эти виды являются реликтами (Белковская и др., 1988; Камелин и др., 1999). Проведены комплексные исследования 27 природных популяций (82 выборки) редких видов растений. Для изучения генетического разнообразия A. vernalis из разных частей Кунгурской островной лесостепи избраны 10 популяций, в том числе самая северная популяция Av2, расположенная на Спасской горе в Кунгурском районе. На территории Ординского района находятся 4 популяции: Av1, Av3, Av4 и Av10, в Уинском районе - одна (Av7). Южная группа представлена популяциями Октябрьского района: Av5, Av6, Av8 и Av9. Для анализа генетического разнообразия A. sibirica избраны 3 популяции из разных частей Пермского края: As1 из центральной (Добрянский район), As2 - из юго-западной (Кишертский район), а As3 - из северной части (Ильинский район). Первая популяция Ad. liilifolia (Ad.lil.1) приурочена к северному участку островной Кунгурской лесостепи. Вторая (Ad.lil.2) и третья (Ad.lil.3) популяции находятся в юго-западной, а четвертая (Ad.lil.4) - в северной части края. Для изучения динамики численности и генетического разнообразия D. grandiflora были избраны 5 популяций в разных районах Пермского края: первая (Dg1) расположена в Кишертском районе, вторая (Dg2) - на Спасской горе Кунгурского района, 3 популяции (Dg3, Dg4, Dg5) - в Октябрьском районе. Популяции P. anomala находятся в центральной части Пермского края: Ра1 в Чусовском, Ра2 в Добрянском, а Pa3 в Губахинском районах. Для апробации ISSR- и IRAP-методов анализа полиморфизма ДНК помимо редких видов растений были использованы широко распространенные как травянистые (зверобой продырявленный Hypericum perforatum L., зверобой пятнистый Hypericum maculatum Crantz) так и древесные (тополь дрожащий или осина Populus tremula L.) виды растений.

Разработка методики молекулярно-генетической паспортизации редких видов растений с целью оптимизации сохранения их генофондов проведена на примере двух видов рода Adonis (A. vernalis, A. sibirica) (Боронникова, 2008), а ее апробация - на примере как редких так и широко распространенных видов растений рода Adenophora (бубенчик лилиелистный Adenophora lilifolia (L.) A.DC., бубенчик трехлистный Adenophora triphylla A.DC.), рода Digitalis (наперстянка крупноцветковая Digitalis grandiflora Mill., наперстянка пурпуровая Digitalis purpurea L., наперстянка ресничатая Digitalis ciliata Trautv., наперстянка шерстистая Digitalis lanata Ehrh., наперстянка желтая Digitalis lutea L.).

Полевые исследования проводились с использованием традиционных методов, применяемых в ботанике, молекулярной и популяционной генетике. С 1988 по 2005 гг. проведены исследования биологических особенностей избранных для изучения редких видов растений, подсчет общей (Голубев и др., 1978; Денисова и др., 1986), и эффективной численности или эффективного размера их популяций (Вахрамеева, 1981; Хедрик, 2003; Алтухов, 2004) и его состава посредством определения семенной продуктивности особей разных возрастных групп генеративного периода (Работнов, 1960; Вайнагий, 1973), а с 1994 по 2009 гг. - молекулярно-генетический анализ генофондов (Chalmers, 1992; Алтухов, 1995, 2003; Хедрик, 2003; Артюкова и др., 2004; Динамика популяционных генофондов..., 2004). Определение степени антропогенного воздействия на изученные популяции редких видов растений проведено в соответствии с рекомендациями С.В. Боронниковой (2008). Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны листья с 30 случайно выбранных растений в каждой популяции на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Торрес (Torres et al., 1993) с незначительными модификациями. Навеска фрагментов свежесобранных листьев для одной пробы ДНК составляла 100 мг. С целью молекулярно-генетического анализа ДНК выделена из более 1520 образцов листьев редких видов растений, а так же с целью молекулярно-генетической паспортизации дополнительно из 1240 образцов проростков, почек возобновления и листьев. Анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК, включая основные его стадии, проведен в молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГУ с использованием ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats) (Zietkiewicz et al., 1994) и IRAP- (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) (Kalendar et al., 1999) методами с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). С целью разработки праймеров для IRAP-анализа полиморфизма ДНК в лаборатории растительной геномики Института биотехнологии университета Хельсинки (Финляндия) проведены клонирование и секвенирование последовательностей ДНК 5 редких реликтовых видов растений Пермского края. Клонирование последовательностей ретротранспозонов осуществляли с помощью нового универсального метода (Kalendar et al., 2008), основанного на использовании ПЦР с праймерами из консервативного участка связывания tRNA (PBS, Primer Binding Site), непосредственно прилегающего к левому прямому повтору LTR (Long Terminal Repeats) в центральной части ретротранспозона. Все ПЦР продукты амплификации с универсальными PBS праймерами были клонированы в pGEM-T (Promega, США) плазмидный T-вектор после очистки в QIAGEN «MinElute PCR Purification Kit». Лигирование проводили при 16°C в течение 12 часов. Трансформацию плазмидной ДНК со вставками осуществляли с использованием компетентных клеток E.coli штамма JM109 (Promega). Клетки, несущие плазмиду со вставкой фрагмента чужеродной ДНК, были выявлены путем бело-синей селекции на среде с ампициллином в конечной концентрации 100мкг/мл, X-Gal (20мг/мл) и IPTG (200мг/мл). Проверка pGEM вектора на наличие клонированных ПЦР продуктов проведена с помощью ПЦР с универсальными pUC праймерами (M13 universal и reverse). Секвенирование последовательностей ДНК проведено с использованием капиллярного секвенатора ABI3700 (Biosystems, USA). В соответствии с консервативными участками LTR ретротранспозонов в различных ориентациях были разработаны праймеры с использованием программы «FastPCR» (Календарь и др., 2007). Для IRAP-анализа 5 редких видов Урала синтезированы 70 праймеров в MWG (Германия). Амплификация ДНК IRAP- и ISSR-методами была выполнена в термоциклерах «MJ Mini-Cycler» («Bio-Rad», USA) и «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва) по типичным для IRAP- и ISSR-методов программам. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймера варьировала при IRAP-анализе от 55° до 68°С, а при ISSR-анализе - от 56° до 60°С. Для проверки достоверности полученных спектров ДНК опыт повторяли не менее четырех раз. Амплифицированные продукты были подвергнуты электрофорезу на 1.7-2% агорозном геле в присутствии бромистого этидия. Гели были отсканированы в системе гель-документации «Gel-Doc XR» («Bio-Rad», USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp +1.5 + 3 Кb DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва) и программу «Quantity One» («Bio-Rad», USA). С целью разработки IRAP-метода проанализирован полиморфизм геномных участков 5 редких реликтовых видов растений с использованием 70 IRAP-праймеров. Эффективность выявления полиморфизма IRAP-праймерами рассчитана для A. vernalis, A. sibirica, Ad. lilifolia, D. grandiflora, P. anomala в соответствии со шкалой 1-5: от низкой (1) до высокой (5). У 4 -х редких реликтовых видов растений Пермского края проведен анализ полиморфизма 350 ISSR- и 450 IRAP-маркеров, том числе 219 IRAP-маркеров у 2 видов рода Adonis.

Для количественной оценки степени полиморфизма и определения уровня дивергенции между изученными популяциями, полученные данные были представлены в виде матрицы бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в ISSR- и IRAP-спектрах одинаковых по размеру фрагментов рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, изменчивость по интенсивности не брали в расчет. Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программы «PopGen32» и специализированного макроса «GenAlEx6» для «MS-Excel» с определением: доли полиморфных локусов (при ), общего числа аллелей (), эффективного числа аллелей () (Kimura еt al., 1964), ожидаемой гетерозиготности () (Nei, 1987). Уровень внутрипопуляционного разнообразия оценен через показатели среднее число морф (м) и доля редких морф () (Животовский, 1980). Объемы использованных выборок в среднем составляли 30 особей. Оценку отклонения наблюдаемых распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга проводили с использованием теста . Оценка генетического разнообразия внутри и между популяциями редких видов растений проведена с использованием информационной мера Шеннона (Schennon, 1949; Chalmers, 1992), которая не предусматривает существование в популяциях равновесия Харди-Вайнберга и традиционно применяется (Артюкова и др., 2004) при молекулярно-генетическом анализе редких видов растений. Индекс разнообразия Шеннона рассчитывали для каждой популяции (), среднее значение для популяций () и для суммарной выборки (), на основе этих значений определяли долю внутри- и межпопуляционного разнообразия. Для описания генетической структуры подразделенной популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций () (Nei, 1975). Генетическое расстояние между популяциями определяли по формулам M.Нея (Nei, 1978; Nei et al., 1979). На основе матриц бинарных признаков были рассчитаны матрицы генетических различий (Nei, 1972), на основании полученной матрицы невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-grup method using arithmetic average) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых популяций по ISSR- и IRAP-спектрам при помощи компьютерных программ «Treecon 1.3b» и «PopGen32». Молекулярно-генетическая паспортизация проведена по методике С.В.Боронниковой (2008). Проверка всех выявленных идентификационных молекулярных маркеров у всех исследованных видов проведена не менее 5 раз. Стандартные статистические анализы выполнены при помощи программ “STATISTICA 6.0” (версия 6.0.) и «MS EXCEL». Статистическая обработка данных молекулярно-генетического анализа проведена с использованием стандартных для популяционно-генетических исследований методов (Животовский, 1983, 1990; Лакин, 1990).

3. Биологические особенности редких реликтовых видов растений и характеристика избранных для изучения популяций

Adonis vernalis L. В Пермском крае отмечено 19 местонахождений A. vernalis. За последние 15 лет общая численность этого вида сократилась на 20-25% (Боронникова, 2008). Показано, что основной вклад в семенное размножение A. vernalis вносят средневозрастные генеративные особи (), составляющие эффективную численность популяций. Установлено, что к популяциям с низкой общей численностью относятся Av3, Av6, Av7, Av8, Av10 (от 39 в Av7 до 184 особей в Av6), а к популяциям с высокой общей численностью - Av1,Av2, Av4, Av5, Av9 (от 248 в Av2 до 562 особей в Av1). Нами установлено, что в изученных популяциях A. vernalis с низкой общей численностью эффективная численность варьировала от 8 (Av7) до 64 особей (Av6), а в популяциях с высокой общей численностью эффективная численность - от 99 (Av4) до 194 (Av9) особей. Популяции Av3 , Av6, Av7 и Av10 находятся под антропогенным воздействием сильной степени, популяции Av, Av2, Av5 и Av8 - средней, а Av4 и Av9 - слабой степени.

Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. В Пермском крае выявлено 16 местонахождений A. sibirica. Размножение этого вида в естественных условиях происходит только семенным путем. Установлено, что как и у A. vernalis, так и у A. sibirica принимают участие в семенном размножении преимущественно средневозрастные генеративные особи (). Общая численность в As1 составила 22 особи, в As2 - 246, в As3 - 257 особей. В As1 к настоящему времени эффективная численность равна 3 особям, в As2 и As3 - 89 и 77 особям соответственно. C 1994 по 2008 гг. из-за строительства горнолыжной трассы общая численность As1 сократилась на 75.00 %, а эффективная численность - на 85.71% (рис. 1). Исследованные популяции находятся под антропогенным воздействием As1 сильной, As2 средней и As3 слабой степени.

Paeonia anomala L. В северной части Пермского края P. anomala представлен популяциями с большой стабильной численностью. В центральной части края из-за антропогенного воздействия численность популяций сокращается. Общая численность Pa2 в 1988 составляла 562 особи (Боронникова, 2002), а в 2008 году - 377 особей, то есть за 20 лет сократилась на 41.04%. Эффективная численность популяции за этот же период сократилась с 402 до 224 особей, то есть на 44.28% (рис. 1). Одной из причин сокращения показателей численности Pa2 является усиление антропогенного воздействия в связи со строительством новой автомобильной трассы в 1 км от Pa2. В Pa1 общая численность составила 957, а эффективная - 190 особей. В Pa3 общая численность составила 441 особь, а эффективная численность - 146 особей. По нашим данным в природе P. anomala размножается только семенным путем (Боронникова, 2002). Нами установлено, что в семенном размножении у P. anomala принимают участие особи g₂ , редко g₃. Изученные популяции находятся под антропогенным воздействием средней степени, кроме Pa2, которая испытывает антропогенное воздействие сильной степени.

Рис. 1. Динамика общей и эффективной численности первой популяции (As1) A. sibirica и второй популяции (Pa2 ) P. anomala

Adenophora lilifolia (L.) A.DC. Общая численность вида в крае сократилась за последние 10 лет в среднем на 15-20% (Боронникова, 2008). В изученных популяциях Ad. lilifolia этот показатель варьировал от 59 особей в Ad.lil.4 до 293 особей в Ad.lil.1, а эффективная численность - от 36 в в Ad.lil. 4 до 239 особей в Ad.lil.1. По нашим данным размножение вида в природе осуществляется и семенным и вегетативным, то есть комбинированным способом (Боронникова, 1999). Наибольший вклад в семенную продуктивность вносят особи g₂ и g₃, которые и определяют эффективную численность популяций. Сильную степень антропогенного воздействия испытывает популяция Ad.lil.4, среднюю - Ad.lil.1, а слабую - Ad.lil.2 и Ad.lil.3.

Digitalis grandiflora Mill. D. grandiflora на территории Пермского края встречается, в основном, в островной Кунгурской лесостепи, где и отмечено 12 местонахождений этого вида. Общая численность изученных популяций D. grandiflora варьировала от 56 (Dg3) до 487 особей (Dg1), а эффективная - от 40 до 304 особей соответственно. Для вида характерен комбинированный (семенной и вегетативный) способ размножения. При анализе показателей семенной продуктивности особей D. grandiflora разных возрастных групп генеративного периода было отмечено, что у средневозрастных особей показатели выше, чем у особей остальных групп (Боронникова, 2009б). Эффективная численность у данного вида представлена особями g₂ и g₃. Изученные популяции D. grandiflora находятся под антропогенным воздействием сильной (Dg3), средней (Dg1, Dg2) и слабой степени (Dg4, Dg5).

Таким образом, избранные для изучения 5 редких реликтовых видов представлены в Пермском крае, кроме P. anomala, небольшим числом сравнительно малых по численности популяций. Три из изученных видов (A. vernalis, A. sibirica, P. anomala) размножаются только семенным путем. Для Ad. lilifolia и D. grandiflora характерен комбинированный (и семенной и вегетативный) способ размножения. Эффективная численность популяций выявлена благодаря изучению участия в семенном размножении особей разных возрастных групп генеративного периода. Самые низкие значения данного показателя характерны для видов рода Adonis (3 особи у A. sibirica и 8 особей у A. vernalis), а самые высокие - для P. anomala (от 146 до 224 особей).

Анализ генофондов редких видов растений на основании оценок полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными микросателлитными повторами (ISSR-PCR маркеры)

Анализ генетического разнообразия популяций двух видов рода Adonis. В изученных популяциях A. vernalis выявлено 109 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 100 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 19 (М9) до 29 (М12). В среднем при ISSR-анализе у A. vernalis один праймер инициировал синтез 22 фрагментов ДНК. Число полиморфных ISSR-фрагментов A. vernalis варьировало от 16 до 29, а их размеры - от 210 до 1900 пн (рис. 2).

мультилокусный полиморфизм популяция растение

Рис. 2. ISSR-спектр популяции A.vernalis (Аv1) c праймером М1: цифрами обозначены номера проб, М - молекулярный маркер, стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты ДНК

Доля полиморфных локусов в общей выборке в среднем (при ) составила 91.74%. В популяциях данный показатель варьировал от 34.86% в Av2 до 62.39% в Av6. Ожидаемая гетерозиготность A. vernalis по локусам равна 0.313. Этот показатель самый высокий в Av4 (0.242), а низкий - в Av2 (0.147) (Боронникова и др., 2007; Боронникова и др., 2008). Абсолютное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент ДНК) на общую выборку составило 1.973, а эффективное число аллелей на локус () - 1.521. Число редких аллелей (фрагментов ДНК с частотой <=0,05) варьировало по популяциям от 0 (Av4) до 8 (Av6).

Генетическая структура изученных популяций A. vernalis: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции выше (=0.313), чем в субпопуляциях (=0.184). Коэффициент подразделенности популяций () показывает, что на межпопуляционную компоненту генетического разнообразия A. vernalis приходится 41.22% разнообразия, то есть изученные популяции сильно дифференцированы (Боронникова и др., 2009г). Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями A. vernalis отмечено между Av2 и Av6 (0.109), а наиболее генетически удаленными являются популяции Av1 и Av4 (0.305). На дендрограмме (рис. 3) популяции A. vernalis сформировали 3 кластера по 2 выборки, соответствующие исследованным популяциям. Узлы ветвления имеют высокую поддержку (индекс бутстрепа >50%).

Рис. 3. UPGMA дендрограмма генетического сходства популяций, построенная на основании полиморфизма ISSR-маркеров A.vernalis. Шкала сверху - генетические дистанции. На дендрограмме указаны значения бутстрепа (в %)

Среднее значение индексов разнообразия Шеннона () в изученных популяциях A. vernalis, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.278. Выше этот показатель в Av4. Индекс разнообразия Шеннона, рассчитанный на общую популяцию A. vernalis, равен 0.477. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. vernalis приходится 58.40%, а на долю межпопуляционного - 42.60%. Итак, оба подхода к определению генетического разнообразия, то есть определение показателя подразделенности популяций () и коэффициента разнообразия Шеннона () у A. vernalis дали близкие результаты.

Таким образом, самые высокие показатели генетического разнообразия отмечены в популяциях Октябрского района (Av4, Av5, Av6), а самые низкие показатели - в самой северной популяции на Спасской горе (Av2). Высокое число редких аллелей в Av2 (=7) указывает на необходимость сохранения данной популяции в качестве генетически уникальной.

Полиморфизм структурных элементов генома A. sibirica был выявлен с использованием тех же ISSR-праймеров, что и у A. vernalis. В трех изученных популяциях A. sibirica ISSR-праймеры инициировали синтез меньшего, чем у A. vernalis, числа ампликонов, равного 74, из которых 66 были полиморфными ( =89.19%). Размеры ампликонов в A. sibirica варьировали от 270 до 1620 пн. В среднем при ISSR-анализе у A. sibirica один праймер инициировал синтез 14.8 фрагментов ДНК, что значительно меньше, чем у A. vernalis (22 ампликона). Высокий процент полиморфизма ISSR-маркеров отмечен в As3 (=81.08%), а самый низкий - в As1 (=35.13%). Низкие значения ожидаемой гетерозиготности () отмечены в As1 (0.142), а высокие - в As2 (0.243). В общей популяции A. sibirica ожидаемая гетерозиготность выше и составила 0.356. Абсолютное число аллелей на локус на общую выборку A. sibirica составило 1.914. Этот параметр выше в As2 и ниже в As1. Эффективное число аллелей на локус () на общую популяцию составило 1.608. Наибольшее значение данного показателя отмечено в As3 (1.409), а его резкое снижение - в As1 (1.257). Наибольшее число редких аллелей отмечено в As3 (=11). Редкие аллели отсутствуют в As1, что свидетельствует об обеднение генофонда этой популяции. Генетическая структура популяций A. sibirica такова: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов выше в общей популяции (=0.334), чем в субпопуляциях (=0.214). Показатель генетической подразделенности популяций () A. sibirica равен 0.358. Генетически более гетерогенна As3 (=81.08%; =0.235; =1.409), а наименьшие основные показатели генетической изменчивости отмечены в As1 (=35.13%; =0.145; =1.257). Таким образом, на межпопуляционную изменчивость у A. sibirica приходится 35.77% генетического разнообразия. Наибольшее генетическое расстояние отмечено между As2 и As3 (0.290), а наименьшее между As1 и As2 (0.166). Кластерный анализ показал, что As1 генетически ближе к As2. Третья популяция (As3) находится на большем генетическом расстоянии от первых двух популяций и характеризуется наименьшей степенью родства с ними. Среднее значение индексов разнообразия Шеннона () в изученных популяциях A. sibirica, рассчитанные по ISSR-праймерам, составило 0.292. Выше этот показатель в As3. Индекс Шеннона, рассчитанный на общую популяцию A. sibirica, равен 0.504. На долю внутрипопуляционного генетического разнообразия A. sibirica приходится 59.55%, а на долю межпопуляционного - 40.45% разнообразия.

Таким образом, молекулярно-генетический анализ двух видов рода Adonis показал, что полиморфизм ISSR-маркеров высок у обоих видов (91.74% у A.vermalis и 89.19% у A. sibirica). У A. vernalis большая часть генетической изменчивости (по данным G-статистики) является внутрипопуляционной (58.78%), на межпопуляционную изменчивость приходится 41.22 % генетического разнообразия. У A. sibirica сохраняется та же тенденция: внутрипопуляционная изменчивость составляет большую часть (64.20%), на межпопуляционную изменчивость данного вида приходится 35.77% генетического разнообразия. Среди изученных популяций A. vernalis тенденция к обеднению генофонда отмечена в Av2 (=34.86%; =0.122; =1.199; =7) и Av3 (=40.37%; =0.139; =1.125). Среди изученных популяций A. sibirica деградация генофонда выявлена у As1 (=35.13%; =0.145; =1.257). Данная популяция находится в критическом состоянии и требует экстренных мер охраны.

Анализ генетической изменчивости Adenophora lilifolia (L.) A.DC. У Ad. lilifolia, выявлено 56 амплифицированных ISSR-фрагментов ДНК, из которых 46 были полиморфными. Число амплифицированных фрагментов ДНК в общей выборке растений варьировало в зависимости от праймера от 9 (праймеры М8, Х10) до 15 (праймер М1), а их размеры - от 279 до 1370 пн. В среднем один праймер инициировал синтез 11 фрагментов ДНК. Доля полиморфных локусов в общей выборке в зависимости от ISSR-праймера колебалась от 75.00% до 90.91% и, в среднем, составила =82.14 %. Данный показатель выше в Ad.lil.1 и ниже в Ad.lil.4. Ожидаемая гетерозиготность по локусам Ad. lilifolia составила 0.228. Абсолютное число аллелей на локус равно 1.930, а эффективное число аллелей на локус () - 1.412. Ожидаемая гетерозиготность выше в Ad.lil.3 и значительно ниже в Ad.lil.4. Абсолютное число аллелей () на локус выше в Ad.lil.1, а эффективное число аллелей на локус () и ожидаемая гетерозиготность () выше в Ad.lil.3. Наименьшие значения эти показатели имеют в Ad.lil.4. Ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на общую популяцию Ad. lilifolia () составила 0.270; а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляциях () равна 0.228. Итак, среднее выборочное генетическое разнообразие по популяциям ниже, чем общее генетическое разнообразие в общей популяции. Коэффициент подразделенности популяций () показал, что на межпопуляционную компоненту Ad. lilifolia приходится 15.51% разнообразия (Боронникова, 2009г).

Таким образом, при молекулярно-генетическом анализе Ad. lilifolia установлено, что доля полиморфных локусов и абсолютное число аллелей выше в Ad.lil.1, а эффективное число аллелей и ожидаемая гетерозиготность - в Ad.lil.3. Все выше перечисленные показатели генетического разнообразия достоверно ниже в Ad.lil.4.