Механизмы формирования и сохранения условных рефлексов у виноградной улитки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механизмы формирования и сохранения условных рефлексов у виноградной улитки

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Известно, что консолидация памяти проходит через несколько фаз (Milner B. et al., 1998; McGaugh J.L., 2000). Если в кратковременную и промежуточную (по предложению некоторых авторов) фазы она является лабильной и в это время может наступить амнезия в результате воздействия целого ряда агентов, то фаза долговременной памяти является устойчивой, прежде всего к блокаде биосинтеза белка (Davis H.P., Squire L.R., 1984; Роуз С., 1995; Анохин К.В., 1997; Lechner H.A. et al., 1999). Еще в 60-х годах было предположено, что долговременная память не только неустойчива (лабильна) сразу после обучения, но становится снова таковой после реактивации, а именно после вспоминания (Misanin J.R. et al., 1968; Sara S.J., 2000). Недавно была показана возможность амнезии памяти при реактивации у крыс (Nader K. et al., 2000). Результаты привели авторов к заключению, что, когда долговременная память реконсолидируется, то для стабилизации требуется новый синтез белка, как и после начального обучения. Контекстуально специфическое обучение и память о нем найдена также у некоторых беспозвоночных животных (Colwill R.M. et al., 1988; Haney J., Lukowiak K., 2001; Child et al., 2003; Lukowiak K. et al., 2003; Солнцева С.В. и др., 2006). Имеющиеся данные позволяют предположить, что после реактивации долговременная память или способность к воспроизведению памяти становятся чувствительными к ингибиторам белкового синтеза после начального обучения (Anokhin K.V. et al., 2002; Arshavsky Yu.I., 2003). Однако есть исследования, в которых не нашли этого феномена (Cammarota M. et al., 2004), ряд авторов демонстрируют трудность экспериментального разделения животных разных протоколов (Garelick M.G., Strom D.R., 2005). Также показано, что важную роль в процессе реконсолидации может играть активация МАР киназы (Kelly A. et al., 2003) и протеинкиназы А (Kemenes G. et al., 2006).

Изучение роли мембранных характеристик нейронов и параметров синаптической передачи в механизмах обучения, представляет большой интерес (Byrne J.H., 1987; Benjamin P.R. et al., 2000; Kandel E.R., 2001; Balaban P.M., 2002; Crow T.J., 2004; Нистратова В.Л., Пивоваров А.С., 2004; Crisp K.M., Muller K.J., 2006; Соколов Е.Н., Незлина Н.И., 2007; Mozzachiodi R. et al., 2008). Речь идет о мембранных системах клетки, что определяется, во-первых, ключевой ролью нейрона в интегративной деятельности мозга, а во-вторых, тем, что в основе клеточных механизмов обучения и памяти лежат биофизические и биохимические характеристики нервных клеток, которые дают важное звено для перехода кратковременных пластических изменений в долговременные. К настоящему времени нет недостатка в доказательствах решающей роли ионов Са²⁺ в индукции ассоциативных и неассоциативных форм обучения (Hawkins R.D. et al., 1993; Schaffhausen J.H. et al., 2001; Никитин В.П., Козырев С.А., 2002). Ионы кальция играют чрезвычайно важную роль в регуляции большого разнообразия нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальным внутриклеточным посредником (Костюк П.Г., 1986; Brini M., Carafoli E., 2000; Rizzuto R. et al., 2002; Волков Е.М. и др., 2002; Rusakov D.A., 2006).

Все клетки должны иметь механизмы, позволяющие им контролировать состояние окружающей среды и отвечать на происходящие в ней изменения. Медиатор оказывает свое влияние на рецептор через образование комплекса «лиганд-рецептор», затем информация должна быть передана внутрь клетки, чтобы возник клеточный ответ (Геннис Р., 1997; Smith C.U.M., ed., 2002). Серотонин является одним из широко распространенных и хорошо изученных медиаторов нервной системы (Kandel E.R., Schwartz J.H., 1982; Сахаров Д.А., 1990; Burrell B.D., Sahley C.L., 1999; 2005; Захаров И.С., 2001; Пивоваров А.С., Нистратова В.Л., 2003; Gillette R., 2006). Особенно важным является иннервация серотонином центральных генераторов и других возбуждающих цепей, а также поддержка общей поведенческой активности (Zakharov I.S. et al., 1995; Whitaker-Azmitia P.M., 1999; Дьяконова В.Е., 2007). Воздействия присоединившихся к рецепторам на поверхности клетки медиаторов и гормонов на внутриклеточные процессы обмена опосредуются промежуточными соединениями, называемыми вторичными посредниками. Среди них существенную роль играет аденилатциклазная система, которая модулируется серотонином (Yanow S.K. et al., 1998; Гринкевич Л.Н., 2000; Dyer J.L. et al., 2003). Факторы, влияющие на образование и распад цАМФ, достаточно хорошо изучены. Внутриклеточная концентрация цАМФ находится под контролем двух противоположно направленных процессов и опосредуется относительной активностью аденилатциклазы, образующей цАМФ из АТФ, с одной стороны, и фосфодиэстеразы, разрушающей циклический нуклеотид с образованием 5`АМФ - с другой (Кольман Я., Рем К.-Г., 2000; Tasken K., Aandahl E.M., 2004). Имеющиеся данные свидетельствуют о функциональной зависимости между двумя вторичными посредниками - цАМФ и Са²⁺, а также между двумя системами - аденилатциклазной и системой мобилизации ионов Са²⁺ (Пивоваров А.С. и др., 1989; Martin K.C. et al., 1997; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Никитин В.П., 2006).

Одним из агентов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺, является кофеин (Orkand R.K., Thomas R.C., 1995; Berridge M.J., 1998; Rusakov D.A., 2006). Установлено, что кофеин вызывает высвобождение ионов Ca²⁺ из эндоплазматического ретикулума, ингибирует также фермент фосфодиэстеразу, что в результате приводит к повышению в клетках уровня цАМФ (Howell L.L. et al, 1997; Brini M., Carafoli E., 2000; Celenza K.M. et al., 2007). В последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что кофеин может оказывать противоположные эффекты на разных стадиях консолидации памяти и что его воздействие зависит от формы обучения (Angelucci M.E.M. et al., 1999).

Для решения этих вопросов широко используются моллюски, обладающие относительно простой нервной системой с идентифицируемыми клеточными элементами и достаточно сложным поведенческим репертуаром. Результативными оказались эксперименты на брюхоногих моллюсках и упрощенных моделях, направленные на изучение клеточных основ ассоциативного обучения (Сахаров Д.А., 1974; Кэндел Е., 1980; Соколов Е.Н., 1981; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Alkon D.L., 1984; Carew T.J., Sahley C.L., 1986; Балабан П.М., Захаров И.С., 1992; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Byrne J.H., Kandel E.R., 1996; Benjamin P.R. et al., 2000; Палихова Т.А., 2000; Пивоваров А.С., Богуславский Д.В., 2000; Lukowiak K. et al., 2003; Гринкевич Л.Н. и др., 2006; Балабан П.М., 2007).

Таким образом, исследование мембранных механизмов, а также изменений активности внутриклеточной сигнальной системы, сопутствующих сохранению условного оборонительного рефлекса и изучение реконсолидации долговременной памяти представляется актуальной задачей в рамках проблемы нейробиологии обучения и памяти.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы - исследование долговременной памяти у виноградной улитки, включая анализ мембранных коррелятов, роли ионов кальция, серотонина и аденилатциклазной системы в сохранении условного оборонительного рефлекса, а также особенностей зависимости формирования условного обстановочного рефлекса от белкового синтеза.

Исходя из поставленной цели, были намечены следующие основные задачи исследования:

1) исследовать возможность существования у виноградной улитки фазы реконсолидации памяти, чувствительной к блокаде синтеза белка, при напоминании (реактивации) после выработки обстановочного условного рефлекса;

2) проанализировать роль подкрепления в реконсолидации обстановочного условного рефлекса у виноградной улитки;

3) исследовать мембранные механизмы формирования условного оборонительного рефлекса и длительность сохранения изменений электрических характеристик командных нейронов виноградной улитки после его выработки;

4) проанализировать роль ионов Са²⁺ в изменениях электрических характеристик командных нейронов улиток после выработки условного оборонительного рефлекса;

5) исследовать роль Са²⁺- и Са²⁺- зависимых К⁺- каналов в изменениях электрических характеристик командных нейронов улиток после выработки условного оборонительного рефлекса;

6) изучить эффекты антител к Са²⁺- связывающему белку S100B на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки после обучения;

7) провести исследования эффектов действия нейротоксических аналогов серотонина 5,6- и 5,7-дигидрокситриптамина и нейролептика хлорпромазина на поведенческие реакции виноградной улитки и электрические характеристики командных нейронов;

8) изучить изменения возбудимости командных нейронов виноградной улитки в ответ на действие серотонина при обучении;

9) исследовать эффекты хронического введения кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX на выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.

10) изучить электрофизиологические эффекты хронического введения кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX на выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.

Положения, выносимые на защиту:

Долговременная обстановочная память у улиток при напоминании обстановки проходит стадию реконсолидации, для которой необходим синтез белка. В случае предъявления напоминания контекста одновременно с подкреплением нарушения реконсолидации памяти при блокаде белкового синтеза не происходит.

В механизмы обучения у виноградной улитки вовлечены изменения мембранного потенциала, а также серотонинергической и аденилатциклазной систем: долговременным эффектом обучения является снижение возбудимости командных нейронов оборонительного поведения в ответ на внеклеточный серотонин, долговременное снижение их мембранного и порогового потенциалов, повышение активности фосфодиэстеразы цАМФ в командных нейронах. Скорость формирования условного оборонительного рефлекса увеличивается при хроническом введении кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы цАМФ.

Научная новизна. Впервые на моллюсках обнаружено явление зависимого от белкового синтеза процесса реконсолидации долговременной памяти, когда может быть нарушено воспроизведение обстановочного условного рефлекса после блокады биосинтеза во время напоминания. Впервые показана связь процесса реконсолидации долговременной памяти с подкрепляющим стимулом - инъекция анизомицина после напоминания в сочетании с подкрепляющим стимулом не оказывала влияния на контекстуальную память.

Найдено, что введение в омывающий раствор серотонина вызывает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала командных нейронов как интактных, так и обученных улиток, а у улиток после формирования условного рефлекса снижается возбудимость командных нейронов (повышение порогового потенциала) при действии внеклеточного серотонина. Показано, что хроническое воздействие хлорпромазина приводит к деполяризационному сдвигу мембранного потенциала и снижению порога генерации потенциала действия командных нейронов виноградной улитки и мотонейронов закрытия пневмостома, как и введение 5,6- DHT. Впервые обнаружено, что в результате выработки условного оборонительного рефлекса и условного рефлекса (УР) аверзии к пище происходит снижение мембранного и порогового потенциалов в командных нейронах оборонительного поведения, что может происходить за счет потенциал-зависимых К⁺-каналов, Са²⁺-зависимых К⁺-каналов, быстрых К⁺-каналов, Са²⁺-зависимых К⁺-каналов высокой проводимости, Са²⁺-каналов L-типа. Найдено, что эти изменения электрических характеристик командных нейронов сохраняются в течение времени сохранения поведенческих реакций.

Среди спонтанно активных идентифицированных нейронов виноградной улитки обнаружены клетки, отвечающие на аппликацию антител к Са²⁺- связывающему белку S100 (АS100) увеличением частоты генерации ПД, а также нейроны, отвечающие уменьшением частоты генерации ПД. Впервые обнаружено, что снижение внутриклеточной концентрации Са²⁺ применением мембранопроникающего хелатора BAPTA-AM, не вызывающего изменений мембранного и порогового потенциалов командных нейронов интактных и обученных улиток, не только снимает деполяризационный эффект антител к Са²⁺-связывающему белку S100 у интактных улиток, но и приводит у них к гиперполяризации командных нейронов, в то время как у обученных улиток наблюдается только уменьшение деполяризационного эффекта. Эти результаты свидетельствуют о том, что антитела к Са²⁺-связывающему белку S100 действуют на систему внутриклеточного кальция. Обнаружено разнонаправленное действие кофеина в концентрациях 2 и 15 мМ/л на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки: снижение порогового потенциала при неизменном мембранном потенциале для концентрации 2 мМ/л и снижение мембранного потенциала при неизменном пороговом потенциале для концентрации 15 мМ/л как у интактных, так и у обученных улиток.

Впервые найдено, что хроническое введение, как кофеина, так и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX сразу после процедуры обучения увеличивает скорость формирования условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки по сравнению с улитками активного контроля и показан деполяризационный сдвиг мембранного потенциала командных нейронов после этих воздействий. Отсутствие суммирования изменений мембранного потенциала командных нейронов при обучении и применении кофеина и IBMX указывает на повышение активности аденилатциклазы при формировании условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Показано, что аппликация водорастворимого аналога цАМФ - 8Br-cAMP и активатора аденилатциклазы форсколина вызывает деполяризацию командных нейронов как у интактных, так и у обученных улиток. Однако неспецифический ингибитор фосфодиэстеразы - IBMX вызывает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала только у обученных улиток. Эти результаты свидетельствуют, что у обученных улиток происходит долговременное увеличение активности фосфодиэстераз, по сравнению с интактными животными.

Научно-практическая ценность. Впервые у виноградной улитки показано, что напоминание условий выработки обстановочного УР приводит к возникновению процесса реконсолидации, чувствительного к блокаде синтеза белка. Чувствительность реконсолидированной памяти к белковому синтезу в настоящее время резко меняет отношение исследователей и практиков к вопросам долговременной памяти. Демонстрация того, что подкрепляющий стимул взаимодействует со стимулом напоминания, создает условия для применения воздействий, приводящих к реконсолидации долговременной памяти.

Установление факта деполяризационного сдвига мембранного потенциала и снижение порогового потенциала при формировании условных рефлексов, а также сохранение изменений этих характеристик в течение длительного времени расширяет представления физиологии о механизмах ассоциативного обучения на клеточном уровне в центральной нервной системе животных. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли серотонина в процессах обучения и памяти. Они позволяют оценить вклад серотонинергической системы не только в синаптическую передачу, но и в формирование мембранных характеристик нейронов, а также предположить один из возможных механизмов интегративной функции серотонина, когда пороговый потенциал командных нейронов в ответ на серотонин меняется в результате обучения. Из полученных результатов следует, что эффекты хлорпромазина на локомоцию и оборонительные реакции виноградной улитки можно объяснить, исходя из его серотонин истощающего действия. Результаты, свидетельствующие об увеличении скорости формирования условного оборонительного рефлекса при хроническом введении кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX сразу после процедуры обучения, а также их электрофизиологические эффекты позволяют составить более полное представление о роли ионов кальция и системы фосфодиэстераз в механизмах обучения и сохранения долговременной памяти.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях Казанского научного центра РАН (Казань, 2001-2006 г.г.); 8 Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (2001 г.); Central European Conference of Neurobiology (Krakуw, Poland, 2001 г.); IBRO Summer School 2001 “Neuronal transmission: microphysiology of synaptic currents and receptor function” (Tihany, Hungary, 2001); XVIII съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань 2001 г.); 6, 9, 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино 2002, 2005, 2006 г.г.); VI и VII Всероссийских симпозиумах “Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке” (Казань, 2002 г. и Набережные Челны, 2004 г.); IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002 г.); 3-rd Forum of Federation of European Neuroscience Societies (Paris, 2002 г.); IBRO Summer School 2002: “Contemporaty approaches to the study of CNS function using electrophysiological, behavioral and imaging techniques” (Prague, 2002 г.); Международном симпозиуме “Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals” (Moscow, Russia, 2003); XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург 2004 г.); III Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004 г.); Всероссийской конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005 г.); Международном симпозиуме «Mechanisms of adaptive behavior». (Санкт-Петербург, 2005 г.); I съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005 г); Всероссийских конференциях молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2005; 2007; 2008; 2009 г.г); V и VI Сибирских физиологических съездах (Томск, 2005 г.; Барнаул, 2008 г.); 7-th, 8-th, 9-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology “Simpler Nervous Systems” (Kaliningrad, 2003 г.; Kazan, 2006 г.; S-Peterburg, 2009 г.); XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва. 2007 г); IX Всероссийской научно-теоретической конференции "Физиологические механизмы адаптации растущего организма" (Казань, 2008 г.); конференции с международным участием "Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций" (Москва, 2008 г.).

Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 19 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, в 2 учебных пособиях, 1 монографии и в 52 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 381 страниц состоит из введения, четырех глав (каждая из которых включает в себя обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение), общего заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 588 источников, из них - 408 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 92 рисунками и содержит 6 таблиц.

Список используемых сокращений: УОР - условный оборонительный рефлекс; УС - условный стимул; БС - безусловный стимул; ПУОР - условный рефлекс аверзии к пищи; АК - активный контроль; АН - анизомицин; ФР - физиологический раствор; 5-НТ - серотонин; 5,6- и 5,7-DHT - 5,6- и 5,7-дигидрокситриптамин; 5-HTP - 5-гидрокситриптофан; цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ФДЭ - фосфодиэстераза; Vm - потенциал покоя; Vt - порог генерации потенциалов действия; Vs - амплитуда потенциала действия; Ec - критический уровень деполяризации; ts - продолжительность потенциала действия; ПД - потенциал действия, ЦНС - центральная нервная система.

Объект и методы исследований

В эксперименте использовали половозрелых особей, однородных по весу и размеру. До эксперимента улитки не менее двух недель находились в активном состоянии. Нами были выбраны несколько форм обучения, представляющих как декларативную, так и процедурную память. Условный обстановочный рефлекс является формой декларативной памяти (Balaban P.M., 2002), примером процедурной памяти являются условные оборонительные рефлексы, на основе которых мы исследовали клеточные и мембранные механизмы обучения. Условный оборонительный рефлекс закрытия пневмостома (УОР) вырабатывался по схеме, предложенной О.А.Максимовой и П.М.Балабаном (1983). В качестве условного стимула (УС) использовались постукивания по раковине, которые в норме не вызывали оборонительной реакции улитки. Безусловным стимулом (БС) служило вдувание струи воздуха в отверстие легочной полости, что вызывало у животных безусловную оборонительную реакцию закрытия пневмостома. Для выработки условного рефлекса аверзии на пищу (ПУОР) в качестве УС предъявлялся кусочек огурца, БС служил электрический ток. Кусочек пищи на металлическом стержне подносили к оральной области улитки и в момент первого жевательного движения через стержень пропускали ток величиной в 1 мА. Другой электрод прикладывали к ноге улитки. Сочетания пищи и тока предъявляли с интервалами в 10-20 мин. Рефлекс считался выработанным после того, как улитка либо избегала пищу 10 раз подряд, либо, дотронувшись до нее, проявляла оборонительную реакцию, не дожидаясь подкрепления. Для формирования условного обстановочного рефлекса, улитки в течение 5 дней получали по 5 электрических стимулов величиной в 1 мА (0,5 сек) на шаре. Тестирование проводилось в двух вариантах: 1) на шаре (т.е., в той обстановке, в которых животные подвергались процедуре обучения), и 2) на плоской поверхности крышки террариума (т.е., в условиях, отличных от тех, в которых улитки обучались). На следующий день после тестирования, подтверждающего выработку обстановочного условного рефлекса, улиток помещали на 20 мин. на шар (в обстановку, в которой проводилось обучение), что служило напоминанием условий обстановочного рефлекса, а затем сразу производили инъекцию анизомицина (АН), растворенного в 0,2 мл солевого раствора для виноградной улитки (ФР) в дозе 0,4 мг на улитку. Другой группе, для сравнения, после напоминания вводили такое же количество ФР. Анизомицин блокирует биосинтез белка в нервной системе улитки (Girardi M. et al., 2004). Было проведено несколько серий экспериментов по следующим протоколам:

Протокол №1 . Схема: первые 1-2 дня - приучение к установке, тестирование > следующие 5 дней - обучение обстановочному рефлексу > следующие 2 дня - отдых, кормление, тестирование > следующий день - инъекции АН или ФР > тестирование через 24 часа.

Протокол №2. Схема: первые 1-2 дня - приучение к установке, тестирование > следующие 5 дней - обучение обстановочному рефлексу > следующие 2 дня - отдых, кормление, тестирование > следующий день - напоминание, инъекции АН или ФР сразу после напоминания > тестирование через 24 часа.

Протокол №3. Схема: первые 1-2 дня - приучение к установке, тестирование > следующие 5 дней - обучение обстановочному рефлексу, после каждого электрошока - инъекции АН или ФР (5 раз в день по 0,4 мг 5 дней) > тестирование через 24 часа.

Протокол №4. Схема: первые 1-2 дни - приучение к установке, тестирование > следующие 5 дней - электрошоки по1-4 мА, 1с., 50Гц > следующие 2 дня - отдых, кормление, тестирование > следующий день - напоминание с подкреплением двумя электрошоками, инъекции АН или ФР сразу после напоминания > последний день - тестирование через 24 часа.

Протокол №5. Схема: тестирование оборонительной реакции втягивания омматофоров при нанесении тактильного стимула (ТС) по передней и средней части ноги до инъекций > инъекция анизомицина (5 улиток) и ФР (5 улиток) > 4ТС с интервалом 12-15 мин. Через 10 минут после укола > 1 электрошок, вызывающий сенситизацию (2-4мА) > ТС сразу после электрошока, измеряемые в течение 1,5 часов с интервалом 12-15 мин. Эксперимент был проведен для выяснения, можно ли повлиять на обстановочную память в стадии ее консолидации у улиток.

Протокол №6. Схемы эксперимента такие же, как и в протоколах 1 и 2, но было проведено сравнительное тестирование реакции втягивания омматофоров у улиток (при напоминании без него) не только через 24 часа после инъекций АН и ФР, но и через 4 часа после них. Все поведенческие эксперименты проводились с применением метода двойного слепого контроля.

При хроническом введении использована доза кофеина 30 мг/кг веса животных, растворенная в 0,1 мл ФР для виноградной улитки (она вводилась сразу после процедуры обучения, контрольным улиткам вводился ФР, кроме того, была группа улиток, которым ежедневно инъецировался кофеин без обучения). Было исследовано также влияние хронического введения неспецифического ингибитора фосфодиэстеразы (ФДЭ) IBMX (3-изобутил 1-метилксантин) сразу после сеанса выработки условного оборонительного рефлекса.

Нейротоксический аналог серотонина 5,6-дигидрокситриптамин (5,6-DHT) вводился двумя инъекциями по 15 мг/кг веса каждая с интервалом в 7 дней, он был растворен в 0,1 мл ФР, кроме того, в раствор была добавлена 0,1 % аскорбиновая кислота в качестве антиоксиданта. В отдельной серии применяли 5,7-DHT фирмы “Sigma” в дозе 20 мг/кг веса однократно. Метаболический предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан (5-HTP) применялся в дозе 10 мг/кг веса, его растворяли в 0,1 мл ФР и вводили каждый день за 1 час до сеанса обучения. Контролем служили улитки, которым был введен только ФР (0,1 мл) с 0,1 % аскорбиновой кислотой в те же сроки, что и в опытных сериях.

Регистрация электрических характеристик происходила после окончания поведенческой части. Перед приготовлением препарата ЦНС улитки для анестезии помещались в смесь воды со льдом на 15-30 минут. В работе использовался препарат изолированной центральной нервной системы улитки. Электрофизиологические измерения проводились по стандартной методике (Первис, 1983) при комнатной температуре (18 - 22^оС) с применением внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, имевших сопротивление 5 - 25 МОм и заполненных раствором 2,5М КCl. Микроэлектрод соединялся с регистрирующей аппаратурой посредством проводящей ток цепочки «агаровый мостик - хлорсеребряный электрод». Индифферентный электрод представлял симметричную цепочку, агаровый конец которой опускался в омывающий препарат раствор. Подведение микроэлектродов к нейронам и регистрация осуществлялись под визуальным контролем с помощью бинокулярного микроскопа. Электрический сигнал с нейронов через предусилитель поступал на усилитель МС-01М и интегрированный с ним вольтметр. С выхода усилителя сигнал можно было наблюдать на экране осциллографа и вести запись на компьютер с последующей обработкой. Большинство измерений было проведено на командных нейронах ЛПа3, ППа3, ЛПа2 и ППа2 (Иерусалимский В.Н. и др., 1992). Поскольку они в норме являются молчащими, то для инициации в них потенциала действия (ПД) через регистрирующий микроэлектрод на клетку подавали импульс тока прямоугольной формы продолжительностью 1 с; величина тока стимуляции подбиралась минимальной для генерации ПД. В проведенных сериях экспериментов эта величина тока варьировала от 1.7 до 3.5 нА. В экспериментах по исследованию влияния антител к белку S100 объектами исследования были также спонтанно-активные нейроны висцерального ганглия В4, В6, В10, В17 (Сахаров Д.А., 1974). В ходе эксперимента регистрировались мембранный потенциал (Vm) и порог генерации ПД (Vt), амплитуда ПД (Vs) и продолжительность ПД (ts). Мембранный потенциал определяли по точке наименьшего изменения мембранного потенциала между спайками. Пороговый потенциал обычно определяется по точке перегиба потенциала во время спайка. Мы определяли его как разницу между мембранным потенциалом и значением потенциала, при котором скорость его нарастания (первая производная потенциала по времени) достигала определенного значения (Ходоров, 1969; Andersen et al, 1987). Ранее экспериментально было показано, что точка перегиба потенциала соответствует величине производной 1 В/сек (Гайнутдинов, Береговой, 1994). Продолжительность потенциала действия определяли на полувысоте амплитуды ПД. Регистрация электрических характеристик нейронов в экспериментах производилась в солевом растворе для виноградных улиток (ФР)- NaCl - 80 мM/л, KCl - 4 мM/л, CaCl₂ - 10 мM/л, MgCl₂ - 5 мM/л, NaHCO₃ - 5 мM/л. Применялись следующие фармакологические препараты: водорастворимый аналог цАМФ 8-Br-цАМФ - 10О⁴ М/л; активатор аденилатциклазы форсколин - 10О⁴ М/л; неспецифический блокатор фосфодиэстераз IBMX - 2?10О⁴ М/л, блокатор потенциал-зависимых Ca²⁺-каналов верапамил - 5 10О⁴ М/л, блокатор Ca²⁺-зависимых K⁺-каналов хинин - 2 10О⁴ М/л, блокатор потенциалзависимых K⁺-каналов тетраэтиламмоний 25?10^-2 М/л, блокатор быстрых К⁺-каналов 4-аминопиридин - 15?10^-3 М/л. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция (или ингибирование фосфодиэстеразы - ФДЭ) достигалось аппликацией кофеина в концентрации 2 мМ/л и 15 мМ/л. Для снижения содержания кальция внутри клетки использовали инъекцию хелатора кальция - ЭГТА и аппликацию мембранопроникающего хелатора BAPTA-АМ в концентрации 10^-4 М/л. Для изучения роли Ca²⁺-активируемых K⁺-каналов высокой проводимости применялся специфический блокатор ибериотоксин в концентрации 10^-7 М/л. Для исследования роли Са²⁺- связывающего белка S100 использовали моноспецифическую иммунную сыворотку кролика к белку S100 (Институт цитологии и генетики СО РАН), разведенную ФР в соотношении 1:5. Результаты статистически обрабатывались с применением t-критерия Стъюдента и U-критерия Манна-Уитни с помощью программы «SigmaStat», приведены среднее значение и стандартная ошибка среднего (M SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ и их обсуждение

Контекстуальная память у улиток. Введение анизомицина и ФР интактным улиткам не вызывало никаких достоверных изменений в реакциях на оборонительные стимулы. Во время предварительного тестирования не наблюдалось значительных отличий в амплитуде втягивания омматофоров в ответ на тестовую тактильную стимуляцию во всех группах животных, как на шаре, так и на плоской поверхности. Затем улитки были подвергнуты процедуре обучения условному обстановочному рефлексу, последующее тестирование показало (рис. 1), что во всех случаях ответы в той обстановке, в которой улитки подвергались электрическим стимулам, были значительно сильнее, чем те, которые были в нейтральной для них обстановке (P<0.001, Манн-Уитни). Отличия в группах интактных улиток, тестируемых как на шаре, так и на плоскости, были незначительными (рис. 2).

Рис. 1. Тестирование реакции втягивания омматофор на шаре и на плоской поверхности до и после выработки обстановочного условного рефлекса. Выработка обстановочного рефлекса показана стрелкой.

Было показано, что улитки демонстрируют увеличение амплитуды оборонительной реакции только в той обстановке, в которой происходило обучение. Этот вывод находится в соответствии с предположением, что улитки могут дифференцировать ту обстановку, в которой им были предъявлены электрические стимулы.

Реконсолидация контекстуальной памяти (эффекты инъекции анизомицина) Протокол № 1. Тестирование оборонительных реакций втягивания омматофоров в ответ на тактильную стимуляцию передней части ноги после обучения показывает достоверное возрастание оборонительных реакций, когда виноградная улитка находится на шаре (в 5-7 раз, p<0.001), в то же время число оборонительных реакций при тестировании на плоской поверхности достоверно не увеличивается. Этот результат демонстрирует выработку у улитки обстановочного условного рефлекса (рис. 1). Чтобы проверить, может ли инъекция анизомицина влиять непосредственно на контекстуальную память, на следующий день после тестирования мы вводили АН или ФР улиткам, не напоминая им о ситуации, в которой было выполнено обучение обстановочному рефлексу. Через 24 часа после инъекций было проведено тестирование, в результате которого улитки демонстрировали сохранение обстановочного рефлекса как в случае блокады синтеза белка (n=11), так и без нее (n=7) (рис. 2). Полученные результаты предполагают, что сама по себе инъекция АН не нарушает контекстуальную память. Одновременно в таких же условиях были протестированы интактные улитки (n=7), никаких достоверных изменений обнаружено не было.

Рис. 2. Средние изменения величины оборонительной реакции улитки на тактильное раздражение передней части ноги, динамика изменения ответов, тестированных у каждой группы животных на шаре и на плоской поверхности. Протокол 1.

Протокол №2. В следующей серии экспериментов мы решили проверить, может ли напоминание о контексте влиять на уже сформированную память, и будет ли этот процесс чувствителен к блокаде синтеза белка. На следующий день после тестирования, демонстрирующего выработку обстановочного рефлекса, проводили сеанс «напоминания», который заключался в помещении улиток на 20 мин на шар, на котором при обучении они подвергались электрошокам. Затем сразу после напоминания улиткам вводили АН (контрольным улиткам вводили ФР). Повторное тестирование показало, что инъекция АН привела к полному забыванию обстановочного условного рефлекса (n=15, рис. 3), отличия ответов на шаре до и после анизомицина достоверны, p<0.001; отличия ответов на шаре и плоскости после АН недостоверны. Улитки, получившие инъекцию ФР (n=16), демонстрируют условный обстановочный рефлекс (то есть достоверную разницу между тестированием на шаре и на плоскости). Эти результаты свидетельствуют о том, что инъекция блокатора синтеза белка АН после напоминания, нарушает уже сформированную долговременную память, то есть проявления обстановочного условного рефлекса могут быть заблокированы применением блокатора биосинтеза во время напоминания. Описанные нами данные подтверждают существование ассоциативной контекстуальной памяти у моллюсков (как было показано ранее у Balaban P.M., Bravarenko N.I., 1993) и показывают, что реактивация памяти (напоминание) через два дня после формирования долговременной памяти вызывает процесс, чувствительный к блокаде синтеза белка, включенный либо в хранение памяти, либо его воспроизведение.

Рис. 3. Средние изменения величины оборонительной реакции улитки на тактильное раздражение передней части ноги, динамика изменения ответов, тестированных у каждой группы животных на шаре и на плоской поверхности. Протокол 2.

Протокол №3. Для нас было интересно найти, может ли анизомицин влиять на контекстуальную память на стадии ее консолидации и в этой экспериментальной серии мы вводили улиткам анизомицин через 3-5 мин после каждого электрического стимула во время обучения. Процедура была повторена в течение 5 дней (рис. 4). Не было найдено отличий в ответах на тактильный стимул передней части ноги, как в случае тестирования на шаре, так и при тестировании на плоскости у АН-инъецированных улиток (n=4), в то время как у параллельной группы улиток, которым вводили ФР (n=4), отличия были значительны (рис. 4), у них вырабатывался обстановочный условный рефлекс. Результаты этих экспериментов показывают, что применение АН на стадии консолидации предотвращает формирование долговременных изменений поведения.

Рис. 4. Средние изменения величины оборонительной реакции улитки на тактильное раздражение передней части ноги, динамика изменения ответов, тестированных у каждой группы животных на шаре и на плоской поверхности. Протокол 3.

Протокол №4. Известно, что сильный подкрепляющий стимул может скрывать эффекты других стимулов и взаимодействовать с продолжающимися процессами. В следующей серии экспериментов мы тестировали, может ли подкрепление во время сессии напоминания изменить эффективность реконсолидации. На следующий день после окончания сессии обучения, улиткам напоминали об обстановке, в которой они были обучены (на шаре), при этом (в отличие от протокола 2) они получали два дополнительных электрических стимула. Сразу после напоминания с применением электрошока улиткам вводили АН (n=9) (или ФР, n=9). Через 24 часа после инъекций было проведено тестирование реакции втягивания омматофоров и было найдено, что обстановочный рефлекс сохраняется у обеих групп улиток, без каких-либо нарушений (рис. 5), то есть блокада синтеза белка не приводит к забыванию полученного навыка. Результаты демонстрируют, что инъекции АН и ФР не оказывают влияния, т.е. предъявление подкрепления во время напоминания об обстановке, в которой проходило обучение, заблокировало эффект АН на реконсолидацию памяти. Отсутствие вызванных АН эффектов при применении после напоминания, комбинированного с подкреплением подтверждает предположение, что нарушение памяти после вспоминания может отличаться от нарушений памяти после его приобретения (Taubenfeld S.M. et al., 2001; Anokhin K.V. et al., 2002; Муравьева, Анохин К.В., 2006).

Рис. 5. Средние изменения величины оборонительной реакции улитки на тактильное раздражение передней части ноги, динамика изменения ответов, тестированных у каждой группы животных на шаре и на плоской поверхности. Протокол 4.

Специфичность эффектов анизомицина на долговременную память. Далее мы провели изучение влияния блокады синтеза белков на кратковременную и долговременную память в обстановке, в которой проводилось формирование обстановочного УР. Чтобы посмотреть, влияют ли инъекции АН на кратковременную неассоциативную пластичность, мы выполнили серию экспериментов, в которых анализировались ответы на тестовую стимуляцию в 15-минутном интервале, когда предъявлялся только один электрический стимул (2 сек, 2-4 мА). Обычно амплитуда поведенческого ответа после такого электрошока увеличивается в течение 1-2 часов. Результаты показали, что поведенческие ответы улиток тех групп, которым инъецировали АН или ФР до начала тестирования, не отличались друг от друга (рис. 6). Таким образом, инъекция АН не влияет на кратковременные изменения возбудимости, вызываемые облегчающими стимулами.

Рис. 6. Тестирование оборонительной реакции втягивания омматофор при нанесении тактильного стимула по передней и средней части ноги до инъекций.

Для анализа специфического эффекта АН на консолидацию долговременной памяти необходимо провести также сравнение с действием АН на кратковременную память. Мы выполнили серию экспериментов (протокол 5), в которой тестировали существование стабильной контекстуальной памяти через 4 и 24 часа после инъекции АН или ФР с напоминанием и без него. Было найдено, что ответы улиток в группах с напоминанием (n=12) и без напоминания (n=10), которым были произведены инъекции ФР, не отличались друг от друга при тестировании как через 4 часа (кратковременная память), так и через 24 часа (долговременная память) (то есть описанных в протоколах 1 и 2. В то же время при инъекции АН ответы в аналогичных группах через 4 и 24 часа достоверно отличались (n=12 и 10). Эти результаты предполагают, что инъекция АН в комбинации с подкреплением специфично нарушает реконсолидацию долговременной памяти на обстановку. Таким образом, полученные результаты показывают наличие кратковременной памяти после блокады биосинтеза белка и подавление долговременной памяти спустя 24 часа.

Исследование мембранных коррелятов формирования условного рефлекса. В командных нейронах ЛПа2, ЛПа3, ППа2 и ППа3 спонтанная активность представлена только возбуждающими постсинаптическими потенциалами, поэтому ПД в этих клетках вызывали стимуляцией. ПД у интактных улиток генерировался при применении тока амплитудой 2.90.4 нА, у улиток после выработки УОР ПД вызывался электрическим стимулом меньшей величины (2.20.2 нА). Мембранный потенциал этих клеток у интактных улиток достигал значени -60.90.3 мВ (n=92), пороговый потенциал был равен 20.20.4 мВ (рис. 7).

Рис. 7. Величина мембранного (А) и порогового (Б) потенциала командных нейронов оборонительного рефлекса ЛПа3, ППа3, ЛПа2 и ППа2 у интактных улиток (К), улиток после выработки условного оборонительного рефлекса аверзии на пищу (ПУОР), после выработки условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине (УОР) и после выработки обстановочного условного рефлекса (ОбУР).

· - достоверные отличия от значений в ФР (p<0,001).

У улиток после формирования УОР наблюдалось достоверное (р<0.05) снижение величин Vm и Vt на 4 мВ (n=74) (рис. 7). Результаты активного контроля (n=38), не отличались от данных у интактных улиток. Полученные изменения являются мембранными коррелятами условного рефлекса у виноградной улитки. Измерения электрических характеристик командных нейронов оборонительного рефлекса животных на разных сроках после выработки УОР, показывают сохранение наблюдаемых изменений в течение 1 месяца, что свидетельствует о длительном сохранении повышенной возбудимости этих клеток после обучения. У улиток после выработки условного оборонительного рефлекса аверзии к пище также было выявлено (рис. 7) снижение величин Vm и Vt (n=23) по сравнению с интактными улитками (n=24). Кроме того, было показано снижение Vm и Vt у улиток после выработки условного обстановочного рефлекса (рис. 7).

Исследование эффектов блокаторов ионных каналов на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток. В следующих экспериментах мы изучали эффекты и влияния блокаторов ионных каналов на электрические параметры командных нейронов у улиток после выработки УОР. Было показано, что как у контрольных, так и у обученных улиток, тетраэтиламмоний (ТЭА) часто приводил к появлению двойных спайков, иногда возникала спонтанная активность; во всех случаях происходило значительное увеличение (более 100 раз) продолжительности ПД (ts) (рис. 8, табл. 1) и наблюдалась деполяризация мембраны на 9 мВ. Блокада Ca²⁺-зависимых K⁺-каналов хинином как в группе интактных, так и в группе обученных улиток приводила к увеличению ts (рис. 9, табл. 1). Достоверно уменьшалась и величина Vm, изменения Vt не происходило. 4-аминопиридин (4-АР) в ряде случаев приводил к увеличению частоты ПД, наблюдались увеличение ts с 6,9 мс до 9,3 мс и деполяризация мембраны 6 мВ (табл. 1). Характерной особенностью действия 4-АР является повышение амплитуды ПД (на 16 мВ). Верапамил снижал мембранный потенциал командных нейронов в группах интактных и обученных улиток (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о том, что эти типы ионных каналов присутствуют в командных нейронах. Таким образом, в формировании мембранного потенциала командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки принимают участие потенциал-зависимые К⁺-каналы (блокада ТЭА), Са²⁺-зависимые К⁺-каналы (блокада хинином), быстрые К⁺-каналы (блокада 4-АР), Са²⁺-каналы L-типа (блокада верапамилом). Спад потенциала действия в командных нейронах обеспечивается преимущественно потенциал-зависимыми К⁺-каналами и Са²⁺-зависимыми К⁺-каналами. Быстрые К⁺-каналы (блокада 4-АР) и Са²⁺-зависимые К⁺-каналы высокой проводимости (блокада ибериотоксином) обеспечивают более раннее начало спада ПД командных нейронов и влияют, соответственно, на величину амплитуды ПД. Стоит отметить, что не было найдено изменений, специфичных для обученных улиток.

Таблица 1. Изменение мембранного потенциала (Vm), порога генерации потенциала действия (Vt) и продолжительности потенциала действия (ts) командных нейронов у интактных улиток и у улиток после формирования условного оборонительного рефлекса в физиологическом растворе (ФР) и после добавления блокаторов ионных каналов.* - достоверное отличие от значений в ФР (p<0,05 и менее)

Рис. 8. Примеры электрической активности командного нейрона до аппликации ТЭА и после нее.

Рис. 9. Примеры электрической активности командного нейрона до аппликации хинина и после нее.

Исследование эффектов изменения содержания внутриклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток. Целью этой серии наших экспериментов явилось изучение эффектов разных концентраций кофеина, которые действуют на ФДЭ и внутриклеточную концентрацию ионов Ca²⁺: 2 и 15 мМ/л. Результаты показывают разнонаправленное действие кофеина в концентрациях 2 и 15 мМ/л (рис. 10) на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки: снижение порогового потенциала при неизменном мембранном потенциале для концентрации 2 мМ/л и снижение мембранного потенциала при неизменном пороговом потенциале для концентрации 15 мМ/л как у интактных, так и у обученных улиток.

Рис. 10. Значение мембранного (А -Vm, мВ) и порогового потенциалов (Б - Vt, мВ) командных нейронов у интактных улиток (К) и обученных (УОР) улиток в норме и при добавлении в раствор кофеина в концентрациях 2 и 15 мМ. * - достоверные отличия от значений в ФР (p<0,01).

Влияние хелаторов кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток. Было проведено исследование влияния снижения внутриклеточной концентрации Ca²⁺ на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток. Измерения электрических характеристик при внутриклеточной инъекции хелатора кальция - ЭГТА, а также при аппликации мембранопроникающего хелатора Са²⁺ - ВАРТА-АМ, показало, что мембранный и пороговый потенциалы, а также критический уровень деполяризации не отличались достоверно у интактных и обученных улиток (рис. 11). Таким образом, снижение внутриклеточной концентрации Ca²⁺ в командных нейронах не приводит к специфическим изменениям электрических характеристик обученных улиток.

Рис. 11. Значения электрических характеристик командных нейронов оборонительного поведения (А -Vm, мВ и Б - Vt, мВ) интактных (К) и обученных (УОР) улиток в норме (ФР) и при добавлении в раствор BAPTA-АМ.

Ибериотоксин (блокатор Са²⁺-активируемых К⁺ каналов) не влияет на Vm и Vt, но вызывает достоверное увеличение амплитуды ПД. Неожиданным для нас фактом оказалось снижение ибериотоксином продолжительности ПД в командных нейронах, особенно на фоне применения ВАРТА-АМ, в том числе у обученных улиток (рис. 12).

Рис. 12. Значение продолжительности потенциала действия (ts, мс) командных нейронов у интактных улиток (А) и обученных (Б.УОР) улиток в норме (ФР) и при добавлении в раствор BAPTA-АМ (В) и последующем добавлении ибериотоксина (И).

Исследование влияния антител к Са²⁺- связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов после обучения. Было найдено два типа нейронов, реагирующих различным способом на аппликацию AS100: снижение частоты в нейронах В1, В3, В17 и ППа6 (идентификация по Д.А.Сахарову, 1974) и увеличение - в нейронах В4, В6 и В11 (рис. 13).

Рис. 13. Зависимость соотношения частот генерации потенциалов действия n_e/i нейронов V1,V17 и V4,V6 (n_e/i=Ne/Ni, где Ni - частота до начала аппликации растворов, а Ne - после аппликации) от действия антител к белку S100. Пунктирная линия - значения в ФР.

* - достоверность различия от значений в ФР (p<0.05).

В клетках В4 и В6 частота генерации ПД при добавлении хинина снижалась более чем в 2 раза, а ts увеличивалась в 6 раз (рис. 14). При совместном действии AS100 и хинина частота генерации ПД, Vm и Vt достоверно не изменялись по сравнению с эффектом AS100 в ФР. Величина ts увеличивалась в 1.6 раза, что было менее выражено по сравнению с действием хинина в физиологическом растворе. Это означает, что AS100 препятствует увеличению продолжительности ПД после аппликации хинина (блокады Са²⁺- зависимых К⁺-каналов).

Рис. 14. Изменение длительности потенциалов действия (ts) нейронов V4, V6 при действии хинина (б), антител к белку S100 (в) и совместном применении антител к белку S100 и хинина (г); а - длительность потенциалов действия в физиологическом растворе.

Отдельная серия экспериментов была посвящена анализу эффектов антител к Са²⁺-связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов оборонительного поведения интактных и обученных улиток на фоне снижения внутриклеточной концентрации Са²⁺ применением ВАРТА-АМ. Мембранный потенциал у обученных улиток при аппликации АS100 снижался с -55,30,7 мВ в физиологическом растворе до -48,42,1 мВ (р<0,001) (рис. 15).

Рис 15. Динамика изменения мембранного потенциала командных нейронов при добавлении в раствор AS100 и BAPTA-АМ+AS100 у контрольных (К) и обученных (УОР) животных.

При снижении внутриклеточной концентрации Са²⁺ хелатором кальция ВАРТА-АМ при действии АS100 деполяризационный эффект ослаблялся. Мембранный потенциал у интактных улиток при аппликации АS100 снижался с -59,1±1,3 мВ в физиологическом растворе до -42,6±4,4 мВ после аппликации антител к белку S100 (р<0,01). Однако, при аппликации хелатора Са²⁺ ВАРТА-АМ деполяризация мембраны при действии АS100 не развивалась, а даже наоборот, наблюдалась гиперполяризация (рис. 15). Порог генерации ПД и его продолжительность достоверно не изменяются ни в группе интактных, ни в группе обученных улиток. Таким образом, сравнение результатов показывает, что ВАРТА-АМ значительно уменьшает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала у обученных улиток, а у интактных животных наблюдается не только полное восстановление мембранного потенциала, но и гиперполяризация мембраны. Полученные результаты подчеркивают прямое действие AS100 на систему регуляции ионами кальция Са²⁺-зависимых К⁺- каналов. Исходя из структуры этих каналов (Weiger T.M. et al., 2002), можно ожидать, что белок S100 локализован трансмембранно или вплотную примыкает к внутренней стороне мембраны (Kubista H. et al., 1996).