Апробация ISSR ДНК-маркеров для генотипирования регенерантов подснежника Воронова и анализ генетической стабильности растений, полученных в культуре in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

На территории Западного Кавказа сосредоточено большое количество (более 65 %) редких видов растений, подлежащих охране на государственном и региональном уровнях [1]. Поэтому особую актуальность имеют исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижается, а также для уникальных форм, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений.

Разрешение проблемы сохранения биоразнообразия возможно на основе всестороннего изучения редких и исчезающих видов растений, их биологических и экологических особенностей, тактики и стратегии выживания. Одной из составляющих стратегии сохранения редких видов, которая может ослабить или снять антропогенное давление, оказываемое на природные популяции таких видов, является введение их в культуру. При этом важную роль играет освоение различных способов их массового размножения [2]. В связи с чем наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов. Несомненно, привлечение методов биотехнологии, базирующихся на культивировании изолированных органов, тканей и клеток растений для решения проблем сохранения биологического разнообразия имеет преимущества перед традиционно используемыми подходами.

Одним из видов, подлежащих охране на территории Западного Кавказа, является подснежник Воронова (Galanthus woronowii Losinsk.). Этот вид внесен в Красную книгу Краснодарского края и рекомендован к охране на территории Большого Сочи [3, 4]. Также он включен в Приложение II Международной Конвенции СИТЕС. Это эндемик, численность которого сокращается в результате чрезмерного использования его человеком. Встречается в Краснодарском крае на Черноморском побережье от Туапсе до реки Псоу, в Республике Адыгея (Гузерипль), в Ставропольском крае близ г. Ессентуки [3].

По мнению Слепченко Н.А. (2013) для размножения Galanthus woronowii необходимо в большей степени, чем для других луковичных (Leucojum aestivum и Pancratium maritimum) использовать методы культуры тканей, поскольку малый размер луковиц этого вида не позволяет размножать растения вегетативным способом [2].

Во ВНИИЦиСК (г. Сочи) проводятся исследования по разработке приемов размножения и сохранения редких и исчезающих видов Западного Кавказа в условиях in vitro [5-7]. С 2016 года начали проводиться работы по введению в условия культуры in vitro и эндемичного вида G. woronowii. Важным преимуществом разрабатываемой технологии размножения редких генотипов, в том числе и подснежника Воронова, в культуре in vitro должно явиться массовое воспроизводство генетически стабильных регенератов, не отличающихся по ряду морфологических, биохимических и генотипических признаков от исходных растений [8] (рисунок 1).

Рисунок 1. Микролуковички подснежника Воронова в культуре in vitro

генетический подснежник микроклональный

Однако при размножении культуры in vitro возникает опасность возникновения сомаклональной изменчивости. Для мониторинга подобной ситуации необходимо проведение анализа, способного выявить генетические отклонения в размножаемом растительном материале [9].

В качестве метода быстрой и эффективной оценки генетического полиморфизма положительно себя зарекомендовали мультилокусные ISSR ДНК-маркеры. ISSR праймеры, комплементарные микросателлитным последовательностям генома, позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двух расположенных в достаточной близости микросателлитных локусов. И как следствие в процессе ПЦР синтезируется большое количество фрагментов ДНК, представленных на электрофореграмме в виде ДНК-фингерпринта [10].

В настоящее время в научной литературе имеется целый ряд примеров успешного использования мультилокусных ДНК-маркеров для проведения анализа растений, полученных путем микроклонального размножения, на предмет наличия у них генетических отклонений. Примером может послужить работа, проведенная с использованием 18 ISSR маркеров для скрининга полученных растений-регенерантов лилии восточной при микроклональном размножении в условиях in vitro. При этом уровень проявления генетических мутаций, вызванных микроклональным размножением был минимален [11]. В исследованиях Wang Q.M. с соавторами [12] по анализу генетической стабильности растений-регенерантов, относящихся к виду Clivia miniata (Lindl.) Bosse, ISSR маркеры также были использованы в качестве эффективного молекулярно-генетического «инструментария» для анализа генетической однородности регенерантов.

Так же наглядным примером эффективности применения ISSR маркеров для анализа генетической стабильности является работа группы исследователей из лаборатории лесной генетики и биотехнологии Нанкинского университета (Китай). В ходе проведения микроклонального размножения вида Lilium longiflorum Thunb. данным коллективом была осуществлена обработка адвентивных почек гамма-облучением с целью индицирования мутагенеза. Облученные растения-регенеранты и исходные растения были сопоставлены друг с другом с использованием ISSR ДНК-маркеров. Использованный в работе метод позволил выявить мутантные образцы, у которых в процессе последующей оценки по комплексу морфолого-анатомических признаков были установлены отличия от исходной формы [13]. В данной работе, в ходе апробации ISSR-маркеров, из 50 маркеров были отобраны только 7 наиболее информативных. Это подчеркивает необходимость в оценке достаточно большого числа ДНК - маркеров для успешного выявления наиболее информативных.

В связи с этим, целью нашего исследования являлось выполнение апробации 33 ISSR ДНК-маркера и последующий анализ генетической стабильности регенерантов подснежника Воронова, полученных путем микроклонального размножения, по технологии, разработанной в ВНИИЦиСК.

Материалы и методы. Для проведения ДНК-анализа были отобраны 20 растений-регенерантов из in vitro коллекции ВНИИЦиСК и маточное растение. Выделение ДНК проводилось стандартной ЦТАБ методикой из листьев [14].

В работе оценивали полиморфизм следующих ISSR-маркеров: UBC813, UBC864, UBC844, UBC843, UBC825, UBC818, UBC811, UBC845, UBC853, UBC826, UBC810, UBC817, UBC808, UBC824, UBC807, UBC815, UBC 27, UBC873, ASSR02, ASSR15, ASSR20, ASSR 29, 3A39, 3A21, 3A30, 3A35, 3A37, 3A59, M1, M8, X9, X11, X10 [15, 16].ПЦР была проведена согласно следующей программе: 3 минуты предварительной денатурации при температуре 95 °С; последующие 35 циклов: денатурация 35 секунд при 95 °С, отжиг праймеров 1 минута при 50 °С, элонгация 1,5 минуты при 72 °С, и финальный цикл синтеза при температуре 72 °С в течение 5 минут. Концентрации реагентов в ПЦР смеси: 2,5 мкл 10-кратного буфера для Taq ДНК-полимеразы (ООО «Сибэнзим», Россия), 0,5 или 2,5 мклdNTP (2,5 мМ), 1 единица активности Taq ДНК-полимеразы, 2 мклпраймера (3,75 мМ) и 40-50 нг тотальной ДНК в общем объеме 25 мкл. Электрофорез ПЦР-продуктов проводился в 2,5 % агарозном геле при напряжении 100 В.

Результаты и обсуждение. Для пополнения сведений об эффективных ISSR маркеров для генотипирования образцов подснежника Воронова были апробированы как новые, ранее не использовавшиеся в работе ISSR, так и задействованные нами в предыдущем исследовании [17], но с измененными условиями ПЦР (рисунок 2). В проведённой работе эффективность ISSR маркеров оценивалась по общему количеству апмлифицированных ДНК-фрагментов и степени их выраженности на электрофорезе.

Рисунок 2. Электрофоретические спектры ISSR-маркеров подснежника Воронова

Примечание: М - маркер молекулярной массы ДНК; 1 - UBC864, 2 - UBC815, 3 - UBC827, 4 - ASSR29, 5 - UBC813, 6 - UBC818, 7 - UBC811, 8 - ASSR02

Из 24 маркеров, ранее не использовавшихся для генотипирования образцов подснежника Воронова, по 7 ISSR маркерам (3A39, 3A30, M8, UBC826, X11, UBC807, ASSR20) амплификация не была выявлена. Их дальнейшее использование для генотипирования целевого вида бесперспективно. В свою очередь, девять маркеров, по которым прошла ПЦР, имели различное качество амплифицированных фрагментов. В зависимости от качества фингерпринтов, маркеры были разделены на группы по приоритетности их использования в генотипировании подснежника Воронова (таблица 1). По результатам анализа по ряду маркеров были получены минорные ДНК фрагменты с недостаточной степенью выраженности. К таким маркерам можно отнести UBC817, UBC824, 3A37, X9, UBC853, X10, UBC815, UBC873. Использование фингерпринтов по данным маркерам для генотипирования образцов нежелательно из-за возможного возникновения ошибок при анализе результатов, связанных с плохим качеством детектируемых фрагментов в электрофоретическом спектре. Маркеры, имеющие только минорные фрагменты, вошли в IV и III группы приоритетности. Исключение составил маркер X10, который был включен в группу II из-за большого количества минорных фрагментов. Остальные маркеры, отнесенные во II группу, при генотипировании образцов подснежника Воронова дали четкие ДНК-фрагменты, однако количество фрагментов было недостаточно для включения маркеров в I группу. В I группу вошли три маркера, имеющие наиболее качественные фингерпринты по образцам подснежника Воронова. К I группе отнесены маркеры: UBC844, UBC843, 3A59. Также помимо новых, ранее не применявшихся на генотипах подснежника Воронова ISSR маркеров в работе были задействованы прежде апробированные на данном виде маркеры, но с использованием новых условий ПЦР, в частности была увеличена концентрация dNTPc0,5 до 2,5 mM. В эту группу входят 9 маркеров: UBC813, UBC864, ASSR29, UBC825, UBC818, UBC811, ASSR02, ASSR15, UBC827.

Таблица 1 Количество фрагментов в спектрах апробированных ISSR-маркеров у вида Galбnthus wуronowii Losinsk

В большинстве случаев качество фингерпринтов использованных маркеров улучшилось за счет изменения параметров ПЦР. Исключение составили маркеры UBC813 и ASSR15. Маркер UBC813 не выявил дискретных фрагментов в спектре и его использование для искомого вида бесперспективно. По маркеру ASSR15 при новых параметрах ПЦР также не было выявлено увеличения фрагментов в спектре, при высоком качестве амплификации. У остальных маркеров количество ДНК фрагментов варьировало от 3 у UBC825 до 8 у UBC818, что делает их перспективными для проведения генотипирования. Поэтому, они были включены в группу приоритета I. Таким образом, в ходе оценки информативности ISSR маркеров было определено 10 маркеров, имеющих высокую информативность при проведении генотипирования образцов подснежника Воронова. Из числа этих маркеров было выбрано пять образцов подснежника Воронова для проведения анализа на генетическую стабильность в процессе микроклонального размножения: 3A59, ASSR 02, UBC843, ASSR29, UBC818 (Рисунок 3). Анализ был проведен на выборке, включающей 20 растений-регенерантов и исходное растение, послужившее донором эксплантов.

Рисунок 3. Генотипирование растений - регенерантов подснежника Воронова по маркерам UBC843 (A) и ASSR29 (B)

Примечание: М-маркер молекулярной массы ДНК, 1 - маточное растение, 2-8 - растения регенеранты.

По всем маркерам для всех изученных растений-регенерантов наблюдались идентичные ДНК-фингерпринты, что свидетельствует о генетической однородности клонов и их генетической идентичности с исходным растением-донором эксплантов.

Выводы. Проведенная работа позволила выявить перспективные ISSR маркеры для генотипирования вида Galanthus woronowii. На основе набора установленных эффективных ДНК-маркеров был проведен анализ выборки из 20 растений-регенерантов и донорного растения. Выявленная генетическая однородность растений-регенерантов, полученных в культуре in vitro, установленная методом ISSR-генотипирования, позволяет утверждать, что технология размножения подснежника Воронова in vitro, разработанная во ВНИИЦиСК не влияет на генетическую структуру регенерантов. Ее использование не приведет к генетическому вырождению in vitro линий в череде поколений микроклонально размноженных растений. Наряду с оценкой генетической стабильности растений-регенерантов, отобранные нами в ходе исследования ISSR ДНК-маркеры могут быть успешно использованы при анализе генетической структуры природных популяций данного вида, что обладает высокой актуальностью, учитывая его охранный статус.

Литература

1. Тимухин И.Н. Флора сосудистых растений Сочинского национального парка // Инвентаризация основных таксономических групп и сообществ, созологические исследования Сочинского национального парка - первые итоги первого в России национального парка. Монография. М.: «Престиж», 2006. С. 41-84.

2. Слепченко Н.А. Редкие и исчезающие виды семейства Amaryllidaceae Jaume Saint-Hilaire на черноморском побережье России и стратегия их сохранения: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.02.08, 03.02.01 / Слепченко Наталья Александровна. - Махачкала, 2013. - 23 с.

3. Красная книга Краснодарского края. Том Растения и грибы. -- Краснодар: ООО «Дизайн Бюро № 1», 2007. -- 489 с.

4. Солодько А.С., Кирий П.В. Красная книга Сочи. Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды. Том 1. Растения и грибы. - Сочи, 2002.148 с.

5. Маляровская В.И., Коломиец Т.М., Соколов Р.Н., Самарина Л.С. Влияние спектрального состава света на рост и развитие Lilium caucasicum в условиях культуры in vitro// Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - 2013. - № 94. - С. 1016-1026.

6. Соколов, Р.Н., Коломиец Т.М., Маляровская В.И. Введение в культуру invitro некоторых редких и исчезающих видов флоры Западного Кавказа // Политематический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. - 2013. - №94(10). - С. 1-17.

7. Самарина Л.С., Коломиец Т.М., Слепченко Н.А. Сохранение in vitro исчезающего псаммофита черноморского побережья России Pancratium maritimum // Субтропическое и декоративное садоводство. -- 2012. - Вып. 47.-- С. 172-177.

8. Супрун И.И, Коломиец Т.М., Соколов Р.Н., Маляровская В.И., Самарина Л.С. Поиск оптимальных ISSR маркеров для проведения генотипирования панкрация морского// Плодоводство и виноградарство Юга России, 2014. - № 30(06).

9. Новикова, Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro Центрального Сибирского ботанического сада // Вестник ВОГиС. - 2008. - Том 12. - № 4. - С. 564-572.

10. Morgante, M. PCR-amplified microsatellite markers in plant genetics M. Morgante, A.M. Oliveri // Plant J. - Vol. 3. - 1993. - P. 175-182.

11. X. Liu, G.Yang., Adventitious shoot regeneration of oriental lily (Lilium orientalis) and genetic stability evaluation based on ISSR marker variation //. In Vitro Cell. Dev. Biol.-- Plant.- 2012.- Vol.48. P. 172-179.

12. Wang Q.M., Gao F., Gao X. Regeneration of Clivia miniata and assessment of clonal fidelity of plantlets // Plant. Cell. Tiss. Organ. Cult. 2012.-Vol.109. P.191-200.

13. M. Xi, SunL., Qiu S. In vitro mutagenesis and identification of mutants via ISSR in lily (Lilium longiflorum) // Plant Cell Rep - 2012.- Vol.31- P.1043-1051.

14. Doyle, J.J., Doyle J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. - Vol. 19. - 1987. P. 11-15.

15. Arzate-Fernandez, A.M. Miwa M., Shimada T., Yonekura T., Ogawa K. Genetic diversity of Miyamasukashi-yuri (Lilium maculatum Thunb. var. bukosanense), an endemic and endangered species at Mount Buko, Saitama, Japan // Plant Species Biology. - 2005. - № 20. - P. 57-65.

16. Krishna Parvathaneni, R., Natesan S., Arunachalam Devaraj A., Muthuraja R., Venkatachalam R., Prathap Subramani A. , Laxmanan P. Fingerprinting in Cucumber and Melon (Cucumi sspp.) Genotypes Using Morphological and ISSR Markers / R. Krishna Parvathaneni, // J. Crop Sci. Biotech. - 2011. - № 1. - P. 39-43.

17. Супрун И.И., Коломиец Т.М., Маляровская В.И., Соколов Р.Н., Самарина Л.С., Слепченко Н.А. Апробация ISSR ДНК-маркеров для генотипирования редких видов растений Западного Кавказа: Lilium caucasicum Miscz. Ex Grossh., Galбnthus woronowii Kolak., Pancratium maritimum // Научный журнал КубГАУ, №103(09), 2014 года.

Размещено на Allbest.ru