Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Возрастные и индивидуальные особенности реакции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и антиоксидантной ферментной системы эритроцитов на психоэмоциональное стрессовое воздействие у обезьян

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В связи с увеличением психоэмоциональных нагрузок в современном обществе проблема изучения механизмов влияния стресса на организм человека и устойчивости организма к стрессовым воздействиям является одной из важнейших проблем современной биологии и медицины. Психоэмоциональный стресс, выполняя адаптивную, стимулирующую жизнедеятельность роль, в определенных условиях может переходить в патологическую форму, приводя к развитию ряда заболеваний. Психоэмоциональные стрессы лежат в основе формирования различной патологии, такой как ишемическая болезнь сердца и ее осложнения, дисциркуляторные энцефалопатии, гипертоническая болезнь, нарушения репродуктивной системы, нервно-психические расстройства и др. (Pryor J.C. and Nemeroff C.B., 1990; Гончарова Н.Д. и Коновалова Г.М., 2002; Судаков К.В., 2002, 2008; Шаляпина В.Г., 2005; Отеллин В.А., 2007; Перцов С.С., 2007; Башкатова В.Г., 2008; Губарева Л.И. и Попова С.П., 2008; Ордян Н.Э. и др., 2008).

Резкое увеличение лиц пожилого и старческого возраста в демографической структуре современного общества определяет актуальность изучения возрастных особенностей реакции организма на стресс и устойчивости к стрессорным воздействиям в этот возрастной период, поскольку стресс-зависимая патология наиболее широко распространена у лиц пожилого возраста. Кроме того, клинические и экспериментальные данные указывают на снижение адаптационной способности стареющего организма к стрессовым воздействиям (Sapolsky R.M. et al., 1986; Seeman T.E. and Robbins R.J., 1994; Pedersen W.A. et al., 2001; Кветной И.М. и др., 2004; Кветная Т.В. и др., 2005; Smith R.G., 2005).

В основе стресс-реакции организма лежит активация ряда нейроэндокринных систем, важнейшей из которых является гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система (ГГАС) (Selye H., 1952; Sapolsky R.M. et al., 1986; Pedersen W.A. et al., 2001; Smith R.G., 2005). Изменения функционирования ГГАС при старении, по-видимому, являются важными факторами нарушения адаптивных способностей организма и развития возрастной патологии. Механизмы, лежащие в основе негативного влияния возрастных нарушений ГГАС на здоровье индивидов, разнообразны. К ним, в частности, относятся: увеличение секреции кортизола (F), оказывающего деструктивное влияние на функционирование многих физиологических систем, снижение продукции дегидроэпиандростерона (DHEA) и дегидроэпиандростерона сульфата (DHEAS) - антагонистов F в ряде тканей, повреждение механизма обратной связи, нарушения циркадианного ритма секреции F (Toutou Y. and Haus E., 2000; Ferrari E. et al., 2001, 2008; Pedersen W.A. et al., 2001; Гончарова Н.Д. и др., 2002, 2005, 2007; Goncharova N.D. et al. 2002, 2004, 2006; Smith R.G., 2005).

По-видимому, весомый вклад в развитие возрастной патологии вносят и нарушения циркадианного ритма стресс-реактивности ГГАС, сопровождающиеся развитием выраженных возрастных различий в реакции ГГАС на острое психоэмоциональное стрессовое воздействие в послеполуденное и вечернее время с более высокой реактивностью у молодых животных (Гончарова Н.Д. и др., 2006; Goncharova N.D., 2006). Сходным циркадианным и возрастным изменениям подвергалась и реакция на стрессовое воздействие со стороны глутатионредуктазы (ГР) эритроцитов - адаптивного антиоксидантного фермента, представителя одной из важнейших периферических стресс-лимитирующих систем (Goncharova N.D., 2006; Шмалий А.В., 2007). Это дало основание полагать о важной роли ГГАС в регуляции активности антиоксидантной ферментной системы (АОФС) эритроцитов, а также предположить, что нарушение стресс-реактивности ГР при старении может явиться важным фактором снижения надёжности антиоксидантной ферментной защиты эритроцитов, активизации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и повреждения транспорта кислорода к тканям, испытывающим повышенную потребность в нём в условиях острого стресса.

Однако для того, чтобы получить более убедительные данные в пользу высказанного предположения, необходимо проведение оценки не только возрастных особенностей динамики активности ГР и других глутатионзависимых антиоксидантных ферментов при стрессе, что было сделано ранее (Goncharova N.D., 2006; Шмалий А.В., 2007), но также активности супероксиддисмутазы (СОД) - ключевого антиоксидантного фермента, непосредственно нейтрализующего токсичные супероксидные радикалы кислорода (Арутюнян А.В. и др., 2000; McCord J.M. and Edeas M.A., 2005; Дубинина Е.Е., 2006; Goncharova N.D. et al., 2006). Кроме того, существенный интерес представляет изучение возрастных особенностей интенсивности процессов ПОЛ в эритроцитах в ответ на острое стрессовое воздействие, сведения о которых отсутствуют в литературе.

В литературе имеется достаточное количество работ, посвящённых изучению реакции ГГАС на острое психоэмоциональное стрессовое воздействие. Однако в подавляющем большинстве работ оценка функционирования ГГАС как в базальных условиях, так и в условиях стресса проводилась без учёта индивидуальных особенностей организма (Таранов А.Г., 1981; Чирков А.М. и др., 1987; Sapolsky R.M. et al., 1986; Toutou Y. and Haus E., 2000; Ferrari E. et al., 2001, 2008). Лишь в некоторых работах анализировались индивидуальные особенности реакции ГГАС на стрессовое воздействие (Liebsch G. et al., 1998; Шаляпина В.Г., 2005; Перцов С.С., 2007; Veenema A.H. and Neumann I.D., 2007). В то же время изучение индивидуальных особенностей реакции ГГАС на стрессовое воздействие в разные возрастные периоды представляет большое значение, поскольку индивидуальные реакции организма достаточно вариабельны и, по-видимому, ассоциированы с различной устойчивостью к стрессовым воздействиям и соответственно с различной предрасположенностью к стресс-зависимой патологии (Дмитриева Т.Б., 2002; Судаков К.В., 2002, 2008; Соллертинская Т.Н. и др., 2003; Лысенко А.В. и др., 2005; Ордян Н.Э., 2005; Шаляпина В.Г., 2005; Перцов С.С., 2007; Башкатова В.Г., 2008; Губарева Л.И. и др., 2008). Полностью отсутствуют сведения о характере индивидуальных особенностей реакции АОФС эритроцитов на психоэмоциональное стрессовое воздействие.

Одним из перспективных подходов к изучению индивидуальных особенностей реакции ГГАС и АОФС эритроцитов на стрессовое воздействие является исследование стресс-реактивности этих систем у животных с различной поведенческой стратегией. Основанием для такого подхода являются многочисленные литературные данные, свидетельствующие о наличии взаимосвязи между стресс-реактивностью данных систем и поведением животных. Как правило, у индивидов с одной поведенческой стратегией выявляется сходный тип функционирования ГГАС как в базальных условиях, так и при стрессе (Liebsch G. et al., 1998; Arborelius L. et. al., 1999; Holsboer F., 1999, 2000; Dirks A. et al., 2003; Шаляпина В.Г., 2005; Boyle M.P. et al., 2005, 2006; Перцов С.С., 2007; Veenema A.H. and Neumann I.D., 2007). Так, гиперактивация ГГАС была отмечена у лиц с повышенной тревожностью в поведении, склонных к депрессии либо страдающих ею (Amsterdam J.D. et al., 1987; Arborelius L. et. al., 1999; Holsboer F., 1999, 2000; Шаляпина В.Г., 2005), а также у животных с депрессивноподобным типом поведения (Dirks A. et al., 2003; Шаляпина В.Г., 2005; Boyle M.P. et al., 2005, 2006). У лиц с повышенной агрессивностью отмечалось увеличение уровня DHEAS в крови (van Goozen S.H.M., et al., 1998; Buydens-Branchey L. and Branchey M., 2004; Graber J. et al., 2006). К сожалению, в литературе отсутствуют сведения о характере возрастных изменений функционирования ГГАС у индивидов с различным типом поведения. Кроме того, подавляющее большинство данных по этой проблеме было получено в экспериментах с использованием грызунов, ведущих ночной образ жизни и существенным образом отличающихся от человека по характеру функционирования ГГАС. Так, кора надпочечников грызунов не секретирует DHEAS и F, а секреция кортикостерона претерпевает циркадианный ритм, противоположный циркадианному ритму секреции F у человека (Гончарова Н.Д. и др., 2002; Гончарова Н.Д. и др., 2005).

В связи с этим, большую актуальность представляют исследования, направленные на изучение как возрастных, так и индивидуальных особенностей функционирования ГГАС и АОФС эритроцитов в условиях психоэмоционального стресса с учётом принадлежности индивидов к группам с различными поведенческими стратегиями на адекватной животной модели. Лабораторные приматы, в частности макаки резусы (Macaca mulatta), вследствие развитой психоэмоциональной сферы и большого сходства по основным параметрам функционирования ГГАС (циркадианному ритму, характеру стероидогенеза), а также эритроцитарной АОФС с человеком (Чирков А.М. и др., 1987; Hornsby P.J., 1995; Kemnitz J.W. et al., 2000; Гончарова Н.Д. и др., 2002; 2003; Muehlenbein M.P. et al., 2003), по-видимому, представляет одну из наиболее перспективных животных моделей.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилось изучение возрастных и индивидуальных особенностей функционирования ГГАС и надёжности антиоксидантной ферментной защиты эритроцитов в условиях психоэмоционального стресса в эксперименте на лабораторных приматах - самках макак резус.

Основные задачи исследования

1. Изучение функционирования ГГАС и надёжности антиоксидантной ферментной защиты эритроцитов у самок макак резус разного возраста в условиях умеренного острого психоэмоционального стрессового воздействия (нежесткой двухчасовой иммобилизации в метаболических клетках);

2. Изучение особенностей функционирования ГГАС и эритроцитарной АОФС у самок макак резус разного возраста и с различными типами адаптивного поведения в условиях стресса, обусловленного изменением условий жизни, частично сглаженного вследствие предварительной адаптации животных.

Положения, выносимые на защиту

1. АОФС эритроцитов у самок макак резус в условиях острого психоэмоционального стрессового воздействия в послеполуденное время подвергается выраженным возрастным изменениям. Активность ГР увеличивается в большей степени у молодых, чем у старых животных; активность СОД у молодых животных снижается, в то время как у половины старых животных - повышается; интенсивность процессов ПОЛ увеличивается у старых животных и не претерпевает существенных изменений у молодых животных. Данные возрастные нарушения могут являться важным патогенетическим фактором активизации свободнорадикальных процессов в эритроцитах и нарушения транспорта кислорода к тканям.

2. Возрастные изменения активности ГГАС и АОФС эритроцитов характеризуются выраженными индивидуальными различиями, ассоциированными с особенностями адаптивного поведения животных (агрессивное, адекватное и депрессивноподобное). Наиболее выраженным возрастным изменениям подвергается функция ГГАС и АОФС эритроцитов у животных с депрессивноподобным типом поведения: максимальное возрастание коэффициента F/DHEAS, снижение амплитуды циркадианного ритма F, увеличение базальной активности ГР и минимальное снижение её стресс-реактивности.

3. Ассоциируемые с депрессивноподобным типом поведения возрастные нарушения в характере функционирования ГГАС и эритроцитарной АОФС могут указывать на предрасположенность индивидов с таким поведением к процессам преждевременного и / или ускоренного старения и развитию возрастной патологии.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование эндокринных, клеточных и поведенческих реакций организма на психоэмоциональное стрессовое воздействие в эксперименте на адекватной животной модели - самках макак резус (Macaca mulatta).

Выявлено, что возрастные изменения в реакции коры надпочечников на острое психоэмоциональное стрессовое воздействие в послеполуденные часы более характерны для животных с агрессивным и адекватным условиям эксперимента поведением.

Получены оригинальные данные об особенностях функционирования АОФС эритроцитов - одной из важнейших периферических стресс-лимитирующих систем - в условиях острого стрессового воздействия в разные возрастные периоды. В то время как у молодых животных регистрировалось выраженное увеличение активности ГР и понижение активности СОД, у старых животных увеличение активности ГР носило менее выраженный характер, а активность СОД в 50% случаев, наоборот, увеличивалась.

Впервые экспериментально показана взаимосвязь между нарушением стресс-реактивности эритроцитарной ГР и СОД и активацией процессов ПОЛ в эритроцитах у старых индивидов. Нарушение стресс-реактивности ГР и СОД у старых животных сопровождалось интенсификацией процессов ПОЛ, что неизбежно приводит к нарушению подвижности эритроцитов и, соответственно, транспорта кислорода к тканям.

Получены оригинальные данные о взаимосвязи особенностей поведенческой стратегии обезьян в условиях стресса с особенностями функционирования ГГАС и АОФС эритроцитов, а также характером их возрастных изменений. При старении происходят изменения, которые характеризуют группу животных с депрессивноподобным поведением как наиболее неблагополучную в плане устойчивости к психоэмоциональным стрессовым воздействиям и развитию возрастной патологии.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты, полученные в ходе проведенных экспериментов, а также при анализе литературных источников, вносят существенный вклад в понимание нарушений, происходящих при старении в ГГАС и эритроцитарной АОФС, их роли в развитии возрастной патологии.

Большой теоретический и практический интерес представляют обнаруженные искажения стресс-реактивности ГГАС и эритроцитарной АОФС, происходящие при старении. В этой связи повышение концентрации продуктов ПОЛ в эритроцитах периферической крови у старых животных в ответ на иммобилизационный стресс является доказательством снижения надёжности антиоксидантной ферментной защиты эритроцитов.

Большое теоретическое и практическое значение представляют данные о наличии двух типов стресс-реактивности СОД у старых животных: со снижением активности (по типу молодых животных) и с ее повышением, обусловленное, предположительно, различной скоростью протекания процессов старения в АОФС.

Обозначенные выше изменения в реакции ГГАС и эритроцитарной АОФС в ответ на острое стрессовое воздействие могут являться важным звеном в процессе формирования возрастных нарушений функционирования эритроцитов и надёжности кислородного транспорта к тканям в условиях острого психоэмоционального стрессового воздействия. Данная особенность стареющего организма представляет теоретический интерес в плане изучения физиологических и биохимических особенностей функционирования организма и имеет высокую практическую значимость при проведении лечения и назначении курса комплексных оздоровительных реабилитационных мероприятий.

Обоснована необходимость использования индивидуального подхода при изучении особенностей функционирования организма в условиях стресса, поскольку усреднённые данные, получаемые в большинстве других экспериментов, не в полной мере отражают особенности реакции индивидов на стрессовые воздействия.

Большой теоретический интерес представляют данные о характере функционирования ГГАС и эритроцитарной АОФС в условиях стресса у особей с различными поведенческими стратегиями в разные возрастные периоды.

Высокая практическая значимость полученных в данном исследовании результатов обусловлена возможностью их использования при разработке критериев раннего прогнозирования развития процессов преждевременного старения и возрастной патологии и их дальнейшей профилактики.

Апробация работы. Положения диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); I Всероссийской студенческой научно-практической конференции (Сочи, 2007); Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (Сочи-Адлер, 2007); XXXV Научной конференции студентов и молодых ученых вузов Южного федерального округа (Краснодар, 2008); V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Украина, Харьков, 2008); II Санкт-Петербургском международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2008), II Съезде физиологов стран СНГ (Молдова, Кишинэу, 2008), 1-ой Конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологии (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых российских и зарубежных журналах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список цитированной литературы включает 76 отечественных и 256 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами.

Содержание работы

антиоксидантный макака стресс адаптивный

Материалы и методы исследования

Общая характеристика экспериментов и экспериментальных животных

Экспериментальное исследование было выполнено на базе лаборатории эндокринологии (руководитель - д.б.н. Н.Д. Гончарова) НИИ МП РАМН, Сочи-Адлер (директор - академик РАМН Б.А. Лапин).

В экспериментах было использовано 50 здоровых молодых половозрелых (6-8 лет) и 37 старых (20-27 лет) самок макак резус, содержащихся в питомнике НИИ МП РАМН. Масса тела молодых обезьян составляла 5,3 ± 0,2 кг, старых животных - 5,5 ± 0,1 кг. Животные обычно содержались в вольерах либо клетках для группового содержания, а на время экспериментов были отсажены в индивидуальные метаболические клетки в изолированное помещение с контролируемыми температурой (20-25єС) и световым режимом (свет с 06.00 ч до 18.00 ч). Эксперименты проводились в летне-осенний период (июнь-сентябрь), когда овариально-менструальные циклы у самок данного вида обезьян обычно отсутствуют.

Состояние здоровья животных контролировалось неинвазивными методами (по подвижности животного, состоянию волосяного покрова, стула, мочи, микробиологическим показателям ректальных мазков, цвету и степени набухания «половой кожи»), а также по общему и биохимическому анализу крови. Животные получали привычное для них сбалансированное питание в виде гранулированного корма, изготавливаемого по технологии фирмы «Altromin» (Германия), дополнительно хлеб, вареное яйцо, свежие овощи и фрукты, а также воду в неограниченном количестве.

В течение четырёх недель животные подвергались адаптации к пребыванию в метаболических клетках и процедуре взятия образцов крови. Ранее было показано, что срок 3-4 недели является достаточным для установления нормального гормонального баланса и суточного ритма секреторной активности стероидпродуцирующих желез, характерного для низших обезьян (Таранов А.Г., 1981; Чирков А.М. и др., 1987).

Поведение животных оценивалось как в адаптационный период, так и собственно экспериментальный. Оценка поведения проводилась с учётом ранее опубликованных рекомендаций для лабораторных приматов (Butter C.M. and Snyder D.R., 1972; Чирков А.М. и др., 1987; 1989; Arborelius L. et al., 1999). В зависимости от особенностей поведения обезьяны были распределены в три типологических группы: I группа - животные с активным, агрессивным типом поведения, II группа - с активным, адекватным условиям эксперимента поведением и III группа - с преимущественно пассивным, депрессивноподобным поведением.

В I группу вошло 9 молодых и 8 старых животных, во II группу - 20 молодых и 14 старых животных, в III группу - 21 молодое животное и 15 старых животных.

Животные I группы характеризовались неадекватной агрессивно-оборонительной реакцией на исследователей и процедуру взятия образцов крови (демонстрацией угрозы с помощью пристального взгляда, раскрывания рта без демонстрации зубов, лая, имитации различных поз готовности к прыжку в сторону экспериментатора, кусанием прутьев решетки и др.), которая не только не исчезала к концу адаптационного периода, но и сохранялась в течение всего эксперимента. Животные этой группы всегда пытались помешать процедуре венепункции, а пищевое подкрепление (фрукты, печенье, конфеты), используемое для угасания оборонительного рефлекса на эту процедуру, как правило, с угрозой выхватывали из рук экспериментатора.

У животных II группы ориентировочная реакция на экспериментаторов исчезала уже через 2-4 недели адаптационного периода. Эти животные в дальнейшем легко вступали в контакт с исследователями, были дружелюбны; сидели, главным образом, у передней решетки клетки; пищевое подкрепление принимали спокойно. Для взятия образцов крови часто самостоятельно подавали передние конечности и сидели лицом к экспериментатору во время самой процедуры.

Животные III группы характеризовались гиперболизированной ориентировочной реакцией на экспериментаторов, которая не исчезала не только к концу адаптационного периода, но сохранялась до окончания эксперимента. Для обезьян такого типа было характерно длительное замирание в сгорбленных позах, скованность и неестественность поз, общая заторможенность, попытки лечь на дно клетки, забиться в угол. Такие животные всячески сопротивлялись взятию образцов крови, а во время этой процедуры всегда занимали позу, позволяющую изолироваться от экспериментатора (головой вниз, спиной к экспериментатору), не реагировали на пищевое подкрепление в присутствии экспериментаторов.

После четырёхнедельного периода адаптации обезьян к пребыванию в метаболических клетках и процедуре взятия образцов крови, проводились собственно эксперименты, направленные на решение первой задачи диссертационного исследования (изучение возрастных особенностей реакции ГГАС и надёжности антиоксидантной ферментной защиты эритроцитов в условиях острого психоэмоционального стресса; эксперимент 1) и второй задачи (изучение индивидуальных особенностей функционирования ГГАС и АОФС эритроцитов в условиях стресса; эксперимент 2).

Описание экспериментов

Эксперимент 1. Изучение особенностей функционирования ГГАС, эритроцитарной АОФС и интенсивности процессов ПОЛ в эритроцитах крови у самок макак резус разного возраста в условиях умеренного острого психоэмоционального стрессового воздействия.

Десять молодых и 10 старых самок макак резус в 15.00 ч подвергались острому умеренному психоэмоциональному стрессовому воздействию - ограничению подвижности (иммобилизации) в течение 2 ч. Ограничение подвижности достигалось путем перемещения подвижной задней стенки метаболической клетки в сторону неподвижной передней стенки и прижатия животного к последней. Тело животного и конечности при этом не были жестко фиксированы. Взятие образцов крови проводили до начала стрессового воздействия (0 мин) и через 30, 60, 120 и 240 мин, а также 24 ч после начала иммобилизации. Эритроцитарную массу отделяли от плазмы и хранили до проведения анализов. В плазме крови определяли уровень F, в эритроцитарной массе - активность ГР, глутатионпероксидазы (ГП), глутатион-S-трансферазы (ГТ), СОД и интенсивность процессов ПОЛ.

Оценка как уровня F, так и активности антиоксидантных ферментов и интенсивности процессов ПОЛ проводилась без учета принадлежности животных к той или иной поведенческой группе.

Эксперимент 2. Изучение индивидуальных особенностей функционирования ГГАС и эритроцитарной АОФС у самок макак резус разного возраста в условиях стресса, обусловленного изменением условий жизни, частично сглаженного вследствие предварительной адаптации животных, с учетом принадлежности животных к той или иной поведенческой группе.

Данный эксперимент представлял собой серию экспериментов (2А, 2Б, 2В).

Эксперимент 2А. Изучение концентрации F, DHEAS и их соотношения в плазме крови и активности ГР в эритроцитах.

У 34 молодых и 34 старых самок макак резус с различным типом поведения (8 особей каждого возрастного диапазона относились к I группе, 13 - ко II группе и 13 - к III группе) проводилось взятие образцов крови в 09.00 ч. В плазме полученных образцов крови определялся уровень F и DHEAS и рассчитывалось соотношение их молярных концентраций (коэффициент F/DHEAS). В эритроцитарной массе, собранной от образцов крови 23 молодых и 23 старых животных (5 особей каждой возрастного диапазона относились к I группе, 9 - ко II группе и 9 - к III группе) определялась активность ГР.

Эксперимент 2Б. Изучение циркадианного ритма концентрации F в плазме крови.

У 28 молодых и 28 старых самок макак резус с различным типом поведения (6 особей каждого возрастного диапазона относились к I группе, 11 - ко II группе и 11 - к III группе) проводилось взятие образцов крови 2 раза в сутки с учетом циркадианного ритма секреции коры надпочечников (в 09.00 ч и 21.00 ч). В полученных образцах плазмы крови определялся уровень F. Амплитуда циркадианного ритма концентрации F в плазме крови рассчитывалась как разность между максимальными значениями F (в 09.00 ч) и его минимальными значениями (в 21.00 ч.) в нмоль/л.

Эксперимент 2В. Изучение реакции ГГАС и эритроцитарной АОФС на умеренное острое психоэмоциональное стрессовое воздействие.

Тридцать четыре молодых и 34 старых самок макак резус с различным типом поведения (8 особей каждого возрастного диапазона относились к I группе, 13 - ко II группе и 13 - к III группе) подвергались острому психоэмоциональному стрессовому воздействию - двухчасовой нежесткой иммобилизации в метаболических клетках, по такой же схеме, что и в эксперименте 1. Животные подвергались стрессовому воздействию в 15.00 ч. Взятие образцов крови производилось до (0) и через 30, 60, 120 и 240 мин, а также 24 ч после начала иммобилизации. В полученных образцах плазмы крови определялся уровень F, а в образцах эритроцитарной массы от 14 молодых и 14 старых животных (6 особей каждого возрастного диапазона относились ко II группе и 8 - к III группе) проводилось измерение активности ГР.

Определение концентрации гормонов в плазме крови, активности антиоксидантных ферментов и интенсивности процессов ПОЛ в эритроцитах крови

Все образцы крови (2,5-3,0 мл) были взяты из локтевой либо из бедренной вены животных натощак с иcпользованием гепарина в качестве антикоагулянта и немедленно центрифугировались при 2000 g и температуре +4єС. Плазму и эритроциты отделяли друг от друга и хранили при -70єС.

Содержание F и DHEAS в образцах плазмы крови определялось иммуноферментными методами с помощью стандартных наборов реактивов («Алкор-Био», Санкт-Петербург - для F и «DSL», США - для DHEAS). Коэффициент вариации уровня гормонов в пределах одной реакции для каждого образца крови не превышал 10%, разных реакций - 15%. Эритроциты подвергали гемолизу и гемолизаты сразу же после приготовления использовали для определения активности антиоксидантных ферментов: СОД (EC 1.15.1.1, Cu, Zn-SOD), ГР (EC 1.6.4.2), ГП (EC 1.11.1.9), ГТ (EC 2.5.1.18). Активность СОД измерялась полярографическим методом (Rigo A. et al., 1975) в Институте проблем химической физики РАН (г. Черноголовка) к.б.н. Т.Н. Богатыренко. Активность ГР, ГП, ГТ измерялась кинетическими спектрофотометрическими методами (Beutler E., 1975). Интенсивность процессов ПОЛ измерялась по концентрации продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) спектрофотометрическим методом (Ohkawa Y. et al., 1979). Активность СОД, ГР, ГП, ГТ и уровень ТБК-АП вычислялись в отношении к уровню общего белка, который определялся по методу Лоури (Lowry O.H. et al., 1951). Активность ГР выражалась в нмоль НАДФН за 1 мин на 1 мг общего белка эритроцитов, ГП - в ммоль восстановленного глутатиона (GSH) в 1 мин на 1 мг общего белка эритроцитов, ГТ - в мкмоль конъюгата глутатиона с 1-хлор - 2,4 - динитробензолом (GSДНБ) за 1 мин на 1 мг общего белка эритроцитов, СОД - в ммоль фермента на 1 мг общего белка эритроцитов, уровень ТБК-АП - в нмоль малонового диальдегида на 1 мг общего белка эритроцитов.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов исследования производилась общепринятыми статистическими методами с использованием дисперсионного (ANOVA) и корреляционного анализа, t-критерия Стьюдента на базе статистических приложений к программе MS Office Excel 2000. Данные в таблицах и рисунках представлены в виде среднего арифметического ошибка среднего арифметического (Mm).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Особенности функционирования ГГАС, эритроцитарной АОФС и ПОЛ в эритроцитах крови у самок макак резус разного возраста в условиях острого психоэмоционального стрессового воздействия

Рис. 1. Динамика уровня F в плазме крови (а) и активности эритроцитарной ГР (б) у молодых и старых самок макак резус в ответ на острое стрессовое воздействие (M ± m).

** p<0,01; *** p<0,001 - по отношению к соответствующим значениям до начала иммобилизации (0 мин) у молодых животных;

¹⁾** p<0,01; ¹⁾*** p<0,001 - по отношению к соответствующим значениям F до начала иммобилизации (0 мин) у старых животных;

²⁾* p<0,05 - возрастные различия

Как видно из рисунка 1а, концентрация F увеличивалась как у молодых, так и у старых животных, при этом максимальный подъем уровня F в плазме периферической крови у старых животных был существенно ниже по сравнению с молодыми животными (1300 ± 90 нмоль/л против 1572 ± 80 нмоль/л у молодых животных, p<0,05).

В ответ на стрессовое воздействие существенно увеличивалась активность ГР у молодых животных, в то время как повышение активности ГР у старых животных было менее выраженным по сравнению с молодыми животными и не носило статистически значимого характера (рис. 1б). Кроме того, за исключением исходных значений, достоверных возрастных различий в динамике активности ГР в ответ на стрессовое воздействие выявлено не было. По-видимому, это обусловлено более высокой базальной активностью ГР у старых животных. Однако, возрастные различия выявлялись при выражении активности ГР в процентах от базального уровня с более высокой стресс-реактивностью ГР у молодых животных, поскольку исходный уровень активности этого фермента у них был ниже (табл. 1).

Таблица 1. Динамика активности ГР (нмоль НАДФН/мин/мг белка) в эритроцитах крови у молодых и старых самок макак резус в ответ на острое стрессовое воздействие (M ± m, % от исходного уровня)

* p<0,05 - возрастные различия

У молодых животных между активностью ГР и концентрацией F отмечалась тесная положительная корреляционная зависимость в течение всех четырех часов эксперимента. Так, коэффициент корреляции между динамикой концентрации F и динамикой активности эритроцитарной ГР в интервале 0-240 мин составлял r = 0,78 ± 0,09. На протяжении же первых двух часов величина коэффициента корреляции приближалась к 1 (r = 0,98 ± 0,04). У старых обезьян, в отличие от молодых обезьян, отмечалась слабая корреляция между динамикой активности ГР в эритроцитах и динамикой уровня F в плазме крови. Так, коэффициент корреляции в диапазоне от 0 до 240 мин был равен 0,52 ± 0,15, а в диапазоне от 0 до 120 мин составил 0,67 ± 0,13.

В отличие от активности ГР, активность СОД у молодых самок макак резус в ответ на стрессовое воздействие, наоборот, снижалась (рис. 2а).

Рис. 2. Динамика активности СОД в эритроцитах крови у молодых (а) и старых (б) самок макак резус в ответ на острое стрессовое воздействие (M ± m).

* p<0,05; ** p<0,01 - по отношению к уровню СОД до начала иммобилизации (0 мин) у молодых обезьян и в 1-й подгруппе старых обезьян; ¹⁾* p<0,05; ¹⁾** p<0,01 - по отношению к соответствующим значениям активности СОД до начала иммобилизации (0 мин) во 2-й подгруппе старых обезьян; ²⁾*** p<0,001 - по отношению к величине базальной активности СОД во 2-й подгруппе старых обезьян

По базальной активности СОД и по характеру изменений СОД в условиях стресса старые животные были сгруппированы в 2 подгруппы. Первую подгруппу составили 5 животных, у которых базальная активность СОД и ее динамика в ответ на стрессовое воздействие были аналогичны таковым у молодых животных (рис. 2б). Вторую подгруппу составили 5 старых животных, у которых базальная активность СОД была достоверно ниже, чем у животных первой подгруппы (соответственно 6,28 ± 0,24 и 8,50 ± 0,10 ммоль/мг белка, p<0,001) и повышалась в ответ на стрессовое воздействие в отличие от старых животных первой подгруппы и молодых животных (рис. 2б).

Активность эритроцитарных ГП и ГТ не претерпевала существенных изменений в условиях стресса (табл. 2).

Таблица 2. Динамика активности ГП и ГТ в эритроцитах крови у молодых и старых самок макак резус в ответ на острое стрессовое воздействие (M ± m)

Концентрация ТБК-АП в эритроцитах крови в ответ на острое стрессовое воздействие значимо увеличивалась у старых животных, в то время как у молодых животных не претерпевала достоверных изменений (табл. 3).

Таблица 3. Динамика уровня ТБК-АП (нмоль/мг белка) в эритроцитах крови у молодых (n=5) и старых (n=5) самок макак резус в ответ на острое психоэмоциональное стрессовое воздействие (M ± m).

* p<0,05 - по отношению к соответствующим значениям до начала иммобилизации (0 мин)

Таким образом, подтверждено наличие выраженных возрастных изменений в реакции ГГАС и эритроцитарной ГР, отмечаемое ранее у небольшой группы животных (Гончарова Н.Д. и др., 2006; 2007; Goncharova N.D., 2006; Шмалий А.В., 2007). Кроме того, выявлены выраженные возрастные различия в реакции эритроцитарной СОД в ответ на острое стрессовое воздействие в послеполуденные часы. При этом тесная корреляционная связь между изменениями уровня F и активности ГР в условиях стресса, а также её снижение при старении указывают на важную роль нарушений стресс-реактивности ГГАС в развитии возрастных нарушений стресс-реактивности ГР эритроцитов. Наряду с повышением активности ГР выявлялось снижение активности СОД в эритроцитах у молодых животных. У половины старых животных активность СОД в базальных условиях носила сходный с молодыми животными характер. У другой половины старых животных (2-я подгруппа) базальная активность СОД была существенно ниже по сравнению как с молодыми животными, так и животными 1-й подгруппы, в ответ же на стрессовое воздействие она повышалась.

Возрастные нарушения стресс-реактивности эритроцитарных ГР и СОД, по-видимому, являются основной причиной активации ПОЛ, в эритроцитах у старых животных. Активация ПОЛ, в свою очередь, неизбежно приводит к повреждению клеточной мембраны эритроцитов, что сопровождается нарушением их функциональной активности, и, по-видимому, снижением надежности транспорта кислорода к тканям. Это заключение согласуется с литературными данными выявившими увеличение интенсивности ПОЛ и снижение электрофоретической подвижности эритроцитов в условиях острого стресса у грызунов (Крылов В.Н. и Дерюгина А.В., 2005).

2. Индивидуальные особенности функционирования ГГАС и эритроцитарной АОФС у самок макак резус разного возраста в условиях стресса, обусловленного изменением условий жизни, частично сглаженного вследствие предварительной адаптации животных

2.1. Особенности функционирования коры надпочечников у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения

Не было отмечено статистически значимых различий в концентрации F ни между группами молодых и старых обезьян с одинаковым поведением (т.е. возрастных изменений), ни между различными поведенческими группами в каждом возрастном диапазоне (табл. 4). Отмечалась, однако, тенденция к более высоким концентрациям F у животных с депрессивноподобным поведением как в молодом, так и старом возрасте.

Таблица 4. Концентрация F (нмоль/л) в плазме крови у самок макак резусов разного возраста с разным типом поведения (М±m)

Результаты исследования уровня DHEAS в крови у молодых и старых самок макак резус с разным типом поведения (табл. 5) позволили выявить статистически достоверное увеличение уровней DHEAS у молодых животных I группы по сравнению с молодыми животными II и III групп и отсутствие каких-либо статистически значимых различий у старых животных с различной поведенческой стратегией. С возрастом концентрация DHEAS в крови резко снижалась у животных всех исследуемых групп (табл. 5). Наибольшим возрастным изменениям подвергалась концентрация DHEAS в I группе животных (в 5,07 раз), а наименьшим - во II группе (в 1,96 раз).

Таблица 5. Концентрация DHEAS (нмоль/л) в плазме крови у самок макак резусов разного возраста с разным типом поведения (М±m)

* p<0,05; ** p<0,01 - отличия от агрессивных животных; ¹⁾*** p<0,001 - возрастные отличия

Более высокая концентрация DHEAS у молодых животных с агрессивным типом поведения хорошо согласуется с результатами клинических исследований, выявивших повышение уровня DHEAS в крови у агрессивных людей (van Goozen S.H.M., et al., 1998; Buydens-Branchey L. and Branchey M., 2004; Graber J. et al., 2006). Выявленное снижение уровня DHEAS также хорошо согласуется с литературными данными о снижении секреции адреналовых андрогенов в процессе старения у человека и различных видов обезьян (Гончарова Н.Д., 1993, 1997, 2005; Sapolsky R.M. et al., 1993; Goncharova N.D. et al. 2000, 2002; Kemnitz J.W., et al., 2000; Muehlenbein M.P. et al., 2003).

Снижение уровней DHEAS с возрастом может способствовать прогрессированию процессов старения и развитию возрастной патологии, поскольку известно регулирующее влияние DHEA и DHEAS на функции головного мозга и иммунной системы, липидный и углеводный обмен, процессы роста и деления клеток (Diamond D.M. et al., 1995; Majewska M.D., 1995; Muller C. et al., 2006). Кроме того, DHEAS оказывает антагонистическое действие по отношению к F, избыток которого токсичен для организма и способствует развитию процессов старения и возрастной патологии (Blauer K.L. et al., 1991; Uno H. et al., 1994; Diamond D.M. et al., 1995; Гончарова Н.Д. и др., 2005).

Соотношение молярных концентраций F и DHEAS в плазме периферической крови (коэффициент F/DHEAS), рассматривается в качестве биомаркера предрасположенности к преждевременному и / или ускоренному старению и развитию возрастной патологии у человека и обезьян. Увеличение коэффициента F/DHEAS при старении отмечалось многими авторами у человека и разных видов обезьян. Повышение этого коэффициента, равно как и снижение уровня адреналовых андрогенов, сопряжено и с нарушением адаптации организма к стрессовым воздействиям (Анциферова Н.Д., 1997; Гончарова Н.Д., 1997; Ferrari E. et al., 2000, 2008; Гончарова Н.Д. и др., 2002, 2005; Morgan C.A. et al., 2004; Grillon C. et al., 2005).

Результаты исследований коэффициента F/DHEAS у молодых и старых самок макак резус с разным типом поведения (табл. 6) также выявили достоверное повышение этого коэффициента при старении. Однако, впервые было показано, что величина коэффициента F/DHEAS зависит от принадлежности животного к той или иной типологической группе. Так, самые высокие показатели этого коэффициента отмечались у животных с депрессивноподобным типом поведения как в молодом, так и в старом возрасте (табл. 6). Стало быть, можно полагать, что животные с таким типом поведенческой стратегии являются наиболее уязвимыми в плане устойчивости к преждевременному и / или ускоренному старению и развитию возрастной патологии.

Таблица 6. Величина соотношения молярных концентраций F и DHEAS в плазме крови у самок макак резусов разного возраста с разным типом поведения (М±m)

* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 - возрастные различия; ¹⁾* p<0,05; ¹⁾** p<0,01 - отличия от молодых агрессивных животных; ²⁾* p<0,05 - отличия от старых агрессивных животных

У агрессивных животных наряду с наиболее выраженным снижением при старении уровня DHEAS отмечалось наиболее резкое увеличение коэффициента F/DHEAS (в 3,4 раза). В то же время у старых животных II группы коэффициент F/DHEAS увеличивался в 1,77 раза, а у животных III группы - в 2,51 раза. Это обстоятельство дает основание полагать, что животных с агрессивным типом поведения вряд ли можно рассматривать как наиболее устойчивых к возрастным нарушениям. Минимальная амплитуда изменений как уровня DHEAS, так и коэффициента F/DHEAS у животных с адекватным типом поведения указывают на наибольшую устойчивость индивидов именно такого типа к процессам старения.

У обезьян и у людей неоднократно отмечалось снижение с возрастом амплитуды циркадианного ритма уровня F в плазме крови, что дало основание рассматривать этот показатель в качестве биомаркера старения (Deuschle M. et al., 1997; Goncharova N.D. et al., 2000; 2006; Toutou Y. and Haus E., 2000; Ferrari et al., 2001; Гончарова Н.Д. и др., 2002; 2007; Goncharova N.D., 2006). Однако эти исследования были проведены без учета типологических особенностей индивидов. Изучение амплитуды циркадианного ритма концентрации F в плазме крови у молодых и старых самок макак резус с разным типом поведения позволило выявить (табл. 7), что только у обезьян с депрессивноподобным типом поведения наблюдалось ее значимое снижение при старении.

Таблица 7. Амплитуда циркадианного ритма концентрации F в плазме крови у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения (M ± m)

* p<0,05 - отличия от животных с депрессивноподобным поведением;

¹⁾* p<0,05 - возрастные различия

Вследствие этого было выявлено, что амплитуда циркадианного ритма F у старых животных с депрессивноподобным поведением статистически значимо ниже по сравнению с животными других поведенческих групп (табл. 7).

Данный факт позволяет считать животных этой группы наименее устойчивыми к процессам старения. У обезьян с адекватным типом поведения циркадианный ритм концентрации F в крови характеризовался высокой стабильностью в процессе старения, что свидетельствует о высокой степени резистентности животных этой группы к возрастным нарушениям.

Изучение динамики уровня F (% от исходного уровня) в плазме крови у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения в ответ на стандартизированное острое стрессовое воздействие (двухчасовую нежесткую иммобилизацию в метаболических клетках), нанесенное в 15.00 ч позволило выявить (рис. 3) достоверное снижение стресс-реактивности ГГАС у животных I и II типологических групп.

Рис. 3. Динамика изменения уровня F в плазме крови у самок макак резусов разного возраста с разным типом поведения в ответ на острое стрессовое воздействие (М±m, % от базального уровня)

* p<0,05; ** p<0,01 - возрастные различия

Данное наблюдение согласуется с результатами первой части настоящего диссертационного исследования, а также с результатами ранее проведенных в нашей лаборатории работ, выявивших более высокую стресс-реактивность ГГАС в послеполуденные часы в небольшой группе молодых самок макак резус по сравнению со старыми животными не подразделяемыми по особенностям индивидуального поведения (Гончарова Н.Д. и др., 2006, 2007; Goncharova N.D., 2006).

У старых самок макак резус с депрессивноподобным поведением (рис. 3), в отличие от животных с агрессивным и адекватным поведением не было выявлено снижения стресс-реактивности коры надпочечников. Однако, принимая во внимание вышеприведенные данные о формировании у животных с таким типом поведения расстройств в характере функционирования ГГАС, указывающие на предрасположенность таких животных к процессам преждевременного старения и развитию возрастной патологии, было бы ошибочным считать отсутствие изменений в стресс-реактивности коры надпочечников у старых животных с депрессивноподобным поведением благоприятным в плане устойчивости к процессам старения. Можно полагать, что сохранение высокой стресс-реактивности ГГАС в послеполуденные часы у старых животных III группы свидетельствует не о их физиологическом сходстве с молодыми животными, а лишь о высокой чувствительности животных этой группы к стрессовым воздействиям, что приводит к постоянному избыточному уровню F, который является токсичным для организма, по сравнению с животными I и II групп.

2.2. Особенности функционирования эритроцитарной АОФС у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения

Как было показано выше, в условиях стрессовых воздействий и в процессе старения наибольшим изменениям подвергается активность эритроцитарной ГР. Поэтому особый интерес представляло изучение зависимости активности ГР от принадлежности животных к той или иной поведенческой группе в разные возрастные периоды.

Результаты исследования активности ГР в эритроцитах периферической крови у молодых и старых самок макак резус позволили установить (табл. 8), что при старении активность эритроцитарной ГР достоверно увеличивается только в группе животных с депрессивноподобным типом поведения.

Таблица 8. Активность ГР в эритроцитах крови у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения в 09.00 ч (М±m)

* p<0,05 - отличия от старых животных с адекватным типом поведения;

¹⁾* p<0,05 - возрастные различия

Обезьяны с адекватным типом поведения вне зависимости от возраста характеризовались наименьшей активностью эритроцитарной ГР. У этих обезьян не было обнаружено даже тенденции к увеличению активности ГР с возрастом (табл. 8). Увеличение активности эритроцитарной ГР в процессе старения отмечалось также в ряде клинических и экспериментальных исследований (Andersen H.R. et al., 1998; Goncharova N.D., 2006; Goncharova N.D. et al., 2006; Шмалий А.В., 2007). Однако в этих работах не проводился анализ зависимости возрастных изменений активности ГР от типологических особенностей индивидов.

При оценке характера изменений активности ГР в ответ на стандартизированное острое стрессовое воздействие (двухчасовую нежесткую иммобилизацию в метаболических клетках) в 15.00 ч было выявлено, что базальная активность ГР различалась у животных с разным типом поведения. У молодых животных с депрессивноподобным поведением базальная активность ГР была выше, чем у молодых животных с адекватным поведением (0,525±0,069 нмоль НАДФН/мин/мг белка против 0,318±0,058 нмоль НАДФН/мин/мг белка соответственно, p<0,05).

В ответ на иммобилизацию у молодых животных с адекватным типом поведения увеличение активности ГР было существенно выше по сравнению со старыми животными (рис. 4а), аналогично тому, что было выявлено при изучении стресс-реактивности F у обезьян с адекватным поведением (см. рис. 3).