Клеточная инженерия

Размещено на http://www.allbest.ru

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ



Клеточная инженерия является одним из основных разделов биотехнологии. Под клеточной инженерией в широком смысле понимают культивирование в асептических условиях среды вне организма (in vitro) изолированных клеток и тканей растений, животных и микроорганизмов, а также различные манипуляции с ними (слияние, размножение и др.). Культура клеток и тканей растений in vitro основана на трех принципах:

1. Необходимость изолирования экспланта (клетка, кусочек ткани,орган) от материнского растения.

2. Культивирование экспланта в регулируемых условиях, определяемых химическим составом питательной среды, а также физическими условиями (интенсивность освещения, длина дня и спектральный состав света, температурный режим, влажность воздуха, газовый состав культуральных сосудов).

3. Выполнение всех работ по культивированию клеток и тканей в стерильных условиях (стерилизация экспланта, питательной среды, культуральных сосудов и др.)

История развития клеточной инженерии растений началась в 19 веке. Главные вехи на этом пути представлены в таблице 1 (по Р.Пиерик, 1987, с изменениями). клеточный инженерия каллус морфогенез

Таблица 1

Этапы развития клеточной инженерии растений (по Р.Пиерик, с изменениями)

Год	Содержание этапа	Авторы
1	2	3
1902	Первые попытки культивирование тканей растений	Хаберландт
1922	Культивирование кончиков корней in vitro	Роббинс
1925	Эмбриокультура межвидовых гибридов льна	Лайбах
1934	Длительное культивирование растительных тканей в условиях in vitro	Готрэ
1934	Успешное культивирование корней томата	Уайт
1944	Получение адвентивных побегов в культуре in vitro табака	Скуг
1948	Образование адвентивных побегов и корней табака в зависимости от соотношения ауксина и аденина	Скуг, Цай
1954	Получение первого растения из одиночной клетки	Муйр и др.
1955	Открытие кинетина	Миллер и др
1957	Открытие регуляции образования органов (корней и побегов) путем изменения отношения цитокинин/ауксин	Скуг, Миллер
1958	Регенерация соматических зародышей in vitro из нуцеллуса	Магешвари, Рангасвами
1960	Первое успешное оплодотворение растения in vitro	Канта
1960	Ферментативное разрушение клеточной оболочки для получения большого количества протопластов	Кокинг
1962	Разработка широкого применения среды мурасиге и скуга	Мурасиге, Скуг
1964	Получение первого гаплоида из пыльцевых зерен	Гуха, Mагешвари
1965	Индукция цветения табака in vitro	Агион-Прат
1970	Селекция биохимических мутантов in vitro	Карлсон
1970	Впервые достигнуто слияние протопластов	Пауэр и др.
1971	Первое растение, регенерированное из протопластов	Такебе и др.
1974	Открытие Ti-плазмид	Зеанен и др. Ларебеке и др.
1975	Клеточная селекция кукурузы, устойчивой к гельминтоспориозу	Генегенбах, Грин
1976	Инициация побегов из криосохраненных апексов растений	Сейберт
1977	Успешная интеграция Ti-плазмидной ДНК из Agrobacterium tumefaciens в растения	Мельхерс и др.
1978	Соматическая гибридизация томата и картофеля	Чилтон и др
1981	Введение термина «сомакланальная изменчивость»	Ларкин, Скоукрофт
1982	Электрослияние протопластов	Зиммерманн

Большой вклад в развитие клеточной инженерии внесли биотехнологи СНГ. Р.Г. Бутенко (Институт физиологии растений, Москва) создала научную школу по культуре изолированных тканей и физиологии морфогенеза растений in vitro. Ю.Ю. Глеба, В.А. Сидоров и др. (Украинский биотехнологический центр, Киев) выполнили цикл исследований по соматической гибридизации и клеточной селекции растений. Н.А.Картель и др. (Институт генетики и цитологии НАН Беларуси) изучили генентические основы процессов каллусогенеза и регенерации у растений.

С переходом на культивирование клеток биологи получили мощный инструментарий для изменения наследственности организмов, получения принципиально новых форм, разработки новых технологий в селекции, семеноводстве, защите растений, повышения плодородия почв, защите окружающей среды и др.

Кратко рассмотрим основные направления использования достижений клеточной инженерии.

1. В области селекции с переходом на клеточный уровень стало возможным вести клеточную и гаметную селекцию на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, преодолевать барьеры нескрещиваемости и создавать принципиально новые формы, несущие различные наборы ядерных и цитоплазматических генов в результате соматической гибридизации, изменять уровень плоидности и ускорять селекционный процесс путем использования гаплоидов, сохранять генофонд в виде культуры клеток посредством криосохранения в жидком азоте. Следует также отметить, что технологии создания трансгенных растений, как правило, включают и культивирование клеток и тканей in vitro.

2. В области семеноводства создана индустрия производства оздоровленного от вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых культур (картофель, плодовые, ягодные, овощные, декоративные растения)

3. В области защиты растений получены на основе достижений генной и клеточной инженерии растения, устойчивые к насекомым, вирусам, болезням, и другим патогенам; созданы новые средства защиты растений путем культивирования бактерий и грибов (антагонистов патогенов), биологически активных веществ, полученных при культивировании организмов и т.д.

4. Путем клеточной инженерии созданы новые штаммы микроорганизмов, повышающие усвоение азота и фосфора, подавляющие развитие вредной микрофлоры, что позволяет конструировать микробоценоз, достигая повышения плодородия почвы и продуктивности растения.

Принципиально новые возможности открываются в области защиты окружающей среды. Новые штаммы микроорганизмов позволяют решить экологически безопасным путем проблему утилизации отходов промышленности и сельского хозяйства, получая при этом энергию. Этот же подход позволяет уменьшить действие поллютантов (тяжелые металлы, нефтепродукты, пестициды и др.) на экосистемы и человека.

Создание на основе генной и клеточной инженерии растений с максимальным накоплением поллютантов позволит извлекать их из загрязненного субстрата (почва, вода), а растения с минимальным накоплением дадут возможность получать экологически безопасную продукцию.

6. Культивирование новых микроорганизмов и растений-суперпродуцентов биологически активных веществ позволит более эффективно решить проблему создания и производства новых лекарств и препаратов для медицины и ветеринарии. Важным направлением практического применения клеточной инженерии является микробиологический синтез белка и незаменимых аминокислот.

Область применения достижений клеточной инженерии постоянно расширяется по мере пополнения методов культивирования клеток и тканей и различных манипуляций с ними и разработки этих подходов для новых видов растений, животных и микроорганизмов.



1. ИСТОЧНИКИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСПЛАНТОВ

Эксплантом для введения в культуру in vitro может быть практически любая часть растения (часть стебля, листа, корня, цветка, запасающих органов, семена, пыльца). Для введения в культуру in vitro экспланта главными являются две задачи: 1) добиться инициации роста и развития клеток и тканей экспланта; 2) обеспечить стерильность в сосудах для культивации. Успех введения в культуру определяется генетическими и физиологическими особенностями материнского растения и степенью его инфицированности микроорганизмами. Растения, выращенные в фитотроне, имеют значительно меньшую степень инфицированности микроорганизмами, в сравнении с растениями из теплиц и, тем более, полевых условий (табл.2)

Таблица 2

Среднее количество микроорганизмов на цветке томата в зависимости от условий культивирования (Боурне,1977)

Место выращивания растения	Растения	Инфицирование среды в культуре in vitro после дезинфекции (%)
	До дезинфекции	После дезинфекции
Поле	1300000	92000	100
Теплица	85520	1600	60
Фитотрон	90	43	30

Для быстрого выявления инфекции на первом этапе культивирования желательно использовать питательную среду Зао или среду Мурасиге и Скуга, дополненную 250 мг/л молочного альбумина.

Конкретный выбор экспланта определяется спецификой культуры, а также целью культивирования. Экспериментальный материал, вводимый в культуру in vitro, во многом определяет эффективность культивирования. Р.Пиерик (1987) обсудил основные аспекты этого вопроса.

Генотип. Регенерационная способность растения зависит в первую очередь от генетических особенностей (семейство, вид, сорт). Так, например, двудольные растения легче образуют каллус и регенерируют, чем однодольные. Среди двудольных лучше регенерируют представители семейств Solanaceae, Begoniaceae, Grassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae. Представители некоторых семейств (например, пасленовые) традиционно служат модельными объектами для отработки методик в культуре in vitro (табак). Имеется существенная сортовая специфика протекания морфогенетических процессов in vitro, что особенно важно при разработке технологий клонального микроразмножения растений.

2. Возраст растения. Эмбриональные ткани имеют более высокую регенерационную способность. С возрастом способность растений к регенерации уменьшается, поэтому молодые растения как источник эксплантов предпочтительнее старых.

3. Физиологическое состояние. Стадия развития и физиологическое состояние материнского растения определяют способность экспланта к активной пролиферации in vitro. Растения, вступившие в генеративную фазу; обычно снижают регенерационный потенциал в сравнении с находящимися в вегетативной фазе. Почки, взятые с растения, находящегося в состоянии покоя (поздняя осень или ранняя зима) труднее регенерируют в сравнении с почками, взятыми весной. Выведение органа, из которого вычленяется эксплант, из состояния покоя изменяет соотношения эндогенных регуляторов, повышая концентрацию стимуляторов (ауксины, цитокинины, гиббереллины) и уменьшая концентрацию ингибиторов (этилен, абсцизовая кислота). В связи с этим в некоторых случаях прибегают к предобработке материнского растения перед вычленения экспланта химическими (регуляторы роста) или физическими факторами (холодовая обработка и др) для изменения физиологического состояния и инициации ростовых процессов. На рост in vitro влияет также «состояние здоровья» растения. Угнетенные растения со слабыми ростовыми процессами менее эффективны. Условия при культивировании материнского растения изменяют его физиологическое состояние, способствуя накоплению запасных веществ и регуляторов роста и влияя на рост in vitro. Так, например, растения из теплиц (более вытянутые и этиолированые) обычно регенерируют лучше растений этого вида из открытого грунта.

4. Расположение экспланта на растении. У растений имеется так называемый градиент регенерации. Каждое растение отличается различной эффективностью регенерационных процессов из разных органов. Так, для лилии лучшими эксплантами являются луковичные чешуи. Листья и стебли не дают положительного результата (Французенок,1997).

Размер экспланта и метод инокуляции. Большие по размеру экспланты снабжены большим запасом питательных веществ, что положительно влияет на эффективность регенерации. Однако большие размеры экспланта могут повышать и вероятность инфицирования в культуре in vitro. На эффективность регенерации влияет также площадь раневой поверхности.В некоторых случаях она специально увеличивается для активизации образования каллуса.

Экспланты могут помещаться на среду полярно (основание к среде) и аполярно (основание выше среды, верхушка в среде). В ряде работ показано, что аполярное размещение способствует более быстрой регенерации корней и побегов.



2. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Стерильность является одним из основопологающих принципов культивирования клеток и тканей растений in vitro, поскольку питательная среда - отличный субстрат для развития микроорганизмов. Все манипуляции с культурой in vitro выполняются в ламинар-боксе, который подвергается стерилизации ультрафиолетом в течении 30 минут с последующим протиранием рабочих поверхностей 70%-ным спиртом.

Посуду, завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим паром в сушильном шкафу при температуре160⁰ С в течение двух часов или влажным жаром в автоклаве при 2 атмосферах в течение25-30 минут.

Стерилизацию экспланта проводят следующими агентами: 0,1% сулема; 0,1%диацид; 1% бром,3-6%-ный хлорамин, 5-10% гипохлорит (кальция,натрия), 10-12 % перекись водорода Концентрация и длительность экспозиции зависят от вида растения, экспланта и стерилизующего агента (см. табл. 2.3).Органы, используемые для получения экспланта моют щеткой с мылом, затем промывают дистиллированной водой и опускают на несколько секунд в 70%-ный этанол (семена на 1-2 минуты).После обработки основным стерилизующим агентом органы тщательно промываются стерильной водой для удаления антисептика.

Таблица 3.

Стерилизация исходного растительного материала (Р.Г.Бутенко, 1990)

Объекты	Время стерилизации, мин
	Диацид, 0,1%	Сулема, 0,1%	Гипохлориты Na, Ca, 5-9%	Перекись водорода, 10-12%
Семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
Семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
Ткани мясистого корня, клубня	20-30	15-25	15-20	-
Ткани стебля	20-40	20-25	20-25	-
Листья	1-3	0,5-3	3-6	3-5
Апексы	1-10	0,5-7	3-15	2-7

Для стерилизации питательных сред используют автоклавирование при температуре 120 ⁰ С и давлении 1 атмосфера в течение 20 минут. Термолабильные компоненты, разрушающиеся при автоклавировании, подвергают холодной стерилизации. Для этой цели используются бактериальные фильтры. Профильтрованные растворы смешиваются в ламинар-боксах с автоклавированной средой, охлажденной до 40 ⁰С.



3. УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОРГАНОВ, ТКАНЕЙ, КЛЕТОК И ПРОТОПЛАСТОВ НА ИСКУССТВЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Рост и развитие растений in vitro определяется их генетическими особенностями, физиологическим состоянием, а также химическими и физическими условиями культивирования. Химические условия связаны с составом питательной среды для культивирования, физические условия - свет, температура, рН, содержание О_2,, СО₂ и других газов.

Важным моментом культивирования является выбор культуральных сосудов. Обычно они выполняются из стекла или пластика. Стекло имеет преимущество в связи с возможностью автоклавирования и длительностью использования. Пластик не всегда можно автоклавировать. В ряде случаев пластик одноразового пользования упаковывается в стерильные пакеты. В качестве стеклянных сосудов могут быть пробирки, чашки Петри, колбы Эрленмейера и специальные сосуды с крышками, устойчивыми к автоклавированию. Пробирки и колбы могут закрываться ватно-марлевыми пробками, фольгой или специальной пленкой. Если пластик не автоклавируется, он подвергается стерилизации гамма-лучами. В такие сосуды простерилизованная питательная среда разливается в ламинар-боксах.

В больших сосудах культура in vitro растет лучше, чем в маленьких, что связано с увеличением объема воздуха и среды на одно растение, снижением концентрации токсичных газов (СО_2, этилен и др).

3.1 Основные принципы составления питательных сред

Компоненты среды

Вода. Питательные среды представляют собой водные растворы различной концентрации, поэтому качество воды играет большую роль. Для практических и исследовательских целей используют дистиллированную воду, для работы с протопластами и меристемами применяют двойной дистиллят

Агар-агар.Твердая консистенция питательной среды определяется наличием в ней агар-агара - полисахарида, получаемого из морских водорослей. Оптимальная концентрация агара - 0,6-0,8 %. Возможно культивирование клеток и тканей на жидкой питательной среде или на заменителях агара (синтетические полимеры, минеральная вата, мостики из фильтрованной бумаги и др). Один из вариантов культивирования - двухфазная среда. В этом случае на твердую питательную среду высаживается эксплант, а затем добавляется жидкая среда.

Углеводы. Растительные клетки и ткани в культуре in vitro питаются преимущественно гетеротрофно, поскольку процесс фотосинтеза в этих условиях затруднен или невозможен (если культивирование происходит в темноте). Наиболее часто источником углеводов является сахароза в концентрации 1-5%, возможно также применение глюкозы и фруктозы.

Макро- и микроэлементы. Обязательными компонентами среды для роста и развития растения in vitro являются макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо) и микроэлементы (медь, цинк, марганец, бор, молибден, кобальт). Для улучшения поступления железа в растительные клетки в состав питательной среды добавляется этилендиаминтетроуксусная кислота ЭДТА или ее натриевая соль. Наиболее распространенной и часто применяемой является среда Т. Мурасиге и Ф. Скуга (1962), которая хорошо сбалансирована по основным элементам питания. Эта среда отличается высоким содержанием ионов (93 ммол/л) и считается богатой средой, в то время, как среда Кнопа содержит только 23 ммол/л и относится к бедным. Некоторые культуры не выносят высокой концентрации солей отдельных элементов (например хлора) и их соотношений. В этом случае необходимо подбирать специальные среды с оптимальным для культуры составом макро-и микроэлементов. Обычно среды называют по имени их создателей: Среды Мурасиге-Скуга, Гамборга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Хеллера, Кнопа и др (Табл. 4).

Таблица 4

Состав некоторых питательных сред, применяемых при культивировании тканей растений

Компоненты сред	Концентрация в средах по прописи, мг/л
	Мурасиге и Скуга, 1962 г.	Гамборга и Эвелега (Б5), 1968 г.	Уайта, 1939 г.	Нич, 1974 г.	Као и Михайлюка, 1975 г.	Китайские среды
						N6	С картофельным экстрактом
KNO3	1900	3000	80	950	1900	2830	1000
NH4NO3	1650	-	-	720	600	-	-
Ca(NO3)2	-	-	2085	-	-	-	-
Ca(N03)2. 4H20	-	-	-	-	-	-	100
(NH4)2S04	-	134	-	-	-	463	100
MgS04. 7H20	370	250	360	185	300	185	125
CaCl2. H20	-	-	-	166	-	166	-
CaCl2. 2H20	440	150	-	-	-	-	-
KC1	-	-	65	-	300	-	35
KH2P04	170	-	12	68	170	400	200
Na2S04	-	-	200	-	-	-	-
NaH2P04. 2H20	-	169,6	18,7	-	-	-	-
MnS04. H20	-	10	-	-	10	-	-
MnS04. 4H20	22,3	13,2	7	25	-	4,4	-
ZnSO4. 4H2O	8,6	-	-		2	-	-
ZnSO4. 7H2O	-	2	3	10	-	1,5	-
H3BO3	6,2	3	1,5	10	3,6	1,5	-
KJ	0,83	0,75	0,75	-	0,75	0,8	-
CuSO4. 5H2O	0,025	0,025	0,001	0,025	0,025	-	-
Na2MoO4. 2H2O	0,25	0,25	0,0025	0,25	0,25	-	-
CoCl2. 6H2O	0,025	0,025	-	-	0,025	-	-
Fe2(S04)3	-	-	2,5	-	2,46	-	-
FeSO4. 7H2O	27,8	27,8	-	27,8	27,8	27,8	27,8
Na EDTA. 2H2O	37,3	37,3	-	37,3	37,3	37,3	37,3
Мезоинозит	100	100	-	200	100	200	-
Аскорбиновая кислота	-	-	-	3	-	3	-
Тиамин. HCl	0,4	10	0,1	3	0,005	3	1
Пиридоксин. НС1	0,5	1	0,5	1	0,005	1	-
Никотиновая кислота	0,5	1	0,5	-	-	-	-
Глицин	2	-	3	-	-	-	-
Гидролизат казеина	1000	-	-	400	-	400	-
Картофельный экстракт	-	-	-	-	-	-	100000
Кинетин	*	*	*	-	-	-	0,5
БАП	*	*	*	6	-	6	-
НУК	*	*	*	2	-	2	-
2,4-Д	*	*	*	-	0,2	-	1,5
Сахароза	3000	20000	20000	60000	125	60000	20000
Агар «Дифко»				7000		7000

Примечание: Среда Као и Михайлюка содержит дополнительно (мг/л): фруктозы, рибозы, ксилозы, маннозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита -- по 125; маннита, никотинамида, аскорбиновой кислоты--по 1; витамина А-- 10; витамина D₃--0,5; Са-пантотената -- 0,01; витамина В ₁₂-- 0,2; п-аминобензойной кислоты -- 0,01; биотина -- 0,005; холинхлорида -- 0,5; рибофлавина -- 0,1; 2,4-Д -- 0,2; зеатина -- 0,5; НУК--1; гидролизата казеина -- 125; кокосового молока -- 10; CaCI₂ (30 %) -- 1,5; глюкозы -- 68 400; пирувата Na -- 5; лимонной, яблочной и фумаровой кислоты -- по 10.

* Состав экзогенных гормональных препаратов варьирует в зависимости от объектов.

В ряде случаев используют не полную концентрацию солей, а ее часть (1/4-1/2). К примеру, высокая концентрация солей может задерживать образование корней в культуре in vitro, что приводит к необходимости уменьшения концентрации.

рН среды. Оптимальная рН среды для большинства культур колеблется в пределах 0- 6, Чаще всего используют рН 5,5-5,6. При низкой (меньше 4,5) и высокой (больше 7,0) рН рост и развитие in vitro останавливается. Концентрация водородных ионов в культуре in vitro влияет на устойчивость индолилуксусной кислоты, гиббереллина, витамина В₁ и пантотеновой кислоты, желатинизацию агара, поступление в растение фосфатов, аммония, железа (Бутенко,1968). Корректировка рН производится добавлением в среду растворов щелочи Na OH или кислоты НСl (0,1- 1,0 М).

Витамины. В состав питательных сред могут входить следующие витамины: мезоинозит, витамин В₁ (тиамин), пантотеновая кислота, фолиевая кислота (витамин М), рибофлавин (витамин В₂), аскорбиновая кислота (витамин С), никотиновая кислота (витамин РР), пиридоксин (витамин В₆), биотин (витамин Н), пара-аминобензойная кислота, токоферол (витамин Е). Концентрация витамина С в некоторых случаях повышается в связи с его антиоксидантной активностью (например, если эксплант при культивировании выделяет токсичные метаболиты).

Регуляторы роста. Для роста культуры клеток и тканей растений in vitro необходимо наличие в составе питательной среды природных или синтетических гормонов. Их концентрация и взаимодействие обусловливают направление и скорость процессов морфогенеза (образование каллуса, корней, побегов и др.). К наиболее часто употребляемым регуляторам относятся ауксины и цитокинины. Могут использоваться также гиббереллины, этилен и абсцизовая кислота, а также недавно открытые брассиностероиды.

Ауксины. К ауксинам относятся индолил-3-уксусная кислота (ИУК), - нафтилуксусная кислота (НУК), индолилмасляная кислота (ИМК), 2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 -Д). Степень активности ауксинов возрастает от ИУК к 2,4 -Д. Используют их в концентрации от 0,01 до 10 мг/л. Ауксины вызывают дедифференцировку клеток, растяжение клеточной оболочки, деление клеток и образование каллуса, образование корней, ингибируют образование боковых побегов. При низких концентрациях ауксины образуют корни, при высоких преобладает образование каллуса. 2,4-Д как самый активный ауксин (в 30 раз активнее ИУК) вызывает образование каллуса, но может индуцировать мутации.

Цитокинины. Среди цитокининов используются аденин, кинетин, 6- бензиламинопурин (6- БАП), зеатин, 6-, - диметилаллиаминопурин (2 иП). Они применяются в концентрациях от 1 до 10 мг/л и индуцируют процесс деления клеток, образования боковых побегов, подавляя при этом развитие корней. Цитокинины задерживают старение тканей in vitro.

Гиббереллины не являются обязательными компонентами питательных сред. Наиболее часто применяют гибберелловую кислоту (ГА₃). Гиббереллины способствуют удлинению междоузлий, а также росту меристем и почек in vitro. Кроме того, они выводят из состояния покоя изолированные зародыши и семена. Гиббереллины могут ингибировать образование придаточных побегов и корней.

Другие регуляторы. Использование других регуляторов достаточно редко и обычно связано со специальными или исследовательскими целями. Абсцизовая кислота может способствовать образованию микроклубней картофеля in vitro. Гормон газообразной природы этилен может накапливаться в культуральных сосудах в результате выделения тканями растений. При этом возможно ингибирование ростовых процессов in vitro. Этилен влияет на процесс органогенеза, например усиливает образование луковичек у лилий in vitro. Есть сведения и о положительном действии этилена на индукцию клеточного деления. Брассиностероиды могут способствовать образованию каллуса.

Взаимодействие фитогормонов in vitro. При подборе видов и концентраций фитогормонов in vitro необходимо учитывать следующие обстоятельства.

1. Каждая морфогенетическая реакция происходит при определенной концентрации фитогормонов.

2. Действие экзогенных фитогормонов зависит от генотипа, стадии органогенеза, наличия эндогенных фитогормонов и физических условий.

3. Любая морфогенетическая реакция обусловлена балансом фитогормонов. Согласно правилу Скуга, Миллера образование побегов стимулируется при преобладании в среде цитокининов по отношению к ауксинам, преобладание ауксинов вызывает образование корней. Антагонизм может наблюдаться при взаимном действии стимуляторов и ингибиторов на любую морфогенетическую реакцию (образование корней, побегов, каллуса и др). Возможен и синергизм (совместное положительное действие фитогормонов). Примером может служить стимулирующее действие ауксинов и цитокининов на процесс деления клеток и рост тканей.

Другие компоненты среды. В отдельных случаях в состав питательной среды могут добавляться кокосовое молоко, солодовый и дрожжевой экстракт, томатный и апельсиновый сок, гидролизат казеина, пептон. В питательную среду может добавляться также активированный уголь, который обладает способностью адсорбировать токсические темноокрашенные пигменты и другие метаболиты, угнетающие рост растения in vitro. Добавление активированного угля в среду способствует развитию и органогенезу древесных растений.

Приготовление и хранение питательных сред. Растворы макро- и микроэлементов готовят более концентрированными (макросоли- в 10-20 раз, микросоли- в 100-1000 раз и витамины - в 1000 раз). Маточные растворы хранят в холодильнике, причем витамины - при отрицательной температуре. Регуляторы роста также используют в виде маточных растворов.

Приготовленные среды желательно хранить в холодильнике в темноте при температуре 5 ⁰ С. На свету может происходить потеря активности некоторых фитогормонов (ИУК, кинетин).

3.2 Физические условия культивирования

Для создания оптимальных физических условий при культивировании клеток и тканей in vitro используют культуральные комнаты или климокамеры. При культивировании в отдельных случаях свет не нужен (каллусные ткани и др.), что позволяет использовать термостат. Обычно в культуральных комнатах устанавливают стеллажи, на которых монтируют люминесцентные лампы. Культуральные комнаты снабжаются системой автоматизации для регуляции температуры и длины светового дня, влажности и аэрации.

Свет. При выборе светового режима необходимо учитывать три фактора: длину дня, интенсивность освещенности и спектральный состав света. Оптимальная длина дня зависит от биологии культуры. Наиболее часто используют длину дня 14-16 часов. В отдельных случаях длину дня сокращают. Например, для индукции образования микроклубней картофеля длину дня можно уменьшить до 8 часов или поместить пробирки с растениями в условия пониженной освещенности. Оптимальная интенсивность света зависит от особенностей культуры и фазы онтогенеза и колеблется от 1 до 10 тысяч люкс. Для большинства культур оптимальной является освещенность 4-6 тысяч люкс, однако для прохождения отдельных этапов онтогенеза растения нуждаются в пониженной освещенности. К примеру образование луковичек in vitro у лилий происходит при освещенности 1-3 тысяч люкс (Французенок, 1997). Реже регулируется спектральный состав, который определяется типом ламп. Однако иногда это необходимо. Так, рядом авторов установлено, что красный свет способствует образованию придаточных побегов и корней. А.П. Ермишиным (1998) было установлено, что при подсветке растений картофеля - доноров пыльников дуговыми ртутными лампами (ДРИ-2000- 6) существенно повышается частота образования каллуса в культуре пыльников, т.е. спектральный состав света играл ключевую роль в этом процессе.

Температура. Оптимальная температура для большинства культур in vitro составляет 24-26 ⁰ С и определяется биологией культуры и фазой онтогенеза. Для тропических культур оптимальна более высокая температура (28-29 ⁰ С). Для растений умеренного климата оптимум температуры может быть до 18-20 ⁰ С. Низкие температуры могут использоваться также для выведения из состояния покоя, прорастания семян и др. Так, для выведения из состояния покоя образованных in vitro луковичек гладиолусов и лилий необходима температура 5⁰ С в течение 4-6 недель (Пиерик,1967). Низкая температура используется также для остановки роста культур in vitro.

Влажность в культуральной комнате поддерживается на уровне 60-70%. При недостатке влаги в воздухе подсыхает питательная среда, угнетаются растения in vitro. Влажность в культуральной комнате регулируется автоматически или путем установки сосудов с водой для испарения.

Газовый состав. Наиболее важны для культивирования клеток и тканей содержание в воздухе кислорода и углекислого газа. Содержание кислорода в жидкой питательной среде можно повысить путем встряхивания культуральных сосудов на шейкерах. Содержание кислорода в культуральных сосудах можно регулировать способом их закрывания (металлические крышки дают лучшую аэрацию в сравнении ватно-марлевыми пробками). Жидкая среда при встряхивании снабжается кислородом лучше в сравнении с твердой. Содержание СО₂ в культуральных сосудах достаточно для протекания фотосинтеза, тем более, что углеводы среды являются дополнительным источником углерода.



4. СПЕЦИФИКА КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ

4.1 Получение и культивирование каллуса

Каллус - неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных (утративших специализацию) клеток. Каллусная ткань обычно возникает в местах поранения тканей и является « запасной программой» растения, обеспечивающей защиту раны, накопление необходимых питательных веществ для регенерации утраченного органа (Бутенко, 1990). Каллус может быть получен из эксплантов различного типа (корней, побегов, листьев, пыльцы, эндосперма). Эффективность каллусогенеза зависит от особенностей вида, физиологического состояния растения, типа экспланта и условий его культивирования. Явление каллусогенеза свойственно не только покрытосеменным, но и голосеменным растениям, папоротникам, мхам, печеночникам (Бутенко,1990). Двудольные растения образуют каллус более интенсивно в сравнении с однодольными. Наблюдаются различия между генотипами в способности к каллусогенезу (Рис.1). Молодые ткани более предпочтительны в сравнении со старыми. Размер и форма экспланта не имеют определенного значения. Однако существует минимальный критический размер, уменьшив который, нельзя вызвать рост экспланта (Диксон,1989).



Рис.1. Проявление эффекта гетерозиса по массе каллуса у томата на среде с 6 БАП и НУК (+ - линия 7, >- Тorosa, +- линия 7х Тorosa) (Никонович, Кильчевский, 1995)

Стерилизация экспланта описана в разделе 2. Эксплант после стерилизации помещают на поверхность твердой питательной среды и слегка вдавливают его в агар для обеспечения контакта со средой. Культуральные сосуды - пробирки, чашки Петри, колбы, стеклянные или пластмассовые баночки с завинчивающимися крышками. В качестве питательных сред используют обычно среды Мурасиге-Скуга (МС); Шенка, Хильдебрандта (ШХ), Гамборга (В5) и другие. Оптимальная температура для образования каллуса 22-28 ⁰ С. Каллус может образоваться на свету и в темноте.

Главным условием успешного каллусогенеза являются концентрация и баланс эндогенных и экзогенных ауксинов и цитокининов. Наличие ауксинов вызывает дедифференцировку клеток, то есть утрату специализации и связанных с ней структур и возвращение к состоянию делящейся клетки. Для инициации каллуса обычно используют 2.4-Д и ИУК. При индукции образования каллуса ауксины обычно применяют в концентрациях в 10 раз более высоких, чем та, которая используется для поддержания его роста. Процесс деления дедиффенцированных клеток происходит под действием цитокининов. Отношение ауксинов к цитокининам для получения каллуса до 10:1. Примеры сред и регуляторов роста для получения и роста каллуса у злаков представлены в таблице

Таблица. 2.5

Среды, используемые для получения и роста каллусных культур злаков (Флик, Эванс, Шарп, 1983)*

Вид	Основная среда	Концентрация регуляторов роста, мкМ
		ИУК	2,4-Д	НУК	n-ХФУК	К	2 иП	Зеатин
1	2	3	4	5	6	7	8	9
Кукуруза (Zea mays)	МС	-	2,3-67,8	21,5**	-	-	0,24**	-
Пшеница (Triticum aestivum)	МС, В5	-	4,5-9,0	-	-	-	-	-
Рис (Oryza sativa)	МС	-	9,0-45,2	-	-	-	-	-
Райграс (Lolium multiflorum X L. Perenne)	МС	31,7	6,8	-	-	1,0	-	-
Овес (A vena sativa)	В5	-	2,3-13,6	-	-	-	-	-
	ШХ	-	9,1	-	10,7	-	-	-
	МС	-	22,0	-	-	-	-	-
Ячмень (Hordeum vulgare)	В5	-	4,5	-	-	-	-	-
	МС	10,0	1,5	-	-	-	1,5	-
Просо (Panicum miliaceum)	МС	-	9,0	-	-	-	-	-
Сорго (Sorghum bicolor)	МС	-	22,6-67,8	-	-	-	-	-
	МС	-	5,0	-	-	-	-	10

* Эта ссылка содержит также детальные характеристики использовавшихся эксплантов.

** При добавлении к 4,5 мкМ 2,4-Д.

Образующаяся каллусная ткань не имеет анатомической структуры и может быть разной консистенции: 1) рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы. Рыхлый каллус быстрее растет и используется для получения суспензионной культуры, плотный каллус может применяться для морфогенеза. Цвет каллусной такни может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов (Бутенко, 1990). Клетки каллуса, как и другие клетки проходят три фазы роста (деление, растяжение, дифференцировка), после чего деградируют. Популяция культивируемых клеток каллуса проходит пять фаз развития (рис.2.).

Рис. 2. Модельная кривая ростового цикла при периодическом выращивании каллусных тканей и клеточных культур. Фазы роста: 1 -- лаг-фаза; 2 -- логарифмическая; 3 -- линейная; 4--замедления роста; 5--стационарная.

В течение лаг-фазы не происходит увеличения числа клеток, фаза логарифмического роста отличается наибольшей интенсивностью деления клеток и увеличения массы каллуса, в линейной фазе скорость роста числа клеток постоянна, в фазе замедленного роста уменьшается интенсивность деления, в стационарной фазе число делящихся клеток уравновешивается числом деградировавших, в результате их общее количество не изменяется. После стационарной фазы происходит деградация и отмирание клеток каллуса. Обычно это процесс сопровождается потемнением тканей каллуса. Постепенное старение клеток каллуса обусловлено не только естественной цикличностью в развитии клеток и тканей, но и изменениями, происходящими в составе питательной среды (расходование питательных веществ, повышение концентрации отдельных компонентов в результате испарения воды с поверхности среды, выделение каллусом в состав среды некоторых метаболитов, в том числе токсичных). Все эти причины побуждают переносить часть первичного каллуса на свежую питательную среду через 4-6 недель. Такой прием называется пассированием. Масса переносимого кусочка при культивировании колеблется от 60 до 100 мг ткани на 20-40 мл питательной среды. Ф.Констэбель (1984) рекомендует при субкультивировании первичный каллус, достигший 2-3 см в диаметре, отделять от экспланта и разделять на 4-8 частей для пересадки на свежую питательную среду. Каллусная ткань может пассироваться в течение длительного времени. Так, культура каллусной ткани моркови, полученная Р.Готре более 60 лет назад, поддерживается до сих пор. Поскольку первичный каллус может образоваться из клеток, различных по своей специализации, в процессе длительного пассирования (субкультивирования) образуются штаммы каллусных клеток, имеющие индивидуальные генетические и физиологические особенности.



4.2 Особенности каллусных клеток

Физиолого-биохимические особенности. Образование каллусных клеток часто связано с возникновением раневой поверхности. По мнению Р.Г.Бутенко (1990), между травмами тканей и клеток и образованием каллуса существует причинно-следственная связь, механизм которой неизвестен. Предполагается, что в результате травмы синтезируются биологически активные вещества - индукторы клеточных делений, отличающиеся по своей природе от известных стимуляторов роста : ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, Возможно, что эти вещества - продукты разрушения полисахаридов растительной клетки. В результате происходит быстрая дедифференцировка специализированной клетки, метаболизация запасных веществ, перестройка пластидного аппарата, увеличение структур, связанных с синтезом белков, при этом стимулируется синтез всех форм РНК, начинается репликация ядерной ДНК, исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Таким образом, дедифференцировка клеток каллуса является особым состоянием клетки, при котором изменяется активность генов и белкового аппарата. В остальном клетки каллуса сохраняют физиолого-биохимические особенности организма (устойчивость к абиотическим факторам, способность к синтезу вторичных метаболитов и др.)

В некоторых случаях каллус может образоваться и при отсутствии раневой поверхности. Важной особенностью каллусных клеток при их длительном пассировании является утрата способности к регенерации. Для некоторых культур это наблюдается уже после 4-го пассажа. Обязательным условием деления клеток каллуса является наличие в составе среды ауксинов и цитокининов. При длительном субкультивировании клетки каллуса могут приобрести способность к росту на среде без регуляторов роста. Такая гормононезависимая ткань называется «привыкшей». Природа гормононезависимости, по мнению Р.Г.Бутенко, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость). В первом случае гормононезависимость сохраняется при получении растения, во втором случае приобретенная гормононезависимость может исчезать в ряду клетка- растение - клетка. Таким образом, «привыкшие» ткани приобретают способность к синтезу эндогенных ауксинов и цитокининов, что обеспечивает возможность клеточных делений.

Привыкшие ткани имеют много общих черт с опухолевыми тканями, возникающими у растений под воздействием бактерий и вирусов. Наибольший интерес представляют галловые опухоли, индуцируемые агробактериями Agrobacterium tumеfaciens. Как привыкшие, так и опухолевые ткани гормононезависимы и теряют способность к регенерации. Опухолевые ткани могут образовывать тератомы (уродливые органоорганоподобные структуры), не способные к нормальному развитию.

Различия у привыкших и опухолевых тканей заключаются в природе гормононезависимости. У «привыкших» тканей гормононезависимость чаще имеет эпигенетический характер и не наследуется, а у опухолевых тканей такая способность связана с переносом чужеродных генов из бактериальных клеток в растительные (природный трансгеноз).

Генетические особенности. При длительном культивировании в клетках каллуса накапливаются генетические изменения различной природы. Можно выделить несколько типов таких изменений.

1. Полиплоидизация. В результате ряда клеточных делений увеличивается число хромосомных наборов, что приводит к образованию смешанной ткани, состоящей из клеток разного уровня плоидности (миксоплоидов). По сути дела это ткани-химеры.

2. Анеуплоидия. Клетки каллуса in vitro могут терять или приобретать дополнительные хромосомы при субкультивировании. В результате образуется хромосомный набор, некратный основному числу n.

3. Хромосомные аберрации. Потеря отдельных участков хромосом, приводящая к резким изменениям генотипа в культуре in vitro.

4. Генные мутации, которые можно идентифицировать по изменению признаков каллуса и растений-регенерантов.

Все эти типы генетических отклонений можно отнести к сомаклональной изменчивости - увеличению уровня мутирования растительных клеток, выращиваемых в культуре in vitro длительное время.

4.3 Использование каллусных клеток

Сохранение генетического материала. Поддержание биоразнообразия является глобальной задачей всего человечества. Одним из подходов к решению этой проблемы является хранение культуры клеток и тканей с использованием низких температур, в т.ч. в жидком азоте при температуре -196⁰ С. Одним из видов тканей, которые могут сохраняться в таких условиях является каллус, который был использован у моркови, перца, люцерны, риса, кукурузы и других культур. Главные преимущества такого способа - неизменность генотипа, поддерживаемая в течение длительного периода.

Получение суспензионных культур и протопластов. Рыхлый каллус используют для получения одиночных клеток в жидкой питательной среде и последующего культивирования суспензионной культуры, каллусные ткани могут быть также использованы для получения протопластов (клеток, лишенных оболочки)

Использование каллуса в клеточной селекции. Состояние каллуса индуцирует сомаклональную изменчивость, что дает основание для проведения отбора в культуре клеток и создания новых генотипов.

Использование каллуса для микроразмножения растений. Культуры, могут размножаться в результате образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) из каллуса или суспензионной культуры, полученной на его основе. Недостаток этого метода вегетативного размножения - возможность появления генетических отклонений в результате сомаклональной изменчивости.

Получение вторичных метаболитов. Культура каллуса и суспензионная культура применяется для промышленного получения синтезируемых клетками соединений, используемых для целей медицины, защиты растений, производства продуктов питания и др.



5. СУСПЕНЗИОННЫЕ КУЛЬТУРЫ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

Суспензии растительных клеток представляют собой одиночные клетки и их агрегаты, которые растут в жидкой аэрируемой питательной среде во взвешенном состоянии. Для обеспечения аэрации в жидкой среде необходимо постоянное перемешивание или встряхивание, что можно обеспечить следующими способами:

Культура суспензионных клеток выращивается в колбах в жидкой питательной среде на качалках ротационного или шейкерного типа или роллерах (накопительное культивирование);

Выращивание суспензионной культуры в жидкой питательной среде в ферментерах при подаче воздуха в сочетании с механическим перемешиванием (непрерывное культивирование).

Обычно суспензионную культуру получают путем переноса кусочков рыхлого каллуса в перемешиваемую жидкую питательную среду того же состава, что и среда, на которой выращивался каллус, но без агара. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2-3 г каллусной ткани на 60-100 мл питательной среды. Первичную суспензию получают на круговой качалке при скорости вращения 100-120 об/ мин.

Успех получения суспензионной культуры из каллуса обеспечивается использованием рыхлых каллусов, полученных с применением 2,4 Д, исключением из среды ионов Са²⁺, обработкой ферментом пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре.

Возможно также получение суспензионной культуры из мезофильных клеток листьев путем обработки специальной средой для мацерации клеток, содержащей фермент мацеразу (Диксон,1989). Таким образом можно получать суспензионные культуры томата и табака.

Рост клеточной популяции в суспензии при накопительном культивировании выражается S- образной кривой и включает те же этапы, что и при росте каллуса. Обычно накопительные суспензии культивируют до стационарной фазы роста, что составляет длительность пассажа 21-28 дней. При этом суспензия включает не только одиночные клетки, но и их агрегаты (группа клеток), число которых зависит от условий культивирования (Рис.3).

Рис. 3. Число отдельных клеток и различных агрегатов суспензионной культуры мака при выращивании в колбах (а) и в ферментере (б) (Тухбатулина, Шамина, 1986, цит. по Бутенко 1990)

Клетки суспензионной культуры так же, как и клетки каллуса, находятся в дедифференцированном состоянии и нуждаются для деления в наличии в составе питательной среды ауксинов и цитокининов. Суспензионная культура имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом на твердых средах. Здесь легче влиять на клеточный метаболизм, в связи с чем суспензионные культуры часто используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов. Важным их преимуществом при выделении ферментов или продуктов вторичного метаболизма является отсутствие у большинства суспензионных культур хлорофилла и каротиноидных пигментов (Диксон, 1989).

Суспензионные культуры клеток обычно требуют регулярного и более частого субкультивирования, чем каллусные культуры, из которых они получены. Первичную суспензию в конце экспоненциальной фазы фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных агрегатов или остатков экспланта. Определенный объем суспензионной культуры переносят с помощью пипеток или шприцов на свежую питательную среду. Рост суспензионной культуры можно оценивать по следующим параметрам: объем осажденных клеток, число клеток, сырая и сухая масса, содержание белка и ДНК, жизнеспособность клеток. Объем осажденных клеток изучается при центрифугировании суспензионных культур в процентах от объема суспензии, число клеток подсчитывается в счетной камере Фукса-Розенталя под микроскопом после мацерации (разделения клеток) с помощью хромовой кислоты или пектиназы. Жизнеспособность клеток оценивают по их окрашиванию красителем (метиленовая синь или синь Эванса). Мертвые клетки при этом окрашиваются в синий цвет. Суспензионные культуры, как и каллусные клетки, образуют линии, отличающиеся между собой генетически и физиологически. Культивирование в суспензионной культуре может приводить к увеличению сомаклональной изменчивости.

Суспензионная культура, как и каллусная используется для сохранения генетического материала при пониженных температурах, получения протопластов, использования в клеточной селекции, микроразмножения растений и получения искусственных семян, получения вторичных метоболитов.



6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАЛЛУСА И СУСПЕНЗИОННЫХ КУЛЬТУР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Растения издавна используются не только для производства продуктов питания, но и как источник различных химических соединений., число которых в настоящее время достигло 2. 10⁴. Среди веществ, синтезируемых растением, выделяют группу так называемых "вторичных метаболитов", то есть компонентов клетки, не являющихся необходимыми для ее выживания. К их числу относятся алкалоиды, гликозиды, стероиды, терпены, флавоноиды и другие вещества. Вторичные метаболиты нашли широкое применение в народном хозяйстве в качестве лекарственных средств, природных пестицидов, пищевых добавок, красителей и отдушек. Примеры промышленного использования некоторых вторичных метаболитов представлены в таблице 6.

Таблица.6

Промышленное использование некоторых растительных продуктов (Фаулер, 1987)

Промышленное производство	Растительный продукт	Вид растения	Промышленное использование
Фармацевтические средства	Кодеин (алкалоид)	Papaver somniferum	Болеутоляющее
	Диосгенин (стероид)	Dioscorea deltoidea	Противозачаточные средства
	Хинин (алкалоид)	Cinchona ledgeriana	Антималярийное
	Дигоксин (серде-чный гликозид)	Digitalis lanata	Тонизирующее сердечную деятельность
	Скополамин (алкалоид)	Datura stramonium	Понижающее давление
	Винкристин (алкалоид)	Catharanthus ro-Seus	Антилейкемическое
Агрохимикаты	Пиретрин	Chrysanthemum Cinerariaefolium	Инсектицид
Производство продуктов питания и напитков	Хинин (алкалоид)	Cinchona ledgeriana	Вещество, усиливающее горечь
	Тауматин (халь-кон)	Thaumatococcus danielli	Низкокалорийное вещество, заменяющее сахар
Косметические	Жасмин	Jasminum sp.	Отдушки

Химический и микробиологический синтез ряда химических соединений не всегда дает положительные результаты в сравнении с получением их из растительного сырья. Новые возможности для производства вторичных метаболитов открывает культивирование растительных клеток in vitro. Установлено, что в культуре клеток in vitro способность к синтезу вторичных метаболитов сохраняется. Преимущество этого способа в сравнении с традиционным получением из растительного сырья заключается в независимости от погодных условий, высоком выходе и качестве продукции, возможности организации промышленного производства. Конечным критерием в таком случае является рентабельность производства химических соединений.

Для культивирования суспензионной культуры с целью производства вторичных метаболитов используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания, клеточная масса остается закрытой в определенном объеме среды до конца выращивания. В закрытой непрерывной культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изученным и распространенным режимом культивирования клеточных суспензий является закрытая периодическая система. В этом случае для аэрации и перемешивания используют роллеры, качалки, ферментеры, где аэрация осуществляется механическими мешалками или воздушным потоком.

Для промышленного выращивания суспензионной культуры растений служат ферменты, которые обеспечивают стерильность условий культивирования, регулирование факторов среды (температура, газовый состав, освещенность и др.) на различных этапах развития суспензионной культуры и возможность контролировать путем отбора проб продуктивность биомассы и синтез вторичных метаболитов.

Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе.

Для получения вторичных метаболитов возможно культивирование не только суспензионных клеток, но и каллуса на твердой питательной среде (например, каллуса женьшеня и других лекарственных растений). Технология производства биомассы женьшеня из каллуса освоена на Бобруйском гидролизном заводе.