Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Промышленный синтез белков с участием рекомбинантных микроорганизмов

введение

Для получения коммерческих продуктов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов в двух областях: молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов заключается в идентификации, изучении свойств, модификации нужных генов и создании эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, которые можно будет использовать для промышленного синтеза соответствующего продукта, а задача биотехнологов - в обеспечении условий оптимального роста нужного рекомбинантного микроорганизма с целью получения продукта с наибольшим выходом.

1. Биотехнология рекомбинантных белков

Для крупномасштабного культивирования рекомбинантных микроорганизмов в промышленных биореакторах (>1000 л) недостаточно просто экстраполировать условия роста в лабораторных ферментерах (0,1-1,0 л). При конструировании промышленных биореакторов необходимо учитывать такие параметры, как температура, рН, скорость и характер перемешивания, потребность аэробных организмов в кислороде, количество питательных веществ. Ферментацию можно проводить по-разному. При периодической ферментации посевной материал вводят в свежую культуральную среду и проводят культивирование, не добавляя субстрат до тех пор, пока количество нужного продукта не достигнет максимума. В этих условиях рост культуры проходит шесть этапов: латентную фазу, фазу ускорения, логарифмическую (log) фазу, фазу замедления, стационарную фазу и фазу отмирания. Больше всего белков синтезируется во время логарифмической фазы, а многие низкомолекулярные продукты - во время стационарной. При таком способе ферментации необходимо тщательно следить за тем, чтобы клетки были собраны в нужное время. При периодической ферментации с добавлением субстрата в биореактор добавляют свежую культуральную среду через разные интервалы времени, как правило для того, чтобы продлить логарифмическую фазу. Непрерывная ферментация предполагает добавление свежей среды в течениевсего процесса и одновременное удаление клеток и отработанной среды.

Каждая из этих систем ферментации имеет свои недостатки и достоинства, которые нужно учитывать, применяя ее для промышленного синтеза рекомбинантных продуктов. Несмотря на то, что непрерывная ферментация применяется в промышленном масштабе не очень широко, этот способ имеет ряд преимуществ и в будущем, по-видимому, получит большее распространение. Один из подходов к увеличению количества рекомбинантного белкового продукта состоит в максимальном увеличении плотности культуры трансформированных клеток, синтезирующих данный продукт. Для достижения этой цели лучше всего использовать режим периодической ферментации с добавлением субстрата. Все биореакторы можно отнести к одному из трех основных типов: реакторы с механическим перемешиванием, барботажные колонны, эрлифтные реакторы. В настоящее время в промышленности чаще всего используются биореакторы первого типа, но появляется интерес и кэрлифтным биореакторам. Механическое перемешивание обеспечивается с помощью механической мешалки, а в эрлифтных биореакторах для аэрации и перемешивания используют газ (обычно воздух), который подается под давлением через разбрызгиватель в дне сосуда. При этом во всем объеме происходит непрерывная циркуляция жидкой среды. Барботажные колонны сходны с эрлифтными реакторами, но их недостатком является отсутствие циркуляции культуральной среды. Для обеспечения стерильности, постоянства рН, температуры и других параметров используют разные способы в зависимости от дизайна биореактора. Для синтеза рекомбинантных белков применяют двухступенчатые процессы ферментации, осуществляемые в тандемных эрлифтных биореакторах или в одном реакторе с механическим перемешиванием. Если синтезированный продукт накапливается в клетках, то их осаждают из культуральной среды центрифугированием или фильтрацией, затем разрушают ферментативными, химическими или механическими методами и выделяют нужный продукт. Если синтезируемый продукт секретируется в культуральную среду, то процедура его выделения и очистки значительно упрощается.

рекомбинантный белок микроорганизм биотехнология

2. Микроорганизмы для производства рекомбинантных белков

В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобы используемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродные гены, удовлетворяли бы следующим свойствам:

1. Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в качестве продуцентов рекомбинантных белков используют именно такие микроорганизмы: это Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisie.

2. Микроорганизмы должны быть не патогенны.

3. Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в условиях ферментера.

4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный белок с дополнительной аминокислотной последовательностью, состоящий из гидрофобных аминокислот. Роль гидрофобных аминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липидную мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется нужный целевой продукт - это рекомбинантный белок, выходящий в среду.

5. Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы проницаема для плазмид.

Правила безопасности при работе с рекомбинантными микроорганизмами:

1. Системы выброса оснащаются фильтрами, задерживающими микробные клетки.

2. После завершения процесса производится стерилизация оборудования, но не должно быть разъедания материалов (коррозия), из которых изготовлено оборудование.

3. В ферментере понижается давление на несколько миллиметров ртутного столба.

4. В клетку продуцента вставляется генетический дефект. Дефект заключается в том, что стираются несколько генов путем делеции, то есть избирательно удаляют гены, продуцирующие какую либо аминокислоту или фермент, синтезирующий витамин. Микроорганизм становится более капризным и уязвимым в случае изменения этой среды и соответственно не жизнеспособным. В среде должна быть обязательно для нормального функционирования микроорганизма именно эта аминокислота или витамин, иначе микроорганизм размножаться не будет, и мы не будем иметь целевой продукт.

На первом месте среди белков по значению стоит рекомбинантный инсулин, составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.

3. Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет - 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков. В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков. Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков. С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

? недостаток поголовья скота;

? сложности хранения и транспортировки сырья;

? трудности выделения и очистки гормона;

? возможность развития аллергических реакций.

Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами. Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количество инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае (2.1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором (2.2) - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей

1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

4. Плазмиды вводят в клетку E. coli - кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С - пептида.

При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин (инсуран) с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо - отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

В отличие от инсулина аминокислотная последовательность с-пептида сильно отличается у разных видов млекопитающих, что делает невозможным получение его из животного сырья. Существующие способы получения с-пептида, можно разделить на три категории:

1) Получение с-пептида химическим синтезом. Этим способом получено большинство препарата, представленного на рынке в настоящее время.

2) Получение с-пептида биосинтетическими методами в составе слитых белков. Для получения с-пептида этим способом создается химерный белок, в котором за лидерным фрагментом следуют несколько последовательностей с-пептида, разделенных аминокислотами, обеспечивающих гидролиз специфическими протеазами. На первом этапе происходит культивирование микроорганизмов в ферментерах, затем в них индуцируется синтез рекомбинантного полипептида; клетки разрушаются, и рекомбинантный белок очищается и обрабатывается специфическими протеазами, приводящими к получению с-пептида. На заключительном этапе происходит очистка с-пептида от примесей. Данный способ может обеспечить большие объемы производства, но требует создания штаммов-продуцентов, отработки условий культивирования микроорганизмов, способов очистки рекомбинантного белка, а также создания и валидации методов контроля качества.

3) Получение с-пептида биосинтетическими методами совместно с инсулином. Этот способ производства заключается во введении некоторых модификаций в технологию получения рекомбинантного инсулина с целью оптимизации получения с-пептида, образующегося на определенных этапах производства, в основе которого лежит получение проинсулина, не подвергающегося модификациям. Данный способ имеет ряд преимуществ. Для получения с-пептида этим способом не требуется создания новых штаммов-продуцентов, отработки технологии очистки и сворачивания белка, создания новых инструментальных методов контроля производственного процесса.

4. Описание технологического процесса производства инсулина

1. Подготовка воды.

2. Санитарная обработка производства.

3. Синтез цепей А и В.

Синтез цепей проводят химическим методом. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, цепь Б - 30 остатков

4. Введение генов в плазмиду.

Для того чтобы плазмида могла принять в себя чужеродный ген, ее цепочку разрезают ферментами - рестриктазами. Для сшивания генов, кодирующих синтез цепей А и В используют олигосахаридные остатки различной длинны - линкеры и адапторы. Когда молекула замкнулась, ее можно вводить в пермиссивную клетку.

5. Введение р-ДНК в пермиссивную клетку.

Введение р=ДНК в клетку E.coli проводят методом микроинъекции: в клетку E.coli специальной ультратонкой стеклянной иглой вводят плазмиду, содержащую векторную ДНК.

6. Подготовка питательной среды

Основной питательной средой для культивирования культуры E.coli является бульон по Миллеру. Состав: гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, агар-агар. Конечное значение рН (при 25°С) 7,0±0,2. Так же используется бульон Хоттингера. Состав: гидролизат Хоттингера, натрия хлорид, вода дистиллированная.

Стерилизацию питательной среды проводят в автомате для непрерывной стерилизации - УНС. Питательная среда последовательно проходит секцию нагревания, секцию выдерживания и секцию охлаждения.

7. Культивирование суспензионной культуры

Выращивание биокультуры проводят в биореакторах, суспензионная культура в которых перемешивается за счет подачи воздуха в биореактор. Процесс проводится в полупериодическом режиме, когда в биореатор постоянно добавляют определенный объем свежей питательной среды и одновременно забирают тот же объем клеточной суспензии.

8. Выделение культуры ткани.

Отделение культуры ткани от питательной среды проводят методом седиментации (осаждения) в седиментаторах, более глубокое разделение обеспечивается фильтрованием щадящим методом для сохранения целостности клеток культуры.

9. Очистка

Очистку инсулина проводят методами хроматографии: фронтальной, гельпроникающей, анионообменной. Очистка инсулина и его производных на сорбентах с сильными катионообменными свойствами (например, SP-Sepharose FF) можно использовать буферные системы на основе ацетата аммония с низким содержанием мочевины (до 2 М и менее).

10. Получение молекулы инсулина

Выделенные и очищенные цепи подвергают фолдингу и окислению, которое обеспечивает образование соответствующих дисульфидных мостиков.

11. Сушка

Сушка продукта проводится в сублимационной сушилке.

12. Оценка качества готовой продукции.

Внешний вид (соответствует описанию), активность (биологическим методом).

13. Упаковка, маркировка, отгрузка.

Заключение

Рекомбинантный инсулин имеет преимущества перед полученными иным способом препаратами. К таким преимуществам можно отнести идентичность по составу человеческому инсулину (соответственно отсутствуют аллергические реакции), экономичность по сравнению с животным инсулином (1 кг инсулина можно получить в 25 кубовом ферментере, используя кишечную палочку, или необходимо 35 тыс. голов с/х животных.

Многие другие белки синтезируются в организме человека в очень небольших количествах, и единственный способ получать их в масштабах, достаточных для использования в клинике, - технология рекомбинантных ДНК. К таким белкам относятся интерферон и эритропоэтин. Эритропоэтин совместно с миелоидным колониестимулирующим фактором регулирует процесс образования клеток крови у человека. Эритропоэтин используется для лечения анемии, связанной с почечной недостаточностью, и может найти применение как средство, способствующее повышению уровня тромбоцитов, при химиотерапии раковых заболеваний.

Список использованных источников

1 Глик, Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

2 Егоров, Н.С., Самуилов В.Д. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // Биотехнология. Кн. 2. М.: Высшая школа, 1988. - 208 с.

3 Чиркин, А.А. Основы генной инженерии: методы рекомбинантных ДНК. - издание второе, исправленное и дополненное, 2005. - 135 с.

4 Электронный ресурс: Препараты на основе рекомбинантных белков и пептидов. Режим доступа: http://pandia.ru/text/80/138/56159-2.php.

5 Электронный ресурс: Получение рекомбинантного инсулина. Режим доступа: http://studopedia.ru/17_156255_poluchenie-rekombinantnogo-insulina.html.

6 Электронный ресурс: Способ получения рекомбинантного инсулина. Режим доступа: http://bankpatentov.ru/node/327063.

Размещено на Allbest.ru