Размещено на http://www.allbest.ru/

РЕФЕРАТ

Робота містить 46 сторінок, 4 таблиці, 5 рисунків, список літературних джерел з 48 найменувань.

Об'єкт досліджень: мутантні лінії Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Мета роботи: створення нової мультимаркерної лінії A. thaliana, життєздатної в грунтовій культурі, маркованої зчепленими мутантними алелями за картованими генами, прояв яких легко візуально проявляється на різних етапах онтогенезу рослин.

Шляхом схрещування мутантів, наступного добору в F2 і розмноження була отримана мультимаркерна лінія bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2, яка об'єднала в собі мутантні ознаки батьківських форм. Полімутантна лінія за рецесивними генами bp-1,clv1-1,gl1,tfl1-2 полегшує роботу зі збереження генофонду (мутантних алелів) A. thaliana. Отримана нова лінія придатна для досліджень в різних галузях сучасної генетики, в тому числі для вирішення завдань з картування генів.

Пропозиції для використання у виробництві. Ймовірно, отриману мультимаркерну лінію за рецесивними генами bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2 можна буде запропонувати для використання в селекційній практиці сільськогосподарських рослин родини Brassicaceae за допомогою методів генетичної інженерії.

ЗМІСТ

ВСТУП

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3. СТВОРЕННЯ НОВОЇ МУЛЬТИМАРКЕРНОЇ ЛІНІЇ ЗА КАРТОВАНИМИ ГЕНАМИ bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2 ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH

4. ВИВЧЕННЯ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ ЛІНІЙ

5. ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ

6. ОХОРОНА ПРАЦІ

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

ВСТУП

Арабідопсис Таля (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) в даний час є найбільш відомим модельним об'єктом для генетики рослин, молекулярно-біологічних, біохімічних та інших досліджень [10]. В результаті виконання міжнародного проекту геном рослини арабідопсиса Таля (2n = 10) був повністю секвеновано у 2000 році [42]. Встановлено нуклеотидні послідовності всіх 25489 генів хромосом клітинного ядра A. thaliana. Однак на сьогодні картовано лише близько 500 генів. Розрив між загальним числом генів і числом картованих генів великий, тому стоїть завдання інтенсифікації робіт з картування. Групи зчеплення і сайти переважної більшості генів арабідопсиса на генетичній карті не визначені, що створює істотні труднощі в експериментальній роботі. Знання точного положення гена ? не тільки основний підсумок генетичних досліджень, а й умова успішної розробки на даному об'єкті багатьох фундаментальних та прикладних проблем, пов'язаних з вивченням структурно-функціональної організації генома рослини [10].

Ряд генів арабідопсиса застосовують в галузі молекулярної генетики та генетичної інженерії в якості донорних генів (ap1-1, bp-1) для створення цінного вихідного матеріалу як для селекції в род. Brassicaceaе, так і для видів інших родин. Молоді пагони арабідопсиса використовують в їжу як салат, а в Іспанії ? як лікарську рослину [23]. Крім того, арабідопсис самозапильна рослина, має короткий період вегетації, високий коефіцієнт розмноження незалежно від сезону.

Виділена значна кількість мутантів, які фенотипово легко діагностуються, частина яких картована. Існує ряд центрів, в яких підтримуються генетичні колекції арабідопсиса. Один із найбільш відомих центрів ? Європейський центр у Великобританії (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC). У процесі складання генетичних карт отримані і підтримуються в NASC лінії, марковані двома і більшим числом зчеплених генів.

Для багатьох генетичних досліджень потрібні чисті лінії, що марковані двома і більшим числом не зчеплених генів. Зокрема, вони необхідні для локалізації сайтів мутантних генів, досліджень в області приватної генетики арабідопсиса. Подібні лінії знаходять своє застосування при організації лабораторного практикуму з генетики. Ефективне використання мутантних ліній для картування можливо, якщо вони задовольняють таким вимогам:

1) об'єднані в одній лінії мутації повинні бути отримані на генетичній основі (background) однієї вихідної чистої лінії,

2) вихідні мутації повинні підтримуватися у відомих центрах по збереженню генетичних колекцій і тим самим бути загальнодоступними.

Актуальною науковою проблемою є створення полімутантних гомозиготних за рецесивними алелями ліній для розширення можливостей генетичного аналізу та функціональної геноміки арабідопсиса. Цінність та значення таких ліній суттєво зростає зі збільшенням кількості гомозиготних рецесивних генів у генотипі.

Найзручнішими для експериментів є гомозиготні за рецесивними генами лінії, марковані за всіма п'ятьма групами зчеплення, так звані пентарецесиви. Наявні поодинокі пентарецесиви дуже складно культивувати в стандартних умовах, оскільки до їх складу входять напівлеталі або такі, що потребують особливих умов вирощування. Тому актуальним залишається створення полімутантних ліній з відомою локалізацією генів, невибагливих до вирощування за стандартних умов, фенотипи яких легко візуально діагностувати на різних етапах онтогенезу.

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Арабідопсис Таля ? ідеальна модельна рослина для вивчення рослинного генома. Геном Arabidopsis thaliana майже в два рази менше, ніж у його найближчого родича Arabidopsis lyrata. Але при цьому втрати, які зазнав A. thaliana, пішли лише на користь: з його генома зникли послідовності транспозонів, що провокували небезпечні мутації.

A. thaliana характеризується найменшим з відомих геномів рослин, який представлений 157 млн. пар основ, приблизно 27025 генів, розташованих на п'яти хромосомах і 35000 білків, які закодовані в геномі. У арабідопсиса всього п'ять пар хромосом, що дозволяє використовувати його для вивчення генетики онтогенезу, генетики відповіді рослин на зовнішні сигнали, у промисловості та біології розвитку рослин [16].

Arabidуpsis thaliбna ? рослина з родини Капустяні (Brassicaceae), висотою від 5 до 20 (50) см з ланцетним невеликим стебловим листям, білими квітами з розміром пелюсток 3-4 мм і стручками довжиною 1-3 см [9]. Арабідопсис Таля формує розетку листя і суцвіття у вигляді відкритої кисті, характерною для більшості представників цієї родини. Весь цикл розвитку арабідопсиса, який триває 21 ? 32 дні, можна розділити на дві стадії.

1. Вегетативна стадія, яка ділиться на два етапи:

а) Розвиток розетки листя (протяжність етапу - від 2,5 тижнів до 1 місяця). Перші справжні листки з'являються через 5-7 днів після появи сходів і відрізняються від сім'ядольних наявністю трихом. На цьому етапі міжвузля стебла скорочені, латеральні меристеми в пазухах листків розвиваються як вегетативні.

б) Розвиток вегетативної частини квітконосу. Латеральні меристеми розвиваються в пазухах стеблових листків як вегетативні, утворюючи бічні пагони (паракладіі). Перші стеблові листки, які розташовані близько до розетки, можна відрізнити від розеткових за характером розташування трихом (трихоми починають з'являтися на нижній поверхні листя, в той час, як листя розетки мають трихоми тільки на верхній стороні). На цьому етапі міжвузля пагона подовжуються і квітконіс виноситься над поверхнею розетки (етап триває кілька днів).

2. Стадія формування суцвіття. Приквіткові листя (брактеї) скорочені; латеральні меристеми розвиваються як флоральні (квіткові). Квітка складається з чотирьох чашолистків, чотирьох пелюсток, чотирьох-шести тичинок і приймочки з двох плодолистків. Дозрівання пилку і розкриття пиляків відбувається ще у закритій квітці, що забезпечує попадання власного пилку на рильце приймочки.

У природі арабідопсис розмножується переважно за рахунок самозапилення і самозапліднення. У природних популяціях з частотою 1-5% відбувається аутбридинг, отримані докази ендогамної гібридизації. У лабораторних умовах при густому посіві частота спонтанної гібридизації коливалася від 0,0 до 9,2% (у середньому 1,2%).

Поширений Arabidopsis thaliana майже всюди: Європа; Північна, Східна і Південна Африка; майже вся Азія, зокрема Індія і Китай; Австралія; Північна Америка [4, 7, 25-27]. Доходить майже до Північного полярного кола (до 650 п. ш.). Росте як в долинах, так і в горах на висоті до 3000 м [4, 26].

Стручок зазвичай містить від 40 до 60 насінин. Рослина дикого типу формує від 20 до 40 стручків на головному пагоні. На рослинах, що розвиваються в пробірці, стручків і насіння як правило менше.

Тривалість окремих стадій і загальна тривалість життєвого циклу залежить як від умов вирощування, так і від особливостей конкретної раси. У межах великого видового ареалу арабідопсиса розселена велика кількість рас, що розрізняються за морфо-фізіологічними показниками: озимі та ярі, ранні та пізні, з наявністю або відсутністю періоду глибокого спокою у насінні і т.д. [13]. Рослини тривало вегетуючих рас зазвичай мають більш потужний габітус і більш високу врожайність насіння.

Вибір раси для проведення досліджень визначається метою експериментів. Серед рас, що найбільш часто використовуються Columbia має найбільший період розвитку (2 місяці в пробірочній культурі, 3,5 місяці в грунті) і високу врожайність. Раса Dijon має короткий життєвий цикл (1,5-2 місяці) і досить низьку врожайність. Раса Kцln та лабораторна лінія Landsberg erecta займають проміжне положення за цими показниками.

Свіжозібране насіння більшості рас практично не схоже, воно перебуває у стані спокою, пов'язаному з високим вмістом абсцизової кислоти в оболонці насіння. Період спокою, під час якого відбувається часткове руйнування абсцизової кислоти, триває близько 1 місяця. Для переривання спокою використовують холодову обробку насіння або пророщують його у присутності гібереліну. При необхідності можна висівати на живильне середовище недозріле насіння, що не увійшло в період спокою, з формованих, але ще зелених стручків. Такий прийом може дозволити отримати до 8-10 поколінь на рік для рас з коротким періодом вегетації. Насіння арабідопсиса зберігається в лабораторних умовах без істотної втрати схожості не більше 3-4 років.

Геном арабідопсиса також корисний при вивченні геному людини, можливо, при розробці нових лікарських препаратів. Дослідники знайшли 139 генів, які також знайдені і у людей, і відповідають за розвиток хвороб, починаючи від раку кишечника і кістозного фіброзу та закінчуючи глухотою і хворобами серця [43].

Дослідники з Університету Техасу (США) провели дослідження, як за допомогою модельного організму Arabidopsis thaliana можна вивчати природу різних захворювань. Синдром Ваарденбурга ? рідкісне захворювання, яке характеризується уродженою глухотою і деформацією кісток черепа. Таке порушення виникає через збій у роботі генів, керуючих міграцією клітин під час ембріонального розвитку. У арабідопсиса, людський ген, запідозрений у розвитку синдрому Ваарденбурга, також викликав порушення розвитку. Рослина не могла правильно зорієнтуватися в полі тяжіння. Маючи швидкозростаючий багатоклітинний організм, який відтворює зацікавлену вченими хворобу, можна спробувати боротися з нею за рахунок впливу на інші гени [46].

Дослідники з Х'юстона під керівництвом Janet Braam помітили, що в строго призначений вечірній час арабідопсис, як по команді починає виділяти гормон жасмінат, що захищає його від гусениць. І цей час збігається з початком вечері гусениць капустяної совки. Коли рівень цих гормонів піднімається, рослина підвищує вироблення метаболітів, що викликає у травоїдних тварин розлад шлунка. Після ряду експериментів, що створюють умови різних часових поясів, як для рослин, так і для гусениць, американські вчені довели, що арабідопсис керує захистом проти гусениць за допомогою біологічних годин. Гусениці не чіпали рослини, які були вирощені в тому ж часовому поясі, але охоче поїдали арабідопсис, вирощений в іншому часовому поясі. Цілком ймовірно, що подібні механізми захисту характерні і для інших рослин [44].

Дослідження показали, що арабідопсис також дуже чутливий до дотиків. У ході ранніх досліджень з'ясувалося, що він росте набагато повільніше, якщо його постійно чіпати. Подібним чином дерева, які знаходяться на березі з постійним вітром, ростуть невисокими і нахиленими. Сьогодні вчені довели, що на зростання впливають гормони жасмонати. Якщо прибрати ключові гени, які потрібні для вироблення жасмонатів, рослина буде рости з нормальною швидкістю, незалежно від того, доторкаються до неї чи ні [45].

Дивовижно, але за допомогою Arabidopsis thaliana можна визначити, чи є на території міни. Так, якщо ця рослина росте в суворих для нього умовах, то вона починає червоніти. А за допомогою генетичних модифікацій вчені почали розводити арабідопсис, який змінює колір тільки тоді, коли з'являється оксид азоту, що виділяється наземними мінами або іншими вибуховими речовинами [46].

Група американських вчених, що працює в Колорадському університеті, виростила генетично модифіковану рослину, яка, змінюючи колір, здатна сигналізувати про наявність вибухових речовин у повітрі. Цей винахід може використовуватися для запобігання терактів. Керівник дослідження пояснив, що модифіковані рослини з легкістю визначають пари тротилу, що знаходяться в повітрі, в концентрації менше 25 мільярдних частин від обсягу, що в сто разів чутливіші, ніж нюх собаки. При цьому змінюється забарвлення листя із зеленого на жовтий колір. Правда, поки що процес зміни кольору протікає досить довго. На повну зміну кольору потрібно не менше кількох годин. З метою створення таких генно-модифікованих рослин вченими були використані такі рослини, як A. thaliana і тютюн, які часто використовуються в лабораторних експериментах. Була змінена структура рецепторів на поверхні клітин, що носять назву периплазмічних сполучних білків, що дозволило вченим "навчити" ці рецептори відгукуватися на появу парів тротилу в повітрі, при цьому змінюючи своє забарвлення з зеленого кольору на жовтий [47].

Вчені з японського дослідницького центру RIKEN розробили систему для виявлення та біологічної інтерпретації невідомих біологічних молекул, що містяться в екстрактах рослин. Для розробки методу вчені скористалися Arabidopsis thaliana. Вчені виявили близько 1000 різних сполук, для половини з яких була отримана чітка фрагментація і створена бібліотека. Для 95 речовин з цієї бібліотеки вдалося розшифрувати структуру і отримати деяку інформацію про їх біологічні функції. На підставі отриманої інформації про структури і спектри з бібліотеки екстракту були побудовані схеми можливих шляхів метаболізму речовин. Вчені також досліджували розподіл 44 речовин в різних тканинах рослин. Деякі речовини, як виявилося, є суворо з специфічної тканини, а для деяких вдалося навіть відшукати гени, що відповідають за їх синтез. Направлене введення мутацій в ці гени і подальше виявлення відмінностей у хімічному складі екстрактів підтвердило дієвість методу.

Довівши високу продуктивність розробленого методу, вчені отримали багатогранні можливості вивчення хімічного складу рослин і вже приступили до створення бібліотек біологічних молекул рису, пшениці, сої і томатів. Можливості нового аналітичного підходу відкривають перспективи вивчення різноманітних багатокомпонентних органічних систем, таких як тканини тварин (при визначенні метаболітів лікарських препаратів), людини (допінг-контроль), нафти і харчових продуктів.

Вчені з університету штату Делавар дійшли висновку, що рослини вміють кликати на допомогу в разі нападу хвороботворних бактерій або грибів. Вчені стверджують, що рослини під час атаки здатні виділяти речовини, які будуть приваблювати мікроорганізмів ? захисників.

Під час наукового експерименту листя Arabidopsis thaliana вчені заразили патогенною бактерією Pseudomonas syringae. Через кілька днів листя інфікованої рослини пожовтіли та з'явилися інші ознаки хвороби. Але ті з інфікованих рослин, на коріння яких були поселені мікроби Bacillus subtilis, які є мікроорганізмами ? захисниками, були повністю здорові. Вчені виявили передачу поклику про допомогу від листя до коренів у рослин, що живуть у грунті, населеному мікробами Bacillus. У відповідь на сигнал про допомогу коріння рослин виділяли органічну яблучну кислоту, що приваблює ці мікроорганізми. При цьому експерти підкреслюють, що практично всі рослини синтезують яблучну кислоту, але тільки в особливих умовах і для специфічних цілей [48].

На даний час отримано кілька тисяч мутантів арабідопсиса (генетичних ліній із зміненим геномом), які дозволили виявити особливості послідовних етапів формування квітки, гени, що забезпечують ембріогенез рослин, контроль морфогенезу світлом, гени синтезу та дії фітогормонів і багато інших [11]. Оскільки організація генів у самих різних рослин подібна, використовуючи ген арабідопсиса в якості «зонда», можна виділити його аналог з ДНК будь-яких інших рослин, у тому числі і господарсько цінних. Тому геном арабідопсиса не тільки «полігон» для досліджень генетики практично всіх життєвих програм рослин, а й «засіб» для виділення важливих генів з інших рослин, включаючи господарсько цінні.

Arabidopsis thaliana є зручним об'єктом для досліджень в галузі кількісної генетики та генної інженерії, а ці два напрямки безпосередньо пов'язані з селекцією рослин. Не випадково дуже докладні генетичні карти арабідопсиса були створені колективом авторів, більшість з яких співробітники аграрного університету в м. Вагенінгене (Нідерланди) [31]. Побудова генетичних карт ? не тільки основний підсумок генетичних досліджень, що дозволяють визначити місце розташування генів у групі зчеплення, а й умова успішної розробки на даному об'єкті багатьох фундаментальних і прикладних проблем, пов'язаних з вивченням структурно-функціональної організації генома рослин.

Початок розвитку генетики як окремої науки пов'язане з ім'ям чеського вченого Грегора Менделя. У 1865 році вийшла в світ його робота "Досліди над рослинними гібридами", в якій він встановив основні закони успадкування ознак, пізніше стали основою генетики [17]. Свої видатні дослідження Мендель проводив на самозапильній рослині ? гороху. Ці закономірності спадковості мали фундаментальне значення для теорії і практики гібридизації рослин і селекції взагалі. У 1900 році троє вчених - К. Корренс в Німеччині, Е. Чермак в Австрії і Г. Де-Фриз в Голландії, проводячи досліди по гібридизації різних рослин, незалежно один від одного отримали ті ж результати, що і Г. Мендель. Звернемо увагу на те, що як Мендель, так і вчені, перевідкривши його закони, проводили свої дослідження на рослинах. Ще одне фундаментальне узагальнення генетики, закон не успадкованих модифікацій, сформульований В. Йогансеном теж за результатами дослідження відбору в популяціях і чистих лініях рослин. Взаємодія генів та їх зчеплення також були відкриті при генетичному аналізі рослин [7].

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. був названий «ботанічною дрозофілою» завдяки короткому життєвому циклу, високому коефіцієнту розмноження, мініатюрності, можливості вирощувати цю рослину круглий рік [8]. Пріоритет відкриття цього генетичного об'єкта належить вітчизняним ученим. У 1932 році у доповіді на Всесоюзній конференції з планування генетико-селекційних досліджень М.І. Вавілов говорив: "Пора серйозно почати пошук рослинних дрозофіл. В найкоротший термін необхідно розшукати серед дикої природи нові об'єкти, які швидко ростуть, що відрізняються різноманітністю форм, великим коефіцієнтом розмноження, доступністю цитологічного аналізу, які могли б бути взяті в генетичну роботу "[1, 2, 9].

Пошуки "ботанічної дрозофіли" велися направлено. У нашій країні ще в 1932-1933 рр. Б.М. Козо-Полянським була організована експедиція Ленінградського інституту ботаніки в район озера Ельтон для збору рослин-ефемерів, які мають короткий життєвий цикле і мале число хромосом. Результати цитогенетичного аналізу 21 виду рослин, привезених експедицією, були опубліковані в роботі М.М. Титової "Пошуки ботанічної дрозофіли". Головним висновком була рекомендація використовувати в якості перспективного генетичного об'єкта вид Arabidopsis thaliana [3]. Однак робота Титової залишилася практично не поміченою. Тільки після опублікування статті Ф. Лайбаха, в якій були узагальнені результати його багаторічних досліджень цього виду та показані незаперечні переваги арабідопсиса для біологічних і генетичних досліджень, цей об'єкт став використовуватися в генетичних експериментах [4].

Перша колекція індукованих мутантів Arabidopsis thaliana була отримана Е. Рейнхольц, яка під керівництвом Лайбаха виконала перші для даного об'єкта досліди з радіаційного мутагенезу [24]. Генетична карта, яка налічує 21 локус, була опублікована в 1964 р. [34]. Більш докладний виклад історії "ботанічної дрозофіли" можна знайти в роботах [10, 37].

Генетичні дослідження з Arabidopsis thaliana в СРСР були розпочаті на кафедрі генетики та селекції Ленінградського Державного Університету [12, 38]. У 1960 р. мутанти, що отримані в цих дослідженнях, були передані для використання в навчальному процесі на кафедру генетики та селекції МГУ. Зусиллями Янушкевича С.І. і Чижевської Є.В. Arabidopsis thaliana був впроваджений в якості основного навчального рослинного об'єкта. Використання радіаційного та хімічного мутагенезу дозволило створити на кафедрі генетики та селекції МДУ саму велику колекцію A. thaliana в Росії [12]. Арабідопсис успішно використовувався в навчальному процесі та науковій роботі Донецького національного університета [18] і Луганського національного аграрного університета [22].

З 20 років ХХ століття для лабораторних генетичних досліджень широко використовувався як модельний об'єкт ? плодова мушка (Drosophila melanogaster). Дрозофіла є популярним об'єктом для генетичних досліджень з наступних причин: вона порівняно легко розмножується в лабораторних умовах, має короткий цикл розвитку, плодовита, має велике число форм з чітко вираженими спадковими змінами морфологічних ознак. Саме на дрозофілі були виконані об'ємні роботи по зчепленню і кросинговеру, що дозволили сформулювати закони Моргана Т.Г., які є фундаментом хромосомної теорії спадковості [15, 16, 18]. Все позитивне, що сказано вище про дрозофілу, характерно і для арабідопсиса, причому часом більшою мірою. Цикл розвитку арабідопсиса декілька довше, ніж у дрозофіли.

Як і у дрозофіли, у арабідопсиса виділені і підтримуються багато мутантних ліній, марковані чітко ідентифікованими картованими генами [5, 14, 21]. В даний час арабідопсис вивчений не гірше, ніж дрозофіла і є пріоритетною моделлю в генетиці рослин [19, 32].

Експерименти з Arabidopsis thaliana проводяться в багатьох лабораторіях світу. Щоб забезпечити збереження мутантних ліній, полегшити дослідникам можливість одержання насіння цих ліній, створено два найбільших міжнародних колекційних центри: при Європейському університеті (Nottingham Arabidopsis Stock Centre - NASC) і Центр біоресурсів Arabidopsis thaliana при університеті штату Огайо (Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State - ABRС). Зазначені центри підтримують і поширюють насіння диких рас і мутантів, а також клони і бібліотеки ДНК. Інформацію про наявні в колекціях зразків насіння, клонів і бібліотек ДНК можна знайти на сторінках Інтернету http://nasc.nott.ac.uk (NASC) і http://aims.cps.msu.edu./aims (ABRС) [31]. Створення банків мутантів арабідопсиса було одним з перших кроків у виконанні багатонаціонального проекту з вивчення геному Arabidopsis thaliana, розпочатого в 1990 році. Постійно оновлюється інформація про дослідження в рамках проекту (про банки, класичні генетичні карти, молекулярні та фізичні карти, тощо) можна знайти у спеціально створеній базі даних (Arabidopsis datebase) за адресою http://genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/.

При узагальненій кількості публікацій з молекулярної генетики та генної інженерії за 1994 рік встановлено, що приблизно 53% досліджень виконано на людині, 18% ? на одному з видів нематод, 12% ? на Arabidopsis thaliana, 11% ? на рисі і т.д. [6]. Проводиться порівняння генетичних і молекулярних карт. Відчувається брак спеціально створених ліній для генетичних досліджень. Такі лінії повинні відрізнятися від вихідної двома і більшим числом картованих генів. За вихідну лінію доцільно брати Landsberg erecta (er), на базі якої отримана особливо велика кількість картованих мутацій [30, 32].

Частина з мутацій NASC є в колекції Луганського національного аграрного університета [33]. Це мутації 24 маркованих генів: 10 генів найдовшою першої хромосоми (AN1, DIS1, GAI, DW1, FB, DIS2, CH1, AP1, CLV1, FE), 6 генів з п'ятої хромосоми (TFL1, FY, FG, CH5, YI, MIN), 5 генів з четвертої хромосоми (BP, FCA, FD, AP2, CP3), з другої ? два гени (CP2, ER), з третьої ? ген GL1. Загалом, є маркери всіх п'яти хромосом арабідопсиса.

У арабідопсиса отримано багато мутантних ліній на одній генетичній основі, і вони використовуються у вивченні успадкування кількісних ознак. В основному, це мутації, що візуально виявляються на ранніх етапах картування, відрізняються від дикого типу за одним або кількома генами [28, 40]. У відомих світових центрах по збереженню генофонду арабідопсиса є десятки ліній цього модельного рослинного об'єкта, марковані двома і більшим числом мутантних алелів. Всі ці лінії, кожна з яких має свої переваги і недоліки, використовувалися і використовуються насамперед при картуванні генів, а також і в інших генетико-селекційних дослідженнях. Зокрема, в лінії W100 кожна з п'яти хромосом маркована мутантними алелями, і це дає великі переваги при генетичному картуванні. Однак, ця лінія несе алелі, які ускладнюють роботу з нею в звичайних стандартних умовах [42]. Ряд інших полімутантних ліній обтяжені цими ж або іншими, ускладнюючими роботу, алелями. З цієї причини актуальним завданням залишається отримання полімутантних ліній, маркованих високо життєздатними у звичайній грунтовій культурі алелями, прояв яких легко візуально виявляється на різних етапах онтогенезу рослин без використання складних приладів і обладнання. Проблемі отримання нової рекомбінантної лінії арабідопсиса присвячена наша робота.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Матеріалом для створення нового рецесиву є лінії, насіння яких було отримано нами з Європейського центру підтримки генетичної колекції арабідопсиса (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, NASC). Це лінії за рецесивними генами bp-1, clv1-1, gl1-1 і tfl1-2, загальна характеристика яких наведена в табл. 1.

Взяті в експеримент мутантні лінії за генами bp-1, clv1-1, gl1-1 і tfl1-2 отримані на основі чистої лінії, авторська назва Landsberg erecta, фенотип ? прямостояче (еректоїдне) стебло. Таким чином, вихідні мутантні лінії відрізняються від лінії Landsberg erecta тільки за одним геном er, а по відношенню до дикого типу є подвійними рецесивами.

Таблица 1 Загальна характеристика ліній Arabidopsis thaliana із колекції NASC

Символ алеля	Назва лінії	Фенотип	Хромосома/ сайт
er-1	Erecta	Прямостояче (єректоїдне) стебло	2/48
bp-1	Brevipedicеllus	Короткі квітконіжки, плоди повернуті донизу	4/15
сlv1-1	Clavata	Булавоподібний плід	1/110
gl1-1	Glabra	Трихоми на розеткових листках та стеблі відсутні	3/46
tfl1-2	Terminal flower	Суцвіття рано закінчується верхівковою квіткою	5/2

Фахівцями NASC використовується класифікація мутацій, за якою виділяють: біохімічні (biochemical mutants), що визначають зміну забарвлення рослин (color mutants), морфологічні (form mutants), що мають відношення до квіток і цвітіння (flowering mutants) і фотоморфогенетичні мутації (photomorphogenic mutants). У роботі використовували мутації, пов'язані з двома типами цієї класифікації: bp-1, clv1-1, er-1, gl1-1 - form mutants; tfl1-2 - flowering mutants.

Техніка роботи з арабідопсисом та методика проведення досліджень докладно описана Соколовим І.Д. [22]. Експеримент проводили в лабораторії світлокультури на кафедрі біології рослин ЛНАУ в 2012 році. Культивували рослини арабідопсиса на стелажах при температурі 18 - 22 є С, освітлення цілодобове, освітленість в межах 4000 люкс.

Рослини, які використовували як батьківські лінії, і гібриди першого покоління вирощували в горщиках. Для аналізу розщеплення рослини F2 висівали в ящики. У ящику 14 рядків по 14 рослин в кожному рядку, що становить 196 рослин. Перевірку гомозиготності створених ліній проводили за допомогою генетичного аналізу розщеплення в F3 за мутантними рецесивними генами, що нас цікавлять.



Рис. 1. Ящик з рослинами F2 Arabidopsis thaliana

Рослини вирощували в грунтовій культурі [18]. Для більш дружного проростання, а також скорочення вегетаційного періоду виробляли холодову обробку насіння арабідопсиса. Насіння розміщали в простерилізовані чашки Петрі на фільтрувальний папір, змочений 0,01% розчином азотнокислого калію (KNO3). Чашки Петрі ставили в холодильну камеру і витримували там протягом 5 діб при температурі 4-60С. Стежили за тим, щоб фільтрувальний папір був весь час вологий. Потім виймали чашки Петрі з холодильної камери і на одну добу залишали їх при кімнатній температурі (18-220С), щоб насіння наклюнулося, тобто, щоб лопнула насіннєва шкірка.

Успіх чи невдача в культивуванні арабідопсиса в лабораторних умовах визначається, в основному, тим, як підготовлена грунтосуміш до посіву і проводився сам посів. Для приготування грунтосуміші заготовляли грунт, пісок і торф. Для вирощування арабідопсиса підходить, зокрема, чорнозем звичайний, взятий під листяними деревами. Верхній 10-15 сантиметровий шар знімали. Цей грунт висушували, а потім просівали через сита діаметром 0,25 і 2,5 мм. Торф придатний верховий або перехідний, що володіє високою поглинаючою здатністю. Оскільки він складається з рослинних залишків різних за розміром, то його також необхідно просіяти через сито діаметром 1,25-1,5 мм, попередньо висушивши. Пісок брали річковий, але якщо нема такого, то можна використовувати звичайний силікатний пісок, використовуваний при будівництві. Попередньо його промивали водою, висушували і просівали через сито 1,5 мм. Для грунтосуміші брали 4 частини грунту, 2 частини піску і 1 частина торфу і все ретельно перемішували.

Посів зручно проводити спеціально виготовленою маленькою лопаткою з препарувальною голкою із зігнутим кінцем. Для посіву брали тільки насіння, яке наклюнулося, контролюючи його придатність за допомогою лупи або інших збільшувальних приладів.

Насіння слід обережно приліпити на стінку лунки нижче поверхні грунту на 2-3 мм. Якщо посадити нижче, то рослина не викине на поверхню сім'ядолі, і розеткове листя буде рости в лунці, стінки якої будуть перешкоджати нормальному його розвитку. Якщо посіяти на поверхню грунту, то насіння може висохнути (наприклад, у нічний час) і загинути. У кожну лунку необхідно саджати по одному насінні.

Після посадки грунтосуміш сильно зволожували. До появи добре розвинених зелених сім'ядолів посів накривали поліетиленовою плівкою, щоб створити парниковий ефект. Як тільки сім'ядолі досягнуть поверхні поліетиленової плівки, плівку прибирали. На ранньому етапі розвитку арабідопсиса поверхня грунту повинна бути завжди вологою, тому що в цей період неприпустимо пересихання грунту. Звичайний полив проводили два рази на добу (вранці та ввечері). Щоб уникнути засолення грунту, яке може негативно вплинути на розвиток рослин, полив проводили дистильованою водою.

Для отримання нових ліній арабідопсиса проводили гібридизацію наявних ліній. Квітка у арабідопсиса мала (2,5 - 3,0 мм) і тичинки неозброєним оком практично не видно, тому для роботи застосовували збільшувальний прилад - мікроскоп з бінокулярної насадкою МБС-1, МБС-9, МБС - 10.

Для кастрації вибирали тільки бутони з трохи виступаючими з чашечки пелюстками. Найкраще, щоб пиляки тичинок були вже жовтого або жовто-зеленого кольору. Квітки з розкритими пиляками не годяться, тому що пилок вже міг або може потрапити на рильце маточки при видаленні тичинок. Рильце маточки має бути волохатим в результаті утворення дрібних видільних залозок для утримання і пророщування пилку.

Пінцетом обережно розкривали чашолистки і пелюстки квітки, видаливши всі 6 тичинок. Пошук і видалення їх вимагає певної навички. Будь-яка, залишена тичинка може опилити маточку своєї квітки, що неприпустимо при проведенні схрещування. Після видалення всіх тичинок з іншої розкритої квітки батьківської лінії (зразка) виривали тичинку з розкритим пиляком, переносили її на рильце маточки від кастрованої квітки і перевіряли наявність пилку на рильце під мікроскопом. Вибір тичинок для запилення проводили під ручною лупою з 7 - 10 - кратним збільшенням.

Квітку, на якій проводили перехресне запилення, відзначали. Для цього з тонкої шовкової нитки довжиною близько 3 см робили петлю і надягали на запилену квітку. Всі процедури схрещування проводили дуже акуратно, щоб не допустити випадкового запилення кастрованої квітки пилком квіток цієї ж рослини. Щоб уникнути перехресного запилення, горщики необхідно розташовувати на достатній відстані один від одного, щоб квітки різних рослин не контактували один з одним.

3. СТВОРЕННЯ НОВОЇ МУЛЬТИМАРКЕРНОЇ ЛІНІЇ ЗА КАРТОВАНИМИ ГЕНАМИ bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2 ARABIDOPSIS THALIANA (L.) HEYNH

Для отримання тетрамутантної лінії bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2 в якості батьківської форми використані такі рецесиви: Brevipedicellus, Clavata,Glabra(bp-1, clv1-1, gl1-1) і Brevipedicellus, Terminal flower (bp-1, tfl1-2). Фенотип лінії bp-1, tfl1-2: рослини з квітками і плодами майже без квітконіжок і плодоніжок, з поверненими донизу стручками; квітконіс рано закінчується верхівковою квіткою, формується кілька зближених квіток без квітконіжок (рис. 2).

Фенотип лінії bp-1, clv1-1, gl1-1: рослини з квітками і плодами майже без квітконіжок і плодоніжок, з поверненими донизу булавоподібними плодами; волоски на розеткових листках і стеблах відсутні (рис. 3).

Рис. 3. Лінія арабідопсиса Таля bp-1, clv1-1, gl1-1

Заради компактності генетичних формул далі замість символу аллеля bp-1 будемо використовувати мнемонічне позначення bp, замість clv1-1 просто clv1, замість gl1-1 просто gl1 і взамін tfl1-2 просто tfl1. Зауважимо, що всі вищевказані лінії, строго кажучи, є три-, тетра-і пентамутантними ? всі вони несуть також у гомозиготному стані алель er-1.

Генотип P1 - bpbpclv1clv1gl1gl1Tfl1Tfl1, генотип P2 - bpbpClv1Clv1Gl1Gl1tfl1tfl1. Генотип F1 від схрещування батьківської лінії - bpbpClv1clv1Gl1gl1Tfl1tfl1. У F1 спостерігається повне домінування ознак нормального або дикого типу (clv1 < Clv1, gl1 < Gl1, tfl1 < Tfl1): плід - стручок, утворений двома плодолистками; рослини опушені переважно розгалуженими волосками з домішкою простих; суцвіття проста чи складна китиця. Рослини з квітками і плодами майже без квітконіжок і плодоніжок, з поверненими донизу стручками, оскільки обоє батьків гомозиготні за рецесивним алелем bp. мультимаркерний мутація алель ген

Гени CLV1, GL1 і TFL1 розташовані в різних хромосомах, а саме: CLV1 в локусі 114 першої хромосоми, GL1 в локусі 46 третьої хромосоми і TFL1 в локусі 2 п'ятої хромосоми [20]. У F2 спостерігається їх незалежний розподіл. Розщеплення відбувається за тригібридною схемою 27:9:9:9:3:3:3:1. З 196 рослин F2 очікувана частка особин, гомозиготними за алелями clv1, gl1 і tfl1, становить 1/64 (тобто ~ 3 рослин).

Схема схрещування

P + bpbpclv1clv1gl1gl1Tfl1Tfl1 Ч > bpbpClv1Clv1Gl1Gl1tfl1tfl1

F1 bpbpClv1clv1Gl1gl1Tfl1tfl1

F2 27 bpbpClv- Gl1- Tfl1-

9 bpbpclv1clv1Gl1- Tfl1-

9 bpbpClv1- gl1gl1Tfl1-

9 bpbpClv1- Gl1- tfl1tfl1

3 bpbpclv1clv1gl1gl1Tfl1-

3 bpbpclv1clv1Gl1- tfl1tfl1

3 bpbpClv1- gl1gl1tfl1tfl1

1 bpbpclv1clv1gl1gl1tfl1tfl1

Фактично кількість тетрамутантних особин дещо відрізняється від очікуваних. У всіх рослин в F2, як і повинно, були короткі квітконіжки і плодоніжки, плоди повернені донизу. У F2 відбирали рослини із плодом чотирьохгніздна коробочка, волоски на розеткових листках і стеблах відсутні, і такі, у яких квітконіс рано закінчується верхівковою квіткою, формується кілька зближених квіток без квітконіжок.

Таким шляхом в результаті схрещування і подальшого відбору було отримано новий тетрамутантний рекомбінант Brevipedicellus, Clavata, Glabra, Terminal flower(bp-1, clv1-1, gl1, tfl1-2). Нова лінія має такий фенотип: короткі квітконіжки і плодоніжки, плоди повернені донизу; плід - чотирьохгніздна коробочка; волоски на розеткових листках і стеблах відсутні; квітконіс рано закінчується верхівковою квіткою, формується кілька зближених квіток без квітконіжок.

Рис. 4. Нова мультимаркерна лінія bp-1, clv1-1, gl1, tfl1-2

З представленого малюнка видно, що загальна довжина геному A. thaliana становить 122 +83 +96 +76 +98 = 475 см. Ймовірність визначення локалізації до групи зчеплення при використанні даної тест-лінії дорівнює (75%). Інакше кажучи, приблизно в 75% випадків мутацію, що тестувалася, буде чітко локалізовано по групі зчеплення A. thaliana.

Отримана нами нова лінія придатна для досліджень в галузі функціональної геноміки. Створення нових ліній сприяє вирішенню завдань з картування генів. Дана тест-лінія дозволяє проводити роботу з картування невідомих генів арабідопсиса в ході одного експерименту. Також отримана полімутантна лінія може бути використана для з'ясування можливостей генетичної мінливості, важливих у розумінні еволюції і селекції. Її можна використовувати для полегшення підтримки колекції мутантних алелей.

Локалізація маркерів за групами зчеплення і сайтами мультимаркерної лінії (bp-1, clv1-1, gl1, tfl1-2) показана на рис. 5. Жирною лінією позначені ті частини хромосом, гени яких виявляють зчеплення з відповідними маркерами. У хромосомах 2 і 3 маркери розташовані так, що з ними повинні виявляти зчеплення практично всі гени цих хромосом. Маркери хромосом 4 і 5 придатні для локалізації до групи зчеплення майже всіх нових мутацій за цими хромосомами. Розташована у кінці найдовшої 1-ої хромосоми алель clv1-1 придатна для локалізації приблизно половини генів цієї хромосоми. Гени другої (на малюнку верхньої) половини не будуть виявляти зчеплення з маркером clv1-1.

4. ВИВЧЕННЯ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ ЛІНІЙ

Результати порівняння життєздатності мономутантної лінії, створеної нами тетрамутантної лінії з вихідною гомозиготною лінією Landsberg erecta (er-1) представлені в табл. 2.

Лінії bp-1 і tfl1-2 достовірно не відрізняються від контрольної лінії, оскільки фактичне значення F-критерію (F = 3,68) менше стандартних значень. Можна прийняти нульову гіпотезу і вважати, що по життєздатності порівнювані лінії однакові.

Таблиця 2 Життєздатність ліній

Лінії	Висіяли пророщеного насіння	Збереглося рослин до моменту цвітіння	Частка збережених рослин, %	F-критерій Фішера	Fst
er-1	33	33	100	-
bp-1	33	31	93,9	3,68	4-7-11,9
clv1-1	32	29	90,6	5,79*	4-7-11,9
gl1-1	32	32	100	-
tfl1-2	33	31	93,9	3,68	4-7-11,9
bp-1,clv1-1,gl1,tfl1-2	33	29	87,9	7,76**	4-7-11,9

Мутантні лінії bp-1 і tfl1-2 мають однакову життєздатність. Лінії clv1-1 і bp-1, clv1-1, gl1, tfl1-2 по життєздатності трохи поступаються вищевказаним лініям. При порівнянні з життєздатністю вихідної лінії er-1 виявилося, що лінії clv1-1 і bp-1,clv1-1,gl1,tfl1-2 достовірно нижче по життєздатності, оскільки фактичний F-критерій Фішера більше, ніж стандартні значення. Правда, надійність цього судження не дуже велика (ймовірність помилки 5%).

Невеликі відмінності в життєздатності ліній не є перешкодою для використання їх у генетико-селекційних дослідженнях. За допомогою математичного моделювання співробітниками кафедри біології рослин ЛНАУ було встановлено, що відхилення в розщепленні від звичайних співвідношень генотипів спостерігаються тільки при зниженні життєздатності ліній нижче 60%.

5. ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ

Економічну ефективність вирощування озимої пшениці розраховували з урахуванням таких основних показників як урожайність, вартість валової продукції, виробничі витрати, собівартість продукції, чистий прибуток і рентабельність.

Ці показники визначали за наступними формулами:

1. Чистий прибуток (ЧП):

ЧП = ВП - ВВ

де ВП - валова продукція

ВВ - виробничі витрати.

2. Валова продукція:

ВП = В х Ц;

де В - врожайність, ц з 1 га;

Ц - ціна 1 ц продукції в гривнях.

3. Виробничі витрати (ВВ) розраховували за технологічною картою обробки озимої пшениці в ННВАК ЛНАУ «Колос».

4. Собівартість продукції (СП):

В - врожайність.

5. Рівень рентабельності (Р):

ВВ - виробничі витрати.

Показники економічної ефективності вирощування озимої пшениці представлені в табл. 4.

Таблиця 4 Економічна ефективність вирощування озимої пшениці Одеська 267 в умовах ННВАК ЛНАУ «Колос» (2012 рік)

N з/р	Параметри	Показники
1.	Урожайність із 1 га, ц	25
2.	Вартість урожаю с 1 га, грн.	2625
3.	Виробничі витрати на 1 га, грн.	1850
4.	Собівартість 1 ц. зерна озимої пшениці, грн.	74
5.	Чистий прибуток з 1 га, грн.	775
6.	Рівень рентабельності, %	41
7.	Реалізаційна ціна грн/т	1050

Розрахунки економічної ефективності показали, що при врожайності озимої пшениці 25 ц/га в 2012 році чистий прибуток склав 775 грн/га, а рівень рентабельності 41%. Таким чином, в умовах вирощування 2012 року рівень рентабельності озимої пшениці ННВАК ЛНАУ «Колос» середній

6. ОХОРОНА ПРАЦІ

Організація охорони праці

Нормативною основою управління охороною праці є: Конституція України; Закон України «Про охорону праці»; ухвали та розпорядження Верховної Ради України, Кабінету Міністрів України; система стандартів безпеки праці; норми, правила, положення, вказівки, інструкції з питань охорони праці, затверджені в установленому порядку органами Державного нагляду, міністерствами і відомствами.

Об'єктом управління охороною праці є діяльність функціональних служб і структурних підрозділів ЛНАУ. Управління охороною праці здійснюють: в ЛНАУ - ректор університету, на факультеті і кафедрах - відповідні керівники (декани та завідуючі кафедрами).

Організаційно-методичну роботу по управлінню охороною праці, підготовку управлінських рішень і контроль за їх реалізацією виконує відділ охорони праці, безпосередньо підлеглий ректору університету. Відділ охорони праці ЛНАУ входить в структуру університету як один з основних виробничо-технічних служб. Відділ охорони праці укомплектований фахівцями, що мають вищу освіту та стаж роботи за профілем виробництва не менше трьох років.

Інструктажі з питань охорони праці в університеті проводяться відповідно до ДНАОП 0.00-4.12-05 «Типове положення про навчання з питань охорони праці» і по характеру і часу проведення підрозділяються на: ввідний, первинний, повторний, позаплановий та цільовий.

Про проведення інструктажів, стажування і допуск до роботи особа, що проводила інструктаж, робить запис в журналі. При цьому обов'язкові підписи інструктуємого і інструктуючого.

Фонд охорони праці ЛНАУ є обов'язковий для формування. Кошти на охорону праці відраховуються від загальних власних заощаджень університету. Кошти на охорону праці ЛНАУ використовуються тільки на виконання комплексних заходів, що забезпечують досягнення встановлених нормативів про охорону праці, а також подальше підвищення рівня охорони праці навчального процесу.

Виробнича санітарія

Створення нової мультимаркерної лінії арабідопсиса bp-1, clv1-1, gl1-1, tfl1-2 проводили в лабораторії світлокультури кафедри біології рослин ЛНАУ. Робота в лабораторії здійснювалася під керівництвом дипломного керівника. Перед початком робіт у лабораторії проводився вступний інструктаж.

Мікроклімат робочої зони визначається діючими на організм людини поєднаннями вогкості, температури і швидкості руху повітря, а також вмістом шкідливих речовин в повітрі робочої зони. Показники мікроклімату приведені в ДСН 3.3.6.042-89 «Санітарні норми мікроклімату виробничих приміщень», і в лабораторії, де проводилися дослідження, відповідають нормам.

Для забезпечення нормованих температур в холодну пору року, всередині приміщення, незалежно від температури зовнішнього повітря, передбачена система опалювання. Для видалення з приміщення надлишків тепла, вологи, пилу, а також з метою створення мікроклімату відповідно до СНиП 2.04.05-86 «Отопление, вентиляция и кондиционирование» в лабораторії встановлений кондиціонер. В лабораторії є також природна вентиляція, яка здійснюється через вікно та витяжні канали.

Кожне місце в лабораторії займає 4.5 м2 поверхні підлоги і 15 м3 об'єму приміщення. Робоче місце складається з стільця і столу. Робота проводиться за допомогою бінокулярної лупи МБС-1 і вимірювальних приладів: торсіонних терезів ВТ-1 і мірної лінійки. Робоче місце обладнано відповідно до вимог ГОСТ 12.2.032-78 «ССБТ. Робоче місце при виконанні робіт сидячи. Загальні эргономічні вимоги».

В лабораторії робоче місце освітлюється як природним (бічне освітлення), так і штучним світлом відповідно до норм, встановленими згідно вимог ДБН.В2.5-28-2006 «Природне і штучне освітлення». Освітленість при штучному освітленні відповідає 300 лк. Штучне освітлення використовують при недостатньому природному, а також при освітленні робочої поверхні в темний час доби. Джерелом штучного освітлення слугують лампи денного світла.

Коефіцієнт природної освітленості при бічному освітленні рівний 2. Рівень природної освітленості значно знижується у зв'язку із забрудненням засклених поверхонь світлових отворів, тому скло очищають не рідше двох разів на рік.

Для підтримки особистої гігієни є водопровідний кран, мило і рушник.

Техніка проведення схрещування арабідопсису

Підготовка робочого місця та інструмента

Квітка у арабідопсису дуже маленька і тичинки неозброєним оком практично не помітні, тому для роботи необхідний збільшувальний прилад. Для цих цілей найкраще підходять мікроскопи з бінокулярною насадкою МБС-1, МБС-9, МБС-10 або їх аналоги. Можна використовувати і бінокулярну стаціонарну лупу. Збільшення повинно бути 10-15-ти кратне.

Дуже добре працювати з мікроскопом без предметного столика. Для цього верхню оптичну частину мікроскопа встановлюють на спеціальний штатив, що дозволяє рухати оптику горизонтально. Обов'язкове верхнє підсвічування.

Верхівку квітконосного стебла необхідно зафіксувати. Для цього використовується звичайний лабораторний штатив із тримачем. У тримачі необхідно закріпити пінцет, кінці якого повинні мати ширину біля 2 мм. З внутрішньої частини на кінці пінцета треба наклеїти смужки дрібнопористого поролону, щоб при фіксації не ушкодити рослину. Цей пінцет повинен мати фіксований затискач з різьбою. Для цього в середній зоні пінцета обидві його частини просвердлюються наскрізь, причому в одному кінці отвір повинен бути більший за діаметром на 1-2 мм. У меншому отворі нарізається різьблення, у який загвинчується відповідний гвинтик, спочатку просмикнутий крізь більший отвір. У результаті при закручуванні гвинтика кінці пінцета будуть сходитися разом. Між ними розміщують верхню частину квітконосного стебла і фіксують його. Фіксувати рослину необхідно дуже обережно, щоб її не ушкодити.

Для кастрації квітки (видалення тичинок) необхідно підготувати ще один інструмент - гостро заточений пінцет. Найкраще підходить очний пінцет довжиною біля 10 см. Загострення проводиться на дрібнозернистому наждаковому обертовому колі. Гарне заточення вдається на побутовому верстаті "Вмілі руки", "Гном" та ін.

Заточення робити дуже обережно, без сильного натискування на наждакове коло. Неприпустима поява іскри, тому що загострені кінці пінцета обгоряють і стають дуже тендітними. Періодично необхідно кінці пінцета поміщати у воду для охолодження. Прямування пінцета по наждаковому колу повинно бути плавним і тільки проти його обертання. Готовність пінцета при загостренні треба періодично перевіряти під мікроскопом. Кінці пінцета обов'язково повинні бути гладкими, однакової довжини й однакової товщини. Студенти одержують готову установку для схрещування, необхідні інструменти і горщики з рослинами.

Техніка проведення схрещування

Обраний горщик із рослиною поставити на робочий стіл. Обережно зафіксувати стебло в пінцеті з затискачем так, щоб у обраної квітки була зафіксована і квітконіжка. Підвести зверху над рослиною бінокулярний мікроскоп і навести на різкість.

Для кастрації необхідно вибирати тільки пуп'янки з ледве виступаючими з чашечки пелюстками. Найкраще, щоб пиляки тичинок були вже жовтого або жовто-зеленого кольору. Квітки з пиляками, які вже розкрилися, не годяться, тому що пилок уже міг або може потрапити на рильце маточки при видаленні тичинок. Рильце маточки повинно бути волохатим у результаті утворення дрібних видільних залозок для утримання і пророщення пилку. У противному випадку пилок може не прорости і запліднення не відбудеться.

Пінцетом обережно розсунути чашолистики і пелюстки квітки, видалити усі 6 тичинок. Дивитися потрібно дуже уважно, тому що дві тичинки набагато коротші за інші. Пошук і видалення їх потребує певної навички. Будь-яка тичинка, що залишилася, може запилити маточку своєї квітки, що неприпустимо при проведенні схрещування. Операцію проводити дуже обережно, тому що гострими кінцями пінцета дуже легко можна ушкодити маточку. Якщо квітка погано зафіксована, наприклад, при довгій квітконіжці, можна другою рукою за допомогою препарувальної голки притримати її, що полегшить кастрацію.

Після видалення всіх тичинок, з іншої розкритої квітки відповідної лінії (зразка) необхідно вирвати тичинку з пиляком, що розкрився, помастити нею рильце маточки відкастрованої квітки і перевірити наявність пилку на рильці під мікроскопом. Вибір тичинок для запилення можна робити і під ручною лупою з 7-10-кратним збільшенням. Після схрещування потрібно віджати затискач пінцета і звільнити суцвіття арабідопсису. З тонкої шовкової нитки довжиною біля 3 см зробити петлю і надіти на відкастровану квітку. Потім обережно затягти петлю нитки навколо квітконіжки, не пошкодивши її. За добу-дві після кастрації для надійності необхідно зробити повторне (контрольне) запилення. Відзначимо, що при фіксуванні одного суцвіття можна зробити подібну операцію з 2-3 квітками.

Оскільки в одному горщику або навіть на одній рослині може бути декілька комбінацій схрещувань, то треба використовувати нитки різних кольорів. Після цього необхідно обов'язково записати дату і комбінацію схрещування, номер горщика, номер рослини, колір нитки і кількість квіток, із якими була зроблена дана операція.

Лінія Brevipedicellus (bp) має дуже короткі квітконіжки, квітки повернені униз, тому видаляти тичинки з бутонів складно. Якщо в комбінації схрещування є bp, то її треба брати в якості батьківської форми. Безпелюсткову лінію Apetala (ap1, ap2) теж краще брати в якості батьківської форми.

Усі процедури схрещування повинні проводитися дуже акуратно, щоб не припустити запилення квіток із видаленими тичинками пилком квіток, що розкрилися, цієї ж рослини.

Кожному студенту необхідно провести дві-три кастрації і зробити відповідну комбінацію схрещування за завданням викладача. Усі операції контролюються викладачем.