Размещено на http://allbest.ru

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ННЦ “Інститут біології”

Кафедра біохімії

Спеціалізація молекулярна біологія

Зав. кафедри проф., д.б.н. Остапченко Л.І.

Дипломна робота

Оцінка взаємодії білка NPRL2 з компонентами мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз

студентки IV-го курсу денної форми навчання

Кулеші Альони Вікторівни

Робота виконана: лабораторія структурної

ензимології та біохімії Національного центру

наукових досліджень Франції в м. Жиф-сюр-Іветт

під керівництвом: доктор Марк Міранд

Київ 2015



РЕФЕРАТ

Макромолекулярні комплекси, до складу яких входять аміноацил-тРНК-синтетази, є відмінною ознакою вищих еукаріот. Найбільшим представником є MARS, мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс , який складається із дев'яти ферментів та трьох допоміжних білків. Аміноацил-тРНК-синтетази, окрім аміноацилювання транспортної рибонуклеїнової кислоти, виконують також неканонічні функції. Трансляція білків пов'язана із іншими метаболічними процесами та сигнальними шляхами, зокрема із mTOR-сигнальним шляхом, який об'єднує велику кількість ланок. Недавні дослідження показали, що білок NPRL2, складова частина комплексу GATOR1, який є інгібітором mTORC1 комплексу, взаємодіє із компонентами макромолекулярного комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз, проте поки що невідомо з якими.

Зважаючи на важливість неканонічних функцій аміноацил-тРНК-синтетаз, їх вивчення зробить великий внесок у розуміння функціонування клітини та дасть можливість розробити ефективніші методи впливу на трансформовані клітини.

Робота присвячена пошуку партнерів білка NPRL2 у комплексі MARS шляхом оцінки його взаємодій між метіоніл-, глутамініл-, лізил-, аспартил-тРНК-ситетазою та р43. В роботі використовувались методи котрансфекції культури клітин людини, імунохроматографії та Вестерн-блот аналізу. В результаті роботи було показано, що група із п'яти компонентів мультисинтетазного комплексу не взаємодіє із білком NPRL2.



ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

АРСаза	-- аміноацил-тРНК-синтетаза
Ар4А	-- диаденозилтетрафосфат
Arc1p	-- (aaRS cofactor 1) кофактор 1р аміноацил-тРНК-синтетаз
DMEM	-- (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) поживне середовище для культур клітин еукаріот
еEF-1H	-- “важка” форма фактору елонгації трансляції 1 (eEF1A, eEF1Bб, eEF1Bв і eEF1Bг)
EPRS	-- глутаміл-проліл-тРНК-синтетаза
GATOR1	-- комплекс-регулятор Rag ГТФаз
KRS	-- лізил-тРНК-синтетаза
LRS	-- лейцил-тРНК-синтетаза
mTOR	-- (mechanistic (mammalian) target of rapamycin) серин-треонінова протеїнкіназа
MARS	-- мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс
MRS	-- метіоніл-тРНК-синтетаза
MutS	-- білок постреплікативної системи репарації місметчів у E. coli
NPRL2	-- (nitrogen permease regulator-like 2) білок, учасник mTOR-сигнального шляху
QRS	-- глутамініл-тРНК-синтетаза
TUSC4	-- (tumor suppressor candidate 4) ген, який кодує NPRL2
Raptor	-- білок, регуляторно-асоційований з mTOR
DEPTOR	-- DEP-домен, що містить ділянку для взаємодії з mTOR.
PRAS40	-- 40 kDa пролін-багатий субстрат для Akt-кінази.
VEGA	-- (valyl-tRNA synthetase/elongation factor 1A/guanine exchange factors assembly) валіл- тРНК-синтетаза -- еEF-1H комплекс



ЗМІСТ

ВСТУП

РОЗДІЛ 1. БІЛОК NPRL2 ТА ЙОГО БІОЛОГІЧНА РОЛЬ

1.1 Ідентифікація гену TUSC4

1.2 Білок NPRL2 як продукт гену TUSC

1.3 Білок NPRL2 у mTOR-сигнальному шляху

РОЗДІЛ 2. МУЛЬТИФЕРМЕНТНІ КОМПЛЕКСИ АМІНОАЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗ

2.1 Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот

2.2 Неканонічні функції аміноацил-тРНК-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу MARS

РОЗДІЛ 3. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3.1 Матеріали та реактиви

3.2 Клітинна лінія

3.3 Підготовка ДНК для трансфекції

3.4 Підготовка клітин HeLa до трансфекції

3.5 Підбір оптимальних умов трансфекції

3.6 Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent

3.7 Імунохроматографія з використанням гелю, що містив антитіла до мітки Flag

3.8 Вестерн-блот аналіз

3.9 Візуалізація результатів досліду

РОЗДІЛ 4. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

4.1 Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene

4.2 Умови проведення трансфекцій

4.3 Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

4.4 Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

4.5 Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

4.6 Ідентифікація взаємодії між лізил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

4.7 Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу MARS, та білком NPRL2

ВИСНОВКИ

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ



ВСТУП

Важливою властивістю живих організмів є їх здатність до контролю анаболічних та катаболічних процесів. Утримання балансу між процесами розпаду та синтезу білків дозволяє виживати та функціонувати в умовах мінливого надходження необхідних речовин. Зокрема, у ссавців цю властивість забезпечує сигнальний шлях, у якому центральним елементом виступає протеїнкіназа mTOR (механічна мішень рапаміцину).

mTOR-сигнальний шлях функціонує у відповідь на різні сигнали навколишнього середовища клітини, контролюючи процеси утворення та використання великої кількості енергії і поживних речовин. Саме тому йому і приписують важливу роль під час росту та поділу клітини. Будь-які зміни у роботі цього шляху призводять до виникнення таких хвороб людини, як різні види раку, ожиріння, діабет ІІ типу та нейродегенеративні захворювання [1].

Відомо, що цей шлях включає в себе велику кількість як специфічних білків, так і таких, які виконують тут свою неканонічну функцію [2]. Зокрема, білок NPRL2 є частиною комплексу GATOR1, який в свою чергу є негативним регулятором mTOR-кінази. За неопублікованими даними групи директора Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) доктора Наойї Фуджіти, цей білок взаємодіє із макромолекулярним комплексом аміноацил-тРНК-синтетаз.

Мульти-аміноацил-тРНК-синтетазний комплекс (MARS), молекулярна маса якого складає приблизно 1,5 MDа, було описано більше ніж 20 років тому, але його структурна і функціональна організація ще й досі є предметом дослідження. Даний комплекс присутній у вищих еукаріот починаючи від Drosophila і закінчуючи ссавцями [3]. До його складу входять дев'ять аміноацил-тРНК-синтетаз та три допоміжних білка (р18, р38, р43). Компоненти комплексу, взаємодіючи між собою, утворюють два структурні субкомплекси. Існує гіпотеза, що MARS може виконувати роль молекулярного центру для координації процесів біосинтезу білка та певних сигнальних шляхів у клітині [4]. Так, як процеси аутофагії та біосинтезу білка є залежними у певних умовах, цілком можлива участь компонентів одного сигнального шляху у іншому.

Метою нашої роботи була перевірка взаємодій між рекомбінантним білком NPRL2 та такими компонентами мультисинтетазного комплексу, як метіоніл-, глутамініл-, лізил-, аспартил-тРНК-синтетазами та білком р43. Для досягнення мети були поставлені завдання: котрансфікувати культури клітин HeLa відповідними векторами, що містять відкриті рамки зчитування зазначених вище білків, виділити можливі утворені комплекси за допомогою імунохроматографії та перевірити наявність обох цільових білків за допомогою Вестерн-блот аналізу.



РОЗДІЛ 1. БІЛОК NPRL2 ТА ЙОГО БІОЛОГІЧНА РОль

1.1 Ідентифікація гену TUSC4

Розвиток злоякісних пухлин з епітеліальних тканин є найбільш поширеним типом раку і вирізняється найвищим рівнем летальності. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я у 2012 році від раку померло близько 8,2 мільйонів людей, з них 1,59 мільйона від раку легень (19,4%), печінки -- 0,8 мільйона (9,1%), шлунка -- 0,7 мільйона (8,8%) та 0,5 мільйона (6%) від раку молочної залози [5]. Через актуальність даної проблеми є необхідним вивчення процесу розвитку різних видів раку та створення дієвих методів лікування. Рак легенів розвивається внаслідок багатостадійного процесу, що включає безліч генетичних та епігенетичних змін домінантних онкогенів та генів-супресорів пухлин. Деякі з них можуть бути знайдені у клітинах епітелію, який ушкоджується під час паління, а також у фенотипово нормальних, неушкоджених клітинах. Для подальшої роботи з такими типами захворювань необхідно детально описати геном перероджених клітин. Найважливішою інформацією є ідентифікація потенційних онкогенів та генів-супресорів.

Дані багатьох досліджень свідчать, що делеція ділянки хромосоми у регіоні 3р21.3 спостерігалась при вивченні деяких видів раку, зокрема раку легенів, молочної залози, шийки матки, яєчників та нирок [6-9]. Так, при аналізі геному траснформованих клітин легенів та молочної залози було визначено ділянки розміром у 630 та 120 тисяч пар нуклеотидів відповідно, втрата яких призводить до їх трансформації [6,10,11]. Ці ділянки було проналізовано та знайдено 9 генів, які вважають потенційними супресорами пухлин: делеції чи мутації цих генів є типовими для ракових клітин. Серед цих генів було знайдено і TUSC4 (потенційний супресор пухлин 4).



1.2 Білок NPRL2 як продукт гену TUSC4

Білок NPRL2 - продукт гену TUSC4; у вигляді різних сплайсованих форм у нормі експресується у багатьох типах тканин, включаючи серцевий та скелетні м'язи, головний мозок, нирки, печінку та легені. Найбільш поширеною формою є білок, який складається із 380 амінокислотних залишків та кодується мРНК, яка містить 11 екзонів. Біоінформатичними методами було передбачено, що NPRL2 містить сигнал ядерної локалізації, домен зв'язування -- гранулін, ділянку, що має схожість із білком MutS та домен-регулятор пермеази азоту [10].

Порушення експресії та функціонування білка NPRL2 пов'язують із багатьма видами раку. Деякий час вважалось, що у трансформованих клітинах присутні відмінні від нормальних форми сплайсованих РНК. Проте, наступні дослідження показали, що клітини пухлин містять безсенсові та міссенсові мутації кодуючого гена[12]. Незважаючи на встановлений факт супресії, механізм NPRL2-опосередкованого впливу на пухлину і досі залишається невідомим. Останні дослідження показали, що NPRL2 бере участь у репарації місметчів ДНК на стадії перевірки клітинного циклу, у регуляції апоптозу [12-14]. Надлишкова експресія NPRL2 в деяких пухлинних клітинних лініях, як повідомлялося, індукує апоптоз і пригнічує проліферацію [13]. Білок NPRL2 виконує ще одну важливу функцію як один із учасників mTOR-сигнального шляху [15].

1.3 Білок NPRL2 у mTOR-сигнальному шляху

mTOR - протеїнкіназа, яка входить у склад двох важливих комплексів mTORC1 та mTORC2. mTORC1 складається із таких основних елементів: mTOR, як каталітична субодиниць, та чотири інших білки, Raptor (білок, регуляторно-асоційований з mTOR), DEPTOR (DEP-домен, що містить ділянку для взаємодії з mTOR), PRAS40 (40 kDa пролін-багатий субстрат для Akt-кінази) та mLST8 (також відомий як GвL) [16-19]. mTOR містить серин-треонін протеїнкіназний домен на своєму С-кінці. На даний момент немає доказів того, що mTORC1 має будь-яку іншу ферментативну функцію, окрім кіназної активності. Raptor і GвL зберігаються у складі комплексу протягом еволюції, проте їх функції і досі погано вивчені. Вважається, що Raptor відіграє роль у збірці комплексу, залученні субстратів і в регулюванні діяльності mTOR-кінази. Міцність зв'язку між mTOR і Raptor регулюється концентрацією поживних речовин та інших сигналів, які впливають на mTORC1-шлях, але як саме цей зв'язок модифікує функціонування всього mTORC1-шляху невідомо. Білок PRAS40 функціонує як інгібітор комплексу mTORC1, а DEPTOR - лише mTOR-кінази. Невеликий ГТФ-зв'язуючий білок Rheb (Ras гомолог, поширений у мозку) зв'язується з доменом кінази mTOR і відіграє важливу роль в її активації. В свою чергу білок Rheb інгібується GAP-білком TSC (комплекс туберозного склерозу).

Комплекс mTORC1, приєднуючись до мембрани лізосоми, блокує деградацію білків. Саме тому активність даного комплексу регулюється кількостю амінокислот всередині лізосоми. Для виконання цієї функції на мембрані лізосоми збирається комплекс, який складається із Rag ГТФази, комплексу Ragulator та вакуолярної АТФази (v-АТФази) [20]. Rag ГТФази відіграють важливу роль у реакції mTORC1 на підвищення концентрацій амінокислот, адже саме їх наявність зумовлює приєднання комплексу до лізосоми. У клітинах ці ферменти існують лише у вигляді гетеродимерів, зокрема у клітинах ссавців як Rag А/В або Rag С/D [21]. Rag ГТФази є одними із найважливіших білків, адже запобігають дерегуляції mTORC1 шляху завдяки точній реакції на зміну концентраційного рівня амінокислот. У свою чергу ці ГТФази регулюються кількома факторами, одним з яких є комплекс GATOR.

GATOR у своєму складі має два субкомплекси, один із яких (GATOR2) негативно регулює інший (GATOR1), який безпосередньо взаємодіє із гетеродимером Rag ГТФаз. GATOR1 складається із трьох компонентів: DEPDC5, NPRL2 та NPRL3; через перший компонент відбувається взаємодія з негативним регулятором (GATOR2). GATOR1, взаємодіючи із Rag ГТФазами, перешкоджає їх зв'язуванню із mTORC1 комплексом, що призводить до його дисоціації із поверхні лізосоми та деградації білків всередині неї. Було показано, що GATOR1 має GAP активність (стимулюює GTPазну активність мішені) по відношенню до Rag А/В, переводячи ці G-білки у неактивний стан. Проте компонент, який має цю активність і досі не визначено [22].

Беручи до уваги всі вище описані процеси, в яких бере участь білок NPRL2 стає зрозумілою необхідність дослідження його взаємодій із білками-учасниками інших метаболічних та сигнальних шляхів.



РОЗДІЛ 2. МУЛЬТИФЕРМЕНТНІ КОМПЛЕКСИ АМІНОАЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗ

2.1 Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот

Характерною особливістю аміноацил-тРНК-синтетаз вищих еукаріот є їх здатність до формування стабільних макромолекулярних комплексів in vivo.

У 1996 році вперше було показано існування мультисинтетазного комплексу у одноклітинних еукаріот -- дріжджів. При аналізі партнерів білка Los1p, який бере участь в біогенезі тРНК, було помічено білок Arc1p (aaRS cofactor 1).

При виділенні Arc1p був асоційований з двома ферментами - метіоніл- і глутаміл-тРНК синтетазами. Також було показано, що Arc1p взаємодіє не лише із синтетазами, а й із тРНК, що сприяє її ефективнішому аміноацилюванню in vivo [23].

У багатоклітинних еукаріот було виявлено існування двох макромолекулярних комплексів, які включають аміноацил-тРНК-синтетази - комплекс VEGA (Valyl-tRNA synthetase/Elongation factor 1A/Guanine exchange factors Assembly) та комплекс MARS (Multi-Aminoacyl-tRNA Synthetase complex).

Комплекс VEGA складається із валіл-тРНК-синтетази та чотирьох субодиниць фактора елонгації трансляції 1 (еEF1A та трьох субодиниць фактора обміну гуанінового нуклеотиду, а саме еEF1Bб, еEF1Bв, і еEF1Bг) [24]. На основі експериментів по реконструкції останнього комплексу in vitro було запропоновано кілька моделей організації еEF-1Н, проте вони суперечать одна одній щодо кількісного співвідношення субодиниць та характеру взаємодій між ними [25-27].

Встановлено, що NH₂-термінальний домен валіл-тРНК-синтетази є необхідним для утворення комплексу з субодиницею еEF1Bв [28]. Проте наявність цього домену у валіл-тРНК-синтетази варіює у клітинах еукаріот.

Наприклад, Artemia має повнорозмірний фермент, у дріжджів NH₂-термінальна додаткова ділянка відсутня [29]. Також відомо, що прокаріоти, нижчі еукаріоти та рослини не мають даного комплексу.

Найбільшим мультисинтетазним комплексом вищих еукаріот є комплекс MARS. Відомо, що до його складу входять АРСази першого і другого класів; деякі з них є мономерами (ізолейцил-, лейцил-, метіоніл-, глутамініл-, аргініл-тРНК-синтетази), димерами (лізил-, та аспаратил-тРНК-синтетази), біфункціональними поліпептидами (глутаміл-проліл-тРНК-синтетаза) та три додаткових білки р18, р38 та р43. Наявність такого комплексу є характерною ознакою всіх багатоклітинних організмів.

2.2 Неканонічні функції аміноацил-тРНК-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу MARS

Окрім своєї основної функції в аміноацилюванні тРНК, велика кількість АРСаз бере участь в інших біохімічних процесах, виконуючи там певні неканонічні функції.

Глутаміл-проліл-тРНК-синтетаза (EPRS) складається із двох різних каталітичних доменів глутаміл-тРНК-синтетази та проліл-тРНК-синтетази, які з'єднуються між собою мотивом WHEP-TRS та кодуються однією мРНК. Ця особливість є унікальною для клітин вищих еукаріот. Також слід зазначити, що EPRS є єдиним прикладом природньо злитого білка у родині аміноацил-тРНК-синтетаз: у одному поліпептидному ланцюзі ковалентно поєднуються два окремі каталітичні домени [30].

EPRS входить до складу GAIT комплексу, який приєднуючись до 3? UTR GAIT-елементу багатьох прозапальних факторів, інгібує їх трансляцію у мієлоїдних клітинах людини. Це відбувається завдяки IFN-г-індукованого фосфорилювання глутаміл-проліл-тРНК-синтетази [31,32].

У мітохондріях дріжджів лейцил-тРНК-синтетаза (LRS) виступає в ролі інтрон-специфічного фактора сплайсингу. Цей фермент бере участь у видаленні двох інтронів групи І, bI4 та aI4-альфа, які переривають мРНК, що кодує основні дихальні білки цитохром В і субодиницю I цитохром оксидази, відповідно [33,34].

Група вчених під керівництвом доктора Мартініс показала, що LRS людини також може брати участь у сплайсингу інтронів групи І дріжджів [35].

Недавні дослідження також показали, що лейцил-тРНК-синтетаза у клітинах дріжджів та ссавців відіграє роль “датчика” лейцину. Зокрема, в клітинах людини, цитоплазматична LRS сприяє транслокації TORC1 ссавців (mTORC1) до мембран лізосом і активує його через зв'язування з ГТФ-азою RagD (компонент mTORC1).

Асоціація LRS з оболонкою лізосоми та взаємодія ферменту з RagD строго регулюється за рівнем лейцину. При порушеннях лейцин-зв'язуючого сайту LRS втрачає здатність асоціювати із RagD і mTORC1 сигнальний шлях стає нечутливим до змін внутрішньоклітинної концентрації лейцину [36,37].

Метіоніл-тРНК-синтетаза (MRS) -- один із найважливіших ферментів цієї групи, адже бере участь у приєднанні стартової амінокислоти до відповідної тРНК.

В нормі ця АРСаза локалізується у цитоплазмі, де може бути як частиною макромолекулярного комплексу, так і у вільному стані. Відомо, що MRS у складі комплексу аміноацил-тРНК-синтетаз тісно взаємодіє із білком р18, супресором пухлин [38,39]. При дії ультрафіолетового випромінювання цей комплекс дисоціює і р18 рухається у ядро, де бере участь у процесах репарації ДНК. Тому вважається, що MRS бере участь у інгібуванні відповіді на пошкодження ДНК на трансляційному рівні [40].

Глутамін -- замінна амінокислота, яка бере участь у багатьох клітинних процесах, зокрема він бере участь у біосинтезі пуринів та піримідинів, які є основними компонентами ДНК та РНК.

Ця амінокислота також відіграє роль у зменшенні виділення запальних цитокінів, у регулюванні сигнальних шляхів проліферації та апоптозу. Дослідження останнього процесу показали, що глутамініл-тРНК-синтетаза (QRS) взаємодіє з ASK1 (кіназа 1, що регулює сигнал апоптозу) у глутамін-залежний спосіб: при підвищенні концентрації амінокислоти комплекс розпадається.

Вище згадані ферменти взаємодіють своїми каталітичними доменами, внаслідок чого втрачається їх канонічна функція. Тобто, QRS інгібує процес клітинної смерті, спричинений активністю ASK1 [41].

Диаденозилтетрафосфат (Ар₄А) -- сигнальна молекула клітин прокаріот та еукаріот, концентрація цієї сполуки збільшується у стресовому стані, тому її відносять до класу алармонів.

Була показана роль Ар₄А у процесах проліферації, ініціації реплікації та репарації ДНК, клітинній відповіді на стрес, інгібуванні АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів [42].

При аналізі процесу утворення цієї сигнальної сполуки, було виявлено, що найбільший внесок робить лізил-тРНК-синтетаза [43]. У імунних клітинах фосфорилювання KRS призводить до вивільнення цього ферменту із мультисинтетазного комплексу та підвищення його здатності продукувати Ар₄А, який в свою чергу виконує свої функції через зв'язування з певними білками.

Вільна АРСаза транслокується у ядро, конформаційні зміни, спричинені фосфорилюванням, підвищують її здатність до продукції Ар₄А. Сигнальна молекула, зв'язуючись із репресором Hint-1, дозволяє від'єднатись транскрипційному фактору MITF із інгібіторного комплексу MITF-Hint-1, що активує транскрипцію цільових генів згаданого фактору Тобто, можна сказати, що окрім канонічної функції у аміноацилюванні тРНК, KRS бере участь у сигнальній трансдукції імунних клітин [44].

Неферментний компонент мультисинтетазного комплексу білок р43 виступає у ролі цитокіна. Він стимулює синтез різних прозапальних факторів, таких як TNF-б, IL-8, IL-1в, MCP-1, MІP-1, а також міжклітинних молекул адгезії (ICAM-1).

Білок р43 бере участь у процесі ангіогенезу, індукує міграцію ендотеліальних клітин [45]. Також він містить сайт, по якому під час апоптозу каспаза відділяє С-кінцевий домен, який називають EMAPII.

Білок р38 також виконує певну неконічну функцію: він може приєднуватись до білка FBP (far upstream element (FUSE)-binding protein ), який являється активатором транскрипції гена, що кодує білок Myc, та спричиняти убіквітинування цього білка з подальшою його деградацією у протеосомі. Цей процес призводить до гіперпроліферації клітин легень [46].



РОЗДІЛ 3. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

3.1 Матеріали та реактиви

У роботі було використано реактиви:

eкстракт дріжджів, бакто-триптон, агар (“Oxoid”, Великобританія), набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN, Німеччина); реагенти для трансфекції клітин Effectene Transfection Reagent (QIAGEN, Німеччина)? середовище DMEM, ембріональна теляча сироватка (FBS), суміш антибіотиків пеніциліну та стрептоміцину, L-глутамін, розчин, що містить хелатуючий агент ЕДТА - Versene (всі реагенти - Gibco, Life Technologies, США)? поліакриламідні гелі для аналізу білків Any kD MiniPROTEAN TGX Gel? концентрований трис-гліциновий буфер без додецилсульфату натрію (BioRad, США); маркер молекулярної маси білків Pierce Unstained Protein Molecular Weight Marker (ThermoScientific, США)? набір для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Packs (BioRad, США)? хемілюмінесцентний субстрат і проявник SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoScientific, США); натрію додецилсульфат, Triton X100, Tween 20%, гліцерол, бета-меркаптоетанол, інгібітори протеаз бензамідин і пефаблок (все - SigmaAldrich, США), знежирене сухе молоко.

Антитіла: AntiFLAG M2 (SigmaAldrich, США); AntiMouse HRP, AntiRabbit IgG (Chemicon, США); антитіла, які було отримано у лабораторії раніше - AntiR3 CHO_3pur, IgG MTS-T 14/04/85 , IgG1 Gln-DEAE 14/04/85, IgG anti cKRS DN lapin 117 25/04/02, IgG AspRS DN20 13/12/96, IgG anti human p43 Ct lapin 052 30/05/00.

Всі розчини готували на деіонізованій та вільній від нуклеаз воді.

Обладнання: ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore)? СО₂-інкубатор для культур клітин MCO20AIC (Sanyo, Японія)? мікроцентрифуги Heraeus Pico 17 та Heraeus Fresco 21 (ThermoScientific, США), центрифугa Beckman J20 зі змінними роторами різного діаметру (Beckman, США)? система візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad, США)? система напівсухого переносу білків на мембрану Trans Blot Turbo Transfer Starter System (BioRad); система для проведення інкубацій для Western-blot аналізу Bench-Pro 4100 Card Processing Station (Invitrogen); система Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fujifilm Life Science)? ? спектрофотометр Varian «Сагу50» (Varian, США).

Плазмідну конструкцію pc5FLAG/TUSC4 люб'язно надав директор Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) доктор Наойя Фуджіта, конструкції pCMV6-XL5/MRS, pCMV6-XL5/QRS, pCMV6-XL5/KRS, pCMV6-XL5/DRS, pCMV6-XL5/p43 - були створені, перевірені та очищені раніше у лабораторії.

3.2 Клітинна лінія

В якості експериментальної модельної системи було використано HeLa HC - безсмертна лінія клітин, отримана із ракової пухлини (карциноми) шийки матки.

Клітини інкубували в середовищі DMEM з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ L-глутаміну та суміші антибіотиків пеніциліну (50 од/мл) та стрептоміцину (50 мкг/мл) в умовах 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С.

3.3 Підготовка ДНК для трансфекції

Бактеріальні колонії, які містили рекомбінантні плазміди на основі вектору pCMV6-XL5 було ізольовано та висіяно у 150 мл рідкого поживного середовища з додаванням ампіциліну. Культури інкубували при 37⁰С протягом 16 годин до досягнення культурою щільності 0,35-0,4 OD.

Для отримання плазмідної ДНК використовували набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN). Процедуру виконували згідно протоколу. По закінченню вимірювали концентрацію отриманого матеріалу методом спектрофотометрії та зберігали його при -20⁰С.

3.4 Підготовка клітин HeLa до трансфекції

Культуру клітин HeLa вирощували у матрацах для культивування площею 75 см² з додаванням збагаченого середовища DMEM до досягнення конфлюентності 80%. Після чого вживане середовище відбирали, додавали 2 мл хелатуючого реагенту Versene та інкубували 20-30 сек для відокремлення адгезованих клітин від поверхні. Відокремлені клітини суспензували з додаванням 8 мл нового середовища.

Для підрахунку кількості клітин використовували ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore). Підрахунок проводили згідно інструкції до приладу. Відому кількість клітин розводили у збагаченому середовищі DMEM до концентрації 0,25*10⁶ клітин/мл.

Для трансфекції використовували 0,5*10⁶ клітин, які висівали у 10 мл поживного середовища у пластикових чашках Петрі (діаметр 8 см, площа поверхні 56,7 см²). Культури вирощували 24 години в умовах 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С.

За дві години до трансфекції середовище у чашках з культурами замінювали свіжим.

3.5 Підбір оптимальних умов трансфекції

Оптимальну кількість клітин та умови для експерименту було підібрано експериментальним шляхом.

Для отримання оптимальних умов трансфекції було використано плазмідні ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6, які кодують білки NPRL2 з міткою Flag та глутаміл-проліл-тРНК-синтетазу відповідно. Загальну кількість ДНК, 0,35 мкг, було вирахувано теоретично, відповідно до попередніх експериментів. У пластикових чашках Петрі (діаметр 35 мм, площа - 9,6 см²) протягом 24 годин вирощувалась культура клітин у кількості 0,2 млн клітин на чашку на момент посіву. Для трансфекції використовували набір Effectene Transfection Reagent. За інструкцією до набору було протестовано такі умови:

ь відношення між плазмідними ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6 -- 1:1, кількість реагенту для транфекції Effectene -- 25 мкл/1 мкг ДНК;

ь відношення між плазмідними ДНК -- 1:1, кількість реагенту для транфекції -- 12,5 мкл/1 мкг ДНК;

ь відношення між плазмідними ДНК -- 1:1, кількість реагенту для транфекції -- 6,75 мкл/1 мкг ДНК;

ь відношення між плазмідними ДНК -- 1:2, кількість реагенту для транфекції -- 12,5 мкл/1 мкг ДНК;

ь відношення між плазмідними ДНК -- 1:3, кількість реагенту для транфекції -- 12,5 мкл/1 мкг ДНК.

3.6 Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent

Для трансфекції використовували 0,5 млн клітин при посіві на чашку Петрі діаметром 85мм (площа 56,7 см2), які культивувались 24 години в умовах 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С. Загальна кількість ДНК складала 2 мкг.

Процес трансфекції проводили відповідно інструкції до набору Effectene Transfection Reagent. У 500 мкл буферу додавали 2 мкг ДНК у кількісному співвідношенні 1:2 та обережно перемішували. Потім додавали 16 мкл підсилювача (Enhancer) у співвідношенні 8 мкл підсилювача на 1 мкг ДНК, обережно перемішували та інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Effectene додавали у кількості 13,5 мкл, тобто у співвідношенні 6,75 мкл на 1 мкг ДНК, перемішували піпетуванням та інкубували 10 хв за кімнатної температури. До культури суміш додавали по краплинах, рівномірно розподіляючи по всій площині.

Трансфіковані культури вирощували за умов 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С протягом 48 годин.

3.7 Імунохроматографія з використанням матриксу, що містив іммобілізовані антитіла до мітки Flag

По закінченню періоду трансфекції культури переносили на лід, повністю відбирали середовище, прибирали залишки середовища промивкою 1х PBS (136 mM NaCl, 2,7 mM KСl, 8 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, pH 7,5) та додавали 1 мл буферу для лізису T2GN50 (рН 7,5), що містив 20 mM Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 0,5% Triton X-100, 5 % гліцеролу, 10 мМ бета-меркоптоетанол, інгібітори протеаз у концентрації 10 mM бензамідин та 1 mM пефаблок. мультисинтетазний трансфекція клітина антитіло

Клітинну суспензію перемішували вортексуванням та осаджували нерозчинну фракцію центрифугуванням протягом 15 хвилин при швидкості 14,000 об/хв за температури +4⁰С. Надосадову фракцію відбирали та 1 годину інкубували із 20 мкл афінного гелю Anti-Flag M2, що містить антитіла до мітки Flag, переміщуючи на вертикальному ротароті при +4⁰С. Після інкубації матрикс із адгезованими білками осаджували центрифугуванням при швидкості 14,000 об/хв 2 хвилини.

До 40 мкл супернатанту додавали 40 мкл буферу SBL 2х (100 mM Tris-Cl (pH 6.8), 200 mM дитіотреїтол, 4% натрію додецилсульфат, 0.2% бром феноловий синій, 20% гліцеролl) та 3 хвилини кип'ятили при 95⁰С, підготовлений зразок тотального екстракту фракції розчинних білків використовували для подальшого аналізу. Афінний матрикс осаджували центрифугуванням при 14,000 об/хв протягом 1 хвилини при +4⁰С та відбирали супернатант, з якого готували зразок незв'язаної фракції білків за умовами, описаними вище.

Матрикс після інкубації промивали 500 мкл буферу WB50+ (20 мМ Tris-HCl (pH7,5), 50 мМ NaCl, 5% гліцерол та 10 мМ бетамеркаптоетанол) 5 разів та ресуспендували у 50 мкл цього ж буферу. До суміші додавали 10 мкг Flag-пептиду та інкубували протягом 1 години при +4⁰С, перемішуючи осівший матрикс кожні 5-10 хвилин. Суміш після інкубації осаджували 2 хвилини при 14,000 об/хв за температури +4⁰С. Відбирали супернатант без домішок афінного гелю, до 30 мкл додавали 10 мкл буферу SBL у кінцевій концентрації 1х та 3 хвилини кип'ятили при 95⁰С.

3.8 Вестерн-блот аналіз

На першому етапі Вестерн-блот аналізу проводили електрофорез у ПААГ за стандартною методикою [47] з використанням системи Bio-Rad (поліакриламідні гелі для аналізу білків Any kD MiniPROTEAN TGX Gel та концентрований трис-гліциновий буфер, у який перед використанням додавали SDS у кінцевій концентрації 0,3%).

Кількість білків розчинної фракції та фракції, яка не зв'язалась із афінним матриксом, нанесених на гель була однаковою. Аліквота у 15 мкл кожного зразка попередньо наносилась на гель та аналізувалась за допомогою системи візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad). Кількість білків порівнювалась відповідно до інтенсивності сигналу флуоресценції триптофану з використанням програмного забезпечення Image Lab. Після цього підбиралися оптимальні об'єми зразків так, щоб вони містили однакову кількість білків.

В середньому об'єм зразків складав 5 мкл чистого екстракту у буфері для нанесення. Для аналізу фракції білків, елюйованих із афінного матриксу 11,25 мкл елюату використовували для перевірки наявності аміноацил-тРНК-синтетаз, а 3 мкл - для перевірки NPRL2.

Таким чином, було визначено об'єми екстрактів, що містили однакову кількість білків для подальшого проведення Вестерн-блот аналізу. Окрім цього, в кожному експерименті вміст нанесеного на гель препарату білка перевірялась додатково з використанням вищезгаданої системи візуалізації гелів.

Після проведення електрофорезу, білки переносили на нітроцелюлозну мембрану. Для цього використовували набір для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Packs (BioRad) та систему для напівсухого переносу білків на мембрану Trans Blot Turbo Transfer Starter System (BioRad) зі стандартними умовами 25 V, 2,5 A протягом 7 хв. Після переносу нітроцелюлозні мембрани швидко поміщали у буфер TBS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.6) та перевіряли його якість за допомогою системи Gel Doc EZ System (BioRad). Перенос з гелів, що містили білкові фракції одного експерименту, на мембрани проводили одночасно.

Для проведення інкубацій нітроцелюлозної мембрани з розчинами, що містять первинні та вторинні антитіла використовували систему для Вестерн-блот аналізу Bench-Pro 4100 Card Processing Station (Invitrogen). Для цього готували відповідні буфери та програмували за стандарним протоколом:

· промивка -- 2 хв -- ТВS-T (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.6);

· блокування -- 30 хв -- блокуючий розчин -- 5% розчин знежиреного молока у 1х ТВS-T;

· промивка -- 2 хв -- ТВS-T;

· інкубація з первинними антитілами, що мають афінітет до Flag-мітки, обраних АРСаз та білка р43 -- 60 хв -- розчин первинних антитіл у блокуючому розчині;

· промивка -- 5 хв, 5 хв, 5 хв, 2 хв -- ТВS-T;

· інкубація із вторинними антитілами проти антитіл миші та кроля-- 30 хв -- розчин вторинних антитіл у блокуючому розчині;

· промивка -- 5 хв, 5 хв, 5 хв, 2 хв -- ТВS-T.

Первинні антитіла миші та кроля розводили у блокуючому розчині і використовували у таких концентраціях: AntiFLAG M2 (SigmaAldrich, США) -- 1/1,000; AntiR3 CHO_3pur -- 1/1,000; IgG MTS-T 14/04/85 -- 1/50,000; IgG1 Gln-DEAE 14/04/85 -- 1/1,000; IgG anti cKRS DN lapin 117 25/04/02 -- 1/1,000; IgG AspRS DN20 13/12/96 -- 1/2,000; IgG anti human p43 Ct lapin 052 30/05/00 -- 1/1,000.

Вторинні антитіла проти антитіл миші, кон'юговані пероксидазою хрону використовували у розведенні 1/2,000, а вторинні антитіла проти антитіл кроля, кон'юговані пероксидазою хрону -- у 1/3,000.

3.9 Візуалізація результатів досліду

Детекцію антитіл, мічених пероксидазою проводили з використанням фірмового хемілюмінесцентного субстрату SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoScientific).

На мембрану додавали 2 мл повного субстрату та інкубували 5 хв. Хемілюмінесценцію фіксували за допомогою системи Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fujifilm Life Science).



РОЗДІЛ 4. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

4.1 Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene

Представлена робота є початковим етапом дослідження взаємодій між учасником mTOR-сигнального шляху білком NPRL2 та комплексом білків, які відіграють важливу роль на дорибосомальному етапі біосинтезу білка -- аміноацил-тРНК-синтетазами. Так, як і досі вчені не дійшли одностайної думки щодо неканонічних функцій мультисинтетазного комплексу, є важливим пошук нових партнерів, що, можливо, проллє світло на багато фундаментальних процесів у клітині.

Група вчених із Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) під керівництвом доктора Наойї Фуджіти досліджує білок NPRL2 та його участь у канцерогенезі.

У одному зі своїх експериментів вони ідентифікували як партнера вище згаданого білка макромолекулярний комплекс аміноацил-тРНК-синтетаз. Метою нашої роботи було визначити, з якими саме компонентами взаємодіє NPRL2 та які наслідки цієї взаємодії. Тому завданнями були: отримати рекомбінантний білок NPRL2 з міткою Flag та компоненти MARS комплексу, виділені із культури клітин людини; імунопреципітувати білок NPRL2 на матрикс, що містить антитіла до мітки Flag; перевірити наявність білків-партнерів у елюаті з афінного матриксу. У рамках експерименту було проведено котрансфекції із кожним компонентом комплексу MARS, проте лише для п'яти було отримано дані, які підлягають інтерпритації.

Для перевірки взаємодій між екзогенним білком NPRL2 та мультисинтетазним комплексом було вирішено обрати лінію клітин, у якій не експресується ген TUSC4. Цьому параметру відповідає клітинна лінія HeLa, отримана із ракової пухлини (карциноми) шийки матки. За результатами деяких досліджень, ця клітинна лінія містить делецію у ділянці 3.16р, а тому можна буде точніше оцінити взаємодію між екзогенними білками. Шляхом культивування різної кількості клітин (0,1 млн, 0,2 млн та 0,3 млн) на чашках з площею дна 9,6 см² було визначено, що оптимальну конфлюентність на день експерименту мають культури з початковою кількістю клітин у 0,2 млн.

Effectene -- неліпосомний ліпідний реагент для ДНК трансфекції широкого спектру клітинних ліній. Даний реагент було обрано через такі його властивості, як висока ефективність трансфекції у середовищі із сироваткою крові та при малій кількості ДНК, низька цитотоксичність.

Для ефективної трансфекції важливими характеристами є тип промотора, під контроль якого клоновано цільовий ген, відношення між кількістю плазмід, які використовуються для котрансфекції та відношення загальної кількості ДНК до об'єму реагенту для трансфекції, які підбираються експериментальним шляхом.

Для визначення оптимальних умов були використані плазміди pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6. Перша конструкція кодує NPRL2 із міткою Flag, друга -- глутаміл-проліл-тРНК-синтетазу із полігістидиновою міткою. Згідно з інструкцією до реагенту, було протестовано такі умови на культурах клітин HeLa кількістю 0,2 млн у одній чашці :

· відношення кількості ДНК до об'єму Effectene -- 1 мкг/25 мкл (Рис. 4.1, доріжка 1), 1мкг/12,5 мкл (Рис. 4.1, доріжка 2), 1 мкг/6,75 мкл (Рис. 4.1, доріжка 3) за умов відношення кількості плазмід 1:1;

· відношення кількості плазміди pc5FLAG/TUSC4 до іншої, що кодує EPRS-H6 -- 1:1 (Рис. 4.1, доріжка 2), 1:2 (Рис. 4.1, доріжка 4), 1:3 (Рис. 4.1, доріжка 5) за умов відношення кількості ДНК до кількості реагенту -- 1мкг/12,5 мкл.

Перевірка ефективності умов показала, що найбільш оптимальними є відношення кількості плазмід 1:1 та відношення ДНК до об'єму реагенту для трансфекції -- 1мкг/6,75 мкл (Рис 4.1), які і використовувались на початковому етапі. У ході експерименту відношення між кількостями плазмід змінювалось відповідно до результатів, отриманих за початкових умов.

Рис. 4.1. Імуноблотограми екстрактів загальних фракцій білків культур клітин HeLa, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6, інкубованих з Anti-Flag M2 антитілами (А) та Anti-R3 CHO_3bleeding антитілами (Б)

4.2 Умови проведення трансфекцій

Щоб перевірити чи взаємодіють між собою NPRL2 та обрані компоненти комплексу MARS було проведено трансфекцію 0,5 млн клітин людини на чашках площею 56,7 см². Для цього використали таку загальну кількість ДНК, як 2 мкг на кожну чашку. Трансфекцію проводили для отримання трьох зразків:

· позитивний контроль -- pc5FLAG/TUSC4:pSG5 зі співвідношенням 1:2;

· зразок для перевірки -- pc5FLAG/TUSC4:pCMV6-XL5/ARS зі співвідношенням 1:2;

· негативний контроль -- pc5FLAG:pCMV6-XL5/ARS зі співвідношенням 1:2.

Позитивний контроль використовувався для перевірки експресії плазмідного вектору, що кодує NPRL2 та взаємодії білка із ендогенними компонентами MARS. Плазмідна ДНК pSG5 не кодувала жодного білка інтересу, але використовувалась для стандартизації умов трансфекції, адже у такому випадку кожен зразок містив однакову кількість плазмід. У тотальному екстракті білків зразку для перевірки очікувалось отримати білок NPRL2 та певну кількість екзогенної АРСази, а у фракції після імунохроматографії - NPRL2, що містить мітку Flag та, в разі взаємодії, певну кількість аміноацил-тРНК-синтетази. Щоб упевнитись, що фермент взаємодіє саме із екзогенним білком NPRL2, а не з афінним матриксом, було створено негативний контроль: в результаті котрансфекції отримували Flag-пептид та певну АРСазу, яка не преципітувалась на даному типі матриксу.

Так, як у клітинах є неможливим усунення ендогенних аміноацил-тРНК-синтетаз, які є необхідними для біосинтезу білків, було використано екстракт нетрансфікованих клітин для контролю кількості їх власного ферменту.

Для оптимізації кількості білка, який буде аналізуватись методом Вестерн-блотинга, його попередньо наносили на гель та аналізували за допомогою системи візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad) по 15 мкл фракції розчинних білків та фракції, яка не зв'язалась із афінним матриксом.

Кількість білків порівнювалась відповідно до інтенсивності флуорисценції триптофану з використанням програмного забезпечення Image Lab. Після цього підбиралися оптимальні об'єми зразків так, щоб вони містили однакову кількість білків. Всередньому ця кількість складала 5 мкл чистого екстракту у буфері для нанесення. Після проведення електрофорезу для Вестерн-блот аналізу кількість білків знову перевірялась за допомогою тієї ж системи. Елюцію проводили у 50 мкл буферу WB50+. З них 11,25 мкл елюату використовували для перевірки наявності аміноацил-тРНК-синтетаз, а 3 мкл - для перевірки NPRL2.



4.3 Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

При трансфекції культури клітин HeLa плазмідними векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/MRS ми спостерігали помірну експресію екзогенного генетичного матеріалу (Рис. 4.3).

Рис. 4.3. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл(А) та IgG MTS-T 14/04/85 антитіл (Б)

Доріжки: 1 -- загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;

2, 5, 8 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5;

3, 6, 9 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/MRS;

4, 7, 10 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG та pCMV6-XL5/MRS.

Про це свідчить збільшення кількості метіоніл-тРНК-синтетази у загальному екстракті білків після котрансфекції (Рис. 4.3, доріжка 6) по відношенню до кількості ендогенного ферменту (Рис. 4.3, доріжка 5).

Також цікавий той факт, що кількість ендогенної синтетази зменшувалась при контрансфекції клітин векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5 (Рис. 4.3, доріжка 5) по відношенню до її кількості у нетрансфікованих клітинах (Рис. 4.3, доріжка 1).

При аналізі фракцій, які зв'язались із афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, на блотограмі детектовано певну кількість MRS, яка, ймовірно, взаємодіє із NPRL2.

Проте наявність однакової кількості білка у фракціях, що не містили екзогенної MRS (Рис. 4.3, доріжка 8) чи NPRL2 з міткою Flag (Рис. 4.3, доріжка 10), свідчить про неспецифічну взаємодію ферменту із афінним матриксом.

Інтенсивніший сигнал, який спостерігається при аналізі фракції, яка була отримана після імунохроматографії клітин, котрансфікованих плазмідами, що містили відкриті рамки зчитування NPRL2 з міткою Flag та MRS (Рис. 4.3, доріжка 9), пояснюється більшою кількістю ферменту, отриманого при котрансфекції (Рис. 4.3, доріжка 6).

Отже, наявність метіоніл-тРНК-синтетази у фракціях, одержаних після очистки загального екстракту білків на афінному матриксі Affinity gel Anti-Flag M2 швидше за все свідчить про можливу неспецифічну взаємодію ферменту з матриксом, але не з білком NPRL2.

4.4 Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

При аналізі результатів імуноблотингу з використанням антитіл до Flag-мітки та глутамініл-тРНК-синтетази спостерігали кореляцію між умовами котрансфекції та отриманою кількістю білка (Рис. 4.4).



Рис. 4.4. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл (А) та IgG1 Gln-DEAE антитіл (Б)

Доріжки: 1 -- загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;

2, 5, 8 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5;

3, 6, 9 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/QRS;

4, 7, 10 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG та pCMV6-XL5/QRS.

У загальному екстракті білків клітин, котрансфікованих плазмідними конструкціями pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/QRS (Рис. 4.4, доріжка 6) чи pc5FLAG та pCMV6-XL5/QRS (Рис. 4.4, доріжка 7), була детектована певна кількість ферменту, що переважає над такою у загальному екстракті білків нетрансфікованих клітин (Рис. 4.4, доріжка 1) та культур, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 -- pSG5 (Рис. 4.4, доріжка 5).

При елюції білків, які зв'язались із афінним матриксом, антитіла розпізнали фермент у зразках, що мали містити екзогенний NPRL2 з міткою Flag (Рис. 4.4, доріжка 8) та екзогенні NPRL2 з QRS (Рис. 4.4, доріжка 3).

Зважаючи на слідову кількість глутамініл-тРНК-синтетази у вище згаданих зразках, у даному випадку не можна говорити про пряму взаємодію між білком NPRL2 та АРСазою.

4.5 Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

Котрансфекцію культур клітин HeLa проводили плазмідними векторами у співвідношенні 1:2, де одну частину складали вектори, що містили відкриту рамку зчитування NPRL2 з Flag-міткою або тільки Flag-пептид, а дві частини - плазміди з послідовністю аспартил-тРНК-синтетази або пустий вектор.

Результати контрансфекції перевіряли за допомогою імуноблотингу. Як видно з блотограми (Рис. 4.5), було отримано відповідну кількість ферменту у кожній з фракцій.

Про наявність екзогенної DRS свідчить той факт, що кількість білка у загальних екстрактах білків культур, трансфікованих плазмідою з рамкою зчитування DRS (Рис. 4.5, доріжки 6 та 7) вища, аніж у екстракті білків нетрансфікованої культури (Рис. 4.5, доріжка 1) та культури, яка була трансфікована плазмідою, що не містила DRS (Рис. 4.5, доріжка 5).

У фракціях, які отримали після елюції білків з афінного матриксу виявлено слідову кількість синтетази у зразках із культур, які містили екзогенний фермент (Рис. 4.5, доріжки 9 та 10).

Наявність його у фракції, де не було екзогенного NPRL2 з міткою Flag (Рис. 4.5, доріжка 10) свідчить про неспецифічне зв'язування DRS із афінним матриксом.



Рис. 4.5. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл (А) та IgG AspRS DN20 антитіл (Б)

Доріжки: 1 -- загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;

2, 5, 8 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5;

3, 6, 9 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/DRS;

4, 7, 10 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG та pCMV6-XL5/DRS.

4.6 Ідентифікація взаємодії між лізил-тРНК-синтетазою та білком NPRL2

Як відомо, лізил-тРНК-синтетаза у клітині існує у вигляді двох ізоформ: цитозольної та мітохондріальної.

Цитозольна ізоформа, яка входить до складу мультисинтетазного комплексу, має більшу молекулярну масу (Рис. 4.6).

На імуноблотограмах загальних екстрактів клітин видно, що кількість синтетази збільшувалась у зразках, що були трансфіковані вектором pCMV6-XL5/KRS (Рис. 4.6, доріжки 6 та 7), у порівнянні з екстрактами не трансфікованих клітин (Рис. 4.6, доріжка 1) та трансфікованих плазмідою, що не містила відкритої рамки зчитування KRS (Рис. 4.6, доріжка 5).

Рис. 4.6. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл (А) та IgG anti cKRS DN антитіл (Б)

Доріжки: 1 -- загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;

2, 5, 8 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5;

3, 6, 9 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/KRS;

4, 7, 10 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG та pCMV6-XL5/KRS.

Це свідчить про нормальну експресію екзогенних векторів. У жодній із фракцій, які були елюйовані із афінного матриксу, не виявлено АРСази при великій кількості NPRL2 (Рис. 4.6, доріжки 8, 9 та 10).

Це є доказом того, що лізил-тРНК-синтетаза також не взаємодіє із NPRL2.



4.7 Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу MARS, та білком NPRL2

Аналіз екстрактів клітин після котрансфекції векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/р43 методом імуноблотингу показав, що екзогенна ДНК добре експресується за умов, описаних вище.

Рис. 4.6. Імуноблотограми екстрактів трансфікованих клітин HeLa і білкових фракцій після інкубації з афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2, отриманих з використанням Anti-Flag M2 антитіл (А) та IgG anti p43 антитіл (Б)

Доріжки: 1 -- загальний екстракт білків нетрансфікованої культури;

2, 5, 8 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pSG5;

3, 6, 9 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/р43;

4, 7, 10 -- культури клітин, котрансфікованих векторами pc5FLAG та pCMV6-XL5/р43.

Про це свідчить більша кількість білка у загальному екстракті, отриманому із трансфікованих клітин (Рис. 4.7, доріжки 6 та 7) по відношенню до екстракту із нетрансфікованих (Рис. 4.7, доріжка 1) та клітин трансфікованих вектором, що не містив послідовності р43 (Рис. 4.7, доріжка 5).

У всіх трьох випадках, фракції білків, що зв'язались із афінним матриксом не містили компонента комплексу MARS, про що свідчить відсутність сигналу при їх аналізі (Рис. 4.7, доріжки 8, 9 та 10).



ВИСНОВКИ

Отримані результати є першими даними роботи з пошуку елементів зв'язку mTOR-сигнального шляху із компонентами апарату трансляції.

1. В ході експерименту підібрано умови для трансфекції культури клітин HeLa плазмідними векторами, що кодували метіоніл-тРНК-синтетазу (pCMV6-XL5/MRS), глутамініл-тРНК-синтетазу (pCMV6-XL5/QRS), лізил-тРНК-синтетазу (pCMV6-XL5/KRS), аспартил-тРНК-синтетазу (pCMV6-XL5/DRS), білок р43 (pCMV6-XL5/p43), білок NPRL2 (pc5FLAG/TUSC4) з метою оптимізації рівня експресії екзогенної ДНК.

2. Показано, що метіоніл-, глутамініл-, лізил-, аспартил-тРНК-синтетази та білок р43 не утворюють стабільних комплексів з білком NPRL2 in vivo за описаних умов проведення експерименту

3. Виявлено, що метіоніл-тРНК-синтетаза неспецифічно взамодіє із афінним матриксом Affinity gel Anti-Flag M2 і тому для перевірки її взаємодії з білком NPRL2 необхідно оптимізувати умови проведення афінної хроматографії.