Разработка методики получения стерильного интактного материала тропических лиан на примере Passiflora arbelaezii L. в культуре in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное учреждение

Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Разработка методики получения стерильного интактного материала тропических лиан на примере Passiflora arbelaezii L. в культуре in vitro

Кириллов Алексей Александрович, аспирант

Ширнина Ирина Васильевна, м.н.с.

Молканова Ольга Ивановна, к.с.-х.н., с.н.с.

Коломейцева Галина Леонидовна, д.б.н., вед.н.с.

Москва

Аннотация

Усовершенствована методика оздоровления интактного материала P. arbelaezii на основе прививки на резистентные к эндогенным патогенам виды пассифлор при введении в культуру in vitro. Показано влияние происхождения эксплантов в зависимости от подвоя интактного растения на развитие регенерантов P. arbelaezii в условиях in vitro

Ключевые слова: эндофитная контаминация, прививка, стерилизация, passiflora arbelaezii, in vitro.

Род Passiflora L. - крупнейший в семействе Passifloraceae и включает около 575 видов, распространенных, главным образом, в тропиках и субтропиках Нового Света, и только 22 вида происходят из Юго-Восточной Азии, Австралии и Океании. Почти все пассифлоры являются травянистыми или одревесневающими лазающими лианами с усиками, 10 видов представлены кустарниками и невысокими деревьями, ещё реже среди них встречаются однолетние травы (Feuillet, MacDougal, 2007).

Род известен широким ресурсным потенциалом. Более 60 видов возделывается ради съедобных плодов, из которых получают ароматные соки, либо употребляются в свежем виде (Yockteng et al., 2011). Экстракты, выделяемые из травы различных видов пассифлор, отличаются высоким содержанием алкалоидов, фенолов, гликозидов, флавоноидов и цианогенных соединений (Dhawan et al., 2004). Побеги P. incarnata, особенно богаты вторичными метаболитами и в традиционной системе терапии многих стран используется как анксиолитическое, седативное, противосудорожное и болеутоляющее средство (Felter, Lloyd, 1983). Наряду с пищевыми и лекарственными свойствами многие представители этого рода обладают крупными ярко окрашенными цветками и используются в декоративном садоводстве по всему миру. Некоторые виды и сорта успешно выращиваются в открытом грунте круглый год в странах Западной Европы, Средиземноморья и черноземной полосы юга России (Vanderplank, 2000, Молодожников, Рабинович, 1964).

Опубликованные ранее протоколы разработаны для биоресурсных (декоративных, пищевых, лекарственных) видов и сортов пассифлор. Они представляют собой обширную базу данных по микроразмножению многих видов пассифлор. В биотехнологических работах в течение трех последних десятилетий в основном использовались съедобные формы P. edulis var. flavicarpa Sims. и P. edulis var. edulis Sims. Изучали различные способы микроразмножения этих пассифлор путём индукции соматического эмбриогенеза (Pinto et. al., 2010), гипокотелей (Alexandre et. al., 2008); апексов или узловых сегментов побегов (Anand et. al., 2012), адвентивного геммогенеза (Becerra et. al., 2004) и эндосперма (Mohamed et. al., 1996). Однако биотехнологические методы размножения пока ещё не применялись к редким и мало изученным видам из-за отсутствия постоянного источника материала для микроклонального размножения.

Ограниченное количество растительного материала для микроразмножения редких видов пассифлор требует поиска новых методов введения в культуру in vitro и более тщательного подбора стерилизующих агентов. На предварительном этапе по подбору оптимальных условий стерилизации эксплантов сегментов стебля с 1-2 междоузлиями P. arbelaezii L. было выявлено эндогенное бактериальное заражение, что сильно уменьшало выход жизнеспособных эксплантов. Было показано, что тропические растения, в особенности, имеющие лиановидную жизненную форму, характеризуются большим диаметром проводящих сосудов, что приводит к высокому уровню эндофитной контаминации. В то же время, ряд исследований сообщают об антимикотической и антибактериальной активности многих видов пассифлор (Nicolls, 1970; Birner, Nicolls, 1973; Nicolls et. al., 1973; Bendini et al., 2006; Mohanasundari et al., 2007; Doss et. al., 2008; Mondall et al., 2009). Bendini et al., (2006) установили, что метанольные экстракты травы P. nitida Kunth, P. foetida L. и P. palmeri Killip, обладают антимикробной активность против Escherichia coli Migula. 27 видов пассифлор, изученных в работе Nicolls (1970), показали антимикотический эффект против Cladosporium herbarum (Pers.) Link ex Gray.

Предполагая, что естественные антибиотики, содержащиеся в некоторых видах пассифлор, могут способствовать естественному снижению уровня эндогенного заражения P. arbelaezii в культуре in vitro, мы провели исследование по прививке этого таксона на подвои более резистентных видов с целью получения достаточного количества стерильных эксплантов. Необходимо также было оценить влияние прививки на дальнейшее развитие растений-регенерантов в культуре in vitro.

Объектом наших исследований стал редкий вид P. arbelaezii принадлежащий подроду Deidamioides, произрастающий во влажных и сырых тропических лесах Коста-Рики, где изредка встречается по окраинам вторичных лесов и вдоль дорог (Estrada, Rodrнguez, 2009). Согласно критериям IUCN имеет высокий риск исчезновения в природе (EN - a, b, c). В коллекции тропических и субтропических растений ГБС РАН с 2009 года. В условиях Фондовой оранжереи цветёт, но не плодоносит. В связи с этим, оптимизация методики микроклонального размножения этого вида весьма актуальна. пассифлор интактный регенерант

Материалом для исследования в качестве привоя служили черенки P. arbelaezii с 1-2 латеральными почками, а в качестве подвоев, на основании литературных данных, нами были выбраны виды P. nitida, P. caerulea L., P. edulis Sims, P. tripartita var. molissima (Kunth) Holm-Niels. & P. Jшrg., P. laurifolia L. и P. incarnata L (Nicolls, 1970). Прививку проводили согласно ранее разработанной методике (Кръстев и др., 2012). При этом на подвое оставляли 4-5 хорошо развитых листа. Спустя 90 дней оценивали выход первичных эксплантов. В качестве контроля использовали корнесобственные растения P. arbelaezii.

В работе применяли традиционные биотехнологические методики, для введения в культуру in vitro в качестве эксплантов использовали сегменты стебля с 1-2 междоузлиями корнесобственных и привитых растений P. arbelaezii.

Для поверхностной стерилизации использовали раствор фунгицида (фундазол) и перемешивали на качалке в течение 30 минут, затем обрабатывали 70%-ным раствором этанола в течение 1,0-1,5 минут. На втором этапе стерилизации испытывали следующие стерилизующие агенты: раствор 0,1% сулемы с экспозицией 10 и 15 мин., растворы гипохлорита натрия (3%, 5% и 7%) - 10 и 12 мин. и раствор хлорамина (5%) - 5 и 10 мин. Результаты оценивали через 21 день.

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге и Скуга(ссылка), содержащей 0,7 % агара, дополненной регуляторами роста группы цитокининов и ауксинов в различных концентрациях: 2-изопентиладенин (2ip - 1 мг/л) и в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой (ИУК 0,1 мг/л); 6-бензиламинопурин (6-БАП - 0,2-2,0 мг/л) и кенетин (К-0,5-2,0 мг/л). Условия культивирования: температура 24-26 °С, относительная влажность воздуха 60-70 %, 16-ти часовой фотопериод и освещенность 2-3 тыс. люкс. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 и Excel 7.0.

При подборе оптимальных пар прививочных комбинаций оказалось, что P. laurifolia и P. nitida не подходят в качестве подвоев для P. arbelaezii. Черенки привоя либо погибали, либо не трогались в рост. В единичных случаях мы наблюдали прирост до 0,7 см. На подвоях P. caerulea, P. edulis, P. tripartita var. molissima и P. incarnata было достигнуто успешное срастание прививаемых компонентов. Как видно из таблицы 1, наибольший выход метамеров по соотношению количества латеральных почек и длины побега у P. arbelaezii оказался при прививке на P. incarnata и P. tripartita var. molissima. Стоит отметить, что у всех видов, которые были выбраны в качестве подвоев, мы наблюдали активацию пазушных почек, что, вероятно, является следствием их филогенетической удалённости по отношению к прививаемому виду.

Таблица 1. Морфометрические показатели побега в зависимости от типа подвоя через 90 суток

Таким образом, в ходе эксперимента выявлено, что P. caerulea, P. edulis, P. tripartita var. molissima и P. incarnata являются оптимальными подвоями для P. arbelaezii и незначительно замедляют его рост. Вместе с тем, выход эксплантов при прививке на P. tripartita var. molissima и P. incarnata оказался наиболее близкий к контролю.

В эксперименте по подбору оптимальных методов стерилизации во всех вариантах опыта привитые растения оказались наименее инфицированными по сравнению с эксплантами, полученными от корнесобственных растений (рис.1.). Наибольший выход стерильных эксплантов для P. arbelaezii, оказался при использовании 5% раствора гипохлорита натрия с экспозицией 10 минут. Наиболее низкий процент заражённых растений наблюдали у эксплантов, полученных с подвоев P. edulis и P. incarnata.

Следующим важным этапом при введении растений в культуру in vitro является подбор оптимального гормонального состава питательной среды. В ходе исследования установлено, что для P. arbelaezii оптимальной является питательная среда, содержащая 0,2 мг/л БАП, однако однако при действии этого гормона наблюдалось некоторое укорачивание междоузлий (табл. 2). При анализе влияния подвоя на последующий рост эксплантов P. arbelaezii привитые растения имели несколько более низкие показатели за исключением варианта, где в качестве подвоя был использован P. edulis, для которого максимальная высота побегов составила 45,8 мм. В варианте, где в качестве подвоя был использован P. tripartite var. mollissima, у эксплантов P. arbelaezii наблюдалось общее снижение длины побегов при всех вариантах состава питательной среды. На среде с кинетином не наблюдали рост у эксплантов, полученных с растений, привитых на P. edulis и P. tripartita var. mollissima.

Рис.1. Инфицированность эксплантов P. arbelaezii в зависимости от типа подвоя и стерилизующего вещества.

Таблица 2. Влияние гормонального состава питательной среды и происхождения экспланта на первичную регенерацию P. arbelaezii (60 суток культивирования)

Для определения максимального коэффициента размножения, которое можно получить с одного микропобега P. arbelaezii в течение одного цикла культивирования, использовали питательную среду МС с дополнительным содержанием 0,2 мг/л БАП. На рисунке 2 показана зависимость коэффициента размножения от длительности культивирования.

Во всех наблюдаемых вариантах опыта были близкие значения. Количество сформировавшихся узлов для P. arbelaezii за этот период составило 4,2 шт., тогда как первые 15 суток этот показатель составил 1,8 шт. В целом можно отметить общее замедление роста эксплантов после 30 суток и почти полная остановка роста через 45 суток.

Рис. 2. Влияние длительности культивирования на интенсивность формирования узлов.

Таким образом, оптимальная длительность одного пассажа составила 30 суток, различия между привитыми и корнесобственными растениями незначительны.

Выводы

1. Разработан эффективный метод оздоровления интактных растений P. arbelaezii путём прививки на устойчивые к эндогенной инфекции близкородственные виды пассифлор P. caerulea, P. edulis, P. tripartita var. molissima и P. incarnata L.

2. Как показано на модельных объектах, прививка оказывает незначительное влияние на развитие растений на первом этапе введения в культуру in vitro.

3. Использование метода предварительной прививки является видоспецифичным, а его широкое применение ограничено небольшим числом близкородственных иммунных подвоев.

Список литературы

1. Alexandre R. S., Couto F. A. A., Dias J. M. M., Otoni W. C., Mendes R. D. C., & Cecon P. R. In vitro organogenesis of passion fruit (Passiflora edulis Sims. F. flavicarpa Deg.) affected by irradiance, sucrose and explant position //Plant Cell Culture e Micropropagation. - 2008. - Т. 4.

2. Anand S.P., Jayakumar E., Jeyachandran R., Nandagobalan V., Doss A. Direct Organogenesis of Passiflora foetida L. through Nodal Explants //Plant Tissue Culture and Biotechnology. - 2012. - Т. 22. - №. 1. - С. 87-91.

3. Becerra D. C., Forero A. P., Gуngora G. A. Age and physiological condition of donor plants affect in vitro morphogenesis in leaf explants of Passiflora edulis f. flavicarpa //Plant cell, tissue and organ culture. - 2004. - Т. 79. - №. 1. - С. 87-90.

4. Bendini, A., Cerretani, L., Pizzolante, L., Toschi, T. G., Guzzo, F., Ceoldo, S., ... & Levi, M. Phenol content related to antioxidant and antimicrobial activities of Passiflora spp. extracts //European Food Research and Technology. - 2006. - Т. 223. - №. 1. - С. 102-109.

5. Birner J., Nicolls J. M. Passicol, an antibacterial and antifungal agent produced by Passiflora plant species: preparation and physicochemical characteristics //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1973. - Т. 3. - №. 1. - С. 105-109.

6. Dhawan K., Dhawan S., Sharma A. Passiflora: a review update // Journal of Ethnopharmacology. - 2004. - Т. 94. - №. 1. - С. 1-23.

7. Doss A., Doss P.A., Dhanabalan R. 2008. In Vitro Antimicrobial Activity of Extracts of Passiflora edulis (Passifloraceae) and Sphaeranthus indicus (Asteraceae) // Ethnobotanical Leaflets. - 2008. - Т. 2008. - №. 1. - С. 99.

8. Estrada-Chavarrнa A., Rodrнguez-Gonzбlez A. Flores de pasiуn de Costa Rica: Historia natural e identificaciуn Passion flowers of Costa Rica: Natural history and identification.(ISBN 978-9968-927-41-3.).

9. Felter H. W., Lloyd J. U. King's American dispensatory. - Eclectic Medical Publications, 1983.

10. Feuillet C., MacDougal J. M. Passifloraceae // Flowering Plants· Eudicots. - Springer Berlin Heidelberg, 2007. - С. 270-281.

11. Mohamed M. E., Hicks R. G. T., Blakesley D. Shoot regeneration from mature endosperm of Passiflora foetida //Plant cell, tissue and organ culture. - 1996. - Т. 46. - №. 2. - С. 161-164.

12. Mohanasundari, C., Natarajan, D., Srinivasan, K., Umamaheswari, S., & Ramachandran, A. Antibacterial properties of Passiflora foetida L.-a common exotic medicinal plant //African Journal of Biotechnology. - 2007. - Т. 6. - №. 23.

13. Mondall, N. K., Mojumdar, A., Chatterje, S. K., Banerjee, A., Datta, J. K., & Gupta, S. Antifungal activities and chemical characterization of Neem leaf extracts on the growth of some selected fungal species in vitro culture medium //Journal of Applied Sciences and Environmental Management. - 2009. - Т. 13. - №. 1. - С. 49-53.

14. Nicolls J. M. Antifungal activity in Passiflora species //Annals of Botany. - 1970. - Т. 34. - №. 1. - С. 229-237.

15. Nicolls J. M., Birner J., Forsell P. Passicol, an antibacterial and antifungal agent produced by Passiflora plant species: qualitative and quantitative range of activity //Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1973. - Т. 3. - №. 1. - С. 110-117.

16. Pinto D.L.P., Barros B.A., Viccini L.F., Campos J.M.S., Silva M.L., Otoni W.C. Ploidy stability of somatic embryogenesis-derived Passiflora cincinnata Mast. plants as assessed by flow cytometry //Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). - 2010. - Т. 103. - №. 1. - С. 71-79.

17. Vanderplank J. et al. Passion flowers and passion fruit. - Cassell Publishers Limited, 2000.

18. Yockteng R., d'Eeckenbrugge G. C., Souza-Chies T. T. Passiflora //Wild Crop Relatives: Genomic and Breeding Resources. - Springer Berlin Heidelberg, 2011. - С. 129-171.

19. Кръстев М.Т., Кириллов А.А., Протас С.А. Анатомия прививки представителей рода Passiflora L. // Бюлл. Гл. ботан. сада. - 2013. - Т.199.-№2.-С. 38-42.

20. Молодожников М, М., Рабинович И. М, Интродукция пассифлоры инкарнатной в субтропиках Грузинской ССР, Всесоюзное совещание по интродукции растений, Главный Ботанический сад. Академии наук СССР, февраль 1964 г., Москва.

Размещено на Allbest.ru