Особенности функционирования АТФаз эритроцитов цыплят-бройлеров

12

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курский институт социального образования

Особенности функционирования АТФАЗ эритроцитов цыплят-бройлеров

PECULIARITIES OF ERYTHROCYTE ATPASE FUNCTIONING OF CHICKEN-BROILERS

Мосягин В.В. к. б. н., доцент

В статье рассматриваются особенности функционирования АТФаз эритроцитов цыплят-бройлеров. Предложен метод выделения цитоплазматических мембран и ядер эритроцитов цыплят-бройлеров. Представлены данные о влиянии ионов Na⁺ и К⁺ на активность общей АТФазы эритроцитов и АТФаз, локализованных в цитоплазматической и ядерной мембранах.

Peculiarities of functioning of ATPase of erythrocyte of chicken-broilers are considered in the article. Method of discharge of cytoplasmic membranes and nuclei of erythrocytes of chicken-broilers was proposed. Data on influence of ions Na+ and K+ on activity of general ATPase, localized in cytoplasmic and nuclear membranes were presented.

Ключевые слова: АТФазная активность, Na/K-АТФаза, эритроциты, цыплята-бройлеры, цитоплазматическая мембрана, ядра.

Key words: ATPASE ACTIVITY, NA/K-ATPASE, ERYTHROCYTES, CHICKENS-BROILERS,

CYTOPLASMIC MEMBRANE, NUCLEI.

Известно, что ионный состав внутриклеточной и внеклеточной среды имеет существенные различия, особенно в отношении одновалентных катионов натрия и калия. Ионная асимметрия используется для генерации возбуждения в нервных и мышечных клетках, а также является движущей силой для работы белков-переносчиков, осуществляющих транспорт аминокислот и сахаров в клетку [1].

Создание градиента концентраций ионов натрия и калия по обе стороны мембраны осуществляется активным транспортом этих ионов против их электрохимических градиентов специальным ферментом - Na/K-АТФазой, использующей энергию макроэргических связей АТФ. Наибольшая активность Na/K-АТФазы обнаружена в возбудимых и секреторных тканях: мозге, электрическом органе, почках, солевых железах [2]. На активность Na/K-АТФазы существенное влияние оказывают многие факторы: соотношение ионов натрия и калия, количество доступного АТФ и др. Специфическими ингибиторами Na/K-АТФазы служат уабаин (строфантин-G) и другие сердечные гликозиды, а также эндогенные дигиталисоподобные факторы [1, 3, 4, 5].

Наиболее удобными объектами для изучения функционирования Na/K-АТФазы являются препараты, получаемые из эритроцитов, почек и мозга, что связано с легкостью получения достаточно активных мембранных препаратов из этих объектов [4].

Однако изучение функционирования Na/K-АТФаз эритроцитов цыплят-бройлеров затруднено, так как применение специфического ингибитора этой аденозинтрифосфатазы - уабаина (строфантина-G) в концентрации 2,0-100,0 ммоль не вызывает существенного подавления активности АТФазы, выделенной из тканей цыплят [6, 7].

Такая нечувствительность к уабаину, по-видимому, объясняется существованием, по крайней мере, двух видов АТФаз, связанных с транспортом натрия. Одна из них - классическая Na/K-АТФаза - чувствительна к уабаину, а другая - Na-транспортирующая АТФаза - не нуждается для своей работы в ионах калия [8].

Особенности работы Na/K-АТФазы эритроцитов птиц связаны с их более сложным строением, заключающимся в наличии ядра, а в молодых эритроцитах - и митохондрий. Вследствие чего возрастные изменения морфологии и функции эритроцитов птиц изучены недостаточно [9].

Выделение субклеточных структур эритроцитов птицы сопряжено с определенными трудностями. Так, методы, предполагающие для разрушения цитоплазматических мембран эритроцитов использование детергентов (сапонин, тритон Х-100) [10, 11], оказались неприемлемы, так как, по нашим данным, применение детергентов приводило к полному разрушению цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов. Использование метода получения теней эритроцитов млекопитающих [12] путем гемолиза эритроцитов дистиллированной водой приводило в наших опытах к агглютинации мембранных структур.

Цель исследования - изучить влияние ионов Na⁺, К⁺ и Mg²⁺ на активность общей АТФазы эритроцитов и активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров.

Методика исследований. Исследования проводили на 20 цыплятах кросса «Бройлер-6» на базе птицефабрики «Курская» Курской области. Условия содержания и кормления соответствовали действующим нормативам.

Кровь для исследований у цыплят брали из вен шеи. Отделение эритроцитов от плазмы проводили путем центрифугирования в рефрижераторной центрифуге (t = 10⁰C) в течение 30 мин при 3000 оборотах. Эритроциты после отделения от плазмы двукратно отмывали физиологическим раствором.

Активность АТФаз оценивали по приросту неорганического фосфата (Фн) после инкубации при 37⁰С и выражали в нмоль Ф_н·мг белка^-1·мин^-1 [13]. Неорганический фосфат определяли спектрофотометрически [14]. Концентрацию белка устанавливали спектрофотометрическим методом Варбурга и Кристиана [15].

Результаты исследований. Результаты исследований по влиянию различных концентраций ионов Na⁺, К⁺ и Mg²⁺ на активность общей АТФазы эритроцитов цыплят-бройлеров, представленные на рисунке 1, показывают, что ионы натрия, калия и магния оказывают активирующее действие на активность АТФазы в разных диапазонах концентраций. Так, максимальная АТФазная активность проявлялась при концентрациях ионов: натрия - 115-145 ммоль·мл^-1, калия - 17-22, магния - 3,0-4,0 ммоль·мл^-1.

Результаты изучения комбинаций оптимальных концентраций этих ионов представлены в таблице 1. Максимальная АТФазная активность отмечена в инкубационной среде, содержащей: Na⁺ - 120 ммоль·мл, К⁺ - 20 ммоль·мл; Mg²⁺ - 3,0 ммоль·мл, и составляла 9,240,23 нмоль Ф_н ·мг белка^-1·мин^-1.

Рисунок 1 - АТФазная активность эритроцитов при различных концентрациях ионов

Результаты, полученные нами, указывают на то, что основную регуляторную роль в активности фермента играют ионы натрия в сочетании с ионами магния, ионы калия оказывают значительно меньшее влияние на активность АТФазы.

Таблица 1 - Влияние комбинаций ионного состава на активность АТФазы

С целью изучения влияния ионов Na⁺ и К⁺ на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров для выделения этих субклеточных структур был выбран метод замораживания - оттаивания в растворе сахарозы, содержащем 50 ммольл^-1 трис-H₂S0₄ буфер (pH 7,4), с последующим центрифугированием в течение 30 мин при 1000 обмин^-1.

В результате проведения серии опытов было установлено, что оптимальным является 1,375 мольл^-1 (=1,176) раствор сахарозы, а наиболее полное разрушение клеток и выход ядер происходят при 3-кратном замораживании - оттаивании. При этих условиях получили чистую от не разрушенных клеток фракцию ядер. На рисунках 2-5 представлена микрокартина суспензии эритроцитов на разных стадиях замораживания - оттаивания.

Рисунок 2 - Частичный гемолиз эритроцитов после первого замораживания - оттаивания. Видны не разрушенные эритроциты

Рисунок 3 - Микроскопическая картина суспензии эритроцитов после второго замораживания - оттаивания. Тени эритроцитов и ядра

Рисунок 4 - В осадке ядра эритроцитов (после третьего замораживания - оттаивания и центрифугирования)

эритроцит бройлер цыпленок

Рисунок 5 - В супернатанте тени эритроцитов (после третьего замораживания - оттаивания и центрифугирования)

На рисунке 6 представлены данные о влияние ионов Na⁺ и K⁺ на активность АТФаз ядер и цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров. Дисперсионным и регрессионным анализом полученных данных было установлено, что замена в среде инкубации ионов Na⁺ на ионы K⁺ не оказывает достоверного влияния на активность АТФазы ядер (P>0,05). Это, по-видимому, связано с отсутствием в ядерных мембранах Na⁺,K⁺-чувствительной АТФазы. Аналогичная замена ионов в среде инкубации цитоплазматических мембран эритроцитов приводила к достоверному изменению их АТФазной активности на 24,2?4,49% (P<0,01). Коэффициент регрессии (r_xy) составлял 0,657?0,285 (P<0,05), что характеризовало сильную зависимость АТФазной активности этих мембранных структур от концентрации ионов натрия и калия.

Рисунок 6 - Активности АТФаз ядерной и цитоплазматической мембран эритроцитов цыплят в средах различного ионного состава

Заключение. На активность АТФаз эритроцитов птиц существенное влияние оказывают ионы Na⁺, К⁺ и Mg²⁺. Основную регуляторную роль в активности фермента играют ионы натрия. Ионы калия оказывают значительно меньшее влияние на активность АТФазы.

АТФазы цитоплазматических и ядерных эритроцитов цыплят имеют существенные различия, проявляющиеся во влиянии на них ионов Na⁺ и K⁺. Так, цитоплазматические мембраны эритроцитов содержат Na⁺,K⁺- чувствительную АТФазную компоненту, составляющую 24,2+4,5 % от общей АТФазной активности, в то время как в ядерных оболочках наличие такой системы не установлено.

Список литературы

1. Болдырев А.А. Na/K-АТФаза - свойства и биологическая роль // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 4. - С. 2-9.

2. Кометиани, З.П. Кинетика мембранных транспортных ферментов / З.П. Кометиани, М.Г. Векуа. - М.: Высш. шк., 1988. - 111с.

3. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. - М.: МГУ, 1985. -167 с.

4. Болдырев А.А. Современное состояние проблемы транспортных АТФаз и транспортные аденозинтрифосфатазы. - М.: МГУ, 1977. - 115с.

5. Тапильская, Н.И. Эндогенные дигиталисоподобные ингибиторы Na/K-АТФазы - новый класс гормонов с широким спектром функций / Н.И. Тапильская, И.А. Егорова, А.Я. Багров // Цитокины и воспаление. - 2006. - № 3. - С. 3-9.

6. Степанян, Р.А. АТФазная активность плазматических мембран печеночной ткани кур в онтогенезе / Р.А. Степанян, А.А. Симонян // Биологический журнал Армении. - 1983. - № 10. - С. 830-834.

7. Фурман Ю.В. Технологические аспекты производства и использования кормовых добавок и биологически активных препаратов в животноводстве: Дисс. на соиск. уч. степ. док. биол. наук. - М., 2001. - 329 с.

8. Скулачев В.П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. - М.: Высш. школа, 1989. - 283 с.

9. Болотников, И.А. Гематология птиц / И.А. Болотников, Ю.В. Соловьев. - Л.: Наука, 1980. -116 с.

10. Шкорбатов, Ю.Г. Биоэлектрические свойства клеточных ядер / Ю.Г. Шкорбатов, В.Г. Шахбазов // Успехи современной биологии. - 1992. - Вып. 4. - С. 499-503.

11. Шкорбатов, Ю.Г. О роли нуклеиновых кислот и других биополимеров в образовании электрического заряда клеточного ядра / Ю.Г. Шкорбатов, В.Г. Шахбазов // Молекулярная генетика и биофизика. - 1982. - № 7. - С. 35-38.

12. Keeton K.S., Kaneko I.I. Characterization of adenosinetriphosphatase in erythrocyte membrane of the cow // Proc.Soc.Ekp.Biol. and Med. 1972. N 1. P. 140-145.

13. Иващенко, А.Т. Выделение и свойства аниончувствительной аденозинтрифосфатазы из мембран эритроцитов / А.Т. Иващенко, И.А. Бушнева // Биохимия. - 1981. - № 3. - С. 486-488.

14. Кондрашова, М.Н. Метод определения неорганического фосфата по спектрам поглощения молибдатных комплексов в ультрафиолете / М.Н. Кондрашова, М.Н. Лесогорова, С.Э. Шноль // Биохимия. - 1965. - № 3. - С. 567-572.

15. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот. - М.: Мир, 1991. - 544 с.

Размещено на Allbest.ru