Негативна регуляція ініціації транскрипції на прикладі lac-оперона Escherichia coli

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет імені Івана Франка

Кафедра генетики та біотехнології

Реферат на тему

Негативна регуляція ініціації транскрипції на прикладі lac-оперона Escherichia coli

Робота

Студента 4-го курсу

Групи БЛБ-43

Брикалової Юлії Сергіївни

Викладач проф. Федоренко В.О.

Львів - 2016

ЗМІСТ

Вступ

1. Відкриття lac-оперона E. coli

2. Мутації lac-оперона

3. Комплементаційні тести з конститутивними мутантами

4. Lac-мутації у цис-положенні

5. Lac^-мутанти з домінантними мутаціями

6. Комплементаційні тести з конститутивними мутаціями

7. Цис-активні lacO^с мутації

8. Транс-активні домінантні конститутивні мутації

9. Модель оперона Жакоба і Моно

10. Уточнення до регуляції lac-оперона

11. Найбільш значні доробки

12. Регулювання катаболізму lac-оперона

13. Структура lac контролюючої ділянки

14. Розташування lacІ мутації в трьохвимірній структурі lacI репресора

15. Експериментальне використання lac-оперона

Використана література

ВСТУП

За визначенням, системи негативної регуляції використовують репресор для припинення експресії генів. Репресор може перешкодити ініціації транскрипції кількома способами. Послідовність оператора може збігатися з послідовністю промотора, так що зв'язування репресора перешкоджає зв'язуванню РНК-полімерази на промоторі. Крім того, репресор може зігнути промотор ДНК таким чином, що РНК-полімераза не може зв'язатися. Репресор має також тримати РНК-полімеразу на промоторі так, щоб вона не могла покинути промотор і не може синтезувати РНК. Активність репресора може, в свою чергу, контролюватися фізіологічним сигналом, часто дрібними молекулами. Якщо сигнал активує репресор і припиняє експресію гена, то система є індуцибельною.

Негативні індуцибельні системи

Негативні індуцибельні системи, в яких експресія регульованих генів вимкнена дією білка-репресора. Ефектор включає експресію гена ( і, отже, є індуктором) шляхом інактивації репресора. Цей тип регуляторного механізму спільний для катаболічних оперонів, в яких часто індуктором для оперона є субстрат. Тому клітина потребує регульованих продуктів генів, які беруть участь в утилізації субстрату, тільки тоді, коли є субстрат. Негативні індуцибельні системи були першими охарактеризованими системами регулювання і служать як загальна парадигма регуляції генів. Яскравим прикладом є lac-оперон Escherichia coli.

1. ВІДКРИТТЯ LAC-ОПЕРОНА E. COLI

Класичним прикладом негативної індуцибельної системи є lac-оперон Е. coli, який кодує ферменти, що забеспечують утилізацію цукру лактози. Експерименти Франсуа Жакоба, Жака Моно та їх співробітників на регуляцію lac генів кишкової палички є чудовим прикладом генетичного аналізу біологічного явища в бактерій. Хоча ці експерименти були проведені в кінці 1950-х років, невдовзі після відкриття структури ДНК та існування мРНК, вони до сих пір стоять в якості парадигми, з якими порівнюють всі інші дослідження регуляції експресії генів.

2. МУТАЦІЇ LAC-ОПЕРОНА

Коли Жакоб і Моно почали свою класичну працю, було відомо, що ферменти метаболізму лактози індуцибельні тому, що вони синтезуються тільки тоді, коли цукор лактоза присутній у середовищі. Якщо відсутня лактоза, ферменти не виробляються.

З точки зору клітини, це розумна стратегія, оскільки немає ніякого сенсу синтезувати ферменти для переробки лактози якщо її не можна використовувати як джерело Карбону й енергії. Щоб зрозуміти регуляцію lac-генів, Джакоб і Моно провели генетичний аналіз. По-перше, вони виділяють багато мутантів, у яких були порушення метаболізму лактози. Ці мутанти поділяються на дві принципово різні групи. Деякі мутанти були не в змозі рости у середовищі з лактозою в якості єдиного джерела живлення, і тому були названі Lac-мутантами. Інші мутанти синтезували ферменти метаболізму лактози незалежно від наявності чи присутності індуктора названі конститутивними мутантами. Звернули увагу на той факт, що було виділено багато конститутивних мутантів - це перший доказ того, що регуляція фактично негативна.

3. КОМПЛЕМЕНТАЦІЙНІ ТЕСТИ З КОНСТИТУТИВНИМИ МУТАНТАМИ

Як згадувалося вище, деякі lac мутації не роблять клітини з LacП фенотипом, а, скоріше, їх конститутивними, так що вони експресують lacZ і lacY гени навіть у відсутність індуктора лактози. Щоб відповісти на ці питання, вони спочатку визначили чи lac мутація є домінантною чи рецесивною, який вимагає, щоб організми були диплоїдними, тобто з двома копіями гена що випробовуються.

Бактерії зазвичай гаплоїдні, з тільки однією копією кожного з генів, але "часткових диплоїдів" (далі меродиплоїди) для будь-яких генів одержуютьсяза введенням F' плазміди. Нагадаємо, що F'плазміда є плазмідою, у яку були вставлені деякі гени хромосом бактерій. Вони ввели F'плазміди як носії ділянки дикого типу в штам з lac мутацією в хромосомах (рис.1).

Рис. 1. Комплементации двох рецесивних lac мутацій

Одна мутація (m1) - в хромосомі, а інша (m2) F'плазміді. Якщо дві мутації комплементують одина одну клітини будуть Lac⁺ і буде рости з лактозу в якості єдиного джерела енергії та Карбону. Мутації не будуть комплементувати одина одну, якщо вони в тому ж гені або якщо одне впливає на регуляторний сайт або полярний.

Якщо меродиплоїд бактерії Lac⁺ можуть розмножуватися і утворювати колонії на мінімальному середовищі з лактозою в якості єдиного джерела живлення, lac мутація є рецесивною. Якщо меродиплоїди Lac^- і не можуть утворювати колонії на мінімальному середовищі з лактозою , lac мутація є домінантною. Жакоб і Моно виявили, що більшість lac мутацій рецесивні по відношенню до дикого типу і приблизно так інактивуються гени, продукти яких необхідні для засвоєння лактози.

Питання про те, скільки генів представляють lac рецесивні мутації можна дослідити шляхом виконання парних тестів комплементації між різними lac мутаціями. F? плазміди, що несуть ділянку з однією lac мутацією були введені в мутантний штам з іншою lac мутацією в хромосомі. У такого роду експерименту, якщо в меродиплоїда Lac⁺ дві рецесивні мутації можуть комплементувати одна з одною, то вони є членами різних комплементаційних груп або генів. Якщо частково диплоїдні клітини Lac^- дві мутації не можуть комплементувати один з одним, то вони є членами однієї групи комплементації або гена. Жакоб і Моно виявили, що більшість із lac мутації відсортована у дві різні комплементаційні групи, яких вони назвали lacZ та lacY. Тепер ми знаємо третій ген, lacA, який не був виявлений в їх оригінальний селекції, оскільки його продукт не потрібно для зростання на лактозі або регуляції її засвоєння.

4. LAC-МУТАЦІЇ У ЦИС-ПОЛОЖЕННІ

Не всі Lac^- мутанти мають lac мутації, які зачіпають дифузні продукти гена і можуть комплементувати. Безпосередньо примикає до lacZ мутацій інші lac мутації, які зустрічаються набагато рідше і мають радикально різні властивості. Ці мутації не можуть комплементувати для запуску експресії lac генів на тій же ДНК, навіть при наявності копій lac генів дикого типу. Мутації, які не можуть комплементувати є цис-активними і, ймовірно, впливають на ділянку ДНК, а не дифузний продукт гена, таких як РНК або білок.

Щоб показати, що lac мутація діє як цис-активна, тобто впливає тільки на експресію генів на тій же ДНК, де він міститься, ми можемо ввести F?плазміду, що містить потенційну цис-активну lac мутаціїю в клітинах, що містять або lacZ або lacY мутацію в хромосомі.(рис. 2)

Рис. 2. lacp мутації не можуть комплементувати і цис-активні. lacp мутації в F' плазміді запобігає експресії будь-яких інших lac генів на F', тому lac мутація в хромосомі не буде комплементувати. Меродиплоїдні клітини Lac^?. Мутації lac ділянок показані синім кольором.

Будь-який з транс-активних продуктів генів, кодовані lacZ або lacY на F?плазміді комплементують хромосомній lacY або lacZ мутації, відповідно. Однак, якщо утворюється Lac^- фенотип в результаті lac мутації, то на F?плазміді повинні унеможливлювати синтез обох lacY та lacZ білків. Таким чином, мутації в F?плазміді діють як цис-активні.

Як обговорюється нижче, Жакоб і Моно назвали один тип цис-активних lac мутацій як "lacp мутацій" і припустили, що вони впливають на зв'язування РНК-полімерази до початку гена, тобто мутації в області промотора. Тепер ми знаємо, що багато з цих мутацій дійсно сильні полярні мутації на початку гена lacZ, що також запобігає транскрипцію далі і гена lacY.

5. LAC^-МУТАНТИ З ДОМІНАНТНИМИ МУТАЦІЯМИ

Деякі Lac^- мутанти містять мутації, які впливають на дифузний продукт гена, але домінантний, а не рецесивний. Домінантна Lac^- мутація робить клітини не здатними використовувати лактозу навіть якщо є ще одна не пошкоджена копія lac оперона в клітині, чи в хромосомі чи в F?плазміді. Ці домінантні lac мутації називаються мутаціями lacI^s , для "суперрепресивних мутації". Як показано нижче, ці мутації призводять до змін у структурі репресора так, що він більше не може зв'язуватися з індуктором.

6. КОМПЛЕМЕНТАЦІЙНІ ТЕСТИ З КОНСТИТУТИВНИМИ МУТАЦІЯМИ

Як згадувалося вище, деякі lac мутації не роблять клітини з Lac^- фенотипом, а точніше, роблять їх конститутивними, так що вони експресують lacZ і lacY гени навіть за відсутності лактози. У комплементаційних тестах між конститутивними мутаціями меродиплоїди несуть конститутивні мутації, або у хромосомі, або у F?плазміді, або в обидвох молекулах ДНК. Меродиплоїдні клітини потім перевіряють, щоб визначити, чи можуть вони експресувати lac гени конститутивно або тільки в присутності індуктора. Якщо частково диплоїдні клітини експресують lac гени за відсутності індуктора, конститутивні мутації є домінантними. Проте, якщо меродиплоїдні клітини експресують lac гени тільки в присутності індуктора, мутацій рецесивні. Використовуючи цей тест, Жакоб і Моно виявили, що деякі з конститутивних мутацій, які можуть бути рецесивними або домінантними, можуть вплинути на транс-активні продукти гена, або білка або РНК. Комплементація між рецесивниими конститутивними мутаціями показали, що всі вони в одному і тому ж гені, який дослідники назвали геном lacI (рис.3).

Рис. 3. Комплементація між двома типами конститутивних мутацій. lacI можуть комплементу вати з мутацією в F?плазміді з wt ділянкою в хромосомі.

7. ЦИС-АКТИВНІ LACO^С МУТАЦІЇ

Рідше конститутивна мутація в цій та суміжних регуляторних системах є в цис-положенні, дозволяючи конститутивну експресію lacZ і lacY генів з ДНК, що містить мутацію, навіть у присутності копій lac ДНК дикого типу. Жакоб і Моно назвали ці цис-активні конститутивні мутації як lacO^с мутацій, для lac оператор-конститутивних мутацій (рис. 4).

Рис. 4. lacO^с не можуть комлементувати з wt ділянкою хромосоми і є цис-активні.

8. ТРАНС-АКТИВНІ ДОМІНАНТНІ КОНСТИТУТИВНІ МУТАЦІЇ

Деякі lacI мутації, під назвою lacI ^-d мутації, є транс домінантні, що роблять клітину конститутивною для експресії lac оперона навіть у присутності непошкодженої копії lacI гена. Ці lacI ^-d мутації можливі тому, що поліпептиди lacI формують гомотетрамер (комплекс чотирох копій lacI білка). Суміш нормальних і дефектних субодиниць може бути нефункціональною, спричинюючи конститутивний LacI' фенотип. Отже, lacI ^-d мутації транс-домінантні, тому що одна дефектна субодиниця перетворює тетрамер в неактивний комплекс.(табл.1)

9. МОДЕЛЬ ОПЕРОНА ЖАКОБА І МОНО

На основі цього генетичного аналізу, Жакоб і Моно запропонували свою модель lac оперона для регуляції lac генів (рис. 5).

Рис. 5. Схема регуляції lac оперона

lac оперон включає гени lacZ і lacY (пам'ятайте, що третій ген, lacA, був виявлений пізніше). Ці гени, відомі як структурні гени оперона, що кодують необхідні ферменти, для використання лактози. Продуктом гена lacZ є в - галактозидаза, що розщеплює лактозу до глюкози і галактози, які потім можуть бути використані іншими шляхами метаболізму. Продуктом гена lacY є пермеаза, що дозволяє лактозі потрапити в клітку. Продуктом гена lacA є трансацетилаза, функція якої досі незрозуміла.

Модель оперона пояснила, чому структурні гени експресуються тільки в присутності лактози. Продуктом гена lacI є білок-репресор. У відсутність лактози, цей репресор зв'язується з операторною послідовністю (lacO) близько до промотора (lacP) і тим самим запобігає зв'язування РНК-полімерази на промоторі та блокує транскрипцію структурних генів. На відміну від цього, коли лактоза є в наявності, індуктор зв'язується з репресором і змінює свою конформацію так, що репресор більше не може приєднатися до послідовності оператора. Потім РНК-полімераза може приєднатисятися до lacp (промотора) і транскрибувати lacZ, lacY та lacA гени. lacI репресор є дуже ефективним у блокуванні транскрипції структурних генів оперона. Транскрипція приблизно в 1000 разів більш активна за відсутності репресора, ніж у його присутності. Варто підкреслити, як модель оперона Жакоба і Моно пояснює поведінку мутацій, які впливає на регулювання lac-ферментів. Мутанти з lacZ і lacY мутаціями є Lac^- тому що вони не синтезують активні в - галактозидазу або пермеазу, відповідно, обидва з яких необхідні для засвоєння лактози. Ці мутації чітко транс-активні, тому що вони рецесивні і можуть комплементувати. Активна в - галактозидаза або пермеаза з іншої ДНК в одній клітині можуть компенсувати втрачені ферменти і дозволяють використання лактози.

Поведінка lacp мутацій пояснюється моделлю. Жакоб і Моно запропонували змінити послідовність lacp мутаці на ДНК, з якою зв'язується РНК-полімераза. Це пояснює, чому lacp мутації є цис-активними; якщо сайт ДНК, в якому РНК-полімерази що ініціює транскрипцію, змінюється в результаті мутації, так що він більше не зв'язується з РНК-полімеразою, тому не транскрибуються lacZ, lacY, та lacA гени ДНК в мРНК, навіть при наявності хорошої копії lacp області в іншому місці в клітині.

Їх модель також пояснює поведінку двох конститутивних мутацій: lacI (трансдіючі) і lacO^с (цис-). Мутації lacI впливають на функції транс-елемента (оператора), тому що вони інактивують репресорний білок, який зв'язується з оператором і запобігає транскрипції. LacI репресор синтезований з функціональної копії гена lacI в будь-якій точці клітини може приєднатися до послідовності оператора і блокувати транскрипцію в транс-положенні. Проте lacO^с мутації змінюють на послідовність ДНК, до якої LacI репресор може з'єднатися з блоком транскрипції. LacI репресор не можна прив'язати до цієї зміненої послідовності lacO, навіть за відсутності лактози. Таким чином, РНК-полімераза може вільною приєднатися до промотора і транскрибувати структурні гени. lacO^с мутації цис-активні, бо вони дозволяють конститутивну експресію lacZ, lacY, та lacA генів з тієї ж ДНК, навіть при наявності хорошої копії lac оперона в іншому місці в клітині.

Існування суперепресорних lacI^s мутацій також пояснюється їх моделлю. Ці мутації призводять до зміни молекули репресора, так що він не може більше зв'язуватися з індуктором. Мутований репресор зв'язується з оператором навіть у присутності індуктора, роблячи клітини постійно репресованими і фенотипово Lac^-. Теж пояснюються той факт, що даний вид мутації є домінантним над диким типом. Мутований репресор припиняє транскрипцію lac оперона в одній клітині, навіть у присутності індуктора, тому вони роблять клітину Lac^- навіть при наявності хорошого гена lacІ, чи в хромосомі чи у F?плазміді.

lac гени є хорошим прикладом того, що мається на увазі під терміном "оперон". Оперон включає в себе всі гени які транскрибуються в мРНК плюс будь-які сусідні цис-сайти, які беруть участь у транскрипції або регуляції транскрипції генів. lac оперон Е. coli складається з трьох структурних генів, lacZ, lacY та lacA, які транскрибуються в одну і ту ж мРНК, а також lac промотора, з якого ці гени транскрибуються. Він також включає в себе lac оператора, оскільки він є цис - діючою регуляторною послідовністю, яка включена у регуляції транскрипції структурних генів. Однак, lac-оперон не містить ген репресора, lacI. Ген lacІ примикає до lacZ, lacY, та lacA генів і регулює їх транскрипцію, але його не зчитують у ту ж мРНК структурних генів. Більше того, її продукт транс-діючий, а ніж цис-діючий.

10. УТОЧНЕННЯ ДО РЕГУЛЯЦІЇ LAC-ОПЕРОНА

Модель оперона Жакоба і Моно пережила плин часу. У 1965 році, це принесло їм Нобелівську премію, якою вони розділили з Андре Львовом (Andrй Lwoff). З-за її простоту, модель оперона для регулювання lac генів Е. coli виступає в якості парадигми для розуміння регуляції генів в інших організмів. lac гени та цис- діючі сайти також мають безліч застосувань в молекулярній генетиці всіх організмів. Вони були введені у багатьох інших видах організмів, де вони використовуються для вивчення багатьох аспектів генної регуляції і розвитку і в клітинній біології.

Поки ще значною мірою інтактно, модель оперона зазнала кілька уточнень протягом багатьох років. Як вже згадувалося вище, Жакоб і Моно не знали про існування гена lacA і думали, що lacY кодувала трансацетилазу, а не пермеазу, яка була невідома в той час. Крім того, більшість мутацій, що Жакоб і Моно визначили як lac^р не були насправді мутаціями промотора, але замість цього були сильні полярні мутації в lacZ, що запобігає транскрипції всіх трьох структурних генів (lacZ, lacY, та lacA). Більш пізні дослідження також показали, що справжнім індуктором, який прив'язується до LacI репресора є алолактоза, метаболіт лактози, а не сама лактоза. У більшості експериментів, аналог алолактози називається ізопропіл- в - D - тіогалактопіранозид (IPTG) використовується в якості індуктора, тому що він не метаболізується клітинами.

11. НАЙБІЛЬШ ЗНАЧНІ ДОРОБКИ

Моделі оперона Жакоба і Моно прийшли з відкриттям, що LacI репресор може зв'язуватися з не однією, а з трьома операторами, що називаються o₁, o₂, та o₃. (рис.6).

оперон мутація конститутивний тест

Рис. 6. Розміщення операторів lac оперона

Оператор o₁ ближче до промотора, мабуть, найбільш важливий для припинення транскрипції lac експресії і діє стерично заважаючи зв'язуванню РНК-полімерази до промотора, оскільки послідовність зосереджена на позиції +11 від початкової точки транскрипції (+1) і, отже, збігається з позицією приєднання РНК-полімерази протягом ініціації транскрипції. Делеція або o₂, або o₃ має незначний вплив на репресію. Однак, видаливши обидві o₂ та o₃ зменшується репресію аж у 50 разів.

Чому lac оперон має більше одного оператора, тим більше, що ці оператори не так далеко від сайту зв'язування РНК-полімерази, що малоймовірно, що вони можуть блокувати зв'язування РНК-полімерази з промотором? Мета мати більше ніж один оператор для того, щоб LacI репресорна молекула могла зв'язати два оператори одночасно, згинаючи ДНК в області промотора між ними, щоб сформувати петлю ДНК. Це петлі ДНК стабілізує взаємодія LacI з ДНК. Як буде показано нижче, у багатьох інших оперонов, в тому числі gal і ara оперонов, також містять кілька операторів, які сприяють циклізації ДНК в промоторній області. У lac ситемах, формування петлі ДНК допомагає в репресії, але не потрібно для регулювання приєднання РНК- полімерази. Нові технології, в тому числі одномолекулярні дослідження, які дозволяють візуалізацію взаємодії між LacI і РНК-полімерази на індивідуальному матричному ланцюзі молекули ДНК, ймовірно, забезпечить нові проникливості в молекулярні механізми які лежать в основі регуляції транскрипції в цій системі.

12. РЕГУЛЮВАННЯ КАТАБОЛІЗМУ LAC-ОПЕРОНА

На додаток до того, що під контролем власного специфічного репресора, lac-оперон регулюється у відповідь на наявність інших джерел Карбону шляхом катаболичной репресії. Катаболічні шляхи використовуються, щоб розщепити субстрати до продуктів у вигляді інших карбоновмісних сполук або енергії. У катаболічній репресії система гарантує, що гени для використання лактози не експресуватимуться якщо є доступним краще джерело Карбону й енергії , такі як глюкоза. Назва “катаболічна репресія" є неправильною, принаймні в E. coli, оскільки експресії оперонів під контролем катаболізму в E. coli вимагає транскрипційного активатора, катаболізм активуючого протеїну (CAP, історично звані Crp, для катаболізм репресорного протеїну ), і низькомолекулярних ефекторів циклічних АМФ (cAMP). Багатьох оперонів під контролем CAP- cAMP - це тип глобального регулювання.

13. СТРУКТУРА LAC КОНТРОЛЮЮЧОЇ ДІЛЯНКИ

lac промотор являє собою типовий у70 бактеріальний промотор з характерними -10 і -35 ділянками. Один з операторів, до якого приєднується LacI репресор (o₁), перекриває початковий сайт транскрипції (+1) для транскрипції lacZ, lacY, та lacA.

Інші lac операторні послідовності розташовані по обидві сторони від промотора. Кожна симетрична половина оператора зв'язує мономер LacI. Одночасно прив'язка LacI тетрамера на двох сайтах оператора (наприклад, o₁ і о₃) дозволяє кожній з чотирьох субодиниць тетрамера, щоб взаємодіяти з половиною сайта оператора. CAP- зв'язуючий сайт, який збільшує зв'язування РНК-полімерази за відсутності глюкози, є трохи далі перед промотором.

14. РОЗТАШУВАННЯ LACІ МУТАЦІЇ В ТРЬОХ-ВИМІРНІЙ СТРУКТУРІ LACI РЕПРЕСОРА

Коли ген lacІ був секвенований, точні амінокислотні зміни в lac-репресора в результаті деякої мутації може бути визначено, в яких регіонах представлена інформація про LacI білки, які беруть участь у різних функціях репресора. Наприклад, lacI^s мутації слід значною мірою обмежувати сайт білка, де приєднується індуктор, щоб ідентифіковати сайт. Крім того, lacI^-d мутації не повинні інактивувати регіони, залучені до формування димера або тетрамера, оскільки мутантні білки повинні утворювати змішані димери або тетрамери з поліпептидом дикого типу , щоб був домінантним. Ми б очікували, що конститутивні lacI^-d мутації будуть розкидані навколо білка, так як вони можуть вплинути на майже будь-яку активність білків, у тому числі його здатності зв'язуватися з ДНК та її здатності складатися в його кінцеву конформацію. Однак, з'ясувалося, що всі різні типи мутації часто розкидані по всьому гену і не завжди сконцентровані у певній ділянці. Багато років пізніше, коли з'явилася тривимірна структура білка, було легше щоб зрозуміти розподіл мутацій, оскільки амінокислоти, які не входять в лінійний поліпептид може бути близько один до одного в складеному білку.

LacI білок (рис. 7) кристалізували, і його тривимірна структура була визначена методом рентгенівської дифракції, також використовувалася ядерна магнітно-резонансна спектроскопія для визначення його взаємодії з lac операторами і як ця структура змінюється, коли приєднується індуктор IPTG.

Рис. 7. Будова репресора

Відстань між ДНК - зв'язуючими N - кінцевими доменами змінюється коли приєднується індуктор, запобігаючи її приєднання до оператора. Взаємодія, в ході якого індуктор зв'язується в одиній області білка і може сприяти змінам в іншій називається алостеричною. Деякі lacI^s мутації також змінюють амінокислоти в алостеричному сигнальному регіоні, регіоні, який сигналізує до ДНК - зв'язуючих доменів, що зв'язаний індуктор в індуктор - зв'язуючій кишені. В цьому регіоні функціонує як домен димерізації, який допомагає тримати разом двох мономерів, а також змінює орієнтації двох мономерів що може бути частиною сигналу.

15. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИКОРИСТАННЯ LAC-ОПЕРОНА

lac гени і регуляторні області знайшли багато застосувань в молекулярній генетиці. Наприклад, ген lacZ, напевно, найбільш широко використовується репортерний ген і був введений в широкий спектр різних організмів від бактерій до плодових мушок та до людських клітин. Він настільки популярний, тому що його продукт, в - галактозидаза, легко виявляється в колориметричному аналізі використовуючи субстрати, таких як X- Gal (5-бромо - 4 - хлоро - 3 - індоліл- в - D - галактопіранозид) і ONPG (о-нітрофеніл- в - D - галактопіранозид). Крім того, N - кінцевай частина білка є несуттєвою для діяльності, що полегшує синтез. Єдиний мінус lacZ як гена репортера полягає в тому, що його унікальний поліпептидний продукт дуже великий, що може бути недоліком в деяких видах системи експресії.

lac промотор або його похідні використовуються в багатьох векторах експресії. Цей промотор має багато переваг у цих векторів експресії. Вони досить сильні, що дозволяє високий рівень транскрипції клонованого гена. Він також є індуцибельним, що дає можливість для клонування генів, продукти яких є токсичними для клітин. В клітинах можуть бути вирощені за відсутності індуктора IPTG так що клонований ген не транскрибується. Коли клітини досягають високої щільності, доданий індуктор IPTG і клонований ген експресується. Навіть якщо білок є токсичним і вбиває клітини, коли синтезований в таких великих кількостях, достатньо білка зазвичай синтезується перед клітинною загибеллю.

Існує безліч похідних lac промотора у використанні. Ці похідні зберігають деякі з бажаних властивостей дикого типу lac промотора, але мають додаткові функції. Наприклад, мутований lac промотор lacUV5 - це більше не чутливі до катаболичної репресії і так активно навіть якщо глюкоза присутня у середовищі. Гібрид trp-lac промотор (tac-промотор) також широко використовується. Перевагами tac-промотора є те,що він є сильнішим, ніж lac промотор і нечутливий до катаболитної репресії, але як і раніше зберігає свою індуцибельність за допомогою IPTG.

Тому що він приєднується дуже щільно до своєї операторної послідовності, LacI репресорний білок також має безліч застосувань. Один напрямок використання в бактерійній клітинній біології, щоб знайти певні ділянки ДНК у клітині. В одному із застосувань, LacI протеїн дифундує до зеленого флуоресцентного білока, який може бути виявлений в клітині шляхом флуоресцентної мікроскопії. Якщо фундуючий білок синтезується в клітині, в якій кілька копій послідовності операторів були введені в області хромосоми, наприклад, поряд з послідовністю ініціації реплікації, то цей білок зв'язується в декількох екземплярах з регіоном ініціації реплікації хромосоми. Розташування регіону ініціації реплікації хромосоми можуть бути відстежені потім в клітині, як вона проходить через клітинний цикл шляхом спостереження флуоресценції синтезованого білка. Та ж система може бути експериментально використана для затримки реплікативної вилки ДНК, щоб аналізувати механізми хромосомної організації.

ВИКОРИСТАНА ЛІТЕРАТУРА

1. Molecular genetics of bacteria / Larry Snyder ... [et al.]. -- 4th ed. p. ; cm. Rev. ed. of: Molecular genetics of bacteria / Larry Snyder and Wendy Champness. c2007.

Размещено на Allbest.ru