Изучение полиморфных вариантов генов, ассоциированных с продуктивностью крупного рогатого скота

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра генетики

Курсовая работа

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Щуцкой Т.А.

Минск 2016



ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гормон роста и пролактин: структура и биологическая роль

1.2 Общие свойства

1.3 Понятие о ДНК-полиморфизме и МАS -селекции

1.4 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

1.5 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена гормона роста(bGH) c признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

1.6 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена рецептора гормона роста (GH R) с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Выделение ДНК из цельной крови

2.2 Условия проведения ПЦР

2.3 Анализ генетического полиморфизма генов bPit-1-HinFI, bGH- Alul и bGHR-Sspl

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАННИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Результаты генотипирования и оценка соответствия наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемым по закону Харди-Вайнберга

3.2 Сравнительный анализ распределения частот аллелей полиморфных генов соматотропинового каскада у представителей и аулиекольской и белоголовой пород

3.3 Обсуждение полученных результатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ



ВВЕДЕНИЕ

Пролактин (PRL) и гормон роста (GH) представляют собой семейство белковых гормонов, которые принимают участие в инициации и поддержании лактации у млекопитающих и могут рассматриваться как потенциальные генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота (КРС). Применение ДНК - маркеров для ускорения решения селекционных задач получило название “селекция с помощью маркеров или маркер -ассоциированная селекция (MAS - marker assisted selection)”. ДНК - маркеры - это аллельные варианты генов, напрямую или косвенно связанные с продуктивными и адаптационными признаками животных, с устойчивостью или восприимчивостью к заболеваниям. Выявление предпочтительных с точки зрения селекции вариантов таких генов позволяет дополнительно к традиционному отбору животных, например, по содержанию жира в молоке, по уровню удоя, проводить селекцию по генотипу.

К настоящему времени исследован рестрикционный полиморфизм в экзоне 3 гена bPRL с использованием рестриктазы Rsal, обусловленный транзицией A-G в кодоне для 103 аминокислоты и полиморфизм в 5 'нетранслируемой области, который был рассмотрен микросателлитным анализом [35].

Для селекции крупного рогатого скота мясного направления наибольший интерес представляет ген соматотропина (гормон роста - важнейший регулятор роста у млекопитающих) и гены, вовлеченные в работу всего гормонального цикла соматотропинового каскада. К ним относятся ген, принимающие участие в регуляции экспрессии гена соматотропина (такие как ген гипофизарного фактора роста-1 bPit-1) и опосредовании его физиологических эффектов на клетки-мишени (такие как ген рецептора гормона роста bGHR).

Достаточно простым способом применения физиологических эффектов соматотропина в мясном скотоводстве является его введение в рацион животных мясных продуктов. Это приводит к возникновению ряда серьезных заболеваний у человека, в том числе рак простаты [3-4]. Поэтому наиболее безопасным и эффективным способом интенсификации селекционного процесса остается поиск аллельных вариантов генов соматотропинового каскада, ассоциированных с повышенной мясной продуктивностью и применение их в ходе селекционного процесса [5].

Соматотропин, как и другие гены, отвечающие за развитие количественных признаков, является полиморфным. У крупного рогатого скота разных пород выявлен широкий набор их аллелей, представляющих интерес для MAS-селекции в качестве генетических маркеров хозяйственно полезных признаков. Имеется много данных о том, что некоторые его аллели ассоциированы с повышенным потенциалом мясной и молочной продуктивности у КРС [6-7]. Однако в ряде случаев, опубликованные данные об ассоциации аллелей генов соматотропинового каскада (bPit-1, bGH и bGHR) с признаками продуктивности, полученные на разных породах, трудно сопоставимы и противоречат друг другу [2,6,8,9,10], а для значительной части выявленных аллелей такие исследования не проводились.

Целью данной работы было изучение частоты полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада bPit-1-HinFI, bGH-AluI и bGHR-Sspl, для оценки перспектив использования их в качестве генетических маркеров мясной продуктивности КРС.

Задачи:

1. Провести генотипирование быков - производителей аулиекольской и белоголовой пород по полиморфным вариантам генов, связанных с мясной продуктивностью (bPit-1-HinFI, bGH -Alul и bGHR - Sspl).

2. Провести оценку частот встречаемости аллельных вариантов у представителей каждой породы.

3. Провести сравнительный межпородный анализ распределения частот аллелей полиморфных генов соматотропинового каскада у представителей аулиекольской и белоголовой пород.



ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гормон роста и пролактин: структура и биологическая роль

Биологическая роль гормона роста

Соматотропин относится к группе анаболических гормонов. При введении его в организм животного с гипофизарной недостаточностью наблюдается усиление роста скелетных костей и других тканей, усиливается синтез белка и секреция молока. Проявление физиологического эффекта соматотропина связано с появлением в крови особых белков, которые называются соматомединами - веществами, опосредующими действие СТГ. Основным местом синтеза соматомединов является печень. Поэтому печень можно отнести к периферической эндокринной железе, секретирующей вторичные гормоны ( в частности соматомедины ) в ответ на действие продукта центральной железы - гипофиза .

Гормон роста образуется из прогормона с молекулярной массой 28кД, не обладающего гормональной активностью.

Регуляция синтеза и секреции гормона роста осуществляется множеством факторов. Основной стимулирующий эффект оказывает соматолиберин, основной тормозящий - гипоталамический соматостатин ( рисунок 1.1) [34].

Рисунок1.1-Регуляция синтеза и секреции гормона роста



Рецепторы гормона роста находятся в плазматической мембране клеток печени, жировой ткани, яичка , желтом теле, скелетных мышцах, хрящевой ткани, мозге, легких, поджелудочной железе, кишечнике, сердце, почках , лимфоцитах [34].

Основное действие гормона роста направлено на регуляцию обмена белков и процессов, связанных с ростом и развитием организма. Под влиянием гормона роста усиливаются транспорт аминокислот в клетке мышц, синтез белка в костях, хрящах, мышцах, печени и других внутренних органах, увеличивается общее количество РНК, ДНК и общее число клеток ( рисунок 1.2).

Рисунок 1.2- Влияние гормона роста на внутренние органы и ткани

Влияние гормона роста на рост скелета и мягких тканей требует участия веществ, которые синтезируются в ответ на взаимодействие гормона роста с рецепторами плазматической мембраны клеток различных тканей, в основном печени, и носят название соматомединов. Поскольку эти молекулы отличаются высокой гомологичностью друг к другу, а также к проинсулину, и обладает инсулиноподобной активностью и мощным ростостимулирующим действием, они называются инсулиноподобными факторами роста (ИФР-1- одноцепочечный полипептид, основного характера, содержащий 70 аминокислотных остатков, а полипептид ИФР-2 носит кислотный характер и состоит из 67 аминокислотных остатков). В крови примерно 95% соматомединов циркулирует в комплексе с белками. Синтез ИФР-1 в большей степени зависит от концентрации гормона роста в крови , чем синтез ИФР-2. В то же время ИФР-1, образующийся в печени, ингибирует синтез и секрециюгормона роста по механизму ретроингибирования, действуя на уровне гипофиза и гипоталамуса ( рисунок 1.3) [34].

Рисунок 1.3-Механизм действия гормона роста

Биологическая роль пролактина

В аденогипофизе образуется белковый гормон, близкий по химическим и биологическим свойствам соматотропину, - пролактин, или лактогенный гормон. Он значительно эффективнее стимулирует лактацию, чем соматотропин, и помимо этого обладает широким спектром биологического действия. Пролактин влияет на рост органов и тканей животных, регулирует водный и солевой баланс, стимулирует развитие вторичных половых признаков, индуцирует синтез а-лактальбумина и казеина, активирует синтез фосфолипидов [36]. Активирование транскрипции генов белков молока включает олигомеризацию рецептора и активацию киназы Jak2, которая фосфорилирует остатки тирозина у рецепторов сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции Stat5a и Sta5b . Сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции представляют собой семейство из 7 транскрипционных факторов. Stat5 также известны как главные медиаторы действия гормона роста и пролактина на гены, находящиеся под их контролем [35].

Рецепторы пролактина присутствуют в клетках многих тканей: в печени, почках, надпочечниках, яичках, яичниках, матке и других тканях.

Секрецию пролактина стимулируют тиролиберин, серотонин, окситоцин, ацетилхолин, ингибирующий эффект оказывает дофамин [34].

Структура генов пролактина и гормона роста

Молекула пролактина представляет собой одну полипептидную цепь, построенную из 199 аминокислотных остатков и имеющую три дисульфидные связи. Установлена первичная структура пролактина у человека и нескольких видов животных. Видовые различия в химическом строении пролактина немногочисленны. N-концевое положение в полипептидной цепи пролактина у человека и ряда животных (например свинья, кит ) занимает остаток лейцина. У других животных (например, овца, КРС) - остаток треонина. С-концевым аминокислотным остатком в молекуле пролактина независимо от видовой принадлежности является остаток цистеина. Молекула пролактина обладает довольно устойчивой третичной структурой; около 50% полипептидной цепи находится в виде а-спирали (рисунок 1.4) [36].

Рисунок 1.4 - Структура пролактина



Молекула соматотропина представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 190-191 аминокислотных остатков. Соматотропины разной видовой принадлежности, обладая большими или меньшими различиями в аминокислотной последовательности, проявляют четкую структурную гомологию друг с другом. Все они содержат один остаток триптофана и 4 остатка цистеина. Последние образуют в молекуле два дисульфидных мостика, которые формируют две петли - большую, включающий центральный участок аминокислотной последовательности (в соматотропине человека между цистеином -54 и цистеином -165), и малую (на С-концевом участке между цистеином-182 и цистеином-189 ) (рисунок 1.5) [36].

Рисунок 1.5 - Структура соматотропина

1.2 Общие свойства

По структуре и биологическим свойствам пролактин имеет общие черты с гипофизарным гормоном роста и наряду с плацентарным лактогеном и пролиферином образует отдельное семейство - семейство пролактинподобных белков. Все эти гормоны состоят из одной негликозилированной полипептидной цепи и характеризуются значительным сходством первичной структуры.

Гормоны данного семейства, имея определенное структурное сходство, обладают и общностью ряда биологических свойств: все они проявляют в той или иной степени ростовую, анаболическую, гипергликемическую, липолитическую и лактогенную активности.

Поэтому гены пролактина и соматотропина, участвующие в одной метаболической системе, а именно в формировании молочной и мясной продуктивности, более адекватно отражают существующие ассоциации с параметрами молочной и мясной продуктивности КРС [37].

1.3 Понятие о ДНК-полиморфизме и МАS -селекции

Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обуславливает разнообразие признаков внутри вида. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило заключается в незначительных вариациях его генетического кода. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, интронах, регуляторных участках и т.д.

Локус называется полиморфным, если в популяции существует два или более аллеля этого локуса. Однако, если один из аллелей имеет очень высокую частоту, скажем, 0,99 или больше, то высока вероятность того, что ни один другой аллель не будет присутствовать в выборке, взятой из популяции, если эта выборка не будет очень большой. Таким образом, обычно локус определяется как полиморфный, если частота наиболее распространенного аллеля меньше 0,99. Такое деление носит весьма условный характер .

Полиморфизм ДНК - это различия в чередовании нуклеотидов которые наблюдаются у различных особей одного вида.

ДНК - технологии широко используются для разработки методов селекции с помощью молекулярно-генетических маркеров - MAS, то есть маркирования главных генов количественных признаков QTL; сохранения биоразнообразия с использованием молекулярно-генетических маркеров, разработки генетически обоснованных программ разведения и подбора родительских пар животных, изучения генетических механизмов развития и предупреждения различных заболеваний [40].

1.4 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

Наиболее исследованным из полиморфных вариантов гена bPit-1 является bPit-1-HinFI полиморфизм, впервые описанный J.Woollard,1994, и впоследствии идентифицированный как молчащая G>A замена в области шестого экзона [11]. В работе R. Renaville, 1997г. Данная мутация исследована на голштино-фризской породе. Редкий аллель, характеризуемый отсутствием сайта рестрикции для фермента Hinf обозначен как А-аллель гена bPit-1-HinFI. Наиболее частый аллель, разрезаемый рестриктазой Hinf, обозначен как В-аллель . Было выявлено, что аллель А ассоциирован с более высокими показателями по признакам мясной продуктивности. Ассоциация данного полиморфизма с признаками мясной продуктивности исследована и другими авторами. Так, R.Renaville, 1997 г. у бельгийского голубого скота [12], определил генотип bPit-1-HinFI?? , как более редкий в исследуемой популяции. По его данным телята с генотипом bPit-1-HinFI?? обладали более высоким весом тела в возрасте 7 месяцев по сравнению с телятами носителями генотипов bPit-1-HinFI?? и bPit-1-HinFI?? , в то время как в возрасте 13 месяцев по показателю веса тела, предпочтительным оказался генотип bPit-1-HinFI??, Zwierzchowski, 2002г. При изучении мясных пород польского скота, также выявил положительную ассоциацию со скоростью роста в ранний период постнатального развития у телят носителей аллеля A гена bPit-1-HinFI [7]. Однако данные об ассоциации аллеля B гена bPit-1-HinFI с весом телят в раннем возрасте, полученные Renaville в исследованной популяции пьемонтского скота подтверждения не получили [12].

Кроме того, группой ученых университета штата Огайо США под руководством проф. М. Дэвиса проведен ряд исследованний ассоциации других полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности у представителей ангусского скота [13-14]. Ими было обнаружено три полиморфизма в области интрона 3. Однако, ни для одного из исследованных полиморфизмов не было выявлено значительной ассоциации ни со скоростью роста, ни с параметрами туши [15].

1.5 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена гормона роста(bGH) c признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

Учитывая значительную роль в процессе роста и лактации, bGH ген является потенциальным объектом для изучения ассоциации его молекулярных вариантов с признаками продуктивности крупного рогатого скота.

С помощью метода ПЦР-ПДРФ, используя рестрикционный фермент Alul, Lucy et.al., 1993, выявил два аллеля, отвечающих за две альтернативные формы бычьего соматотропина с остатком лейцина или валина в положении 127 [16-17]. В большинстве исследований животные с генотипом VV ( две копии гена с валином в положении 127) демонстрировали более низкие темпы роста, чем животные с генотипом LV и LL. Они также обладали более низкими показателями веса, ежедневного прироста веса и др. [18]. Имеются также данные о том, что по этим признакам преимущественным является генотип LV . В работах Zwerzchowski et al. [12,19] было показано, что VV мясные быки имели более высокий суточный прирост веса по сравнению с быками обладавшими другими генотипами. С другой стороны, Di Stasio et.al., изучая Piedmontese cattle, показал отсутствие связи между полиморфизмом bGH гена с признаками мясной продуктивности. И имеющиеся на данный момент данные позволяют предположить, что фенотипические эффекты гена bGH на рост и мясные количественные признаки отличны между собой.

1.6 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена рецептора гормона роста (GH R) с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

В 1999 году Aggrey et al. при изучении голштинских быков было выявлено три полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) с использованием рестриктаз Alul, Stul и Accl. Ассоциация данных полиморфизмов с признаками продуктивности изучалась впоследствии различными учеными.

В работах A.Maj относительно bGHR-Alul полиморфизма, [21] при изучении ассоциации полиморфизма bGHR-Alul с признаками мясной продуктивности у животных польской черно-пестрой породы, показано, что животные носители аллеля bGHR- Alul (-) обладали более высокими показателями по таким параметрам, как вес тела и масса вырезки. При этом наибольшие результаты по этим признакам были характерны для животных с генотипом bGHR-Alul(-/-).

Новый полиморфизм был обнаружен A. Maj и соавт. в положении - 1104 5'фланкирующей области и представляет собой транзицию С>Т [21]. При исследовании данного полиморфизма на представителях молочной породы, польской черно-пестрой, не было выявлено ассоциации ни с признаками мясной, ни с признаками молочной продуктивности [23].

В 1999 году Ge. W. И соавт. при исследовании популяции ангусского скота была обнаружена одиночная нуклеотидная замена (SNP) в области промоторной зоны первого экзона [24]. Maj A. исследовал данный полиморфизм на мясных породах, таких как ангусский скот, лимузинский и герефорды .Ген RFLP-Nsil оказался ассоциированным с ежедневным поглощением корма. Генотип (-/-) или (+ /-) гена RFLP-Nsil был ассоциирован с меньшим потреблением корма, а также у животных с генотипом Nsil -/- был более высокий показатель процента постной вырезки по сравнению с другими генотипами [21].

Замена Т>А в экзоне 8 вызывает неконсервативную замену нейтрального фенилаланина на незаряженный, но полярный остаток тирозина (F279Y) . Соответствующий остаток фенилаланина локализован в трансмембранном домене гена рецептора гормона роста и является консервативным для всех изученных млекопитающих. Blott выявила значительную ассоциацию Phe/Tyr полиморфизма в трансмембранном домене с большей молочной продуктивностью и составом молока [25] у животных немецкой и новозеландской популяции голштинских коров. В дальнейшем мутация F279Y была исследована Luca Fontantasi и соавт., 2007 на животных итальянской голштино-фризской породы, итальянской черной, итальянской симментальской, джерсейской пород. Была отмечена довольно высокая частота предпочтительного Y -аллеля у представителей итальянских популяций исследованных пород [26].



ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Выделение ДНК из цельной крови

Должны выполняться общие требования, предписанные для взятия биологического материала и его транспортировки:

1.Цельная кровь должна быть охлаждена, но не заморожена

2.Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшие 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры от - 20 до - 80єС, либо криозаморозка

3.Повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК

4.Пробирки с антикоагулянтами, такими как ЭДТА, необходимо перемешать, что бы не допустить свертывания образца , но не встряхивать

Методы выделения ДНК:

1.Метод экстракции с помощью органических растворителей

2.Метод экстракции с помощью силики (диоксид кремния)

3.Метод экстракции с помощью гельфильтрации

4.Метод экстракции с помощью магнитных частиц

5.Метод экстракции с помощью микроцентрифужных колонок

6.Ионообменная смола

7.Метод экстракции на бумажных фильтрах [39]

2.2 Условия проведения ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты

1.ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать

2.Праймеры - короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18-30 оснований комплиментарные противоположным концам х цепей требуемого фрагмента ДНК

3.Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu -полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

4.Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

5.Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. гормон дезоксирибонуклеиновый аллель ген

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 С° на 0,502 мин. Для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество не специфичные продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижает, чтобы праймеров могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4-5 градусов ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5 - 2 мин.

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймеры в качестве затравки. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq, Pfu наиболее активны при 72 . Эта стадия длиться 7-10 мин(рисунок 1.5) [38].

Рисунок 2.1 - Стадии ПЦР



Таблица 1 - Условия проведения ПЦР

Полиморфизм	Условия амплификации	Последовательности праймеров	Ссылки
bPit-1-HinI	94єС - 1 мин; (95єС - 45 сек; 56єС - 6є сек; 72єС - 6є сек) х 35 циклов; 72єС - 1 мин	HinFI-F: 5'aaaccatcatctcccttctt-3'	[11]
		HinFI-R: 5'aatgtacaatgtcttctgag-3'
bGH-Alul	95єC-5 мин; (95єС - 3єсек; 64єС - 3єсек; 72 єС- 6єсек) х 35циклов; 72єС - 1 мин	Alul-F: 5'ccgtgtctatgagaagc-3'	[6]
		Alul-R: 5'gttcttgagcagcgcgt-3'
bGHR-Sspl	95єC- 5мин; (95єС-3єсек; 6єС - 3єсек; 72 єС - 3єсек) х35єциклов; 72єС - 1ємин	Sspl-F: 5'aatatgtagcagtgacaatat-3'	[25]
		Sspl-R: 5'acgtttcactgggttgatga-3'

2.3 Анализ генетического полиморфизма генов bPit-1-HinFI, bGH- Alul и bGHR-Sspl

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов включал обработку амплификата сайт-специфической рестриктазой и последующее разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit-1 в экзоне 6 проводился с помощью рестриктазы HinFI . Полиморфизм обусловлен A>G нуклеотидной заменой, не приводящей к измененнию аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinFI является последовательность GvANTC . Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А соответствующий аллелю bPit-1-HinFI? [11]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit-1-HinFI?.

Длина амплифицируемого фрагмента гена bPit-1 составляет 451 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 244 и 207 п.н. На электрофореграмме визуализируются варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 451 п.н. ( генотип bPit-1-HinFI??); две полосы 244 и 206 п.н.( генотип bPit -1-HinFI??); три полосы - 451 , 244 и 207 п.н. ( генотип bPit-1-HinFI??) (рисунок 2.1).

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовптельности гена bGH в экзоне 5 проводился с помощью рестриктазы Alul. Полиморфизм обусловлен транзицией С>G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности белка. Сайтом узнавания для рестриктазы Alul является последовательность AGvCT . Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH-AlulL [27]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH-AlulV (рисунок 2.2).

Длина амплифицируемого фрагмента гена bGH составляет 208 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 172 и 35 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипо : одна полоса 208 п.н.( генотип bGH-Alul ??); две полосы 172 и 35 п.н. (генотип bGH-Alul??); три полосы 208, 172 и 35 п.н.( генотип bGH-Alul??). Фрагмент рестрикции 35 п.н. на агарозном геле не визуализируется.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в экзоне 8 проводился с помощью рестриктазы Sspl. Рестриктаза Sspl распознает Т>А транзицию в экзоне 8. Длина SNP вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении 279 белка . Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТvАТТ . Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т соответствующий аллелю bGHR-. В случае присутствия А -нуклеотида сайт рестрикции исчезает , такой аллуль обозначен как bGHR-. Длина амплифицируемого фрагмента гена bGHR составляет 182 п.н. Длина фрагментов после рестрикции 158 и 24 п.н.

На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины , характерные для генотипов : одна полоса 184 п.н. (генотип bGHR-) ; две полосы 158 и 24 п.н.( генотип bGHR-); три полосы - 182 , 158 и 24 п.н. (генотип bGHR-). Фрагмент 24 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 2.3).

Генотип животного по всем анализируемым генам документируется и заносится в общую базу данных.

Сравнение выборок по распределению частот аллелей исследуемых генов, а также оценку соответствия фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга , проводили с помощью критерия чІ. Различия во всех случаях рассматривались как статистически достоверные при уровне значимости Р?0,05.



ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАННИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Результаты генотипирования и оценка соответствия наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемым по закону Харди-Вайнберга

Оценка генетической структуры анализируемых популяций включала анализ соответствия наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению в соответствии с законом Харди-Вайнберга, а также сравнение распределения частот аллелей у представителей двух пород мясного направления.

Результаты генотипирования (количество наблюдаемых генотипов), а также оценки соответствия наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемым равновесным приведены в таблице 2 . Оценка значимости наблюдаемых отклонений проводилась с помощью критерия чІ.

Таблица 2 - Распределение частот генотипов полиморфных генов соматотропинового каскада в выборках аулиекольского и белоголового крупного рогатого скота

Полиморфизм	Генотип	Аумекольская порода (n=25)	Белоголовая порода (n=25)
		n наблюдаемое	n ожидаемое	Р	n наблюдаемое	n ожидаемое	Р
bPit-1-HinFI	bPit-1-	3	4	0,69	6	6	0,04
	bPit-1-	14	12		12	12
	bPit-1-	8	9		7	7
bGH-AluI	bGH-	9	10	1,16	18	17	2,60
	bGH-	14	12		5	7
	bGH-	2	3		2	1
bGHR-Sspl	bGHR-	21	20	2,78	13	14	2,49
	bGHR-	3	5		12	9

Из данных, приведенных в таблице следует, что в обеих популяциях отмечается соответствие наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга.

Это свидетельствует о том, что возможно полиморфизмы bPit-l-HinFI, bGH-AluI и bGHR-SspI ассоциированы с хозяйственно-полезными признаками у аулиекольского и казахского белоголового скота и подвергались косвенному давлению искусственного отбора, однако характер этого отбора не был направленным. Дальнейшие исследования ассоциации этих полиморфизмов представляет значительный научный интерес с точки зрения характера ассоциации этих полиморфизмов с повышенной либо пониженной мясной продуктивностью.

3.2 Сравнительный анализ распределения частот аллелей полиморфных генов соматотропинового каскада у представителей и аулиекольской и белоголовой пород

Результаты оценки различий распределения относительных частот аллелей исследуемых генов в популяции аумекольского и белоголового скота приведены в таблице 3.



Таблица 3 - Распределение относительных частот аллелей исследуемых генов в популяции аулиекольского и казахского белоголового скота(Q±SQ)

Полиморфизм	Аллель	Наблюдаемые частоты аллелей	Относительные частоты аллелей	P
		Аулиекольская порода	Белоголовая порода	Аулиекольская порода	Белоголовая порода
bPit-l-HinFI	bPit-l-HinFIA	20	24	0,400±0,02	0,480±0,02	0,442
	bPit-l-HinFIB	30	26	0,600±0,02	0,520±0,02

Примечание - различие между породами значимо при P<0,05.

По данным, приведенным в таблице 3 можно отметить, что HinFI-аллельные варианты гена bPit-l у представителей аулиекольской породы составляют 0,400 к 0,600 для аллелей bPit-1 -HinFIA и bPit-1-HinFIB соответственно. В тоже время для белоголовой это соотношение практически 1:1 (0,480:0,520). Данные других авторов о частотах этих аллелей у мясных пород отсутствует. Однако, следует отметить, что у представителей крупного рогатого скота молочного направления частота аллеля bPit-1-HinFIA значительно ниже. По данным, полученным при исследовании популяций голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота молочного направления частота аллеля bPit-1-HinFIA составляет 0,21 и 0,23 соответственно [28-29]. При этом авторами показано, что у коров обеих пород наблюдается тенденция к повышению удоя, жирномолочности и белковомолочности в группах с генотипом bPit-1-HinFIBB по сравнению с группами коров с генотипами bPit-1-HinFIAB и bPit-1-HinFIAA. По результатам исследования влияния данного полиморфизма на молочную продуктивность у этих пород генотипу коров черно-пестрой породы нежелательный генотип bPit-1-HinFIAA оказался значимо ассоциирован с пониженной белковомолочностью [30-32].

Анализ данных таблицы 2 относительно характера распределения частот генотипов по полиморфизму гена bGH показывает, что у обеих пород редким является аллель bGH- AluIV. Его частота у представителей аулиекольской и белоголовой составляет 0,360 и 0,180 соответственно. Следует отметить, что в популяциях голштинского скота это соотношение варьирует для аллеля bGH -AluIV от 0,07 до 0,25 [6,16-17]. Таким образом, можно отметить, что у аулиекольской породы частота этого аллеля выше частоты, отмечаемых другими авторами.

Данные по распределению частот Sspl-аллелей гена bGHR демонстрирует, что bGHR-SsplY аллель является редким у представителей обеих пород и эти данные согласуются с данными других авторов. Так, по данным Fontanesy et al. частота аллеля bGHR-SsplF у представителей этих пород достигает соответственно 0,95, 0,73, 0,90 [0,90].

С учетом полученных данных можно заключить, что обе исследованные породы, представленные проанализированными выборками, являются перспективными для дальнейшей оценки возможностей применения полиморфизмов генов bPit-1, bGH и bGHR в качестве генетических маркеров мясной продуктивности.

3.3 Обсуждение полученных результатов

Методы совершенствования мясных пород на современном этапе должны базироваться на теоритических основах линейного разведения, совершенствовании заводских линий и перспективных родственных групп, организации селекционно-племенной работы по формированию высокой мясной продуктивности, формировании у животных скороспелости в сочетании с великорослостью, эффективности используемых методов отбора быков-производителей и маточного поголовья, прогнозе результативности селекции.

Однако темпы совершенствования животных на современном этапе не могут в полной мере удовлетворить требования, предъявляемые селекции, В связи с этим, возникла необходимость поиска новых методов и приемов в селекционной работе, основанных на изучении возможности использования генов соматотропиного каскада в качестве маркеров генотипа в селекционных целях, применение их для раннего и более объективного прогнозирования хозяйственной и племенной ценности животных при отборе по происхождению и оценке по качеству потомства. Для этого первоначально были установлены генотипы и белоголовой пород по трем полиморфным генам соматотропного каскада, затем было проведено исследование распределения частот аллельных вариантов генов. По данным результатов оценки различий распределения относительных частот аллелей исследуемых генов в популяции ауликольского и белоголового скота можно отметить, что HinFI-аллельные варианты гена bPit-1 у представителей породы составляют 0,400 к 0,600 для аллелей bPit-1-HinFIA и bPit-1-HinFIB соответственно. В тоже время для белоголовой породы это соотношение практически 1: 1 (0,49 : 0,520). Данные других авторов о частотах этих аллелей у мясных пород отсутствуют.

По данным, полученным при исследовании голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота молочного направления частота аллеля bPit-1-HinFIA меньше. При этом авторами показано, что у коров обеих пород наблюдается тенденция к повышению удоя, жирномолочности и белковомолочности в группах с генотипами bPit-1-HinFIBB по сравнению с группами коров с генотипами bPit-1-HinFIAB и bPit-1-HinFIAA [28-29].

Анализ данных таблицы 3 показывает, что у обеих пород редким является аллель bGH-AluIV . Его частота у представителей аулиекольской и белоголовой составляет 0,360 и 0,180 соответственно. Следует отметить, что в популяциях голштинского скота это соотношение варьирует для аллеля bGH-AluIV от 0,07 и 0,25[6,16-17].

Таким образом, можно отметить, что у ауликольской породы частота этого аллеля выше частоты, отмечаемой другими авторами.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Необходимость повышения эффективности мясного скотоводства и ускорения темпов селекции приводит к поиску эффективных, научно обоснованных способов раннего прогнозирования продуктивности сельскохозяйственных животных. Использование ДНК-маркеров позволяет оценить генетический потенциал продуктивности на ранних этапах постнатального развития.

Представлены результаты оценки частот аллельных вариантов генов bPit-1, bGH и bGHR у двух пород крупного рогатого скота мясного направления: аумекольской и белоголовой.

Установлены генотипы животных по трем полиморфным генам соматотропинового каскада bPit-1, bGH, bGHR . В выборках обеих пород выявлены полиморфные варианты г bPit-1- HinFIA и bPit-1-HinFIB, bGH-AluIV и bGH-AluIL,bGHR-SsplY и bGHR-SsplF.Характер распределения частот аллелей соответствуют данным других авторов, полученным на других породах.

Исследование ассоциации полиморфных вариантов генов bPit-1, bGH и bGHR с признаками мясной продуктивности рекомендовано для популяций аумекольской и белоголового скота.

Полученные в результате дальнейших исследований данные могут позволить значительно ускорить селекцию и выведение высокопродуктивных пород животных, а также исключить на ранних этапах особей, имеющих генетическую предрасположенность к низкой мясной продуктивности.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Parmentier, I. Candidate gene markers associated with somatotropic axis and milk selection/ I. Parmentier//Domest.Anim.Endocrinol/ - 1999. - Vol. 17. № 2 - 3 / - P/139 - 148.

2 Hines, H. Genetic markers for quantitative trait loci in diary cattle / H. Hines // Proc. 4th World Cong. Appl. Livest. Prod. - 1990. - Vol.13. - P.121 - 124.

3 Schernhammer ES, Холли JM, Хантер DJ, Поллак М.Н., Hankinson SE. Инсулиноподобный фактор роста-I, его связывания белков (IGFBP-1 и IGFBP-3), а гормон роста и риска рака молочной железы на здоровье медсестры Study II. Рак Endocr Relat. 2006; 13:5583-592.

4 Futstenberger G, Senn HJ. Инслиноподобный фактор роста и рака. LancetOncol. 2002; 3:298-302.

5 Thomsen, H. The choice of phenotypes for use of marker assisted selection in dairy cattle / H. Thomsen // 8th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, August 13 - 18. - 2006 / Belo Horizonte M. G. Brasil. - 2006 Vo. 34. - P. 181.

6 Growth hormone gene polymorphism and its association with lactation yield in dairy cattle / R.S. Pawar [et al.] // Indian Journal of Animal Sciences. - 2007. - Vol. 11. - № 9. - P. 884 - 888.

7 Effect of polymorphisms of growth hormone(GH), Pit -1, and Leptin (LEP) genes, cow's age, lactation stage and somatic cell count on milk yield and composition of Polish Black - and - White cows / L. Zwierzchowski [et al.] // Anim. Sci. Pap. Rep. - 2002. - Vol. 20. - №4. - P. 213 - 227.

8 Boichard, D. Implemenntation of marker - assisted selection: practical lessons from dairy cattle / D. Boichard [et al.] // 8th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, August 13 - 18. - 2006 / Belo Horizonte M. G. Brasil, 2006. - Vol. 34. - P. 186.

9 Белая Е. В. Генотипирование полиморфных вариантов гена гормона роста, ассоциированного с молочной продуктивностью и ДНК- диагностика мутации BLAD в белорусской популяции KPC / Е.В. Белая, М.Е, Михайлова, Н.М. Волчок, Н.А. Камыш // Фактори експеиментфльної еволюцїї органїзмїв :зб. наук. Пр. / Укр.т-во генетиків і селекціонерів ім. М.I.Вавилов; ред. Кол. I.P. Бариляк [та інш.]. - К.: Логос, 2008. - Т. 4. - С. 133 - 138.

10 Михайлова М.Е. Связь HinFI и StuI полиморфных вариантов гена гипофизарного фактора роста-1 (bPit-1) с признаками молочной продуктивности у коров голштинской породы / М.Е. Михайлова, Е.В. Белая, Н.М. Волчок // Материалы Международной научно-практической конференции «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (к 45-летию основания Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси). - Минск 25 - 29 октября 2010 г. / редколл. А.В. Кильчевский [идр.]. - Минск, 2010. - С. 109.

11 Rapid communiacation : HinfI polymorphism at the bovine Pit1 locus / J. Wollard [et al.] // J. Anim. Sci. - 1994. -Vol.72. - №12. - P. 3267.

12 Pit - 1 gene polymorphism, milk yield, and conformation traits for Italian Holstein - Friesian bulls / R. Renaville [et al.] // J.Dairy Science. - 1997. - Vol. 80. - №12. - P. 3431 - 3438.

13 Partial genomic structure of the bovine Pit - 1 gene and characterization of a HinfI transition polymorohis in exon 6 / B. Dierkes [et al.] // Anim. Genet. - 1998. -Vol. 29. - №5. - P. 405 - 407.

14 Ge, W. Two SSCP alleles detected in the 5? - flanking region of bovine IGF I gene / W.Ge. , M. E. Davis, H. C. Hines // Anim. Genet. - 1997. - Vol. 28. - № 2. - P. 155.

15 Receptor binding and growth - promoting activity of insulin - like growth factor - I in a bovine mammary epithelial cell line (MAC -T3) / X. Zhao [et al.] // J. Endocrinol. - 1992. - Vol. 134. - №2. - P. 307 - 312.

16 Jiang, H. L. Variants of the 5? - untranslated region of the bovine growth hormone receptor mRNA: isolation, expression and effects on translational efficiency / H. L. Jiang, M.C. Lucy // Gene. - 2001. - Vol. 265. - № 1 - 2. - P. 45 - 53.

17 Jiang, H. Isolation and characterization of a novel promoter for the bovine growth hormone receptor gene / H. Jiang, C.S. Okamura, M.C. Lucy // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - № 12. - P. 7893 - 7900.

18 Association between gene polymorphism of growth hormone and carcass traits in dairy bulls / R. Grochowska [et al.] // Animal Science. - 2001. - Vol. 72. - № 3. - P. 441 - 447.

19 Maj, A. Molecular evolution of coding and non - coding sequences of the growth hormone receptor (GHR) gene in the family bovidae / A. Maj, L. Zwierzchowski // Folia Biol. (Krakow). - 2006b. - Vol. 54. - № 1 - 2. - P. 31- 36.

20 Markers within the regulatory region of the growth hormone receptor gene and their association with milk - related traits in Holstein / S. E. Aggrey [et al.] // J. Hered. - 1999. - Vol. 90. - № 1. - P. 148 - 151.

21 Single nucleotide polymorphism SNP in the 50 - noncoding region of the bovine growth hormone receptor gene and its association with dairy production traits in Polish Black - and - White cattle / A. Maj [et al.] // Czech Journal of Animal Science. - 2004. - Vol.49. - № 10. P. 419 - 429.

22 Association of the polymorphism in the 5? - noncoding region of the bovine growth hormone receptor gene with meat productin traits in polish black - and - white cattle / A. Maj [et al.] // Meat Sci. - 2006. - Vol. 72. -№ 3. - P. 539 - 544.

23 Polymorphism in the 5? - noncoding region of the bovine growth hormone receptor gene and its association with meat production traits in cattle / A. Maj [et al.] // Anim. Res. - 2004. - Vol. 53. - № 6. -P. 503 - 514.

24 Association of single nucleotide polymorphisms in the growth hormone and growth hormone receptor genes with blood serum insulin - like growth factor I concentration and growth traits in Angus cattle / W. Ge [et al.] // J. Anim. Sci. - 2003. - Vol. 81. 0 № 3. - P. 641 - 648.

25 Molecular Dissection of a Quantitative Trait Locus. A phenylalanine - to - tyrosine substitution in the transmembrane domain of the bovine growth hormone receptor is associated with a major effect on milk yield and composition // S. Blott [et al.] // Genetics. - 2003. - Vol.163. - № 1. - P. 253-266.

26 Fontanesi, L. Investigation of allele frequencies of the growth hormone receptor (GHR) F279Y mutation in dairy and dual purpose cattle breeds / L. Fontanesi [et al.] // Ital. J. Anim. Sci. -2007. - Vol. 6. - P.415 - 420.

27 Variants of somatotropin in cattle : gene trequencies in major dairy breeds and associated milk production / M. C. Lucy [et al.] // Domest. Anim. Endocrinol. - 1993. - № 10. - P. 325.

28 Белая Е. В. Внутрипородный анализ генетической структуры популяций крупного рогатого скота черно-пестрой породы белорусского разведения по полиморфным вариантам генов соматотропинового каскада / Е.В. Белая, М.Е. Михайлова, Н.М. Волчок, Н.И. Тиханович // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. Тр. - 2010. - Т. 11. - С.92 - 98.

29 Белая Е.В. Сравнительный анализ генетической структуры белорусских популяций крупного рогатого скота черно-пестрой и голштинской пород по полиморфным вариантам генов соматотропинового каскада (bPit-1, bPRL, bGH, bGHR и bIGF-1) / Е. В. Белая, М.Е, Михайлова, Н.М. Волчок // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2011. - Т. 12 - С. 108 - 114.

30 Михайлова М.Е. влияние HinFI-полиморфизма гена гипофизарного фактора роста bPit-1 на признаки молочной продуктивности крупного рогатого скота голштинской и черно-пестрой пород / М.Е. Михайлова, Е.В. Белая // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч.тр. - 2010. -Т. 11. - С. 120 - 126.

31 Михайлова М.Е. Полиморфные варианты генов соматотропинового каскада bPit-1 и bPRL для ДНК-типирования признаков молочной продуктивности крупного рогатого скота голштинской породы / М.Е, Михайлова, Е.В. Белая // Весцi Нацыянальнай акадэмii навук. Серыя Бiялагiчных навук. -2011. - № 2. - С. 49 - 53.

32 Белая Е.В. Оценка индивидуальнного фенотипического эффекта полиморфных вариантов генов гипофизарного фактора роста-1 (bPit-1) и инсулиноподобного фактора роста-1 (bIGF-1) на признаки молочной продуктивности у черно-пестрого голштинизированного крупного рогатого скота / Е.В. Белая, М.Е. Михайлова, Н.В. Батин // Молекулярная и прикладная генетика: сб.науч.тр. - 2012. - Т.13. -С. 30 - 35.

33 Хатами С.Р. ДНК - полиморфизм генов пролактина и гормона роста у ярославской и черно-пестрой пород крупного рогатого скота: автореферат. дис. канд.биол.наук:03.00.15/С.Р.Хатами; Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН- Москва, 2004- 96с.

34 Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинноков. - М.: Просвещение, 1987. - 816с.



УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ИФР-1 - инсулиноподобный фактор роста -1

ИФР-2 - инсулиноподобный фактор роста-2

КРС - крупный рогатый скот

СТГ - соматотропин

bGH - ген гормона роста

bPRL - ген пролактина

bGHR - ген рецептора гормона роста

bPit-1 - ген гипофизарного гормона роста

bGH-AluI - полиморфный вариант гена гормона роста

bGHR-Sspl - полиморфный вариант гена рецептора гормона роста

RFLP-Nsil - полиморфный вариант гена рецептора гормона роста

bPit-1-HinFI - полиморфный вариант гена гипофизарного фактора роста-1

MAS - маркер ассоциированная селекция

Размещено на Allbest.ru