Исследования L-форм бактерий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВВЕДЕНИЕ

L_формы бактерий характеризуются высокой устойчивостью к L_трансформирующему фактору, размножаются делением, почкованием и образованием элементарных телец, обладающих способностью к репродукции.. L_формы многих видов патогенных бактерий в процессе трансформации сохраняют вирулентность. Они часто выделяются при различных патологических процессах.

Бактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, существуют и в природе: это микоплазмы. Микоплазмы могут существовать как сапрофиты в естественных условиях, а также вызывать заболевания у человека (например, возбудители плевропневмонии) и у растений.



ГЛАВА 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1.1 Бактерии

1.1.1 Понятие Бактерия. История изучения бактерий

Бактерии, микроскопические, обычно одноклеточные организмы, для которых характерно отсутствие оформленного ядра. Распространены повсеместно: в почве, воде, воздухе, внутри и на поверхности тел живых и мёртвых организмов. Форма бактерий различна: палочковидная (бациллы), шаровидная (кокки), извитая (вибрионы), спиралевидная (спирохеты) и др. Бациллы могут соединяться в цепочки (возбудители дифтерии, брюшного тифа, туберкулёза). Кокки также могут иметь вид цепочек (стрептококки) или гроздьев (стафилококки). Имеются виды, состоящие из двух клеток (гонококки), многоклеточные (трихобактерии, серо-, железобактерии)[1].

Впервые бактерии увидел в оптический микроскоп и описал в 1676 году голландский натуралист Антони ван Левенгук. Как и всех микроскопических существ, он назвал их «анималькули».

Название «бактерии» ввёл в употребление в 1828 году Христиан Эренберг.

В 1850-х годах Луи Пастер положил начало изучению физиологии и метаболизма бактерий, а также открыл их болезнетворные свойства.

Дальнейшее развитие медицинская микробиология получила в трудах Роберта Коха, которым были сформулированы общие принципы определения возбудителя болезни (постулаты Коха). В 1905 году он был удостоен Нобелевской премии за исследования туберкулёза. Основы общей микробиологии и изучения роли бактерий в природе заложили М. В. Бейеринк и С. Н. Виноградский.

Изучение строения бактериальной клетки началось с изобретением электронного микроскопа в 1930-е. В 1937 году Э. Чаттон предложил делить все организмы по типу клеточного строения на прокариот и эукариот, и в 1961 году Стейниер и Ван Ниль окончательно оформили это разделение. Развитие молекулярной биологии привело к открытию в 1977 году К. Вёзе коренных различий и среди самих прокариот: между бактериями и археями.

1.1.2 Строение, размножение и генетика бактерий

В строении бактерий выделяют три обязательных клеточных элемента: цитоплазматическую мембрану, нуклеотид, рибосомы. Почти все бактерии имеют внешнюю оболочку - клеточную стенку, благодаря которой форма бактерий постоянна. Эта клеточная оболочка выполняет основные механические и физиологические функции. Клеточная стенка-- важный структурный элемент бактериальной клетки, однако необязательный. Искусственным путём были получены формы с частично или полностью отсутствующей клеточной стенкой (L-формы), которые могли существовать в благоприятных условиях, однако иногда утрачивали способность к делению. Известна также группа природных не содержащих клеточной стенки бактерий -- микоплазм (рис. 1).

Рисунок 1 - Строение бактериальной клетки

Ее главный структурный элемент - биополимер муреин. Микробиологи делят все виды бактерий на грамположительные, грамотрицательные и бактерии без клеточной стенки (микоплазмы), так как в связи с особенностями строения клеточной стенки бактерии по-разному реагируют на окрашивание способом Х. Грама. У грамположительных бактерий стенка утолщена и содержит большее количество муреина, тогда как у грамотрицательных видов клеточная стенка тонкая, а снаружи имеется мембрана, включающая белки, фосфолипиды, липополисахариды. Главная функция внешней мембраны - транспортная. Многие бактерии имеют на своей поверхности ворсинки либо жгутики, обеспечивающие передвижение организма. Некоторые бактерии покрыты снаружи слизистыми капсулами, состоящими из полисахаридов (в некоторых случаях полипептидов или гликопротеинов).

От клеточной стенки цитоплазму бактерий отделяет цитоплазматическая мембрана. Ее основная функция - создание осмотического барьера в клетке, регуляция транспорта веществ. Такие важные для жизнедеятельности организма процессы, как дыхание, хемосинтез, фиксация азота и др., происходят в мембране. Часто формируются выпячивания цитоплазматической мембраны - мезосомы. В мембране осуществляется биосинтез клеточной стенки, а также спорообразование. Жгутики и геномная ДНК тесно связаны с данным структурным элементом клетки бактерии.

От клеточной стенки цитоплазму бактерий отделяет цитоплазматическая мембрана. Ее основная функция - создание осмотического барьера в клетке, регуляция транспорта веществ. Такие важные для жизнедеятельности организма процессы, как дыхание, хемосинтез, фиксация азота и др., происходят в мембране. Часто формируются выпячивания цитоплазматической мембраны - мезосомы. В мембране осуществляется биосинтез клеточной стенки, а также спорообразование. Жгутики и геномная ДНК тесно связаны с данным структурным элементом клетки бактерии.

В целом клетка бактерии устроена достаточно просто. Главное отличие прокариот (бактериальной клетки) от эукарит - это отсутствие ядерной мембраны и других внутрицитоплазматических мембран, которые не являются производными цитоплазматической мембраны. Вся генетическая информация об организме бактерии, необходимая для ее жизнедеятельности, заключена в одной ДНК, которая присутствует в клетке в виде замкнутого кольца. Она называется нуклеотид. Хромосома обычно в бактериальной клетке имеется в единственном экземпляре, но иногда может содержаться несколько ее копий.

В цитоплазме находятся включения в виде разнообразных везикул (пузырьков), которые образованы в процессе впячивания цитоплазматической мембраны. У фототрофных, нитрифицирующих бактерий имеется обширная сеть цитоплазматических мембран, представленная сливающимися пузырьками, как граны хлоропластов у эукариот. У тех бактерий, которые живут в водной среде, есть газовые вакуоли (аэросомы), функция которых заключается в регуляции плотности. Также в цитоплазме имеются включения запасных питательных веществ: полифосфатов, полисахаридов, соединений серы, т.д. Основным элементом бактериальной клетки являются рибосомы, расположенные в цитоплазме клетки. У цианобактерий имеются видоизмененные рибосомы - карбоксисомы, представляющие собой тельца, содержащие фермент, с помощью которого происходит фиксация СО2. У некоторых видов спорообразующих бактерий в параспоральных тельцах образуется токсин, вызывающий гибель личинок насекомых[2].

Размножение и генетика.

Бактерии размножаются бесполым путем: ДНК в их клетке реплицируется (удваивается), клетка делится надвое, и каждая дочерняя клетка получает по одной копии родительской ДНК. Бактериальная ДНК может передаваться и между неделящимися клетками. При этом их слияния (как у эукариот) не происходит, число особей не увеличивается, и обычно в другую клетку переносится лишь небольшая часть генома (полного набора генов), в отличие от «настоящего» полового процесса, при котором потомок получает по полному комплекту генов от каждого родителя.

Такой перенос ДНК может осуществляться тремя путями. При трансформации бактерия поглощает из окружающей среды «голую» ДНК, попавшую туда при разрушении других бактерий или сознательно «подсунутую» экспериментатором. Процесс называется трансформацией, поскольку на ранних стадиях его изучения основное внимание уделялось превращению (трансформации) таким путем безвредных организмов в вирулентные. Фрагменты ДНК могут также переноситься от бактерии к бактерии особымивирусами - бактериофагами. Это называется трансдукцией. Известен также процесс, напоминающий оплодотворение и называемый конъюгацией: бактерии соединяются друг с другом временными трубчатыми выростами (копуляционными фимбриями), через которые ДНК переходит из «мужской» клетки в «женскую».

Иногда в бактерии присутствуют очень мелкие добавочные хромосомы - плазмиды, которые также могут переноситься от особи к особи. Если при этом плазмиды содержат гены, обусловливающие резистентность к антибиотикам, говорят об инфекционной резистентности. Она важна с медицинской точки зрения, поскольку может распространяться между различными видами и даже родами бактерий, в результате чего вся бактериальная флора, скажем кишечника, становится устойчивой к действию определенных лекарственных препаратов[3].

1.1.3 Метаболизм, питание и дыхание бактерий

Отчасти в силу мелких размеров бактерий интенсивность их метаболизма гораздо выше, чем у эукариот. При самых благоприятных условиях некоторые бактерии могут удваивать свою общую массу и численность примерно каждые 20 мин. Это объясняется тем, что ряд их важнейших ферментных систем функционирует с очень высокой скоростью. Так, кролику для синтеза белковой молекулы требуются считанные минуты, а бактерии - секунды. Однако в естественной среде, например в почве, большинство бактерий находится «на голодном пайке», поэтому если их клетки и делятся, то не каждые 20 мин, а раз в несколько дней.

Питание бактерий.

Бактерии бывают автотрофами и гетеротрофами. Автотрофы («сами себя питающие») не нуждаются в веществах, произведенных другими организмами. В качестве главного или единственного источника углерода они используют его диоксид (CO₂). Включая CO₂ и другие неорганические вещества, в частности аммиак (NH₃), нитраты (NO-₃) и различные соединения серы, в сложные химические реакции, они синтезируют все необходимые им биохимические продукты.

Гетеротрофы («питающиеся другим») используют в качестве основного источника углерода (некоторым видам нужен и CO₂) органические (углеродсодержащие) вещества, синтезированные другими организмами, в частности сахара. Окисляясь, эти соединения поставляют энергию и молекулы, необходимые для роста и жизнедеятельности клеток. В этом смысле гетеротрофные бактерии, к которым относится подавляющее большинство прокариот, сходны с человеком.

Дыхание.

Клеточное дыхание - процесс высвобождения химической энергии, запасенной в «пищевых» молекулах, для ее дальнейшего использования в жизненно необходимых реакциях. Дыхание может быть аэробным и анаэробным. В первом случае для него необходим кислород. Он нужен для работы т.н. электронотранспортной системы: электроны переходят от одной молекулы к другой (при этом выделяется энергия) и в конечном итоге присоединяются к кислороду вместе с ионами водорода - образуется вода.

Анаэробным организмам кислород не нужен, а для некоторых видов этой группы он даже ядовит. Высвобождающиеся в ходе дыхания электроны присоединяются к другим неорганическим акцепторам, например нитрату, сульфату или карбонату, или (при одной из форм такого дыхания - брожении) к определенной органической молекуле, в частности к глюкозе[3].

1.2 L-трансформация бактерий

1.2.1 История открытия L-трансформация бактерий

L-формы -- бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. Впервые обнаружены в 1894-1896 гг. микробиолог и эпидемиолог В.Ф.Гамалея описал превращение на средах с хлористым литием холерного вибриона, дифтерийных и тифозных бактерий в огромные шары, спириллы и длинные нити, названные им гетероморфными.

В 1916 г. зоолог и микробиолог G.Enderlein, просматривая в темнопольном микроскопе кровь практически здоровых людей, выявил в ней палочковидные бактерии, водоросли и грибы Mucor racemosus, Aspergillius niger и Penicillinum. Выделенные из крови бактерии теряли клеточную стенку, грибы изменяли морфологическую структуру. В статье, опубликованной в журнале «Friends of Natural Research», G.Enderlein писал, что кровь не стерильна и служит «игровой площадкой» для патогенных и непатогенных микроорганизмов.

В 1935 г. немецкий микробиолог E.Klieneberger-Nobel, работая с культурой Streptobacillus moniliformis, выделила варианты, растущие мелкими колониями из нитевидных, шаровидных, волокнистых и колбасовидных образований, среди которых были субмикроскопические фильтрующиеся структуры размером 0,2-0,5 мкм. Все морфотипы не росли на стандартных питательных средах, главное, полностью или частично утрачивали клеточную стенку. Буква L -- первая буква названия Листеровского института в Лондоне, где впервые Эмми Кляйнебергер-Нобель обратила внимание на развитие морфологически весьма необычных клеток в культуре бактерий Streptobacillus moniliformis, выделенной из жидкости уха крысы.Спустя год R.Pfeiffer заметил отсутствие у них клеточной стенки, a A.Bechamp в клетках крови обнаружил неидентифицированные крошечные гранулы. Изучение L-трансформации сразу же превратилось в самостоятельный раздел микробиологии, ее признали универсальным способом адаптации бактерий к неадекватной среде обитания. При благоприятных условиях L-формы могут реверсировать в классические бактерии с восстановлением основных биологических свойств, включая патогенность. В случае необратимого нарушения генетического контроля за синтезом клеточной стенки по своим морфологическим, культуральным и иным признакам они неотличимы от микоплазм. По мере усовершенствования методов окраски и культивирования бактерий, применения электронной и флуоресцентной микроскопии, иммуно- гистохимических, молекулярно-генетических и других методов, L-формы были выделены из природной среды и любого клинического, биоптического и других материалов.

Многочисленные авторы именовали L-формы «микоплазмами», «плотными телами», «атипичными бактериями», «плеоморфными бактериями», «нанобактериямии» и пр. Особый ажиотаж среди специалистов разных направлений, включая космобиологов, вызвали нанобактерии. Эти округлые либо овальные структуры размером 0,2- 0,3 мкм были обнаружены геологом из Техасского университета R.L.Folk при исследовании минералов скальных пород и вулканического туфа и принявшего их за клетки неизвестных бактерий. Еще до окончательного выяснения их природы появились публикации о циркуляции в крови человека и животных, им даже отводилась роль в этиологии и патогенезе ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, разных форм рака, образовании камней в почках и желчном пузыре, старении и т.д. Сейчас установлено, что «нанобактерии» не содержат ни ДНК, ни белка, а являются аморфными наночастицами из кристаллов апатита, широко распространенных в окружающей среде, из которой попадают в макроорганизм, где связываются с белками, способными соединятся с кальцием и апатитом, и увеличиваются в размерах. Несмотря на это, некоторые авторы упорно считают их живыми. Все старые и новые названия L-форм создавали среди исследователей путаницу, споры и непонимание, поэтому G.J.Domingue и Н.В.Woody предложили новый термин: CWDB (cell wall- deficient/defective bacteria bacteria - бактерии с отсутствующей/дефектной клеточной стенкой), что наиболее полно соответствует морфологическим, серологическим и биохимическим свойствам. Предложение было принято большинством микробиологов, и L.Mattman под этим термином объединила понятия «L-формы», «L-стадии», «сферопласты» и «протопласты». Но правомочность привычного названия «L-формы» сохранена [5].

1.2.2 Факторы трансформации

L-формы образуются в результате несбалансированного роста нормальных бактериальных клеток в длину и в толщину и поэтому полиморфны. В культурах L-форм обнаруживаются шаровидные, нитевидные или вовсе бесструктурные клетки размером от 0,2 до 50 мкм. Они спокойно проходят через бактериальные фильтры и легко разрушаются при механических воздействиях. В отличие от нормальных клеток L-формы часто содержат крупные вакуоли. Их метаболическая активность очень низкая. Клеточное деление происходит нестандартно, за счёт образования элементарных тел путём отпочкования от поверхности клетки или от мембраны вакуоли.

Факторами L-трансформации могут быть многие вещества, было показано, что L-формы возникают спонтанно или индуцировано - под воздействием агентов, блокирующих синтез клеточной стенки универсальными L-трансформирующими агентами являются бензилпенициллин, его полусинтетические аналоги (мети-, окса-, ам- пи-, карбенициллин) и цефалоспорины. L-трансформацию вызывают также D-циклосерин, бадитрацин, ванкомицин, ристомицин, избирательно -- стрептомицин, тетрациклины, некоторые аминокислоты (фенилаланин, глицин, аргинин), лизоцим. Образование L-форм бактерий возможно под влиянием рентгеновских и ультрафиолетовых лучей, магнитных и электромагнитных полей.

L-трансформация описана почти у всех патогенных видов бактерий. Она встречается также у дрожжей и дрожжеподобных организмов. Чаще наблюдается у грамотрицательных видов (с наибольшей частотой у сальмонелл), реже - у грамположительных. Способность к L-трансформации определяется штаммовыми и даже популяционными различиями. Более высокая степень L-трансформации отмечается у бактерий, выделенных от больных. По мере пассирования на искусственных питательных средах она снижается.

1.2.3 Биологические свойства L-трансформантов

В зависимости от степени утраты клеточной стенки L-формы бактерий подразделяются на солезависимые и соленезависимые. В большинстве случаев при L-трансформации сохраняется видовая специфичность, но резко изменяются биохимические свойства, физиологическая активность и снижается вирулентность. Вместе с тем авирулентные L-формы бактерий потенциально опасны, так как, длительно сохраняясь в организме, способны реверсировать в вирулентные бактерии исходного вида.

1.2.4 Характеристика микроструктурных элементов

Различают несколько L-форм бактерий:

1) крупные сферические тела (1-50 мкм);

2) элементарные тельца, или гранулы (0,6-0,7 мкм), располагающиеся внутри и вне сферических тел;

3) бесструктурные массы, меняющие конфигурацию и размеры;

4) извитые и нитевидные структуры, варьирующие в размерах (от едва видимых до 150 мкм);

5) фильтрующиеся элементы.

Микроструктурные элементы размножаются бинарно, у L-форм бактерий утрачиваются мезосомы и, по сравнению с родительскими видами, снижается количество нуклеотидов и увеличивается содержание липидов. Многие L-варианты продуцируют эндотоксины и экзотоксины и даже приобретают ряд признаков патогенности, которых не было у родительских клеток.

1.2.5 Колонии

L-формы бактерий образуют два вида колоний. Одни из них мелкие, диаметром 50-100 мкм, нежные, белесые с перламутровым оттенком (тип А), другие - крупные, 0,5--2 мм в диаметре, с нежным кружевным краем и врастающим центром, при длительном хранении приобретают желто-коричневую окраску (тип В).

Микроструктурные элементы колоний типа А (стабильные L-формы) генетический контроль синтеза клеточной стенки нарушен необратимо (полностью лишены клеточной оболочки и поэтому не агглютинируются специфической сывороткой и не лизируются фагом), и по своим морфологическим, культуральным и иным свойствам становятся неотличимы от микоплазм. Они крайне редко возвращаются в исходные бактериальные формы и существуют без изменений в различных условиях среды.

Элементы колоний типа В (нестабильные L-формы) имеют полноценную систему генетического контроля синтеза клеточной стенки и способны превращаться в нормальные бактериальные клетки после исключения действия фактора, вызвавшего их образование. При этом происходит восстановление всех основных биологических свойств такой клетки, включая патогенность.

Переход в L-форму можно рассматривать как способ переживания бактериями неблагоприятных условий, особенно в случаях патогенных микроорганизмов.



1.2.6 Общие свойства L-форм

Все L-формы независимо от вида бактерий, из которого они возникли, обладают общими особенностями:

1. Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.

2. Сходные культуральные свойства: анаэробные или микроаэрофильные условия роста, потребность в холестерине и сывороточном белке, рост на плотных средах в виде колоний двух типов А и В.

3. Постепенное (по мере нарушения синтеза клеточной стенки) превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры.

4. Образование стабильных и нестабильных L-форм (в зависимости от степени полноты утраты способности синтезировать клеточную стенку.)

5. Изменение антигенных свойств (утрата К- и О-антигенов, как следствие нарушения синтеза клеточной стенки).

6. Снижение вирулентности по сравнению с исходными родительскими формами в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии,эндотоксина и т.п)

7. Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

Способности при неполной утрате синтеза клеточной стенки возвращаться в исходную бактериальную форму.

1.3 Микоплазмы

1.3.1 Понятие микоплазма

Микоплазмы - это очень мелкие прокариотические организмы, полностью лишенные клеточных стенок. Микоплазмы, как правило, неподвижны, однако некоторые виды обладают способностью к скользящему движению по поверхностям, покрытым жидкостью. Клетки других видов, имеющие форму спиральных нитей, обнаруживают подвижность вращательного, изгибательного и поступательного типов. Покоящиеся стадии неизвестны.

Отсутствие клеточной стенки обусловливает еще одну отличительную особенность микоплазм - их нечувствительность к антибиотикам, специфически действующим на бактериальную стенку (пенициллину, ампициллину, цефалоспорину и др.). Микоплазмы представляют собой группу, чрезвычайно разнообразную с точки зрения физиолого-биохимических особенностей.

Они могут расти:

* на искусственных бесклеточных средах разной степени сложности (от простых минеральных до сложных органических).

Большинство видов нуждается для роста; *только внутри организма-хозяина, (откуда их можно выделить, с использованием культуры клеток, стерины и жирные кислоты). Разнообразны также способы получения энергии у микоплазм. Среди них описаны виды, получающие энергию за счет окисления или сбраживания органических соединений, а также за счет окисления неорганических соединений (железа, марганца). Описаны микоплазмы, являющиеся строгими аэробами, хотя большинство из них - факультативные анаэробы. Некоторые микоплазмы - облигатные анаэробы, погибающие в присутствии минимального количества минерального кислорода. Микоплазмы могут быть сапрофитными, паразитическими и патогенными. Патогенные вызывают заболевания человека, животных (в том числе насекомых) и растений[4].

1.3.2 Биологические свойства микоплазм

Патогенные виды микоплазм сходны со стабильными L-вариантами бактерий. Клетки ограничены только цитоплазматической мембраной и не способны к синтезу пептидогликана и его предшественников. В связи с этим для них характерен ярко выраженный плеоморфизм. В культуре одного вида можно одновременно обнаружить кокковидные, эллипсовидные, дискообразные, палочковидные, грушевидные клетки, а также нитевидные формы. Нити могут ветвиться, образуя структуры, подобные мицелиальным. Величина мельчайших зерен (элементарных телец), из которых начинается рост микоплазм, составляет 100-150 нм, у крупных сферических образований - достигает 700-800 нм, а у нитевидных микроструктур - еще больших размеров. Размножаются различными способами: бинарным делением; 388 фрагментацией крупных тел и нитей, сопровождающейся освобождением большого числа кокковидных форм; почкованием. Репликация генома предшествует, но не обязательно синхронизована с клеточным делением[4].

1.3.3 Факторы патогенности микоплазм

Возбудителей микоплазменных инфекций подразделяют на патогенные (М. рneumoniae), вызывающие экспериментальную инфекцию у морских свинок» хлопковых крыс и хомяков» и условно- патогенные (М. hominis, М. fermentans и U. urealyticum). Вирулентность микоплазм обусловлена наличием у них экзо- и эндотоксинов, адгезинов, гемолизинов, уреазы, аргининдезаминазы, лактат дегидрогеназы и нейраминидазы, обусловливающих адсорбционную способность микоплазм с последующей инвазией мембранных компонентов микоплазм внутрь клеток хозяина, что приводит к их деструкции, развитию иммунопатологических процессов.. Например, аргининдегидролаза разрушает необходимую для нормальной жизнедеятельности клеток аминокислоту аргинин. Нейраминидаза вызывает изменения рецепторного аппарата клеточных мембран эритроцитов, респираторного 389 эпителия и т. д. Пероксид водорода вызывает повреждения мерцательного эпителия трахеии бронхов человека и животных. Первая фаза микоплазменной инфекции основана на способности микоплазм адсорбироваться на клетках хозяина. Это обусловлено общностью рецепторных участков на мембранах разных видов микоплазм и разных типов клеток макроорганизмов. Разные виды микоплазм адсорбируются на эритроцитах, макрофагах, мембранных структурах реснитчатого эпителия трахеи и бронхов человека. Проникновение микоплазм в клетки происходит редко, т. е. они действуют с поверхности клетки. Конечный эффект взаимодействия микоплазм и клеток организма может выражаться в развитии либо острой инфекции, сопровождающейся видимым изменением, разрушением поражаемых клеток, либо скрытой ее форме - изменяются метаболизм и функции поражаемых клеток, нарушается нормальное клеточное деление, вызываются хромосомные изменения.

Основными факторами патогенности фитопатогенных микоплазм являются токсины, пероксид водорода, аммиак, ферменты (нуклеазы, про- теазы, уреаза и т. д.). Также одним из факторов патогенности принято считать их конкуренцию с клеткой-хозяином за отдельные субстраты энергетического и белкового обменов (углеводы, аминокислоты и т. д.). Так, для большинства аргининусваивающих микоплазм в качестве основного фактора патогенности является их способность усваивать аргинин. Микрокапсулы и поверхностные антигены микоплазм, имеющие групповые антигены с тканевыми, позволяют им длительное время персистировать в организме[4].

1.3.4 Ферменты микоплазм

Патогенные микоплазмы обладают различной биохимической активностью. М. pneumoniae и М.fermentans расщепляют с образованием кислоты глюкозу, фруктозу, маннозу, мальтозу, крахмал и гликоген, остальные виды микоплазм углеводы не разлагают. М.hominis вызывает гидролиз аргинина, a U.urealyticum расщепляет мочевину.

Порядок Mycoplasmatales по своим свойствам является гетерогенной группой бактерий, включающей три семейства: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae и Spiroplasmataceae. Семейство Mycoplasmataceae представлено двумя родами: Mycoplasma и Ureaplasma. Различия между ними состоят в том, что бактерии рода Ureaplasma обладают уреазной активностью. Все представители данного семейства являются хемоорганогетеротрофами, характеризующимися высокими потребностями в питательных веществах (особенно в холестерине или близких стеринах). Энергетический метаболизм ферментативного или окислительного типа. Использование глюкозы происходит по гликолитическому пути. Некоторые из представителей семейства способны передвигаться путем скольжения. Большинство представителей данного семейства является высокоспециализированными паразитами человека. Многие паразитические формы бактерий этого семейства патогенны, например Mycoplasma pneumoniae - возбудитель острых респираторных заболеваний и пневмоний у человека. Бактерии видов Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum - возбудители воспалительных заболеваний мочеполовой системы, таких как уретриты, циститы, пиелонефриты, простатиты, вагиниты и др. Этими видами микоплазм инфицировано 391 не менее 50 % здоровых мужчин и женщин в возрасте 30-50 лет, причем до 30 % женщин - носители одновременно обоих видов микоплазм. В состав семейства Acholeplasmataceae входит один род - Acholeplasma. Ахолеплазмы менее требовательны к составу питательных сред и не нуждаются для роста в холестерине и сыворотке. Не гидролизуют аргинин и мочевину. К ахолеплазмам относятся свободноживущие сапрофитные бактерии и паразиты млекопитающих и птиц; некоторые из них, возможно, патогенны. Наиболее хорошо изучены бактерии вида Acholeplasma laidlawii, относящиеся к сапрофитным микоплазмам. В третье семейство Spiroplasmataceae включены бактерии рода Spiroplasma. Отличительным признаком спироплазм является их своеобразная морфология: в стадии роста среди разнообразных форм преобладают спиралевидные нити. На первых этапах развития спироплазмы нуждаются в холестерине. На более поздних этапах развития у них индуцируется синтез каротиноидов, которые в мембранах спироплазм выполняют те же функции, что и холестерин. Спироплазмы являются внутриклеточными паразитами. Выделены из клещей, гемолимфы и кишечника насекомых, из сосудистой жидкости растений, с поверхности цветковых растений и т. д [4].



ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методы исследования L-форм

Исследования L-форм представляют существенный интерес для медицинской микробиологии, поскольку в этой форме в организме человека и животных могут сохраняться патогенные бактерии. При нерациональном использовании антибиотиков, приводящем к образованию L-форм из бактерий, может наступить улучшение состояния больного. Однако после прекращения приема лечебного препарата наступает превращение L-форм в бактерии исходного вида с восстановлением их вирулентности, что приводит к рецидиву болезни. L-формы можно рассматривать как свойственную всем бактериям форму приспособления к неблагоприятным условиям (подобно спорообразованию), которая способствует сохранению вида в природе.

Клеточная стенка и её синтез чувствительны к действию антител и различных химиопрепаратов. Освобождение от неё не лишает микроорганизм жизнеспособности, но позволяет преживать действие этих неблагоприятных факторов, а после устраниения их воздействия возвращаться в исходное состояние. Бактерии, у которых отсутствует клеточная стенка, существуют и в природе: это микоплазмы. Первым описанным представителем микоплазм явился возбудитель плевропневмонии крупного рогатого скота. Подобные микроорганизмы обнаружены и у других животных - овец, коз, крыс, собак, а также у человека, всем им было дано общее название PPLO (плевропневмониеподобные организмы). Микоплазмы также могут существовать как сапрофиты в естественных условиях, а также вызывать заболевания и у растений.

Способы идентификации.

Известны два способа определения видовой принадлежности L-трансформантов:

1) прямой, основанный на идентификации вида L-форм путем определения специфических антигенов в серологических реакциях, дифференциации белков электрофорезом в агаровом геле и установлении гомологии ДНК у L-вариантов и их бактериальных форм;

2) непрямой, основанный на реверсии родительских признаков после многократных пересевов L-форм бактерий на оптимальных для них питательных средах при исключении из среды фактора L-трансформации, а в некоторых случаях ~ при одновременном воздействии на них УФ-лучей, гидроксиламина, акридина оранжевого и других мутагенов.

Для прямого бактериоскопического и бактериологического обследования отдельных участков организма человека разработан метод, представляющий собой вариант метода отпечатков.

Методика

Забор материала осуществляется с помощью металлического устройства с горизонтальной шляпкой на одном торце или без таковой. Одно устройство используют для взятия материала и последующего микроскопирования на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) LEO 1420 с энергодисперсионным спектрометром, другое устройство с рифленной шляпкой или торцом применяют для взятия и посева материала на твердую питательную среду. В первом случае на шляпку (торец) наклеивают липкую ленту клейкой стороной кверху. Удерживая устройство пинцетом, прикладывают шляпку к интересующему участку тела или ткани и слегка надавливают. Клейкая поверхность ленты захватывает живые и погибшие микроорганизмы и прочно фиксирует их, сохраняя при этом форму, размеры, взаиморасположение и соотношения клеток. После напыления углеродом в вакуумной установке ВУП- 4 для получения тонкого слоя токопроводящего покрытия препарат-отпечаток просматривают в СЭМ. Предварительный просмотр при увеличениях 500010000 и более раз позволяет: а) определить плотность заселения микроорганизмами объекта- носителя; б) по морфотипу клеток высказать предположение об их принадлежности к той или иной систематической группе; в) заранее избрать метод, технику посева, питательную среду и температуру культивирования.

Взятие материала для бактериологического исследования: стерильным устройством рифленной шляпкой прикасаются к поверхности, колонизированной микробиотой, и делают отпечатки на выбранную питательную среду.

Предлагаемая методика удобна тем, что позволяет брать отпечатки для бактериоскопии и посева материала с отдельных участков площадью 2,25-4 мм², локализованных в полости носа, зеве, на миндалинах (в криптах), задней стенке глотки, трахеи, крупных бронхах и других местах.

Эффективность данного метода апробирована при полипозном риносинусите у взрослых больных обоего пола, страдающих бронхиальной астмой. Проведенные посевы материала, ранее взятого у них из полости носа с помощью ватных тампонов, положительных результатов не дали [6].

При изучении жизненных форм листерий в разных средах использовали 48-часовую культуру Listeria innocua в S-форме с типичными культурально-биохимическими свойствам. Взаимодействие листерий с растениями исследовали по авторской методике моделирования проникновения листерий через корневую систему в вегетативные органы с применением метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и оценкой динамики выживаемости бактерий. СЭМ проводили на электронном микроскопе Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении *1-10 тыс. Пищевые продукты в стерильных емкостях контаминировали взвесью листерий (5*108 КОЕ/мл) и оставляли при комнатной температуре на 3 ч, затем помещали в разные температурные условия (18-22 °С на 3 сут, 4 °С на 3 сут, -8 и -18 °С на 10 сут), после чего отбирали пробы для бактериологического анализа и СЭМ[9].



2.2 Культивирование L-форм

Питательные среды

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк -- от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды

1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находящимся на ней материалом погружают в среду. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду.

2. При посеве на скошенный мясо-пептонный агар пробирку берут в левую руку между I и II пальцами, чтобы основание пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из пробирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прикасаясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой производится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынимания пробки пробирку с питательной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха.



Рисунок 2 - Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку

Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой. Схема пересева культуры микробов из пробирки в пробирку (рис. 2).

3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают I и II пальцами, а с другой -- IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют I и III или I и II пальцами. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки (рис. 3). Затем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находящегося на ней материала. Линию посева начинают с того места, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по секторам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микроорганизмов.

Рисунок 3 -- Посев на плотную питательную среду в чашки Петри

Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользоваться вместо петли тампоном или шпателем.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида.

4. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопроводной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1--1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15--20 мл мясо-пептонного агара, расплавленного и остуженного до температуры 40--45°С (при такой температуре пробирка со средой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого материала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола.

5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробирку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней материалом[8].

L-формы культивируют на специальных средах, пригодных для роста бактерий, из которых произошли эти формы. Если происхождение L-форм неизвестно, используют богатый питательными веществами 1--1,5% агар на мясной воде или триптическом переваре бычьего сердца, содержащих 20--25% сыворотки и 10% дрожжевого экстракта. Обычно к средам добавляют пенициллин. Некоторые L-формы сохраняют стабильность и при отсутствии пенициллина. L-формы лучше растут в плотной, чем в жидкой среде. В плотной среде они образуют колонии, врастающие в агар и имеющие характерную форму перевернутой шляпы. Колонии растут медленно, при этом иногда достигая значительных размеров. В качестве дополнительных факторов роста используют дрожжевой гидролизат и печеночные экстракты. В состав питательных сред включают нормальную лошадиную и кроличью сыворотки. Для предохранения L-форм бактерий от осмотического лизиса к средам прибавляют соответствующие концентрации хлорида натрия, ионов магния или сахарозу. Обычно L-трансформация происходит в условиях полутвердых (1,3 % агара) и полужидких сред (0,3 % агара)[7].

2.3 Культивирование микоплазм

Для выращиванйя микоплазм используются синтетические и полусинтетические питательные среды, по составу сходные с теми, на которых растут L-формы бактерий: триптический перевар сердца и мозга, триптикозосоевый бульон с дрожжевым гидролизатом, аминокислотами, азотистыми основаниями, витаминами и лошадиной сывороткой как источником стеринов. Для некоторых из них разработаны методы культивирования на жидких питательных средах. Питательные среды должны обладать высокой осмотической концентрацией. Микоплазмы растут также на живых куриных эмбрионах и на средах, содержащих вместо сыворотки водные экстракты мелко измельченных куриных эмбрионов. Микоплазмы на плотных питательных средах образуют колонии с уплотненным врастающим центром и нежным ажурным краем, по форме и цвету напоминающие яичницу-глазунью (рис. 4).

Рисунок 4 - Вид колонии микоплазм, выросшей на плотной питательной среде

Через 3--5 дней инкубации при 37°С они могут достигать размера 1,5--2 мм, но чаще колонии настолько малы, что их трудно увидеть невооруженным глазом.

Пересевы на жидкие среды производят, вырезая кусочки агара с соответствующей колонией. На стекле и пластике, покрытых слоем питательного бульона, образуются неправильной формы колонии с отходящими от них нитями и побегами. Растут они медленно в течение нескольких дней на средах с нейтральным или слабощелочным значением pH, преимущественно в аэробных условиях. Уреаплазмы культивируются при pH 6,5 и в жидких средах вырастают через 6-8 ч. При этом в жидких и полужидких (1--1,3 % агара) питательных средах микоплазмы вызывают нежное диффузное помутнение. Развиваясь внутриклеточно, они оказывают цитопатическое действие и обладают способностью вызывать реакции гемадсорбции и гемагглютинации.



2.4 Серологическая идентификация микоплазмозов

В диагностике микоплазменных инфекций широко применяют РСК, реже -- РА и РНГА. Разработана высокочувствительная реакция нейтрализации, или ингибирования роста (РИР), основанная на способности антисывороток подавлять рост гомологичных штаммов микоплазм. Результаты РИР учитывают по разнице числа колониеобразующих единиц, выросших на плотных питательных средах, содержащих иммунную и нормальную сыворотки (на жидких - по снижению показателя мутности в пробирке с антимикоплазменной сывороткой). Для ранней диагностики микоплазмозов используют меченные флюорохромами иммунные сыворотки, которыми обрабатывают мазки из носоглоточных и бронхиальных смывов, отделяемого мочеиспускательного канала, влагалища, канала шейки матки.



ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ

3.1 Результаты и обсуждение прямого бактериоскопического и бактериологического обследования

При электронно-микроскопическом просмотре отпечатков установлено, что непосредственно на полипах и слизистой носовых раковин распространены различные типы полиморфных микробных клеток, среди которых преобладали сферические клетки диаметром от 0,15 до 0,5 мкм, соответствующие элементарным телам L-форм бактерий. Кроме них встречались короткие палочки размером 0,2х0,5 мкм с закругленными концами и единичные, не ветвящиеся нитевидные структуры длиною 3,9120 мкм и шириною 0,2-0,4 мкм, не характерные для гифов грибов. Примечательно, что указанные клеточные типы располагались на полипах и слизистой носового хода в виде отдельных элементов или групп.

Одновременно в комочках самой слизи найдены шаровидные клетки диаметром около 1 мкм. Они соприкасались друг с другом и различались способами репродукции. Одни из них образовывали несколько дочерних клеток, другие делились бинарно, на поверхности третьих происходило почкование, а у некоторых наблюдалось даже внутреннее почкование. Вместе с шаровидными клетками в слизи находились как мелкие (0,3x0,15 мкм) палочки, так и элементарные тела, нитевидные структуры здесь отсутствовали. Между тем проведенный анализ привел нас к предположению, что именно эти нити явились одним из этапом процесса L-трансформации и источником для всех остальных L-клеток (рис.5). Показано, как элементарные тела выходят из нитей, формируясь внутри их цитоплазмы, а после этого в местах их выхода на клеточной стенке остаются выраженные дефекты. Другая, несколько укрупненная часть элементарных тел отпочковывается со стороны верхнего полюса нити.



а - общий вид нитевидных структур. Местами частицы пыли и мелкие палочки. Увеличение х 3000; б - сегментация в нижней части нити с почкованием элементарных тел (ЭТ) в верхней части. Увеличение х 9000; в, г - почкование ЭТ в области верхнего полюса. Отдельно расположены мелкие сферические тела. Увеличения 15000 и 10000. д-з. L-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой: д - ЭТ на поверхности нити и начало ее фрагментации. Увеличение x 8000; е - выход ЭТ из нити с повреждением ее структуры. Увеличение x 25000; ж, з - распад нитей, образование конгломератов L-клеток. Увеличения 6000 и 20000

Рисунок. 5 - а-г. L-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой:

Еще больше укрупняясь, элементарные тела объединяются между собою и образуют различной величины гроздевидные конгломераты - на их периферии можно увидеть даже остатки одной или нескольких нитей. Такие конгломераты содержаться в комках слизи, на полипах в носовых раковинах (рис. 6).

а, б - L-формы в комочках слизи. Увеличения 8000 и 10000; в - скопления L-клеток на сли¬зистой полипа. Увеличение х 7000

Рисунок 6 - L-трансформация бактерий в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой:

В свою очередь, нижняя часть нити сегментируется и служит началом мелким палочковидным формам.

Итак, в отличие от техники взятия посевного материала ватными тампонами, не выявившего присутствия микроорганизмов в полости носа при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой, предложенная нами методика оказалась наиболее результативной. С ее помощью установлено, что микросообщество полости носа у таких лиц представляет собою различные L-варианты бактерий. Согласно даным литературы они не растут на обычных твердых и жидких средах - состав сред (с добавлением лошадиной сыворотки, бычьего альбумина, экстракта дрожжей, пенициллина и других ингридиентов) и условия культивирования (аэро-анаэробиоз или в атмосфере СО₂) зависят от видов бактерий. L-формы длительно персистируют в организме, могут сохранять патогенные свойства исходных бактерий, иницируют иммунологические расстройства и плохо фагоцитируются.

С ними связан патогенез многих хронических заболеваний и их рецидивы. Поэтому сам факт обнаружения L-форм при полипозном риносинусите у больных бронхиальной астмой заслуживает пристального внимания.

Выводы:

Предложенный вариант метода отпечатков позволяет проводить эффективное наблюдение за составом и поведением микроорганизмов в труднодоступных и небольших по площади местах человеческого организма как в норме, так и при патологии.

Микроорганизмы полости носа у больных, стадающих полипозным риносинуситом и бронхиальной астмой, подвержены сплошной L-трансформации. Ее особенностью является отсутствие гигантских форм и многоэтапный переход микроорганизмов в гетероморфные L-клетки с атипичным делением[6].

3.2 Результаты изучения жизненных форм листерий

О морфологической пластичности листерий (рис. 7) свидетельствовало наличие овоидных клеток (типичны для S-колоний), в разных условиях превращающихся в палочковидные, в клетки протопластного типа, нитевидные, мелкие округлые (L-формы), извитые формы, что присуще бактериям на стадиях L-трансформации.

А -- овоидная форма (бар 6,0 мкм); Б -- палочковидная форма (бар 7,5 мкм);

В -- клетки протопластного типа; Г -- нитчатые формы и L-формы (бар 3,1 мкм) (электронный микроскоп Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010, Япония)

Рисунок 7 -- Морфологическая пластичность Listeria monocytogenes:

Широкая экологическая толерантность, сопровождающаяся изменением морфологических особенностей популяций, затрудняет первичную индикацию и идентификацию листерий в объектах ветеринарно-санитарного надзора. При пониженных температурах, угнетающих большинство мезофильных патогенов, листерии не встречают конкуренции и могут активно размножаться. По данным В.С. Зуева с соавт., при температуре 4-6 °С у сальмонелл в воде наблюдается L-трансформация. Мы отмечали (рис. 8, А), что листерии в воде в колониях и микроколониях сохраняли типичную палочковидную форму и были объединены межклеточным матриксом, формирующим покровы, что свидетельствовало о наличии полноценной клеточной стенки. Отрицательные температуры (от -8 до -18 °С) не влияли на морфологию и жизнеспособность популяций листерий. Они поддерживали жизнеспособность при низких положительных и даже отрицательных температурах, существуя в колониях и микроколониях с поверхностной биопленкой (см. рис. 8,Б, В,), образованной внеклеточными продуктами, аналогичными компонентам клеточной стенки, синтезируемым и секретируемым полноценной бактерией.

А --22 °С, 3 мес (клетки палочковидной формы погружены в матрикс, формирующий покров); Б --4 °С, 2 нед (клетки палочковидной формы закрыты покровом); В - 18 °С, 30 сут (клетки имеют типичную овоидную форму) (электронный микроскоп Hitachi-800 со сканирующей приставкой Hitachi-8010, Япония)

Рисунок 8 - Фрагменты популяции Listeria monocytogenes в водной среде в разных условиях: