Размещено на http://allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

Біологічний факультет

Кафедра генетики та цитології

Курсова робота

з Прикладної мікології на тему:

СТВОРЕННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ШТАМІВ ГРИБІВ РОДУ PENICILLIUMІ ЇХ ВИКОРИСТАННЯ ДЛЯ ОТРИМАННЯ МАЦЕРУЮЧИХ ФЕРМЕНТІВ

Вступ

Оскільки для грибів характерним є зовнішнє травлення, вони представляють собою своєрідні «заводи» по виробництву і секреції в навколишнє середовище найрізноманітніших ферментів. Звичайно, така їх властивість обумовлює широке використання у багатьох галузях народного господарства.

Ферменти у порівнянні з хімічними каталізаторами мають ряд переваг. По-перше, вони мають високу каталітичну активність, яка дає можливість здійснювати реакції при температурах, близьких до фізіологічних, що забезпечує зменшення енергоємності процесів. По-друге, висока субстратна специфічність ферментів дає можливість виключити або значно скоротити утворення побічних продуктів і тим самим забезпечити меншу витрату сировини і ресурсів для очищення продуктів реакції. І, нарешті, висока регіо- і стереоспецифічністьферментів дає можливість виготовляти продукти, які важко отримати хімічними методами.

На сьогоднішній день детально описані декілька тисяч ферментів різних класів. Завдяки унікальним каталітичним властивостям ферменти знайшли застосування у найрізноманітніших галузях біотехнології. Все вищесказане стосується і мацеруючих ферментів - целюлаз, геміцеллюлаз і пектиназ, які сьогодні складають близько 20% світового виробництва ферментів. Вони знайшли своє застосування у технологічних процесах харчової, текстильної, деревообробної, паперової галузей промисловості, а також використовуються у виробництві етанола з сировини, що містить целюлозу, для конверсії рослинних відходів різних виробництв, у виробництві кормів і т.д [3].

Кращими продуцентами ферментів-карбогідраз, на сьогоднішній день, є мікроскопічні гриби, які переважно належать до родів Trichoderma, Penicillium, а такожAspergillus[2].

Для вдосконалення грибних штамів - продуцентів ферментів застосовуються різні методи, в тому числі і методи генної інженерії [3]. Створення рекомбінантних штамів є досить перспективним напрямком біотехнології, оскільки ми можемо отримувати гриби з необхідними нам властивостями. На сьогоднішній день рекомбінантні штами грибів є основними продуцентами ферментів для промисловості [3].

Тому мета даної роботи - на прикладі грибів роду Penicillium проілюструвати основні етапи отримання рекомбінантних штамів і приклади їх використання в деяких галузях промисловості, пов'язаних з переробкою рослинної сировини.

1. Створення рекомбінантних штамів грибів

Отримання рекомбінантного штаму складається з декількох етапів. Проілюструємо їх на конкретному прикладі.

Гриб P. verruculosum продукує целюлазний ферментний комплекс, основними компонентами якого є целлобіогідролази та ендоглюканази, а також ксиланази.

Ці ферменти-карбогідрази достатньо ефективно гідролізують целюлозний та геміцелюлозний компоненти рослинних матеріалів. Проте пектинолітична активність комплексу ферментів P.verruculosum- низька.

Тому на основі вихідного штаму P.verruculosum BI-537 niaD^(-) були створені рекомбінантні штами Penicilliumverruculosum ВКМ F-4587D і Penicilliumverruculosum ВКМ F-4586D, які є продуцентами не тільки целюлолітичних ферментів, а ще і гетерологічнихв-глюкозидази з A. niger і пектинліази А з P. canescens[2].

1. На першому етапі ампліфікували цільові гени ферментів карбогідразного комплексу: pelA, який кодує пектинліазуА з P. canescens, та bglI, що кодує в-глюкозидазу (целобіазу) з A. niger, а також промоторну й термінаторну області гена cbhIP. verruculosum.

Рис.1 Схеми векторів для трансформації гриба P.verruculosum BI-537 niaD^(-).

2. Конструювали дві плазміди - pPelA и pBG - полінуклеотидні послідовності, які складаються з промоторної області гена cbhI, сигнального пептида відповідного цільового гена, цільового гена pelAу складі плазмідиpPelA, цільового гена bglIу складі плазмідиpBG і термінаторної області гена cbhI (рис.1.1). грибний штам фермент біотехнологія

Нуклеотидні послідовності отриманих векторів визначали методом секвенування за методикою Сенгера.

3. Отримували протопласти реципієнтного штаму і проводили трансформацію P.verruculosum BI-537 niaD^(-) сумішшю отриманих плазмідpPelA и pBG в умовах контрансформації разом з плазмідою, що має послідовність нуклеотидів гена niaD, як маркера селекції.

Щоб визначити наявність вбудованого екзогенного генетичного матеріалу в хромосомурекомбінантних штамів, проводилипервинний скринінгтрансформантів з використанням ПЛР.

Оскільки цільова плазмідаpBG містить гетерологічний ген в-глюкозидази (целобіази), то скринінг гена bglI здійснювали з використанням пари праймерів BGA і BGB.

Отриманий ПЛР-продукт, який аналізували методом електрофорезу в агарозному гелі, мав ~ 3000 пар нуклеотидів, що відповідає розміру полінуклеотидної послідовності гена bglI з A.niger. Аналогічноскринінг гена pelA здійснювали з використанням пари праймерів PELA і PELB, отримуючи ПЛР-продукт розміром ~ 1500 п.н.

4. Трансформанти, що мали гени bglI і pelA, пересіювали на чашки Петрі з мінімальним середовищем і NaNO₃ в якості джерела азоту і вирощували при 30°С протягом 6 діб до утворення конідій. Потім трансформанти ферментували в качалочних колбах і відбирали ті, які мали більшу пектинліазну та в-глюкозидазну активності у порівнянні з реципієнтним штамом P.verruculosum BI-537 niaD^(-).

Активності ферментів визначали за швидкістю утворення продуктів реакції і виражали в міжнародних одиницях (1 одиниця відповідала утворенню 1 мкмоль продукту за 1 хв при дії ферментів на відповідний сустрат).

Також проводили електрофорез культуральної рідини, в якій вирощувались відповідні штами, щоб ідентифікувати полоси, які відповідають зонам, що займають пектинліаза (38 кДа), целобіогідролаза І (66 кДа), ендоглюканаза ІІ (40 кДа) та в-глюкозидаза (120 кДа).

5. Здійснювали процес ферментації відібраних найбільш активних варіантів штамів-продуцентів у десятилітровому ферментері, використовуючи поживне середовище такого самого складу, як і в качалочних колбах, додаючи глюкозу, при рН 4,5 і 32°С протягом 144 годин. Після закінчення ферментації отримували сухий ферментний препарат і характеризували його за рівнями карбогідразнихактивностей [2].

2. Використання рекомбінантних штамів роду Penicillium в харчовій та текстильній промисловості

Ферментні препарати, які отримують на основі грибних штамів-продуцентів, широко застосовуються в процесах отримання вина, плодово-ягідних соків, джемів, пюре та інших продуктів з плодово-ягідної сировини.

Ферментативний гідроліз плодово-ягідної сировини забезпечується карбогідразним комплексом - сукупністю ферментів різної специфічності, які розщеплюють молекули полісахаридів з утворенням оліго- та моносахаридів. Якісний склад ферментних препаратів залежить від складу плодово-ягідної сировини. Оскільки основними компонентами клітинних стінок рослин є целюлоза та пектини, то відповідно ферментні препарати для її гідролізу повинні мати, перш за все, целюлолітичну та пектолітичну активності [2].

Власне кажучи, розглянуті у попередньому розділі рекомбінантніштамиPenicilliumverruculosum ВКМ F-4587D іPenicilliumverruculosum ВКМ F-4586D, і були створені для отримання ферментів гідролізу плодово-ягідної сировини. Оскільки реципієнтний штам P.verruculosum BI-537 niaD^(-) мав низьку пектинолітичну активність, то було запропоновано вбудувати у його геном ген пектинліази А з P. canescens. Пектинліаза - фермент, що каталізує реакцію розщеплення б-1,4-D-глікозидного зв'язку між метоксильованими залишками галактуронової кислоти у складі пектинових речовин. Особливої властивістю цього ферменту є те, що він діє на етерифікованийгомогалактуронан без попередньої деетерифікації, яка зазвичай передує гідролітичному розщепленню пектину. Тому завдяки пектинліазівідбувається освітлення соків без руйнування летких ефірних компонентів, які обумовлюють специфічний фруктовий запах.

Дослідниками було вирішено вбудовувати ген пектинліази А з P. canescens, оскільки, на відміну від пектинліаз з A. niger, оптимум рН для яких складає від 6,0 до 8,5 одиниць, обрана пектинліаза «працює» в умовах рН=5,0 і є стабільною при рН від 4,0 до 3,3 - нативномурН фруктів та ягід. Пектинліаза А з P. canescens після 3 годин інкубування при рН=4,0 і кімнатній температурі зберігає більше 90% активності, а при зростанні температури до 40°С і 50°С активність пектинліази залишається на рівні 70% і 40% від вихідної активності.

Окрім гену пектинліази А в геном P. verruculosum BI-537 niaD^(-) був вбудований ген в-глюкозидази з A. niger. Ферментні препарати з в-глюкозидазою покращують органолептичні показники продуктів, виготовлених з плодово-ягідної сировини. Наприклад, в-глюкозидазу використовують для зменшення гіркоти цитрусових соків та джемів [2].

Отже, за допомогою методів генетичної інженерії дослідникам вдалося створити рекомбінантні штами P. verruculosum і отримати ферментний препарат, який можна застосовувати в технологічних процесах харчової промисловості, пов'язаних з переробкою плодово-ягідної сировини.

Метою іншої дослідницької групи було отримання рекомбінантного штаму Penicilliumgriseoroseum, який одночасно продукує значну кількість пектинліази (PL) та полігалактуронази (PG) [6]. Ці ферменти розщеплюють б-1,4-глікозидні залишки відповіднопектинової та полігалактуронової кислот. Для досягнення поставленої мети штам з високою продукцією PL був трансформований плазмідоюpAN52pgg2, яка несла ген, що кодує PGР. griseoroseum, під контролем промотора гена gpd з Aspergillusnidulans. В результаті рекомбінантний штам P. griseoroseumТ20 продукував рівні PL та PG, які були відповідно у 266- і 27 разів вищими, ніж у штаму дикого типу.

У Р. griseoroseum є два гена, які кодують PL(plg1 и plg2) і два гена, що кодують PG(pgg2 и pgg1). Гени plg1 и pgg2 представлені однією копією в геномі Р. griseoroseum і вносять найбільший вклад в продукцію PL і PG, крім того, вони регулюються на рівні транскрипції та індукуються пектином і репресуються глюкозою. Зважаючи на цей факт, дослідники намагалися отримати рекомбінантний штам Р. griseoroseum без необхідності індукції його ферментативної активності пектином. Виявилося, що заміна ендогенного промотора генів, які кодують пектиназиу Р. griseoroseum, сильним і конститутивним промотором, таким як промотор гена gpdз A. nidulans, призвела до збільшення продукування PG і PL при використанні альтернативних джерел вуглецютаких як сахароза і сік цукрової тростини. Пов'язано це з тим, що заміна регуляторної області усуває необхідність в індукції та катаболітній репресії, котру розглядали як перешкоду для продукування пектиназ при використанні альтернативних джерел вуглецю. Зважаючи на широке розповсюдження вирощування цукрової тростини і технологію її обробки, використання цього джерела вуглецю в якості субстрата для виробництва грибних ферментів демонструє значний потенціал та низьку вартість.

Важливою особливістю отриманого штаму P. griseoroseumТ20 є те, що в умовах синтезу PLі PG він не продукує целюлаз і протеаз. В текстильній промисловості наявність целюлази може послабити міцність волокон, а наявність протеаз може зменшити стабільність PLі PG.

Отже, рекомбінантний штам P. griseoroseumТ20 можна використовувати як джерело ферментного препарату, який можна застосовувати як в текстильній промисловості, так і в харчовій. До того ж, ферменти Т20, які кодуються генами plg1 и pgg2, працюють в широкому діапазоні рН, мають високу термічну стабільність і можуть зберігатися принаймні протягом двох місяців без втрати активності. Ці особливості вказують на те, що ферменти PLі PG, які продукуються Т20, є перспективними для застосування у промислових процесах освітлення фруктових соків з кислим рН, таких як томатний, апельсиновий та яблучний [6].

Пізніше цією ж дослідницькою групою був створений рекомбінантний штам Р. griseoroseum T146, який продукував значно більше PG у порівнянні з контрольним штамом PG63. Для збільшення синтезу PGкодуючу область гена pgg2клонували під контролем промотора гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (gpd) і термінаторної області гена триптофан синтази(trpC) з Aspergillusnidulans (pAN52pgg2 вектор). Потім цей вектор використовували для трансформації P. griseoroseum. Як наслідок, штам Т146 мав додаткову копію гена pgg2, що призвело до 12-кратного збільшення рівня синтезу PG. Як і P. griseoroseumТ20, Р. griseoroseum T146 здатний був використовувати сахарозу і сік цукрової тростини в якості альтернативного джерела вуглецю[7].

Нові ферментативні препарати (ФП) з високою пектиназною та геміцелюлазноюактивностями були отримані і на основі створення рекомбінантних штамів Penicilliumcanescens. Ці штами синтезували гомологічну пектинліазу А та гетерологічніендо-1,5-б-арабіназу А і ендо-1,4-альфа-полігалактуроназу, а також ферменти штама-господаря(б-L-арабінофуранозидази, ксиланази та інші). Ферментні препарати, отримані з культурального середовища рекомбінантних штамів P. саnescens, ефективно гідролізували рослинну сировину з високим вмістом пектинових сполук. Так, було показано, що вихід відновлюючих вуглеводів та арабінози збільшився на 16 і 22% порівняно з контрольним ферментним препаратом на основі штаму-господаря, коли один з отриманих ФП використовували для гідролізу жому, отриманого з цукрового буряку. Найбільш активний ферментний препарат мав у своєму складі пектинліазу (10%), ендо-1,5-арабіназу (26%), б-L-арабінофуранозидазу та арабіноксилан-арабінофураногідролазу (12%), а також ксиланазу (10%) [5].

3. Застосування рекомбінантних штамів роду Penicillium у виробництві кормів

Одним з ключових кормових ферментів є ендо-1,3/1,4-в-глюканаза, яка гідролізуєв-глюкани - некрохмальні полісахариди клітинної стінки зерна злакових (овса, ячменя, жита), за рахунок чого покращується доступ травних ферментів тварин до поживних компонентів кормів. Одночасно з цим зменшується в'язкість кормової маси і полегшується її проходження через ШКТ тварин. Травні ферменти тварин не містять целюлолітичних ферментів, відповідно наявність довгих неперетравлюваних молекул целюлози значно зменшує поживну цінність кормів і погіршує процеси всмоктування в кишечнику. Деякі грибні ендо-1,3-в-глюканази здатні розщеплювати не тільки 1,3-в-, але й 1,4-в-глюкозидні зв'язки, проявляючи таким чином і целюлазну активність, і тим самим приймають участь в розщепленні целюлози. Як наслідок - значно підвищується засвоєння кормів. Сучасні кормові ферментні препарати неможливо уявити без наявності в них в-глюканази, а також ксиланази, пектинліази та інших ферментів. Основними продуцентами цих ферментів є міцеліальні гриби [1].

Іншою, не менш важливою проблемою кормовиробництва є збереження активності ферментних препаратів при проходженні процедури грануляції корму. Зважаючи на технологічний процес виготовлення комбікорму, мінімальною вимогою є здатність фермента зберігати активність під час обробки при температурі 85°С. Зараз провідні виробники пропонують ферменти, стійкі при температурі 90°С.

Використовуючи експресійну систему грибів роду Penicillium, а також розроблену методологію створення рекомбінантних штамів і ферментних препаратів на їх основі, вченими був отриманий ряд нових ферментних комплексів з гетерологічною активністю термостабільної в-глюканази та інших ферментів [4].

Прикладом одного з таких препаратів є комплексний ФП, який отримують шляхом культивування рекомбінантного штаму Penicilliumverruculosum B10 EGII. Даний штам є продуцентом ендо-1,3/1,4-в-глюканази, целюлази, в-глюкозидази і ксиланази. Отримали його шляхом трансформації штамаPenicilliumverruculosum ВКМ F-3764DплазмідамиpSTA10 и pPrCBHI-EGII. В плазмідіpPrCBHI-EGIIнуклеотидна послідовність структурного гена ендо-1,3/1,4-в-глюканазиPenicilliumverruculosum була поєднана з нуклеотидними послідовностями промоторної області, сигнального пептида і термінатора гена cbhIцелобіогідролази І Penicilliumverruculosum[1].

Висновки

Гриби є важливими продуцентами різноманітних ферментів, у тому числі і мацеруючих. Останні зараз широко застосовуються у багатьох галузях промисловості, а тому перспективним напрямком є вдосконалення грибів-продуцентів. Численні публікації та патенти засвідчують, що застосування методів генної інженерії є досить успішним методом отримання комплексних ферментних препаратів.

Отримання рекомбінантних штамів складається з декількох етапів:

1. Отримання штама-реципієнта

2. Виділення цільового гена (гомологічного, гетерологічного)

3. Включення цільового гена в експресійну касету (створення вектора)

4. (Ко)трансформація протопластів реципієнтного штаму

5. Регенерація протопластів, первинний скринінгтрансформантів на цільову активність (качалочці колби, планшети)

6. Вторинний скринінгтрансформантів (ферментери), отримання, випробування і вивчення властивостей ферментних препаратів

7. Отримання штама-продуцента

На основі створення рекомбінантних штамів грибів роду Penicillium були отримані ферментні препарати, які знайшли застосування у різних галузях промисловості, а також мають більш широкі діапазони оптимальних рН та температур. Зокрема, в роботі були наведені приклади застосування рекомбінантів у харчовій, текстильній галузях промисловості, а також при виробництві кормів для тварин.

Список використаної літератури

1. Беккаревич А. О., Бубнова Т. В., Кошелев А. В., Матыс В. Ю., Немашкалов В. А., Окунев О. Н., Рожкова А. М., Синицын А. П. Штамм гриба Penicilliumverruculosum B10 EGII продуцент эндо-1.3/1.4-в-глюканазы, целлюлазы, в-глюкозидазы и ксиланазы и способ получения кормового комплексного ферментного препарата. Патент RU 0002532840 C2 от 10.11.2014.

2. Бушина Е. В., Волчок А. А., Зоров И. Н., Матыс В. Ю., Окунев О. Н., Рожкова А. М., Синицына О. А., Синицын А. П., Черноглазов В. М. Новый рекомбинантный штамм (варианты) мицелиального гриба Рenicilliumverruculosum и ферментный препарат (варианты), предназначенный для гидролиза плодово-ягодного сырья, и способ его получения. Патент RU 0002574206 C1 от 10.02.2016.

3. Михайлова, Р. В. Мацерирующие ферменты мицелиальных грибов в биотехнологии / Р. В. Михайлова. -- Минск: Белорус.наука, 2007. -- 407 с.

4. РожковаА.М., МерзловД.А., ЧекушинаА.В., РубцоваЕ.А., Зоров И.Н., Матыс В.Ю., Немашкалов В.А., Синицын А.П. Разработка новых ферментных препаратов для кормопроизводства на базе рекомбинантных штаммов низших грибов рода Рenicillium // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: тез.докл. IX Междунар. науч. конф. (Минск, 7-11 сент. 2015 г.). - Минск: Белорусская наука, 2015. - 192 с.

5. Rubtsova E. A.,Bushina E. V.,Rozhkova A. M.,Korotkova O. G., Nemashkalov V. A.,Koshelev A. V.,Sinitsyn A. P. Novel enzyme preparations with high pectinase and hemicellulase activity based on Penicilliumcanescens strains. - 2015. // Режимдоступу: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600014926

6. TeixeiraJA, GonзalvesDB, de Queiroz MV, de AraъjoEF. Improved pectinase production in Penicilliumgriseoroseum recombinant strains //AppliedMicrobiol. - 2011. - 111(4). - P. 818-825.

7. Teixeira JA, Ribeiro JB, Gonзalves DB, de Queiroz MV, de Araъjo EF.Overproduction of polygalacturonase by Penicilliumgriseoroseum recombinant strains and functional analysis by targeted disruption of the pgg2 gene // ApplBiochemBiotechnol. -2013. - 169(6). - Р.1965-1977.

Размещено на Allbest.ru