Стволовые клетки, полученные из жировой ткани молочной железы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани молочной железы

Jie Yang1, Lingyun Xiong1,2, Rongrong Wang1, Jiaming Sun1, Christoph Hirche2

Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Union Hospital, Huazhong Science and Technology University, Wuhan, Hubei, China,

Department of Hand, Plastic and Reconstructive Surgery, BG-Trauma Centre Ludwigshafen, University of Heidelberg, Ludwigshafen, Germany

Введение

Предпосылки. Жировая ткань считается лучшим источником стволовых клеток, специфичных для этой ткани (ADSCs). В прошлых исследованиях сообщалось, что такие стволовые клетки могут быть получены из некоторых органов; однако молочной железе не было уделено значительного внимания. Мы бы хотели сообщить о наших успехов в выделении стволовых клеток из жировой ткани молочной железы.

Материалы и методы. Жировая ткань была взять у семи пациентов с гипертрофированными молочными железами. При помощи коллагеназы стволовые клетки были изолированы. Поверхностные маркеры были проанализированы при помощи проточной цитометрии. Были изучены клеточные морфологии. Сравнивалась пролиферативная активность клеток из разных пассажей. Была оценена жизнеспособность клеток после криоконсервации. Были индуцированы адипогенная и остеогенные дифференцировки.

Результаты. Первичные культуры клеток по морфологии были сходны с фибробластами, и экспрессировали поверхностные маркеры, такие как CD13, CD44, CD90 и CD105. Не наблюдалось разницы в пролиферативной активностью клеток из разных пассажей (P > 0.05) и между клетками, прошедшими и не прошедшими криоконсервацию (P > 0.05). Кроме того, изолированные клетки дифференцировались в адипоциты и остеобласты.

Заключение. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани молочной железы, могут быть представить как альтернативу для тканевой инженерии. Необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы получить более полную информацию об этих стволовых клетках.

Как ссылаться на эту статью: Yang J, Xiong L, Wang R, Sun J, Hirche C. Adipose-derived stem cells from the breast. J Res Med Sci 2014;19:112-6.

С первого сообщения о стволовых клетках, полученных из жировой ткани - ADSC (Zuk и соавт., 2001) [1,2], эти клетки непрерывно исследовали в последнее десятилетие. Тканевая инженерия с использованием этих клеток подает большие надежды в области реконструкции мягких тканей. [9-11]

ADSC могут быть выделены из многих мест, в том числе из подкожной жировой клетчатки и из жировой ткани, окружающей внутренние органы. [12,13] В груди определяются четкие границы между жировой тканью и молочной железой, что позволяет отделить жировую ткань и в последующем получить стволовые клетки.

Сообщалось, что ADSC, полученные из жировой тканей различных органов, имеют разные характеристики. [14] Свойства стволовых клеток, полученных из молочной железы (bADSC), еще недостаточно изучены, что ограничивает их применение в тканевой инженерии. К тому же сообщалось, что эти клетки стимулируют развитие рака молочной железы. [15] bADSC могут быть потенциально значимыми в клеточной терапии рака молочной железы.

Так или иначе, bADSC было уделено незначительное внимание, и требуются дополнительные исследования. В данном исследовании стволовые клетки были изолированы от гипертрофированной ткани молочной железы, и была изучена их способность к мультипотентной дифференцировке. Целью этого исследования было предоставить предварительные данные о ADSC для дальнейших обстоятельных исследований.

Материалы и методы

Эксперимент был одобрен союзом по этике Union Hospital (Wuhan, Китай) и проводился в соответствии с Хельсинской декларацией. [16] Стволовые клетки были выделены из ткани молочной железы у семи пациентов с гипертрофированными молочными железами с июля 2011 года по апрель 2012 года [Рисунок 1]. Все больные были проинформированы до операции. Были использованы скальпели, чтобы предотвратить термические повреждения. Возраст пациентов колебался от 23 до 53 лет (среднее 35,2), а их индекс массы тела лежал в пределах от 20,3 до 23,8 км/м2 (среднее 22,9).

Выделение bADSC

На стерильной поверхности выделение клеток было выполнено так же, как и в наших предыдущих опытах. [17] После воздействия коллагеназы I (Invitrogen, Carlsbad, USA), центрифугирования и фильтрации полученные клеточные фракции культивировались на модифицированной среде Дульбекко (DMEM)/F12 (Boster Biotech, Wuhan, China) с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS; Gibco, Carlsbad, USA), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Boster Biotech, Wuhan, China) при температуре 37 С в присутствии 5% СО2 в течение 48 часов. Затем неприкрепившиеся фракции были удалены, а оставшиеся клетки дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS; Boster Biotech, Wuhan, China). Замену среды производили каждые 3 дня. Когда было достигнуто 80% прикрепления клеток, их пересевали в колбы T25 (Boster Biotech, Wuhan, China) в соотношении 1:2.

Проточная цитометрия поверхностных маркеров

Клетки обрабатывали фикоэритрином (РЕ)-, флюоресцин изоцианатом (FITC)- аллофикоцианином (APC)-, или перидинино-хлорофилловым белковым комплексом (PerPC), связанных с античеловеческими моноклональными антителами кролика к CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD71, CD90 и CD105 (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, USA), соответственно. Все образцы затем анализировали при помощи проточной цитометрии (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, USA) с программным обеспечением CellQuest Pro (Beckton Dickinson, Franklin Lakes, USA).

Иммунофлюорисцентный анализ

Клетки высевали в планшеты с 6 лунками (Boster Biotech, Wuhan, China) при плотности 1.5 Ч 104 клеток/лунка и затем инкубировали при температуре 37С в присутствии 5% СО2. Семьдесят два часа спустя клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида (Boster Biotech, Wuhan, China)в течение 2 минут и обрабатывали 0,5% Triton X-100 в течение 10 минут. После отмывания PBS клетки находились в 5% бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа при температуре 24С. Затем клетки были промыты и инкубированы в течение 12 часов при 4С с антителами в соотношении 1:100 (CD34, CD44, CD45, CD105, и виментин; Gene Tex, Alton Pkwy, USA). После клетки инкубировались с флюорисцентной маркировкой кроличьими противомышиными антителами в соотношении 1:100 (AP-, PE-, and PerCP-conjugated; Beckton Dickinson, Franklin Lakes, USA) при температуре 24С в течение 10 минут. После отмывания, клетки были зафиксированы в PBS-глицероле (Boster Biotech, Wuhan, China). Изображения были получены при помощи инвертированного флюорисцентого микроскопа (Olympus, Tokyo, Japan).

Оценки пролиферации in vitro

Клетки 3 пассажа (P3), 5 пассажа (P5) и 10 пассажа (P10) высевали с планшеты с 96 лунками (Boster Biotech, Wuhan, China) с плотностью 4 Ч 103/мл и объемом 100 мкл/лунка, соответственно. Пролиферация отмечалась при помощи системы подсчета клеток Kit (CCK) - 8 Kit (Dojindo, Kumamoto, Japan) каждый день при 450 нм, используя Multiskan GO reader (Thermo Scientific, Waltham, USA). Была проанализирована оптическая плотность.

Криоконсервация и оживление

Были собраны клетки 3 пассажа, и их жизнеспособность была оценена при помощи окрашивания трипановыми синим. Затем клетки хранили в баллоне с жидким азотом MVE-Chart, Garfield Heights, USA) при температуре -80С в течение трех месяцев. После трех месяц криоконсервации жизнеспособность клеток была оценена снова. Зачем клетки инкубировали при температуре 37С в присутствии 5% СО2, при оценке пролиферации измерялся CCK-8Kit, были построены соответствующие кривые роста.

Ультраструктурное наблюдение

Клетки 3 пассажа были собраны и центрифугированы, а зачем фиксированы в 2,5% глутарового диальдегида (Boster Biotech, Wuhan, China). После инкубации при температуре 4С в течение 12 часов клетки фиксировали в 1% осмиевой кислоты (Boster Biotech, Wuhan, China) при температуре 4С в течение 1 часа, дегидрированы при помощи серийного отмывания ацетоном и помещены в Epon 812 (Boster Biotech, Wuhan, China). Ультраструктурная идентификация была проведена в трансмиссионном электронном микроскопе Tecnai G220 TWIN (Fei, Hillsboro, USA).

Дифференцировка in vitro

Клетки 3 пассажа были помещены в планшеты с 6 лунками с плотностью 1.5 Ч 104 клеток/лунка. Были культивированы экспериментальные группы соответственно, в среде, провоцировавшей адипогенную дифференцировку клеток, состоявшую из DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стремтомицина , 400 мкл инсулина (Sigma, St. Louis, USA), 200 мкл индометацина (Sigma, St. Louis, USA), 200 мкл 3-Изобутил-1-метилксантина (IBMX;Sigma, St. Louis, USA), 2 мл глутамина (Boster Biotech,Wuhan, China), и 200 мкл дексаметазона (Boster Biotech,Wuhan, China); и в среде, провоцировавшей остеогенную дифференцировку, которая состояла из DMEM/F12 с добавлением 10% раствора FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 100 мкл аскорбиновой кислоты (Boster Biotech, Wuhan, China), 2 мл в-натрия глицерофосфата (Boster Biotech, Wuhan, China) и 2 мкл дексаметазона (Boster Biotech, Wuhan, China). Контрольная группа была культивирована на DMEM/F12 с добавлением 10% раствора FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Среду заменяли каждые три дня. Три недели спустя культуры были окрашены при помощи Oil Red O (Boster Biotech, Wuhan, China) и Alizarin Red S (Boster Biotech, Wuhan, China), соответственно.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили при помощи SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). Кривые роста 3, 5 и 10 пассажей клеток были сравнены с однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA). Кривые клеток до и после «оживления» сравнивались при помощи парного критерия Стьютенда. Считали значимыми значения ниже 0,05.

жировой стволовой инженерия иммунофлюорисцентный

Результаты

Выделение и характеристика

24 часа спустя после выделения клетки начали прикрепление. Мы наблюдали их морфологию [Рисунок 2]. Иммунофлюорисцентный анализ показал, что маркеры CD 44 и CD105 экспрессировались значительно; с другой стороны, экспрессия CD34 и CD45 была незначительной. Виментин экспрессировали более 95% клеток [Рисунок 3].

Анализ клеточного цикла показал, что 90% клеток из 3 пассажа находились в фазе G0/G1. Была обнаружена выраженная экспрессия маркеров CD14, CD34, и CD45 [Рисунок 4]. При помощи трансмиссионного электронного микроскопа было отмечено, что клетки содержали явные ядрышки и цитоплазму с лизосомами, шероховатой ЭПС, гладкой ЭПС, и митохондриями [Рисунок 5].

Анализ пролиферации in vitro

Пролиферация 3, 5 и 10 пассажей соответствовала описанию, сделанному Zuk и соавторами.[1,2] Значительной разницы (P > 0.05) между 3, 5 и 10 пассажами не наблюдалось.

Клетки 3 пассажа были «оживлены» и культивированы после трех месяцев хранения в жидком азоте. Выживаемость составила 85,7%. Эти клетки начали прикрепление через 4 часа после посева и достигли 80% прикрепления через 6 дней. Были проанализированы кривые роста нормальных клеток 3 пассажа и клеток после «оживления»; между этими группами не было выявлено явной разницы (P > 0.05).

Адипогенная и остеогенная дифференцировка

В группе, где происходила адипогенная дифференцировка, морфология клеток соответствовала адипоцитам. Все образцы дали положительный результат при окрашивании Oil Red O. В группе, где происходила остеогенная дифференцировка, сформировались коричневые минерализованные узелки, состоявшие из индуцированных клеток, дававших положительный результат при окраске Alizarin Red S. Все образцы контрольной группы были негативны [Рисунок 7].

Обсуждение

Стволовые клетки, полученные из жировой ткани, широко используются в тканевой инженерии в виду их значимых преимуществ: (1) большое количество, (2) потенциальная мультипотентность и (3) минимальная инвазивность при их выделении из организма. В настоящем исследовании представлены полученные нами данные о выделении, характеристике и дифференцировки стволовых клеток, полученных из жировой ткани молочной железы.

Пролиферативная активность клеток 3, 5 и 10 пассажей существенно не различалась. Были оценены жизнеспособность и пролиферация клеток после криоконсервации. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани молочной железы, выражено экспрессировали маркеры мезенхимальных клеток (CD13, CD44, CD90, и CD105). С другой стороны, экспрессия маркеров гематопоэтических и эндотелиальных клеток (CD14, CD34, CD45, и CD71) была не столь очевидной; виментин экспрессировали более чем 95% клеток. При культивировании в среде, направлявшей клетки по определенному пути дифференцировки, клетки дифференцировались в адипоциты и остеоциты. Все вышеприведенные результаты показывают, что свойства этих клеток аналогичны свойствам мезенхимальных стволовых клеток. [20-27]

Насколько нам известно, немногие исследования были сосредоточены на стволовых клетках, полученных из жировой ткани молочной железы. Zhao и соавт. [28] сообщали о выделении этих клеток и об их дифференцировки. Результаты наших исследований согласуются с их данными. Кроме того, мы оценили поверхностные маркеры клеток, их ультраструктуру и пролиферацию. Мы считаем, эти данные будут иметь большое значение в дальнейшем исследовании подобных клеток.

Жировая ткань и ткань молочной железы находятся в тесных связях. Молочная железа состоит из миоэпителиальных клеток и протоковых эпителиальных клеток. И те, и другие клетки происходят из стволовых клеток молочной железы (MaSCs).[29,30]Теоретически, стволовые клетки молочной железы лучше всего подходят для тканевой инженерии молочной железы. Тем не менее, сложно выделить эти клетки в большом количестве и регулировать направление их дифференцировки. С другой стороны, стволовые клетки, полученные из жировой ткани молочной железы, могут быть легко выделены. Если взрослые стволовые клетки из той же микросреды обладают аналогичными возможностями к дифференцировке, они могут заменить MaSCs.

У настоящего исследования есть свои недостатки. Были проанализированы и оценены клетки, выделенные только из гипертрофированных молочных желез, однако клетки из нормальной молочной железы не были выделены и оценены. Между этими типами клеток могут быть существенные различия, например, в способности к адипогенной дифференцировке. Кроме того, не проводилось сравнения между клетками, полученными из жировой ткани других источников, что может привести к игнорированию особых характеристик стволовых клеток, полученных из жировой ткани молочной железы. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы получить более полное представление об этих клетках.

Размещено на Allbest.ru