Репликативная модель смены матрицы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Репликативная модель смены матрицы

Взаимосвязь эффективности рекомбинации и репликации у вируса полиомиелита. Р. D. Cooper с соавторами впервые предложили репликативный механизм образования рекомбинантов вируса полиомиелита. Авторы предположили, что рекомбинация между геномными РНК вируса полиомиелита идет в процессе репликации, за счет переотжига растущей цепи с одной матрицы на другую. По мнению авторов, образование большинства рекомбинантов полиовируса с одним местом перекреста на геном и сохранение у всех рекомбинантов точно такого же размера генома, как у родительских Щмолекул РНК, говорит в пользу репликативного механизма рекомбинации (Cooper et al., 1974).

Впервые получить данные, указывающие на взаимосвязь эффективности рекомбинации и репликации, удалось на примере вируса полиомиелита в 1986 году (Kirkegaard and Baltimore, 1986). В данной работе в качестве рекомбинационных партнеров использовали вирус полиомиелита дикого типа и полиовирус, проявляющий температурочувствительный (ts) и гуанидин iрезистентный (gr) фенотип. В ходе эксперимента клетки инфицировали

родительскими вирусами не одновременно, а последовательно. При этом суперинфекцию вторым родительским вирусом осуществляли в условиях, ингибирующих репликацию первого. Рекомбинантов образовывалось много, если монослой клеток HeLa заражали мутантным вирусом (ts, gr) при 32°С и суперинфицировали диким типом при температуре 39°С. Рекомбинантов было мало, если клетки заражали вирусом дикого типа и суперинфицировали мутантом в присутствии 0,5 М гуанидина. При этом Киркегаард и Балтимор утверждают, что гуанидин.HCI (0,5 М) подавляет синтез обеих цепей РНК вируса дикого типа, тогда как непермиссивная температура (39°С) подавляет синтез только минус-цепи мутантного вируса. Если бы гомологичная рекомбинация в данных экспериментах шла согласно нерепликативной модели (т. е. без участия полимеразы), то ингибирование синтеза РНК у данных вирусов либо вообще не должно сказываться на частоте рекомбинации, либо должно быть одинаковым при подавлении синтеза РНК обоих вирусов, что не согласуется с полученными данными. Следовательно, рекомбинация зависит от эффективности репликации родительских геномов. Так как низкая частота рекомбинации наблюдалась при подавлении синтеза минус цепи мутантного вируса, авторы сделали вывод, что образование большей части рекомбинантов идет в процессе синтеза минус цепи полноразмерной РНК при репликации вирусного генома.

Изменение частоты рекомбинации и характера распределения мест перекреста в экспериментах с использованием мутантного репликативного комплекса вируса мозаики костра (BMV). Во второй половине 90х годов были получены дополнительные экспериментальные доказательства в пользу репликативного механизма рекомбинации у BMV (Nagy et al., 1995; Figlerowicz et al., 1997, 1998). В экспериментах паралельно использовали BMV дикого типа и варианты BMV, у которых белки репликативного комплекса содержали различные аминокислотные замены. При этом наблюдали изменение частоты рекомбинации, характера распределения и структуры мест перекреста. В частности, резко увеличивалось число рекомбинантов, содержащих в месте перекреста нематричные нуклеотиды (как правило, уридин). Наличие дополнительных нематричных нуклеотидов только в сайтах перекреста говорит о том, что включение данных нуклеотидов произошло непосредственно при образовании рекомбинанта. По мнению авторов, мутантная полимераза на определенных участках начинает «проскальзывать», что и приводит к встраиванию нематричного нуклеотида (или нуклеотидов). При этом пауза в синтезе РНК, в свою очередь, способствует диссоциации полимеразы и смене матрицы.

Таким образом, изменение общей частоты рекомбинации, характера распределения и структуры мест перекреста у рекомбинантов при использовании BMV с мутантным репликативным комплексом говорит о том, что вирусная РНК-полимераза непосредственно участвует в образовании РНК- рекомбинантов.

Синтез гетерогенных по длине РНК-транскриптов гомогенными препаратами вирусных РНК-полимераз in vitro. Arnold and Cameron (1999), исследовали эффективность использования ДНК-праймеров в качестве затравки РНК-полимеразой вируса полиомиелита. Было зарегистрировано образование транскриптов, длина которых превышала длину используемых РНК-матриц. Эффективность синтеза «удлиненных» транскриптов зависела от концентрации РНК-матрицы. Следовательно, по мнению авторов, синтез транскриптов данного типа идет за счет удлиннения 3'-концевого участка растущей цепи после копирования одной молекулы РНК, при этом, в качестве матрицы используется новая молекула. Таким образом, РНК-полимераза вируса полиомиелита способна относительно эффективно осуществлять смену матрицы при синтезе РНК in vitro, что, по мнению авторов, отображает репликации in vivo.

К аналогичным выводам пришли Kim and Као (2001), которые исследовали in vitro эффективность использования РНК-праймеров РНК- полимеразами вируса бычьей диареи (BVDV) и трех вирусов растений: вируса мозаики костра (BMV), вируса мозаики огурца (CMV) и вируса хлоротической пятнистости коровьего горошка (CCMV). При транскрипции были обнаружены конкатамерные транскрипты, длина которых была кратна длине используемой матрицы (ди-, три- и тетрамеры). Эффективность образования конкатамерных транскриптов зависела от концентрации матрицы и последовательности нуклеотидов на 5'-концевом участке. Образование таких транскриптов наблюдалось и при использовании РНК-матриц, у которых отсутствовали 5'- концевой фосфат, 2'- и З'-концевые гидроксилы. Следовательно, по мнению авторов, образование конкатамерных транскриптов идет за счет смены матрицы при транскрипции. При этом З'-концевой участок растущей цепи отжигается на 5'-концевом участоке другой молекулы РНК после завершения синтеза на предыдущей молекуле. рекомбинация вирус элонгация матрица

Итак, приведенные выше экспериментальные данные говорят о том, что РНК-рекомбинация может осуществляется при непосредственном участии вирусной РНК-полимеразы в процессе репликации вирусного генома (см. также обзоры King 1988b; Lai 1992; Agol 1997; Nagy and Simon, 1997).

Сформулирована следующая последовательность событий. Полимераза начинает репликацию РНК с З'-конца родительской молекулы РНК (донорная матрица), затем, по тем или иным причинам, процессивная элонгация цепи приостанавливается. З'-концевой участок растущей цепи и полимераз диссоциирует от донорной матрицы и взаимодействуют с участком другой молекулы РНК (акцепторная матрица). Далее, полимераза возобновляет синтез комплементарной цепи на акцепторной матрице, используя З'-концевой участок растущей цени в качестве праймера (участок, где полимераза прекращает синтез растущей цепи называют донорным; участок, где полимераза возобновляет синтез РНК называют акцепторным).

Чтобы подтвердить возможность указанной выше схемы рекомбинации необходимо ответить на три вопроса.

(1) Почему процессивная элонгация растущей цепи прерывается (механизм выбора донорного сайта)?

(2) Каким образом осуществляется выбор акцепторного сайта?

(3) Как непосредственно РНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет смену матрицы при рекомбинации?

Возможные причины прекращения процессивной элонгации растущей цепи.

В литературе обсуждаются три возможные причины возникновения пауз в синтезе РНК при репликации. (А) Наличие относительно стабильной вторичной структуры на определенном участке родительской молекулы РНК. В работе Romanova et al. (1986), описано образование межтиповых гомологичных рекомбинантов при инфекции клеток почек зеленой мартышки полиовирусом типа 1 и типа 3. Места перекреста у межтиповых рекомбинантов были расположены на участке РНК между нуклеотидами 3943 и 4200. Этот участок может образовать как внутримолекулярную шпилечную структуру, так и участвовать в образовании относительно стабильного межмолекулярного РНК-дуплекса. Образование межмолекулярного РНК-дуплекса, по мнению авторов, может вызывать паузу в движении полимеразы при синтезе комплементарной цепи, что, вероятно, способствует смене матрицы. Возобновление синтеза РНК на акцепторной матрице приводит к появлению межтипового рекомбината. Возможность данного механизма рекомбинации подтверждается данными по локализации мест перекреста у вируса мозаики костра. Концентрацию мест перекреста у РНК1/РНКЗ рекомбинантов вируса мозаики костра наблюдали в районе участка 3' нетранслируемой области РНК1, который способен образовать межмолекулярный РНК-дуплекс с соответствующим участком в З'-НТО РНКЗ (Bujarski and Dzianott, 1991; Nagy and Bujarski, 1993; Nagy et al„ 1995).

Предполагается, что относительно стабильная внутримолекулярная шпилечная структура также может определять выбор донорного сайта при рекомбинации. Так, например, искусственно созданные стабильные шпилечные структуры на определенных участках родительских РНК томбусвирусов стимулировали концентрацию мест перекреста у рекомбинантов именно на этих участках (White and Morris, 1995). Наличие внутримолекулярной шпилечной структуры в З'-НТО РНК миковирусов стимулировало образование различных делеций или дупликаций на данном участке РНК (Shapira et al., 1991).

Образование межмолекулярного или внутримолекулярного гетеродуплекса может способствовать образованию дефектных интерферирующих геномов (далее ДИ-геномы), в результате делеции части вирусного генома у томбусвирусов (White and Morris, 1995), бромовирусов (Romero et al., 1993; Pogany et al., 1995), нодавирусов (Li and Ball, 1993), вируса полиомиелита (Kuge et al., 1986; Kuge et al., 1989).

(В) Встраивание нематричного нуклеотида. Предполагается, что встраивание нематричного нуклеотида может препятствовать дальнейшей эффективной элонгации растущей цепи РНК вирусной РНК-зависимой РНК- полимеразой (Jarvis and Kirkegaard, 1991; Pilipenko et al., 1995; Agol, 1997).

В работе Pilipenko et al. (1995), предполагается, что встраивание нематричного нуклеотида вызывает паузу в синтезе РНК, что способствует геномным перестройкам у вируса полиомиелита и вируса энцефаломиелита мышей Тейлора.

Встраивание нематричного нуклеотида может произойти на любом участке РНК независимо от его первичной структуры. Следовательно, в рамках модели смены матрицы, данный механизм возникновения паузы в синтезе РНК, хорошо объясняет возможность расположения мест перекреста у рекомбинантов на принципиально любом участке генома (Lai 1992; Agol, 1997).

(С) Наличие на донорной матрице различных сигналов, увеличивающих вероятность возникновения паузы при синтезе РНК. К таким сигналам можно отнести A/U-богатые участки. Концентрация мест перекреста у рекомбинантов на A/U-обогащенных участках отмечены при различных геномных перестройках у пикорнавирусов (King, 1988а; Pilipenko et al., 1995), образовании гомологичных рекомбинантов вируса мозаики костра (Nagy and Bujarski, 1995, 1996; Bujarski and Nagy, 1996). Предполагается, что A/U-богатые участки могут вызывать «проскальзывание» полимеразы, что, в свою очередь, увеличивает вероятность встраивания нематричных нуклеотидов и, как следствие, способствует возникновению паузы в синтезе комплементарной цепи (Nagy and Bujarski, 1995, 1996; Bujarski and Nagy, 1996; Nagy and Simon, 1997). В пользу данного предположения свидетельствуют данные о структуре мест перекреста рекомбинантов вируса мозаики костра (Nagy and Bujarski, 1996). Увеличение длины A/U-богатой гомологичной последовательности у родительских РНК на участках концентрации мест перекреста вдвое (или втрое), резко увеличивало образование рекомбинантов (до 86%), содержащих в месте перекреста дополнительные нематричные нуклеотиды (как правило, уридин).

Таким образом, выбор донорного сайта при рекомбинации в рамках модели смены матрицы может определяться особенностями первичной (A/U- обогащенные участки) и/или вторичной структуры родительских РНК. Кроме того, предполагается, что отсутствие 3'-5'-корректирующей активности у вирусных РНК-полимераз может способствовать возникновению паузы в синтезе РНК при копировании принципиально любого участка вирусного генома.

В рамках модели смены матрицы предполагается, что пауза в синтезе РНК может способствовать диссоциации полимеразы с 3'-концевым участком растущей цепи от донорной матрицы (Pilipenko et al., 1995; Lai, 1992; Nagy and Simon, 1997). Однако диссоциация З'-концевого участка растущей цепи в случае стабильного совершенного гетеродуплекса с донорным сайтом маловероятна. В связи с этим, предполагается, что A/U обогащенные участки могут увеличивать вероятность диссоциации З'-концевого участка растущей цепи от донорного сайта за счет меньшей термодинамической стабильности A/U-богатого гетеродуплекса. В пользу данного предположения косвенно свидетельствуют данные о концентрации мест перекреста рекомбинантов на A/U богатых участках у пикорнавирусов (King, 1988а) и вируса мозаики костра (Nagy and Bujarski, 1995, 1996).

Вероятность диссоциации полимеразы от матрицы, вероятно, зависит и от свойств самого репликативного комплекса (Lai, 1992). Незаконченные РНК- транскрипты были детектированы в клетках, инфицированных вирусом мышиного гепатита (Makino et al., 1986). Распределение длин абортивных транскриптов совпадало с расположением относительно стабильных вторичных структур (Baric et al., 1987). Предполагают, что абортивные транскрипты могли образоваться при репликации вирусного генома. Наличие таких абортивных транскриптов в инфицированных клетках говорит о незначительной процессивности полимеразы данного вируса, что, вероятно, и определяет относительно высокую частоту рекомбинации у данной группы вирусов (Lai, 1992).

Таким образом, вероятность диссоциации полимеразы от матрицы и, как следствие, частота рекомбинации может зависеть как от первичной и вторичной структуры родительских РНК, так и от свойств самого репликативного комплекса, например, процессивности (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997).

Выбор акцепторного участка при рекомбинации в рамках механизма смены матрицы.

Механизм выбора акцепторного сайта при рекомбинации точно не установлен. В литературе обсуждают возможность нескольких механизмов выбора акцепторного сайта у различных РНК-содержащих вирусов.

(А)Чаще всего предполагают, что выбор акцепторного сайта при рекомбинации осуществляется за счет комплементарных взаимодействий 3'- концевого участка растущей цепи и акцепторного сайта (см. обзоры King 1988b; Lai 1992; Agol 1997; Nagy and Simon, 1997). Данный механизм выбора акцепторного сайта объясняет эффективную рекомбинацию на протяженных гомологичных участках родительских молекул РНК за счет образования стабильного совершенного РНК-дуплекса между З'-концевым участком растущей цепи и акцепторной матрицей.

Расположение мест перекреста на протяженных участках с высокой степенью гомологии было отмечено у пикорнавирусов (Romanova et al., 1986; Kirkegaard and Baltimore, 1986; Tolskaya et al., 1987; Jarvis and Kirkegaard, 1992), у коронавирусов (Makino et al., 1987; Koetzner et al., 1992; van der Most et al., 1992), у альфавирусов (Raju et al., 1995), бактериофага QP (Palasingam and Shaklee, 1992), артеривирусов (Molenkamp et al., 2000), потивирусов (Varrelmann et al., 2000), бромовирусов (Bruyere et al., 2000).

Зависимость частоты рекомбинации от протяженности и степени гомологии предполагаемых донорного и акцептого сайтов родительских РНК наиболее четко показано для вируса мозаики костра (Nagy and Bujaski, 1995) и вируса полиомиелита (Tolskaya et al., 1983; Kirkegaard and Baltimore, 1986).

При смешанной инфекции культуры клеток вирусами полиомиелита, которые принадлежат разным серотипам, частота гомологичной рекомбинации значительно ниже, чем частота рекомбинации между вирусами одного серотипа. Частота рекомбинации между вирусами полиомиелита типа 1 и типа 3, составляла от 1x10~⁵ до 2x1 O'⁴ (Tolskaya et al., 1983), что на два порядка ниже, чем частота рекомбинации при внутритиповом скрещивании (King 1988b). Это соответствует данным Kirkegaard and Baltimore (1986), согласно которым частота рекомбинации между мутантным полиовирусом типа I (gr/ts) и полиовирусом типа II (дикий тип) в 170 раз ниже частоты рекомбинации в экспериментах, где родительские молекулы РНК были представлены одним соответствующим серотипом (см. также King 1988b; Jarvis and Kirkegaard, 1991).

Участок гомологии в 60 нуклеотидов, расположенный вРНК2 и

РНКЗ, обеспечивал эффективное образование гомологичных РНК2/РНКЗ рекомбинантов при совместной инфекции листьев Chenopodium hybridiu (Nagy and Bujaski, 1995). При этом частота гомологичной рекомбинации прямо пропорционально зависела от длины данного участка. Деления 37 и 45 нуклеотидов участка гомологии сокращала частоту рекомбинации вдвое. Гомологичный участок длинной 9 нуклеотидов поддерживал образование 5% РНК2/РНКЗ рекомбинантов. При длине гомологичного участка в 4 нуклеотида образование гомологичных РНК2/РНКЗ рекомбинантов не наблюдалось.

Таким образом, предполагается, что образование протяженного совершенного РНК-дуплекса между 3'-концевым участком растущей цепи и акцепторным сайтом необходимо и достаточно для эффективной посадки полимеразы на акцепторную матрицу.

Предполагается, что и относительно короткие гомологичные участки родительских молекул РНК (4-12 нуклеотида) также определяют выбор акцепторного сайта при рекомбинации у пикорнавирусов (Pilipenko et al., 1995), нодавирусов (Li and Ball, 1993), тобамовирусов (Raffo and Dawson, 1991), томбусвирусов (White and Morris, 1995), бактериофага Qp (Biebricher and Luce, 1992), MS2 (Olsthoom and van Duin, 1996), фб (Onodera et al., 1993), а также при образовании ДИ-геномов у миковирусов (Shapira et al., 1991), бромовирусов (Pogany et al., 1995).

Предполагают, что посадка полимеразы на акцепторную матрицу также может осуществляться за счет образования несовершенного (содержащего различные выпет ливания) РНК-дуплекса между 3'-концевым участком растущей цепи и акцепторным сайтом (King 1988а).

Предполагают, что образование такого несовершенного РНК-дуплекса определяет наличие различных делеций или вставок в месте перекреста при геномных перестройках пикорнавирусов (Pilipenko et al., 1995), пестивирусов (Becher et al., 1999), образовании гомологичных рекомбинантов вируса мозаики костра (Nagy and Bujarski, 1995, 1996; Bujarski and Nagy, 1996).

(B) Концентрация мест перекреста рекомбинантов в районе комплементарных участков родительских молекул РНК предполагает непосредственное участие межмолекулярных вторичных структур в выборе акцепторного сайта при рекомбинации у пикорнавирусов (Romanova et al., 1986; Tolskaya et al., 1987) и бромовирусов (Bujarski and Dzianott, 1991; Nagy and Bujarski, 1993; Nagy et al., 1995; Figlerowicz, 2000). Предполагается, что полимераза, достигнув участка, вовлеченного в образование стабильной межмолекулярной вторичной структуры, в некоторых случаях не может ее расплавить и прекращает синтез комплементарной цепи. После этого полимераза с помощью процессивного или непроцессивного механизма осуществляет смену матрицы. При этом З'-концевой участок растущей цепи

взаимодействует с акцепторным участком родительской РНК, который расположен в непосредственной близости от межмолекулярной вторичной структуры. Таким образом, выбор акцепторного сайта может определяться сближением донорной и акцепторной матриц за счет образования относительно стабильного межмолекулярного РНК-дуплекса.

(C) При изучении рекомбинации между геномной и сателлитными РНК вируса скрученности турнепса [TCV] (Cascone et al., 1990, 1993; Simmon and Nagy, 1996; Nagy et al., 1998) были выделены особые участки, мотивы I и ШАЛИВ. Изменение первичной и вторичной структуры данных мотивов влияло как на частоту рекомбинации и расположение мест перекреста, так и на эффективность репликации родительских РНК (Carpenter et al., 1995; Nagy et al., 1999,2001).

Предполагается, что выбор акцепторного сайта, в данном случае, осуществляется за счет эффективного взаимодействия полимеразы с промотор- подобными элементами мотивов I и ША/ШВ. При этом данное взаимодействие способствует относительно точной посадке полимеразы на акцепторный сайт. Мотивы I и ША/ШВ функционально можно разделить на два «домена». Один «домен» - это неструктурированный участок, расположенный у основания шпилечной структуры мотивов I и ША/ШВ, который участвует в комплементарных взаимодействиях с З'-концевым участком растущей цепи. Другой «домен» представлен шпилечной структурой, к которой полимераза обладает повышенным сродством.

Таким образом, предполагается, что при рекомбинации между геномной и сателлитными РНК вируса скрученности турнепса выбор акцепторного сайта осуществляется за счет эффективного взаимодействия полимеразы с репликативными энхансерами акцепторной матрицы (Simon and Nagy, 1996; Nagy et al., 1998, 1999, 2001). При этом комплементарные взаимодействия 3'- концевого участка растущей цепи с акцепторным сайтом необходимы, но не достаточны для эффективного взаимодействия РНК-полимеразы с акцепторной матрицей (Simon and Nagy, 1996). Данный механизм выбора акцепторного сайта подтверждают экспериментальные данные, полученные на модельных системах in vitro (Nagy et al., 1998) и in vivo (Nagy et al., 1999).

Однако, по мнению Nagy et al. (1998), участие промоторных элементов в РНК-рекомбинации не является уникальной особенностью вируса скрученности турнепса. Наличие мест перекреста в районе субгеномных промоторов вируса мозаики костра (Allison et al., 1990), вируса Синдбис (Weiss and Schlesinger, 1991), вируса табачной мозаики (Beck and Dawson, 1990) говорит о том, что данные структуры могут принимать непосредственное участие в выборе акцепторного сайта при рекомбинации. Кроме того, наличие мест перекреста в районе промоторов, расположенных в 3'- и 5'-нетранслируемых областях вируса мозаики костра (Nagy and Bujarski, 1992; Rao and Hall, 1993), вируса Синдбис (Hajjou et al., 1996), вируса погремковости табака (Goulden et al., 1991), вируса мозаики огурца, вируса аспермии томатов (Femandez-Cuartero et al., 1994), вируса штриховатой мозаики ячменя (Edwards et al., 1992), говорит о возможном участии данных структур в механизме рекомбинации. Таким образом, по мнению Nagy et al. (1998), промоторные элементы геномной РНК могут принимать участие в рекомбинации, осуществляя эффективную посадку полимеразы на акцепторный сайт.

Итак, предполагается, что выбор акцепторного сайта определяется наличием на родительских молекулах РНК: (1) протяженных гомологичных последовательностей; (2) комплементарных участков, формирующих межмолекулярные вторичные структуры; (3) промотор-подобных вторичных структур, обладающих повышенным сродством к полимеразному комплексу.

Необходимо отметить, что для эффективного взаимодействия полимеразы с акцепторной матрицей предполагаемый акцепторный сайт должен быть доступен, т. е. не входить в состав стабильной вторичной структуры. Так, например, места перекреста рекомбинантов вируса полиомиелита в районе стабильной вторичной структуры всегда находились на петлевых одноцепочечных участках (Romanova et al., 1986; Tolskaya et al., 1987). При введении последовательностей, формирующих стабильные шпилечные структуры, в район концентрации мест перекреста рекомбинантов у томбусвирусов, места перекреста «сдвигались» на участки, потенциально не образующие стабильной вторичной структуры (White and Morris, 1995).

Таким образом, предполагается, что полимераза не может возобновить синтез РНК на участке, формирующим стабильную вторичную структуру (Romanova et al., 1986; Tolskaya et al, 1987; White and Morris, 1995).

Возможные механизмы смены матрицы. Как непосредственно РНК- зависимая РНК-полимераза осуществляет смену матрицы при рекомбинации, достоверно не известно. По мнению Nagy and Simon (1997), предполагаемые варианты механизма смены матрицы можно разделить на процессивный и непроцессивный.

Непроцессивный механизм предполагает, что после возникновения паузы в синтезе РНК, репликативный комплекс с З'-концевым участком растущей цепи диссоциируют от донорной матрицы. В рамках процессивного механизма смены матрицы предварительная диссоциация полимеразы от донорного сайта при рекомбинации не происходит.

Непроцессивный механизм. В рамках непроцессивного механизма необходимо объяснить, как полимераза будет осуществлять промотор- независимую посадку на внутренний участок вирусного генома. В связи с этим представляется, что наиболее обосновано непроцессивный механизм сформулирован для коронавирусов (Makino et al., 1986) и вируса скрученности турнепса (Carpenter et al., 1995; Simon and Nagy, 1996; Nagy etal., 1998, 1999).

Предполагается, что возможность данного механизма у коронавирусов определяется характерными свойствами репликативного комплекса. Особенностью транскрипции коронависусов является непроцессивный синтез шести мРНК. В составе мРНК лидерная последовательность 5'-концевой части генома соединяется с разными по длине фрагментами З'-концевой части генома (Makino et al., 1986, 1988; Lai, 1990; Zhang and Lai, 1994). Непроцессивный синтез мРНК предполагает диссоциацию РНК-полимеразы от матрицы с последующей посадкой на внутренний участок РНК (Lai, 1990; Sawicki and Sawicki, 1990; Zhang and Lai, 1994). Таким образом, определенные свойства репликативного комплекса (невысокая процессивность и возможность эффективного взаимодействия с внутренними участками геномной РНК), необходимые для эффективной транскрипции вирусного генома, могут определять непроцессивный механизм РНК-рекомбинации у коронавирусов (Makino et al., 1986).

Эффективность рекомбинации у вируса скрученности турнепса зависит от наличия на акцепторной матрице промотор-подобных вторичных структур. Следовательно, посадка полимеразы на внутренний участок РНК при смене матрицы определяется повышенным сродством репликативного комплекса к определенным вторичным структурам (Carpenter et al., 1995; Simon and Nagy, 1996; Nagy et al., 1998,1999,2001).

Непроцессивный механизм рекомбинации не требует диссоциации репликативного комплекса от З'-концевого участка растущей цепи. Следовательно, по мнению Nagy and Simon (1997), посадка полимеразы на акцепторную матрицу может осуществляться за счет комплементарных взаимодействий З'-концевого участка растущей цепи с акцепторным сайтом. Таким образом, непроцессивный механизм принципиально можно использовать для объяснения рекомбинации у большинства РНК-содержащих вирусов.

Процессивный механизм. Предполагается, что смена матрицы осуществляется без предварительной диссоциации РНК-полимеразы от донорной матрицы.

Согласно одной модели, смена матрицы в рамках процессивного механизма идет за счет вытеснения донорной матрицы из каталитического центра РНК-полимеразы (Jarvis and Kirkegaard, 1991). Данная модель построена по аналогии с механизмом удаления нематричного нуклеотида с З'-конца растущей цепи ДНК 3'-->5' экзонуклеазным доменом ДНК-зависимой ДНК- полимеразой I Е. coli. При встраивании нематричного нуклеотида в растущую цепь, дальнейший синтез ДНК приостанавливается, и ДНК-полимераза проскальзывает назад относительно ДНК-матрицы на восемь нуклеотидов (Freemont et al., 1988). З'-концевой участок растущей цепи ДНК диссоциирует от матрицы и перемещается в экзонуклеазный домен. После удаления нематричного нуклеотида синтез комплементарной цепи возобновляется (Freemont et al., 1988; Catalano et al., 1990).

Авторы предположили, что встраивание нематричного нуклеотида в растущую цепь РНК также может вызвать паузу в синтезе РНК и возвратное движение РНК-полимеразы относительно матрицы (Jarvis and Kirkegaard, 1991). Получив относительную свободу, 3' концевой участок растущей цепи диссоциирует от донорной матрицы и за счет комплементарных взаимодействий отжигается на гомологичный участок акцепторной матрицы. Затем, полимераза проскальзывает вперед, при этом, акцепторная матрица замещает в каталитическом центре донорную матрицу. После этого синтез растущей цепи возобновляется уже по акцепторной матрице.

В рамках другой модели процессивного механизма, предполагается, что смена матрицы может осуществляться за счет проскока, «шунтирования» РНК- полимеразой основания стабильной вторичной структуры при синтезе РНК.

Впервые модель «шунтирования» была использована для объяснения образования делений в кодирующей области и 5'-НТО вируса полиомиелита (Kuge et al., 1986; Kuge et al., 1989). Авторы предполагают, что образование стабильной структуры происходит за счет комплементарных взаимодействий донорного и акцепторного сайтов с участком "поддерживающей" последовательности (рис. 1). В качестве поддерживающей последовательности может выступать геномная РНК обратной полярности.

Рис. 1. Гипотетическая модель образования рекомбинантов вируса полиомиелита (Kuge et al., 1986)

Непрерывной и штрих-пунктирной линиями обозначены матричная РНК и поддерживающая последовательность, соответственно. Пунктирной стрелкой обозначена растущая цепь и указано направление синтеза РНК вирусной РНК-полимеразой. Смена матрицы происходит за счет «шунтирования» РНК-полимеразойоснования вторичной структуры, образованной матричной и поддерживающей молекулами РНК.

В результате, полимераза, при синтезе комплементарной цепи может осуществить проскок ("шунтирование") основания данной структуры, что приведет к отсутствию в составе синтезируемой молекулы РНК выпетленного участка. При этом полимераза проскакивает основание вторичной структуры без паузы в синтезе РНК и предварительной диссоциации от донорного сайта.

С помощью механизма «шунтирования» также объясняют образование рекомбинантов вируса мозаики костра (Bujarski and Dzianott, 1991; Nagy and Bujarski, 1993; Nagy et al., 1995; Figlerowicz et al., 1997, 1998). При этом предполагают, что образование РНК1/РНКЗ рекомбинантов у данного вируса идет за счет «шунтирования» основания стабильного РНК-дуплекса между.

Классификация РНК-рекомбинации. Итак, классические исследования РНК-рекомбинации у представителей семейств пикорнавирусов и коронавирусов показали, что место перекреста у большинства рекомбинантов располагалось на соответствующих участках родительских молекул РНК, гомологичных по первичной структуре (Romanova et al., 1986; Tolskaya et al., 1987; King 1988a, 1988b; Lai, 1992). Накопление экспериментальных данных показало, что РНК-рекомбинация у других вирусов может приводить к образованию рекомбинантов другого типа (см. обзоры Lai, 1992; Agol, 1997; Nagy and Simon, 1997; Aaziz and Tepfler, 1999). Возникает необходимость классификации всего многообразия рекомбинантов и установление соответствия между предполагаемыми механизмами рекомбинации и типами РНК-рекомбинантов. В литературе были предложены две классификации РНК-рекомбинации (Lai, 1992; Nagy and Simon, 1997). Ниже предложена собственная классификация.

Взяв за основу характер молекул РНК, участвующих в рекомбинации, и структуру рекомбинантов в месте перекреста, предлагается разделить рекомбинацию на три типа.

(1) Точная гомологичная рекомбинация. Происходит между родственными молекулами РНК с одинаковой или близкой первичной структурой. Места перекреста располагаются на абсолютно одинаковых или очень близких по первичной структуре последовательностях, расположенных на точно соответствующих участках родительских молекул РНК. При этом рекомбинантная молекула имеет ту же последовательность и структурную Форганизацию генома, что и родительские молекулы РНК. Иными словами,

(2) Неточная гомологичная рекомбинация. Описывает случаи рекомбинации между принципиально любыми молекулами РНК. Места перекреста на каждой из родительских молекул РНК лежат на произвольных участках с относительно высокой степенью гомологии. При этом рекомбинантная молекула РНК может содержать область гомологии с родительскими РНК только в районе места перекреста. Следовательно, рекомбинантная молекула РНК имеет уже другую последовательность и структурную организацию генома по сравнению с родительскими молекулами РНК. Иными словами, происходит неточная гомологичная рекомбинация. Поскольку предполагается, что участки гомологии длинной 4-12 нуклеотидов влияют на выбор акцепторного сайта при рекомбинации, в данный класс попадают все рекомбинанты, содержащие в сайте перекреста относительно короткие участки гомологии.

(3) Негомологичная рекомбинация. Описывает случаи рекомбинации между принципиально любыми молекулами РНК. Места перекреста на каждой из родительских молекул РНК могут располагаться на произвольных участках с различной первичной структурой. Следовательно, места перекреста у рекомбинантов не содержат гомологичных нуклеотидов с родительскими молекулами РНК.

Итак, предложено три класса РНК-рекомбинации. В связи с этим возникает вопрос - насколько адекватно предполагаемые механизмы выбора акцепторного сайта объясняют образование рекомбинантов всех трех типов?

Выбор акцепторного сайта за счет образования гетеродуплекса между 3'- концевым участком растущей цепи и акцепторной матрицей относительно неплохо объясняют преимущественное образование рекомбинантов с областью гомологии в сайте перекреста (гомологичные и неточные гомологичные рекомбинанты).

Определенные сложности возникают при объяснении образования негомологичных рекомбинантов. Для возобновления синтеза растущей цепи на акцепторной матрице необходимы комплементарные взаимодействия 3'- концевых нуклеотидов растущей цепи и акцепторного сайта (King 1988а, 1988b; Lai, 1992; Pilipenko et al., 1995). Однако, структура мест перекреста у негомологичных рекомбинантов (отсутствие гомологии) отрицает возможность такого рода взаимодействий.

Может показаться, что проблема с объяснением образования негомологичных рекомбинантов является надуманной, поскольку гомологичная рекомбинация принципиально происходит гораздо чаще, чем негомологичная. При этом гомологичные рекомбинанты составляют подавляющее большинство рекомбинантов, образующихся как in vivo, так и in vitro.

Однако за последнее время было получено большое количество данных по негомологичной РНК-рекомбинации. Образование негомологичных рекомбинантов с относительно высокой частотой описано для бактериофага QP (Chetverin et al., 1997; Chetverina et al., 1999), вируса Синдбис (Raju et al., 1995; Hajjou et al., 1996), вируса мозаики огурца (Roossinck et al., 1999), вируса мозаики костра (Bujarski and Dzianott, 1991; Nagy and Bujarski, 1993; Nagy et al., 1995), миковирусов (Shapira et al., 1991). Отсутствие гомологичных нуклеотидов в сайтах делеции было описано для ДИ-геномов вируса полиомиелита (Kuge et al., 1986), вируса табачной мозаики (Raffo and Dawson, 1991), миковирусов 4 (Shapira et al., 1991). in vivo и in vitro характерно только для представителей двух семейств: пикорнавирусов и коронавирусов. У остальных вирусов частота гомологичной рекомбинации значительно ниже (см. обзор Lai, 1992). Согласно литературным данным, частота гомологичной рекомбинации в 1% наблюдается между маркерами, расположенными на расстоянии в 1300 и 1700 у пикорнавирусов (вируса полиомиелита и вируса ящура) и коронавирусов, соответственно. Что в пересчете на один нуклеотид составляет 7,6 х КГ⁶ и 5,8x1 O'⁶, соответственно (Jarvis and Kirkegaard, 1992; Lai 1992; Tang et al., 1997; Duggal et al., 1997).

Частота же гомологичной рекомбинации у бактериофага QP, в пересчете на один нуклеотид, составляет 2,5x10' , что, как минимум, на шесть порядков ниже частоты гомологичной рекомбинации у пикорнавирусов и коронавирусов (Palasingam and Shaklee, 1992).

У альфавирусов (вирус Синдбис) при использовании стандартных генетических подходов (скрещивание вирусов с различными фенотипическими маркерами) обнаружить РНК-рекомбинацию, вообще, не удалось (Weiss and Schlesinger, 1991). Только в 1995 году Rajy et al. (1995), было показано образование рекомбинантов, места перекреста которых располагались на участках гомологии родительских РНК. При этом данные гомологичные рекомбинанты удалось получить только при использовании модифицированных геномных РНК вируса Синдбис.

В-третьих, за последнее время получено большое количество данных, согласно которым вирусная и клеточная РНК, а также различные молекулы клеточных РНК могут рекомбинировать между собой по негомологичному 4типу.

Анализ первичной последовательности РНК вируса скрученности листьев картофеля (Mayо et al., 1991), ДИ-геномов вируса Синдбис (Monroe and Schlesinger, 1983), сателлитных РНК фага QP (Munishkin et al., 1988), вируса мозаики огурца (Masuta et al., 1992) показал, что данные РНК содержат последовательности различных клеточных мРНК (Mayo et al., 1991) и тРНК (Monroe and Schlesinger, 1983; Munishkin et al., 1988; Masuta et al., 1992).

Кроме того, различные клеточные последовательности (участки клеточных генов, например, убиквитина) в области неструктурных генов вируса диареи крупного рогатого скота вызывали появление штамма данного вируса с патогенным фенотипом (Collett et al., 1989; Meers et al., 1991). Подобный пример был так же описан для вируса гриппа «С». Сегмент 28S РНК был найден в области гена гемагглютинина, что так же привело к увеличению патогенности 0данного вируса (Khatchikian et al., 1989).

Хотя экспериментально возможность рекомбинации между клеточными РНК показать пока не удалось (отсутствие подходящих экспериментальных подходов), анализ первичной структуры некоторых сателлитных RQ РНК фага QP показал, что они состоят только из фрагментов клеточных РНК (Muniskin et al., 1991; Moody et al., 1994).

Таким образом, за последнее время было описано большое количество примеров образования негомологичных рекомбинантов при участии различных вирусных и клеточных РНК. При этом существуют объективные сложности с объяснением механизма образования данных негомологичных рекомбинантов в рамках репликативной модели.

Данные трудности, по мнению А. Б. Четверина с соавторами, говорят о том, что логичнее описывать гомологичную и негомологичную рекомбинацию не разными вариантами смены матрицы, а принципиально различными механизмами (Chetverin et al., 1997; Четверин, 1999).

Авторы обращают внимание на то, что одна и та же частота негомологичной рекомбинации наблюдается у вируса полиомиелита, обладающего высокой частотой гомологичной рекомбинации, РНК-содержащих колифагов, частота гомологичной рекомбинации которых в миллион раз ниже, и альфавирусов, у которых гомологичная рекомбинация, вообще, не обнаружена при использовании стандартных генетических подходов (Четверин, 1999).

Таким образом, частота гомологичной рекомбинации является вирус- специфическим параметром (Chetverin et al., 1997; Четверин, 1999), который может определяться эволюционно закрепленными свойствами репликативного комплекса (Lai, 1992). В то время как частота негомологичной рекомбинации не зависит от свойств репликативного комплекса того или иного вируса. При этом возможность рекомбинации между вирусной и клеточной РНК, а также между различными клеточными РНК по негомологичному типу говорит о том, что негомологичная РНК-рекомбинация явление более общее (универсальное), чем гомологичная.

Такми образом, по мнению авторов, логично предположить, что негомологичная рекомбинация осуществляется в рамках принципиально другого нерепликативного механизма (Chetverin et al., 1997; Четверин 1999).

Более того, экспериментальные данные позволяют говорить о том, что образование негомологичных рекомбинантов между фрагментами сателлитных РНК фага QP идет по нерепликативному механизму, видимо, за счет химических свойств, присущих самим молекулам РНК (Chetverin et al., 1997; Chetverina et al., 1999).

Размещено на Allbest.ru