Вплив іонів міді, кадмію та заліза на вміст низькомолекулярних антиоксидантних сполук та активність гваяколпероксидази і глутатіонредуктази тютюну

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича

факультет біології, екології та біотехнології

кафедра молекулярної генетики та біотехнології

Курсовая робота

Вплив іонів міді, кадмію та заліза на вміст низькомолекулярних антиоксидантних сполук та активність гваяколпероксидази і глутатіонредуктази тютюну

Пентелюк Олена Сергіївна

Науковий керівник: к.б.н. І.І. Панчук

Завідувач кафедри

молекулярної генетики та біотехнології

доктор біологічних наук, професор Р.А. Волков

Чернівці, 2011

Зміст

Вступ

1. Огляд літератури

1.1 Вплив важких металів на рослинний організм

1.2 Системи антиоксидантного захисту рослин

1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази

1.2.2 Глутатіон редуктаза як фермент антиоксидантного захисту

1.2.3 Низькомолекулярні антиоксидантні сполуки

2. Матеріали та методи дослідження

2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами

2.2 Визначення активності гваякол пероксидази

2.3 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази

2.4 Техніка безпеки праці в лабораторії

Вступ

В умовах активної антропогенної діяльності, бурхливого розвитку промисловості та, як наслідок, інтенсивного забруднення довкілля рослинам все важче вчасно пристосуватись до змін у навколишньому середовищі. Окрім антропогенного фактору також велику роль відіграють несприятливі абіотичні та біотичні екологічні чинники, які, негативно впливаючи на рослинний організм, зумовлюють виникнення стресу та стресових реакцій у відповідь на подразник. Сюди належать кліматичні і едафічні складові - надмірна кількість води, високі та низькі температури, дисбаланс поживних речовин та мінеральних елементів [Atilla Gьr, 2010; Vittoria Locato, 2009].

Важкі метали (ВМ) - одні з основних хімічних забруднювачів довкілля через їх швидке накопичення у ґрунті та легкодоступність для рослин. Надлишкове надходження металів в екосистеми в результаті антропогенного впливу часто призводить до незворотніх змін та порушення життєвоважливих функцій у більшості організмів [Головко, 2008]. Тому за останні роки підвищилась зацікавленість у вивченні їх впливу на рослинний організм. Іони металів необхідні для росту і розвитку рослинного організму, але в надмірних кількостях токсично впливають на нього [Таланова, 2001]. Цим вони зумовлюють зміни на всіх рівнях метаболізму, зокрема сприяють утворенню активних форм кисню (АФК) [Desiikan R, 2004], таких як пероксид водню, супероксид аніон, гідропероксид.

Такі процеси провокують відповідь двох ланок антиоксидантної системи - ферментативної та неферментативної. Пероксидази та глутатіон редуктаза належать до ферментативної ланки захисту, знешкоджуючи відповідно пероксид водню та відновлюючи окиснений глутатіон [Li-Juan Quan, 2008]. До неферментативної ланки належать аскорбат та глутатіон, що виконують функцію антиоксидантів [Padhye S, 2001]. Аскорбат знешкоджує супероксид аніон шляхом перетворення його у пероксид [Aiguo Qin, 2010; Michael W. F. Luwe, 1993], а глутатіон відновлює дисульфідні зв`язки у білках та здійснює детоксикацію гідропероксидів [Y. Cai, 2010].

Для вивчення механізмів відповіді рослинної клітини на дію ВМ важливо оцінити різноманітні показники оксидативного стресу, такі як вміст відновленого і окисленого аскорбату, глутатіону, а також активність гваякол пероксидази і глутатіон редуктази.

Тому метою даної роботи було дослідити зміни активності гваякол пероксидази, глутатіон редуктази, вмісту аскорбату та глутатіону, й ізоферментний спектр гваякол пероксидази та глутатіон редуктази рослин тютюну в умовах стресу, викликаного ВМ.

Відповідно до поставленої мети було сформовано ряд наступних завдань:

1. Визначення відносної активності та порівняння ізоферментного спектру гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 за дії іонів Cu2+, Cd2+, Fe3+ та за нормальних умов.

2. Визначення відносної активності та порівняння ізоферментного спектру глутатіон редуктази контрольних та стресованих рослин тютюну.

3. Визначення вмісту аскорбату у рослин тютюну за дії стресу, викликаного іонами важких металів.

4. Визначення вмісту глутатіону у рослин тютюну за дії стресу.

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Вплив важких металів на рослинний організм

важкий метал рослина гваякол пероксидаза

В природі рослини піддані впливу різноманітних стресових чинників [Shu-Hsien Hung, 2005], джерелом яких є зміни умов довкілля [Graїyna D№browska, 2006], такі як посуха, високі та низькі температури, затоплення, нестача чи надлишок мінеральних речовин, зокрема іонів металів [Ron Mittler, Eduardo Blumwald, 2010; Anil Grover, 2001], засолення, низькі температури, інтенсивне освітлення [Atilla Gur, 2008; You-Cai Xiong, 2006] тощо.

Клітинний гомеостаз підтримується нестійкою рівновагою між численними метаболічними шляхами, які проходять у різних органелах. Різні стресові фактори можуть порушити цю рівновагу, що призводить до оксидативного стресу та як наслідок - надпродукції АФК [Колупаєв, 2007; Shu-Hsien Hung, 2005]. Термін «активні форми кисню» (АФК) означає сукупність реакційно здатних форм кисню, більшість з яких короткоживучі. Вони виникають внаслідок збудження атомів кисню або в окисно-відновних реакціях (ОВР). АФК утворюються в реакціях одно-, дво- та триелектронного відновлення кисню в результаті спонтанного та ферментативного окиснення, а також у фотоіндукованих реакціях. АФК поділяються на: вільнорадикальні частки - супероксидний аніон-радикал (О2•- ), гідроксильний радикал (ОН•), пероксидні радикали (RO2•) та ін., та нейтральні молекули, такі як пероксид водню (Н2О2), синглетний кисень (1О2), озон (О3) та ін. [Колупаєв, 2007].

За нормальних умов АФК постійно генеруються у хлоропластах, мітохондріях, мікросомах та плазматичній мембрані рослинної клітини і за нормальних умов [Vittoria Locato, 2009]. Вони являються токсичними вторинними продуктами аеробного метаболізму та регуляторами росту, розвитку і захисту: здійснюють контроль та регулюють всі біологічні процеси в клітині - ріст, клітинний цикл, апоптоз, гормональну передачу сигналів, дихання, утворення АТФ, фотосинтез тощо.

Посилення утворення АФК - одна з найменш специфічних реакцій живих організмів на дію біотичних та абіотичних стресорів. Завдяки інтенсивному утворенню АФК рослина може знищити патоген, також вони виступають сигнальними молекулами, які активують гени ферментів, що беруть участь в захисних реакціях клітини. За дії абіотичних чинників вони пошкоджують важливі клітинні компоненти, такі як ДНК, білки та ліпіди: АФК викликають окислювальні пошкодження білків, що виявляється в окисненні -SH груп, FeS-центрів ферментів, фрагментації пептидних ланцюгів, підвищенні чутливості білків до протеаз. Вільні радикали здатні прямо взаємодіяти з ДНК, викликаючи пошкодження азотистих основ, дезоксирибози та появу нових ковалентних зв`язків (зшивок). Непряма дія активних форм кисню полягає у їх утворенні рід час виходу з різних компартментів іонів кальцію та активації ними нуклеаз. Загальновідомим є те, що надлишок вільних радикалів кисню ініціює програму апоптозу клітини [Колупаєв, 2007].

Рослина здатна утилізувати АФК в ході різноманітних метаболічних процесів, наприклад, під час утворення лігніну, опадання листя та квіток, старіння клітин, дозрівання плодів та цвітіння [Graїyna D№browska, 2006]. Також рослинні організми захищаються тим, що переводять вільні радикали в менш активні форми [Atilla Gur, 2008].

Сьогодні все більш поширена гіпотеза, згідно якої причиною оксидативного стресу є не стільки продукція АФК, скільки порушення часово-просторового балансу між їх генерацією та видаленням [Колупаєв, 2007].

Останнім часом у зв`язку з бурхливим промислово-технологічним прогресом у біосфері відбувається накопичення важких металів [Колупаєв, 2007; Ron Mittler, 2004, Nobuhiro Suzuki, 2006]. Стрес, викликаний іонами ВМ, впливає на габітус, анатомо-морфологічні, молекулярно-фізіологічні характеристики та розвиток рослин [Shu-Hsien Hung, 2005].

До ВМ умовно належать хімічні елементи з атомною масою більше 50 а.о.м., які володіють властивостями металів та металоїдів. З хімічної точки зору термін «важкі метали» використовується для елементів густиною більше 5 г/см3 [A. Michalak, 2006]. За Реймерсом до ВМ належать: Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg, Pt, Ag, W, Fe, Au, Mn. До екологічно значущих важких металів включені: свинець, кадмій, ртуть, сурма, марганець, нікель, кобальт, цинк, мідь, залізо, молібден.

Але більшість цих металів життєво необхідні (есенціальні) для живих організмів. До них належать такі важкі метали як марганець (Mn), нікель (Ni), мідь (Cu), кобальт (Co) і цинк (Zn), які разом із залізом (Fe) і молібденом (Mo) входять до складу ферментів або їх активаторів [Евсеева, 2003]. У невеликих концентраціях вони необхідні для нормальної життєдіяльності рослин як мікроелементи. Мікроелементи беруть участь в ключових метаболічних процесах, активують багато ферментів - у складі металоензимів здійснюють перенесення електронів в енергоспряжених мембранах хлоропластів та мітохондрій [Головко, 2008].

Щоправда, не всі ВМ однаково небезпечні для рослин: найбільш токсичними є Hg, Cu, Ni, Pb, Co, Cd, Ag, Bi та Sn, для квітнучих рослин - Hg > Pb > Cu > Cd > Cr > Ni > Zn. Запропонований і такий ряд токсичності елементів: Cu > Ni > Cd > Zn > Pb > Hg > Fe > Mo > Mn [Евсеева, 2003].

З літератури відомо, що підвищені концентрації ВМ у навколишньому середовищі можуть призводити до малоспецифічних фізіологічних і біохімічних змін [Головко, 2008]. Дослідження показують, що вплив іонів ВМ викликає підвищення активності ферментативної антиоксидантної системи [Fusun Yurekli, 2006]. Як найбільш загальні прояви стресу, викликаного надлишком ВМ, визначають:

· зміни активності ферментів;

· пошкодження мембран;

· гормональний дисбаланс;

· дефіцит необхідних елементів;

· інгібування фотосинтезу;

· утворення активних форм кисню [Головко, 2008];

· перекисне окиснення ліпідів [Колесниченко, 2009].

Намагання знайти кореляцію між токсичністю та фізичними і хімічними властивостями металів допомогли дійти певних узагальнень. Встановлено, що важливою властивістю, яка визначає біологічну ефективність іонів ВМ, є їх здатність до комплексоутворення. Константи утворення хелатних комплексів залежать від заряду, радіусу, степеню гідратації іона металу та форми його електронних орбіталей, які беруть участь в утворенні ковалентного зв'язку з хелатною групою, а також нуклеофільністю ліганда. Токсичність розчинів солей металів позитивно корелює з електронегативністю, яка визначає здатність металу вступати в хімічні реакції з утворенням іонних або ковалентних зв'язків. Важливою характеристикою біологічної дії іонів металів є розчинність їх сульфідів. При цьому найбільш отруйними виявляються метали, сульфіди яких найменш розчинні. Ця закономірність являє собою відображення двох взаємопов'язаних явищ: особливого споріднення багатьох металів з тіоловими (сульфгідрильними) групами та біологічної ролі -SH груп. Значення тіолових груп для нормального функціонування білків дуже велике. За реакції іонів металів із сульфгідрильними групами утворюються нерозчинні меркаптиди, що є причиною інактивації ферментів. Дуже високу спорідненість до -SH груп виявляють Hg, Cd, Ag, Au, Sb, Cu, Pb, As. Цікавий факт, що властивість металів утворювати нерозчинні сполуки з тіоловими групами, яка обумовлює їх надзвичайну токсичність, також лежить в основі механізму детоксикації цих елементів (наприклад, Hg, Cd, Ag, Au) [Евсеева, 2003].

Рослини розвинули комплексну систему гомеостазу вмісту металів для регулювання надходження та розподілу ВМ, таким чином захищаючи метаболічні процеси. Було запропоновано кілька стратегій/механізмів для опису того, як рослини витримують наявність ВМ. Це - виключення, яке обмежує надходження ВМ, включення (секвестрація, тобто поглинання, та компартменталізація металу в органах і органелах) та/або утворення фітохелатинів. Відомо, що за низьких концентрацій міді рослини персика використовували стратегію виключення, а за середніх - 10-100 µМ - включення. Наведені концентрації - порівняно більші за порогові, хоча звичайні культурні рослини витримують такий діапазон концентрацій. Щоправда, Eucaliptus та Betula здатні витримувати концентрації купруму 1.7-3 М у тканинах листків [Lara Lombardi, 2005].

Але рослини можуть і пристосовуватись до змінених умов зростання. Так, відомо, що, не маючи механізмів специфічного захисту до металів, рослини стають на преадаптивний шлях забезпечення стійкості і більш-менш успішно ростуть за таких умов. Крім цього, преадаптивна концепція стійкості рослин до антропогенних факторів базується на фактах здатності окремих структур рослинного організму виконувати нові захисні функції без шкоди для попередніх. На сьогодні відомі конститутивні механізми, які забезпечують стійкість до важких металів (білки теплового шоку - БТШ, ліганди, фітохелатини, металотіонеїни та ін.), які надають рослинам змогу акумулювати токсичні елементи в метаболічно інертних органах і органелах, або хелатувати, тобто переводити їх у фізіологічно безпечні форми. Щоправда, універсального механізму, який би забезпечував стійкість рослини до кількох ВМ, не існує [Колесниченко, 2009].

За відношенням до концентрації металів у ґрунті та в рослині розрізняють рослини ексклудери, індикатори, акумулятори та гіперакумулятори. Всі ці рослини виробили в процесі еволюції механізми, які допомагають їм вижити в умовах підвищених концентрацій металів, наприклад, толерантні до міді рослини Silene cucubalus екскретують в середовище речовини, що зв'язують іони міді. Зокрема, ексклудери мають природні бар'єри, які перешкоджають поглинанню ВМ (підвищення рН ризосфери), акумулятори змінюють рН виділенням протонів, які замінюються на іони металів у ґрунтових колоїдах, можуть детоксикувати їх [Головко, 2008]. Толерантність у рослин забезпечується певними зовнішніми механізмами, які обмежують поглинання металів коренями. Зокрема, це утворення нетоксичних хелатів у ризосфері з допомогою органічних кислот або імобілізація ВМ у клітинних стінках [A. Michalak, 2006].

Важкі метали індукують оксидативний стрес в клітинах та тканинах наступними шляхами:

1) вони переносять електрони в одноелектронних реакціях, які стимулюють утворення вільних радикалів. Т.з. перехідні метали (Fe, Cu, Mn та ін.), які мають неспарені електрони на їхніх орбіталях, приймають та віддають такі електрони на кисень, що провокує утворення АФК, їх взаємоперетворення та оксидоредукцію;

2) метали порушують метаболічні шляхи, особливо в тилакоїдних мембранах, що також тягне за собою утворення вільних радикалів та АФК;

3) на додачу ВМ переважно інактивують антиоксидантні ферменти (пероксидази, каталазу, супероксиддисмутазу), які знешкоджують АФК;

4) накопичення ВМ зменшує пул низькомолекулярних антиоксидантних сполук, таких як глутатіон, який використовується для утворення фітохелатинів [A. Michalak, 2006].

Токсичність ВМ спричинює пригнічення росту рослин, що пов'язано з зі змінами фізіологічних процесів, викликаних оксидативним стресом [Lara Lombardi, 2005].

Кадмій

Кадмій - один найбільших токсичних полютантів, знайдених у повітрі, воді та грунті, не є есенціальним для рослин. Цей метал впливає на фотосинтезуючий, дихальний та азотний обмін. Як наслідок - зниження біомаси, пригнічення росту стебла, кореня, листкової пластинки, навіть смерть рослини [Magda Pal, 2002]. Він мобільний урослинах, накопичується не лише в коренях та листках, а й у зерні [Головко, 2008]. Пригнічує ростові процеси більшою мірою, ніж Zn2+ і Pb2+, оскільки подібний цинку за хімічним властивостями і завдяки цьому заміщує цинк в металобілкових комплексах ферментів, інгібуючи їх функції [Евсеева, 2003]. Являючись найагресивнішим серед важких металів, викликає оксидативний стрес у рослинах [Magda Pal, 2002] шляхом генерування вільних радикалів та активних форм кисню таких як: супероксид радикал (О2•- ), гідроген пероксид (Н2О2) та гідроксильний радикал (ОН•). Cd2+ накопичується в коренях, стеблі і у листках. Фотосинтез також чутливий до дії кадмію, оскільки хлорофіл є мішенню для впливу іонів цього металу [Hossam Saad El-Beltagi, 2010]. Кадмій знижує поглинання кисню клітинами кореня та ізольованими клітинами тютюну. Він інгібує транспорт електронів та протонів у мітохондріях, що може призводити до порушення роботи електрон-транспортного ланцюга. Цей метал інгібує активність ключових ферментів гліколізу та пентозофосфатного окиснювального шляху, порушує водний статус рослини.

З літератури відомо, що протягом стресу кадмій інтенсивніше накопичується в молодих листках кукурудзи, в коренях накопичення відбувається повільніше, але концентрація металу набагато більша. Одноденний стрес кадмієм лише дещо зменшує активність гваяколпероксидази та глутатіонредуктази в коренях кукурудзи [Gabriella Szalai, 2002; Magda Pal, 2002]. Також він пригнічує ріст рослин та їх спричинює їх загибель, наприклад, за впливу концентрацій кадмію 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 мМ на проростки кадмію спостерігалось значне пригнічення їх росту порівняно з контрольними (не піддавались впливу металу), а на 4 тиждень досліду - загибель усіх підослідних рослин [Колесниченко, 2009]. Кадмій зумовлює виникнення жовтих та коричневих плям на листках рису [Y. Cai, 2010]. Також цей метал може індукувати пошкодження хромосом, але ця його здатність менша порівняно зі свинцем, який вважається менш отруйним для клітин. Показано, що обробка насінин Crepis capillaries 0,01 М розчином CdCl2 протягом години підвищувала частоту перебудов хромосом на 1,69% порівняно з контролем, а 27-годинна експозиція за тієї ж концентрації - лише на 0,21 %. Відома здатність цього металу підвищувати частоту мікроядер при поділі клітин коренів Vicia faba та Allium cepa за дії концентрації 5 та 50 мкМ розчину CdCl2 протягом 24 годин [Евсеева, 2003].

Мідь

Мідь за нормальних концентрацій відіграє вирішальну роль у процесах росту та розвитку рослин, оскільки є кофактором багатьох ферментів і бере участь в утворенні їх конформації. Але в надлишку вона може спричинити оксидативний стрес завдяки тому, що пошкоджує біомакромолекули шляхом зміни їх окисно-відновного потенціалу, виснажує пул глутатіону та модифікує сульфгідрильний гомеостаз. Вільні іони металу можуть незворотно зв'язувати SH-групи каталітичних центрів ферментів. Купрум - компонент ланок фотосинтетичного (пластоціанін) та дихального (цитохром оксидаза) електрон-транспортних ланцюгів (ЕТЛ). Надлишок її зумовлює зміни проникності мембран, структури хроматину, синтезу білків, активності ферментів (зокрема, підвищує активність супероксиддисмутази, каталази, гваякол пероксидази). Також викликає пероксидне окиснення ліпідів та активує старіння [Fusun Yurekli, 2006].

Токсична дія міді проявляється в ультраруйнуванні структури та впливі на біохімічні процеси. Ці дефекти можуть призвести до оксидативного стресу, результат якого - підвищення вмісту АФК, що веде за собою необоротні пошкодження в макромолекулах. Наприклад, зміни в перенесенні електронів в електрон-транспортному ланцюгу та пошкодження мембран тилакоїдів [Lara Lombardi, 2005].

Мідь - обов'язковий елемент для росту та розвитку рослин. Як й інші поживні речовини, мідь необхідна в малих кількостях. Але як і будь-який інший важкий метал, купрум токсичний навіть за низьких концентрацій. Останнім часом цей метал стає все більш небезпечним через інтенсивне використання його у фунгіцидах, пестицидах, добривах тощо. Попри його фізіологічно зумовлену необхідність, підвищення вмісту міді становить небезпеку для рослинного організму та його нормального функціонування тим, що може викликати руйнування ліпідів та білкових складових мембран. А це, в свою чергу, тягне за собою надпродукцію АФК [X.M. Cui, 2010].

Мідь посідає особливе місце серед інших металів, тому що, з одного боку, її солі є відомими токсикантами, а з іншого - вона є кофактором у деяких ферментативних системах [О.Семенова, С.Петров, 2010]. Досить високотоксичний метал, проявляє низьку мутагенну активність [Евсеева, 2003]. Відомо, що вплив міді викликає зменшення площі листової пластинки, сухої маси кореня та росту рослин томату. Вміст міді в більшості рослин - 20-30 мг/кг сухої маси. Мінімальний вміст її у вегетуючих частинах рослинах становив 3-5 мг/кг сухої маси. У молодих рослинах - 1,5 мг/кг сухої маси. Мідь - есенціальний елемент для різноманітних метаболічних процесів. Оскільки потрібний він у незначних кількостях, у підвищених концентраціях стає токсичним. В нетолерантних рослин відбувається пригнічення росту кореня та пошкодження мембрани клітин коренів як пряма відповідь на високі концентрації купруму. Зміни у морфології кореня, такі як уповільнене видовження та збільшене формування бічних коренів також пов'язане з різким зменшенням активності оксидази індолілоцтової кислоти під дією високих концентрацій міді. Мідь - перехідний метал, який бере участь в окисно-відновних реакціях. У надлишку він викликає надпродукцію вільних радикалів кисню, в чому і полягає його основна токсична дія на рослинні клітини. Більше того, пошкодження, викликані міддю, зумовлють негативні наслідки в головних фізіологічних процесах та погіршують ріст [Sahriye Sonmez, 2006].

Мідь - есенціальний поживний елемент для рослин, який є компонентом кількох ферментів, які беруть участь в перенесенні електронів та каталізі реакцій окиснення та відновлення у мітохондріях та пластидах. Надмірний вміст міді в листках може індукувати зміни у процесах фотосинтезу та дихання, активності ферментів, ДНК, цілісності мембран. Кожне з цих порушень може спричинити пригнічення росту. Важлива характерна риса прояву токсичної дії купруму - генерація оксидативного стресу. Надлишок цього металу каталізує утворення шкідливих АФК, таких як синглетний кисень, гідроген пероксид та гідроксильний радикал, які можуть пошкоджувати біомолекули (ДНК, РНК, протеїни) та мембрани, зумовлюючи перекисне окиснення ліпідів [Lara Lombardi, 2005; Chia Chi Yu, 2005].

Показано, що в персика (P. сerasifera) під дією 100 µМ міді відбувалось суттєве підвищення активності каталази та супероксиддисмутази - активація їх генів. Це свідчить про те, що P. Сerasifera є толерантним відносно купруму - здатний мобілізувати такі компоненти антиоксидантного захисту як калаза та супероксиддисмутаза для пом'якшення негативного впливу надлишку міді [Lara Lombardi, 2005].

Вплив іонів купруму протягом 8 днів за концентрації 50 µМ значно пригнічує активність гваякол пероксидази та аскорбат пероксидази у листках і коренях томату. Це компенсується підсиленням активності супероксиддисмутази та каталази [X.M. Cui, 2010].

Залізо

Залізо - есенціальний елемент для всіх рослин, виконує багато важливих біологічних функцій у клітинних процесах. Це - участь у процесі фотосинтезу, розвитку хлоропластів, входить до складу каталітичної групи багатьох клітинних редокс-систем, таких як гемопротеїни (цитохроми, каталаза, пероксидаза) і залізосірковмісні протеїни (фередоксин, аконітаза, супероксиддисмутаза), каталізує початкові етапи синтезу хлорофілу [Pooyan Mehraban, 2008; Головко, 2008, Amal A.Mohamed, 2004].

Але ферум належить до ВМ і низькі концентрації його можуть ставати токсичними для рослин. Токсичність феруму пов'язана з високим рівнем поглинання коренями Fe2+ та його транспортом у листки з висхідним током. Надлишок іонів цього металу викликає утворення вільних радикалів, які незворотно пошкоджують клітинні структури, зокрема ДНК, білки, ліпіди тощо. Токсичність заліза для тютюну, сої супроводжується пригніченням фотосинтезу та підвищенням оксидативного стресу і активності аскорбат пероксидази. Також при цьому збільшується концентрація пероксиду водню, фенольних сполук та зменшується кількість хлорофілу та розчинних білків.

У рису надлишок заліза викликає накопичення його в коренях, появу оксидативного стресу та підвищену активність каталази, пероксидази, зменшення вмісту хлорофілів, розчинних білків [Pooyan Mehraban, 2008].

У соняшника може виникати хлороз, викликаний заміною феруму іншими ВМ в активних центрах ферментів, зокрема міддю та кадмієм [Lara Lombardi, 2005]. Відомо, що іони заліза, вивільняючись з активного центру ліпоксигенази при виході поліненасичених жирних кислот зі складу мембрани, можуть знижувати активність антиоксидантних ферментів. Також іони цього металу можуть спричинювати акумуляцію пероксиліпідів у рослин [Ewa Skorzynska-Polit, 2007]. Нестача заліза викликає інгібування синтезу хлорофілу, зменшення наполовину активності каталази та аскорбат пероксидази, тоді як за підвищених концентрацій активності цих ферментів зростають [Amal A.Mohamed, 2004].

1.2 Системи антиоксидантного захисту рослин

Життя в аеробних умовах вимагало створення системи протидії впливу змін факторів довкілля та викликаному цими змінами абіотичному стресу. Протягом еволюції рослини розвинули складну стрес-специфічну антиоксидантну систему для підтримання балансу та ефективного функціонування клітини [Pongprasert, 2011; Viswanathan Chinnusamy, 2003].

Компоненти антиоксидантної системи, пов`язані з контролем рівня АФК, включають сенсорні складові, чутливі до змін клітинного окисно-відновного балансу та здатні активувати необхідні метаболічні процеси [Vittoria Locato, 2009]. Відомо, що існує дві ланки антиоксидантної системи: ферментативна та неферментативна. Токофероли, флавоноїди, каротиноїди, глутатіон та аскорбінова кислота належать до не ферментативної ланки антиоксидантної системи, супероксиддисмутаза, пероксидази (аскорбат-, глутатіон-, гваякол-), каталаза і ферменти, що окиснюють та відновлюють аскорбат - до ферментативної. Обидві складові системи ефективно регулюють концентрацію АФК у клітині та організмі в цілому [Graїyna D№browska, 2006; Houda Bouazizi, 2007; Tayebeh Abedi, 2010; Shu-Hsien Hung, 2005; Lara Lombardi, 2005; Priscila L. Gratao, 2008].

1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази

Гваякол пероксидаза належить до класу III - класичних пероксидаз рослин. Ці пероксидази глікозильовані, містять 4 дисульфідних зв'язки та 2 катіони кальцію на молекулу ферменту [Газарян, 2006].

Пероксидази використовують різні субстрати як донори електронів (гваякол, аскорбат тощо), і називаються відповідно до типу донора, який вони використовують, наприклад, гваякол пероксидаза (GPX), аскорбат пероксидаза (APX). Гваякол пероксидаза відіграє вирішальну роль у життєдіяльності клітини - бере участь у процесах, пов'язаних з лігніфікацією, розгалуженні полісахаридів клітинної стінки, окисненні фенольних сполук, видовженні клітин. Зміни активності гваякол пероксидази можуть свідчити про зміни у процесах фотосинтезу, транспірації, дихання, газообміну. Підвищення її активності свідчить про наявність вільних іонів ВМ (Cu, Pb, Zn тощо), які не можуть зв'язатись з клітинними стінками чи накопичитись у вакуолях. Тобто активність POD є індикатором стресу ВМ та може використовуватись для передбачення змін стану рослинного організму. Дослідження показують, що 10-денний вплив 100 µМ концентрації міді викликає значне підвищення активності гваякол пероксидази у коренях Phaseolus vulgaris [Fusun Yurekli, 2006].

Відомо, що активність GPX значно підвищується (на 46%) у стеблі проростків кукурудзи за впливу іонів міді концентрацією 100 µМ протягом 10 днів [Houda Bouazizi, 2007]. Підвищення активності POD створює бар'єр для проникнення іонів ВМ, тобто фактично зміцнює тканини проти шкідливої дії АФК. Явище підвищення активності POD можна використовувати як біомаркер у механізмах толерантності рослин до впливу іонів ВМ [Ali Ahmed, 2010].

Під впливом холодового стресу - 5/30С на 5-й день активність апопластичної POD набагато зростає у листках зимової пшениці [T. Cakmak, 2009]. Зростання активності розчинної пероксидази спостерігалося за короткочасного 420С теплового стресу у проростках пшениці, внаслідок чого підвищувалась термостабільність ферменту та поява нової ізоформи на електрофореспектрі [Обозный, 2010].

1.2.2 Глутатіон редуктаза як фермент антиоксидантного захисту

Глутатіон редуктаза (GR, NADPH-залежна глутатіон оксидоредуктаза; ЕС 1.6.4.2.) - фермент, який відновлює глутатіон за рахунок окиснення NADPH.

GSSG + 2 H+ + 2 NADPH -> 2 GSH + 2 NADH+

NADPH регенерує з допомогою глюкозо-6-фосфат дегідрогенази та ізоцитрат дегідрогенази, які каталізують окиснення. В цьому випадку NADPH виступає ко-субстратом. Коли глутатіон редуктаза не в змозі впоратися з надлишком глутатіону дисульфіду в клітині, клітина може активно «викинути це» за рахунок енергії АТФ. Також цей фермент включений до циклу знешкодження АФК у хлоропластах, які є дуже чутливими до оксидативного стресу [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004; Suk-Yoon Kwon, 2001]. Глутатіон редуктаза та аскорбат формують аскорбат-глутатіоновий цикл - один з шляхів знешкодження пероксиду водню [Shu-Hsien Hung, 2005]. В A. thaliana було ідентифіковано два гени - gr 1 і gr 2, які кодують цитозольну та пластидну ізоформи глутатіон редуктази відповідно [Priscila L. Gratao, 2008].

Відомо, що у трансгенних рослин з надекспресією глутатіон редуктази спостерігався підвищений вміст аскорбату та як результат - такі рослини демонстрували покращену толерантність до оксидативного стресу [Suk-Yoon Kwon, 2001]. За дії теплового стресу (450С та вологості 30% протягом п'яти днів) активність GR зростала на 52,36% у термотолерантних проростків Brassica juncea, в той час як у чутливих рослин цей показник становив всього 33,73% [Babita Rani]. Сольовий стрес викликає підвищення активності GR у листках дині (Cucumis melo L.) [Fikret Yasar, 2006].

1.2.3 Низькомолекулярні антиоксидантні сполуки

Пошкодження у рослин зустрічаються тоді, коли здатність антиоксидантних процесів детоксикувати наслідки стресу менша, ніж пошкоджуюча здатність утворених АФК. Аеробні організми створили складні системи, які захищають їх від шкідливого впливу АФК. До їх складу входять і низькомолекулярні антиоксидантні сполуки. Це - аскорбінова кислота (аскорбат), глутатіон, тіоли, б-токоферол, захисні пігменти типу каротиноїдів. Ці сполуки захищають клітинні компоненти від вільних радикалів таких як супероксид та метастабільні гідропероксиди [A. Michalak, 2006].

Глутатіон (д-глутамілцистеїнілгліцин) - трипептид, розчинення у воді якого підсилює його відновні властивості, зумовлені тіольною групою. Синтезується з глутаміну, цистеїну та гліцину. У клітині глутатіон присутній у високих концентраціях в цитоплазмі, мітохондріях та ядрі (5-10 мМ), в ендоплазматичному ретикулумі менше - всього 2 мМ. У мітохондріях глутатіон - основна складова, оскільки він захищає клітину від оксидативного стресу. Більше 99% глутатіону в клітині знаходиться у відновленій формі (GSH), і лише мізерна частка - в окисненій (дисульфід, GSSG) [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004].

Відновлений глутатіон (г-Glu-Cys-Gly, GSH) - завдяки його унікальному окисно-відновному потенціалу та нуклеофільним властивостям включений в клітинний захист проти токсичного впливу ксенобіотиків, вільних радикалів, засолення, закислення та ВМ (мідь, срібло, цинк, хром), утворюючи з ними стійкі комплекси - фітохелатини (ФХ). Також глутатіон є субстратом для синтезу ФХ. Відомо, що генетично модифіковані рослини A. thaliana зі зниженим вмістом глутатіону, були більш чутливими до дії Cd через їх обмежену здатність до утворення ФХ. Основне завдання глутатіону - знешкодження активних електрофільних сполук та роль своєрідного внутрішньоклітинного «відновного буферу» [Y. Cai, 2010; E. Kulikowska-Karpiсska, 2004].

Глутатіон - важливе джерело небілкових тіолів для рослинної клітини та відіграє вирішальну роль у її життєдіяльності. Цей трипептид - частина антиоксидантного аскорбат-глутатіонового циклу, який допомагає попередити або мінімізувати шкоду, спричинену АФК. Також ця функція включає окиснення тіольних груп, переважно утворюючи глутатіон дисульфід (GSSG). Було [Jorge Mendoza, 2009]. Глутатіон бере безпосередню участь у реакції знешкодження та видалення ліпідних пероксидних радикалів у реакції нуклеофільного аткування гідропероксидів глутатіон-S-трансферазою [Ewa Skorzynska-Polit, 2007]. Ще одна з найголовніших функцій полягає в тому, що він підтримує тіольні групи білків у відновленій формі, що є дуже важливим для збереження їхньої активності. Глутатіон може впливати на окисно-відновні умови певних білків через не ензиматичний обмін SH/SS груп. Тобто він поєднує ензиматичний та неензиматичний захист клітинних структур від окиснення [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004].

L-аскорбінова кислота (вітамін С, AsA) - ендіольна форма д-лактону 3-кето-гулонової кислоти. Молекула кислоти складається з ендіольної групи [-C(OH)=C(OH)-], відповідальної за кислотні та відновні властивості. Вона має сильні кислотні властивості, тому є важливим антиоксидантним фактором у водному середовищі.

Вітамін С - нестабільна сполука, чутлива до нагрівання, особливо в присутності кисню, та ВМ (заліза, міді). Вона окиснюється до L-дегідроаскорбату з допомогою вільнорадикального L-монодегідроаскорбату:

L-аскорбінова кислота - вільний аскорбільний радикал - L-дегідроаскорбат.

У водному розчині молекула аскорбату дуже нестабільна - лактонне кільце може розгортатися спонтанно, утворюючи дикетогулонову кислоту, гідроліз якої спричинює втрату активності. Дегідроаскорбат ефективно захищає мембранні ліпіди від переокиснення міддю.

Основна функція аскорбінової кислоти - участь в реакціях гідроксилювання, наприклад, гідроксилази, яка є кофактором у синтезі колагену і вимагає наявності аскорбату. В організмі рослин аскорбат відіграє роль антиоксиданту, який захищає від впливу АФК, реагуючи з з ними та попереджуючи пошкодження ДНК. Разом з цитохромами а і с, піримідинами та флавіновими нуклеотидами, глутатіоном аскорбат формує відновну систему, яка регулює окисно-відновний потенціал клітини. Необхідна для регенерації б-токоферолу. Показано, що за низької концентрації (50 мМ) та присутності іонів транзитних металів аскорбат проявляє пероксидні властивості через встановлення оптимального співвідношення Fe3+/Fe2+ та Cu2+/Cu+, відновлення яких підтримує перекисне окиснення NADPH-залежних ліпідів. За вищої концентрації аскорбат інтенсивно відновлює Fe3+ до Fe2+, чим інгібує перекисне окиснення NADPH-залежних ліпідів [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004]. Серед антиоксидантів аскорбат - ключова сполука у механізмі знешкодження АФК, особливо пероксиду водню. Реакція аскорбінової кислоти з Н2О2 може відбуватись прямо або каталізуватись APX. Відновлення AsA каталізується прямо відновленим фередоксином фотосистеми I та монодегідроаскорбат редуктазою (MDHAR), дегідроаскорбат редуктазою (DHAR) та GSH [Shu-Hsien Hung, 2005].

Аскорбат - важливий антиоксидант, що функціонує як термінальний антиоксидант аскорбат-монодегідроаскорбатної пари через його окисно-відновний потенціал, який є набагато меншим за потенціали більшості вільних радикалів. В оброблених тріазолом рослинах у листках та коренях збільшувався вміст аскорбату [Thirumal Sivakumar, 2010].

Розділ 2. Матеріали і методи

2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами

Рослинний матеріал та умови культивування

Дослідження проводились на рослинах Nicotiana tabacum лінії W38.

Для дослідження ролі гваякол пероксидази в умовах стресу, викликаного іонами міді, кадмію та заліза, використовували рослини Nicotiana tabacum лінії W38, вирощені у ґрунті за сталої температури + 260С та 16-годинного світлового дня. Полив рослин здійснювали по мірі висихання ґрунту в рослин.

Рис. 2.1. Експериментальні рослини Nicotiana tabacum лінії W38, що вирощувались на ґрунті

Умови стресу

Рослинам 5-6 тижневого віку, що росли на ґрунті, у воді гострим лезом відокремлювали надземну частину від кореневої і місцем зрізу занурювали у 0,5х MS, в яке додавали іони Cu2+, Cd2+ та Fe2+ до кінцевої концентрації 0,1; 0,5 та 5 мМ. Стресову обробку рослин проводили у темряві протягом 2-х та 12-ти годин.

Після стресу рослини заморожували у рідкому азоті та зберігали в морозильній камері за температури -700С для подальших досліджень.

2.2 Визначення активності гваякол пероксидази

Визначення активності гваякол пероксидази проводили за методом, описаним в літературі … [].

Для екстракції білку використовували екстракційний буфер, що містив:

До екстракційного буферу додавали рослинний матеріал, розтертий у рідкому азоті, та центрифугували на центрифузі Biofuge pico при 14 000 g протягом 15 хв. Після центрифугування відбирали супернатант та зберігали надалі на льоду.

Загальну активність гваякол пероксидази вимірювали спектрофотометрично за довжини хвилі л=490 нм. Реакційна проба складалась з 975 мкл реакційного буферу та 25 мкл білкового екстракту. Активність ферменту виражали як зміну оптичної густини пероксиду водню на 1 мг білка в пробі за 1 хв. Отримані результати перераховували у відсотки, приймаючи активність ферменту в інтактних рослинах за 100%. Кожний експеримент виконувався … .

Одержані результати опрацьовували статистично з використанням критерію Стьюдента.

2.3 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази

Виявлення ізоферментних спектрів гваякол пероксидази в ПААГ в нативних умовах проводили за загальною методикою … [].

Гель для електрофорезу готували як вказано в таблиці 1.

Електрофорез проводили за напруженості протягом 3 годин. Після закінчення електрофорезу гель … .

В кожну лунку гелю наносили по …. мкл білку. В місцях локалізації гваякол пероксидази на гелі спостерігали появу оранжевих смуг на темному фоні, що пов'язано з розщепленням пероксиду водню під дією ферменту. Реакцію зупиняли … .

Таблиця 1

Приготування ПААГ для проведення електрофорезу білків у нативних умовах

Компонент	Розділяючий гель	Концентруючий гель
бідистильована вода, мл
1,5 М трис-HCI (pH=8,8), мл
0,5 М трис-HCI (pH=6,8), мл
30% АКА-БІС, мл
гліцерин, мг
10% АПС, мкл
ТЕМЕД, мкл
Загальний об'єм, мл

2.4 Техніка безпеки праці в лабораторії

Вимоги безпеки перед початком роботи

1. Лабораторія має знаходитись у прибраному та чистому стані; на робочих місцях повинні знаходитись лише необхідні прилади та матеріали, інші реактиви та матеріали зберігаються в шафах або на складі.

2. Перед початком роботи потрібно:

- оглянути та впорядкувати робоче місце;

- перевірити витяжну систему;

- перевірити правильність підключення устаткування до електромережі;

- перевірити справність струмопровідних дротів та відсутність оголених ділянок;

- переконатися у наявності захисного заземлення приладів.

3. Забороняється приступати до роботи за виявлення пошкодження обладнання. Працівник зобов'язаний повідомити керівника про виявлені пошкодження.

Вимоги безпеки під час виконання роботи

Під час роботи в лабораторії слід дотримуватись таких правил:

1) необхідно використовувати захисний одяг (лабораторний бавовняний халат, за необхідності гумові рукавички та окуляри або захисну маску; при роботі з дрібнодисперсними речовинами потрібно носити респіраторні маски);

2) двері під час роботи повинні бути зачинені;

3) при роботі з вибухонебезпечними та легкозаймистими речовинами потрібно дотримуватись запобіжних заходів. Зберігати вибухонебезпечні та легкозаймисті речовини необхідно в окремих приміщеннях у невеликих кількостях та в місцях, захищених від світла, вологи і пилу;

4) при роботі з леткими речовинами слід користуватись витяжною шафою.

У приміщеннях кафедри забороняється:

- працювати без нагляду співробітника або лаборанта;

- працювати у верхньому одязі;

- користуватися косметикою, палити, їсти, пити та зберігати продукти харчування;

- набирати реактиви у піпетки ротом;

викидати в раковини скло, сміття, виливати концентровані кислоти, луги, органічні розчинники, легкозаймисті та горючі рідини;

користуватись електронагрівачами, джерелами відкритого вогню (сірниками, запальничками тощо);

переносити обладнання без дозволу зав. кафедрою або зав. лабораторією;

користуватись зіпсованими електроприладами;

самостійно проводити ремонт розеток, вимикачів, запобіжників;

користуватись витяжними шафами з розбитим склом або непрацюючою вентиляцією;

зберігати реактиви у посуді без етикеток.

Вимоги безпеки після закінчення роботи

По закінченні роботи кожний працівник зобов'язаний:

- привести до порядку робоче місце, прилади та апаратуру;

- виходячи останнім, зачинити вікна (кватирки), вимкнути світло, газ, перевірити чи вимкнені всі електроприлади та закриті крани, зачинити приміщення на ключ. Ключі передаються черговому охоронцю, про що робиться запис в журналі.

Надання першої медичної допомоги

У випадку ураження людини струмом перш за все потрібно вимкнути рубильники та викликати «Швидку допомогу» за номером 103.

Размещено на Allbest.ru