Использование микробных биопленок в промышленности

С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры. У большинства биопленок можно наблюдать некоторый уровень структурной разнородности, когда совокупность клеток, вкрапленных в экзополисахаридный матрикс, изменяется по плотности, создавая открытые области, где сформированы водные каналы Этот матрикс состоит из смеси полисахаридов выделяемых в окружающую среду (экзополисахариды).[2] В химическом отношении матрикс различается у разных таксонов. В целом же экстрацеллюлярный слой содержит такие полисахариды как декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу и другие. Эта фракция наиболее выражена и составляет порядка 40-95%. Концентрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот 1-20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80-90% объема биопленки занимает вода. Экстрацеллюлярная ДНК участвует в адгезивных процессах и межклеточных взаимодействиях, но до конца роль нуклеиновых кислот в матриксе не выяснена.[7]

Бактериальные экзополисахариды - главный компонент матрикса биопленки, который некоторые авторы называют также гликокаликсом или слизистым чехлом. У большинства видов зкзополисахаридный матрикс состоит из альгината, являясь преобладающе анионным. Например, у P.aeruginosa в биопленках обильно синтезирует альгинат (кодирующий генный кластер - algACD), штаммы со сверхэкспрессией гена algA обычно образуют слизистые колонии с выраженными свойствами вирулентности. Альгинат химически связывает аминогликозиды за счет инактивации гидрофильных и положительно заряженных групп в молекуле. Матрикс биопленки способен препятствовать скорости диффузии некоторых антибиотиков и других биоцидных препаратов, это зависит от его биохимического состава и метаболической активности популяции.[4] Например, аминогликозиды достаточно длительно диффундируют через матрикс, фторхинолоны, напротив, легко проникают через этот барьер. Матрикс является трехмерной структурой, которая окружает, закрепляет и защищает прикрепленные к различным поверхностям микроколонии бактерий. Клетки в слизистом матриксе располагаются не хаотически, а определенным образом. Структура многоклеточных кластеров представлена в виде грибоподобных, столбоподобных образований, «цементированных» в экзополисахаридный слой, что позволяет задерживать и поддерживать концентрацию питательных веществ, необходимых для роста популяции, а также служит защитой клеток от дегидратации, гуморальных и клеточных факторов резистентности макроорганизма. [3]

Матрикс разделен каналами, наполненными водой, а также имеет полости и пустоты. Поры и каналы, пронизывающие всю биопленку - очень важная часть ее структуры. Образно их можно сравнить с кровеносной системой ткани биопленки. При использовании гранулометрических методов было доказано движение потока жидкости через эти каналы. Каналы позволяют свободно распространяться по всей толщине биопленки низкомолекулярным веществам, таким, как, например флуоресцеин, из чего следует, что эти вещества примерно одинаково доступны всем клеткам биопленки. Таким образом, каналы - жизненно важный элемент структуры биопленки, непосредственно влияющий на ее функции, однако механизмы их формирования и поддержания еще не вполне ясны. Каналы обеспечивают распространение питательных веществ и обмен продуктами метаболизма с окружающей жидкостью.[2]

Однако, исследование с использованием микроэлектродов показало, что периферические слои более аэрированы по сравнению с центральными частями, где образуется анаэробная микрониша. Используя микроэлектроды, удалось установить, что на глубине около 30 мкм от поверхности биопленки концентрация кислорода резко снижается. В связи с этим немалый интерес представляют изменения метаболического фенотипа в глубинных слоях биопленки. Хорошо изучен процесс переключения метаболизма с аэробного дыхания на нитратное дыхание у изолятов P.aeruginosa, выделенных от больных муковисцидозом.[11] Такое переключение метаболизма обусловлено заменой конечного акцептора кислорода дыхательной цепи на молекулы нитратов и нитритов. В связи с этим в клетке происходит регуляторная перестройка экспрессии генов, и начинается синтез специфических для нитратного дыхания ферментов: Nap -периплазматической нитратредуктазы, NarGHI, NarZYV - мемранносвязанных нитратредуктаз и других. Ключевая роль в переключении аэробного метаболизма на анаэробный принадлежит регулятору транскрипции Fnr-белку, реагирующему на изменения концентрации молекулярного кислорода Анаэробные субпопуляции биопленок синегнойной палочки обладают более выраженной устойчивостью к факторам окружающей микросреды, а также приобретают устойчивость к действию антимикробных препаратов. [5]

Колебания кислорода, уровня кислотности, параллельно с колебаниями концентраций питательных веществ, метаболитов клеток, обусловливают, следовательно, образование разнородных областей в биопленках. Адаптируясь к таким гетерогенным микронишам, бактерии в биопленке образуют множество фенотипов с широкими метаболическими и репликативными свойствами. Такое сообщество (популяция) обладает громадными способностями к сопротивлению стрессовым факторам[3].

1.3 Микробный состав и взаимодействие микроорганизмов в биопленке

Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо остановиться на основных типах взаимоотношений (прежде всего трофических), возникающих между их компонентами.Взаимодействие между компонентами начинается уже в процессе формирования биопленки. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида. Взаимодействие происходит, по-видимому, на стадии формирования внеклеточного матрикса.[6]

В «зрелых» биопленках, в отличие от планктонных культур, конкуренция между видами обнаруживается редко. И даже в том случае, когда один из видов, благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, второй сохраняет жизнеспособность и высокую численность. Подобные взаимоотношения обнаружены, например, в бинарных (состоящих из культур двух видов) биопленках между популяциями быстро растущей культуры Klebsiella pneumoniae и культурой P.aeruginosa.

Более редкая разновидность конкуренции - амменсализм может быть обусловлен образованием одним из микроорганизмом агентов, ингибирующих других членов сообщества, а также созданием неблагоприятных физико-химических условий (например, величины рН). Такая ситуация обнаружена в бинарной биопленке, сформированной двумя видами Ruminococcus, один из которых образует бактерицин, активный против другого вида.[8]

Наиболее часто встречающимися взаимоотношениями между микробными компонентами биопленок являются комменсализм и протокооперация.

Комменсализм выражается в одностороннем влиянии одного из компонентов биопленки на жизнедеятельность другого ее компонента. Обычный пример - потребление кислорода аэробным микроорганизмом, способствующее росту микроаэрофильных или анаэробных «сожителей». Этот тип взаимодействия играет важную роль в микробной коррозии с участием сульфатредукторов, локализованных в анаэробных микронишах.[3]

Протокооперация приводит к взаимному положительному влиянию компонентов биопленок друг на друга. Такие взаимоотношения существуют, например, в биопленках, содержащих фототрофные и гетеротрофные микроорганизмы. Характерным примером протокооперации служит также взаимодействие целлюлолитических бродильщиков и метаногенов. Последние, утилизируя молекулярный водород, а также формиат, образованные в процессе брожения, сдвигают термодинамическое равновесие, предотвращая накопление восстановленных коферментов в клетках бродильщиков и стимулируя синтез ими АТФ.[12]

Предыдущий случай является примером, когда протокооперация переходит в синергизм, поскольку оба компонента биопленки получают выгоду от сотрудничества, а образование или потребление какого-либо продукта в биопленке превышает величину, характерную для индивидуальных популяций. Типичным примером служит гидролиз целлюлозы в биопленке, содержащей как целлюлолитические, так и неспособные к расщеплению целлюлозы микроорганизмы. Последние стимулируют гидролиз целлюлозы и рост целлюлолитиков путем потребления низкомолекулярных продуктов гидролиза, которые репрессируют биосинтез целлюлаз.[4]

Заметную роль в межклеточных взаимодействиях в биопленках играет обмен генетической информацией, что в определенной степени обусловлено высокой плотностью микробной популяции. Существует множество доказательств того, что горизонтальный перенос генов в биопленках происходит с большей интенсивностью, чем в планктонных культурах.[3] В биопленках, в частности, реализуется механизм защиты плазмид от элиминирования по типу «токсин-антитоксин». Принцип такой защиты состоит в кодировании плазмидой стабильного белка-токсина и лабильного белка-антитоксина. Если дочерние клетки после деления не содержат плазмид и не способны осуществлять ресинтез антитоксина, то после распада остаточного антитоксина стабильный токсин убивает такие клетки. Эффективность горизонтального переноса генов in situ убедительно доказана применением сканирующей конфокальной лазерной микроскопии (SCLM) с помощью генов-репортеров, кодирующих флуоресцирующие белки: зеленый, красный, голубой, желтый и синий. Более того, удается не только определить пространственную локализацию мигрирующих плазмид в популяции, но и изолировать соответствующую субпопуляцию методами сортирования клеток.[4]

В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок. Основное направление этих исследований связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических (имитация естественных условий образования биопленок) и статических условия.[13]

К динамическим можно отнести методы с использованием лабораторных ферментеров. Общая суть методов заключается в инокулировании микроорганизмов в планктонной фазе развития в жидкие питательные среды, которые циркулируют в закрытой системе. Таким образом, создаются условия для постоянного потока жидкости, содержащей микроорганизмы. Первоначальная адгезия микроорганизмов происходит на поверхности системы фильтров и/или на внутренних частях ферментера. В последующем адгезированные микроорганизмы образуют матрикс биопленки.

Другим примером динамического метода можно считать культивирование в аппарате Робинсона и в его различных модификациях. В этом методе используют аппарат сложной конструкции, обеспечивающий ток питательной среды, которая соприкасается с пластинами из искусственного или биологического материала, на поверхности которого находятся адгезированные, физиологически адаптированные клетки микроорганизмов. В результате в условиях постоянного доступа питательных веществ и аэрации образуется биопленка. [1]

Проточный метод можно отнести к микроциркуляторным методам. Биопленка микроорганизмов образуется на поверхности силиконовых трубок проточных ячеек (flow cells), через которые с помощью помпы постоянно подается питательная среда. Такой метод позволяет моделировать процессы образования биопленки на абиотических объектах, например на внутрисосудистых катетерах. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем. Постоянное поступление питательных веществ и удаление продуктов жизнедеятельности микроорганизмов позволяет значительно интенсифицировать процесс формирования биопленки. Условия, обеспечивающие жизнедеятельность микроорганизмов в биопленке, полученной такими методами, стандартизированы, а влияние посторонних факторов минимизировано. [13]

В модификациях метода Робинсона и в проточном методе возможно изучение процесса образования или подавления биопленок в реальном времени с использованием световой микроскопии. К недостаткам данной группы методов можно отнести их ограниченное использование в связи с большими объемами потребления питательных сред, сложной конструкцией оборудования, затруднением стерилизации внутренних поверхностей аппаратов, низкой производительностью методов, высокой стоимостью эксплуатации.

Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов. [9]

Наиболее часто используемой техникой, среди данной группы, является метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов в различных модификациях. Метод основан на способности бактерий формировать биоплёнки на поливинилхлоридном пластике(ПВХ) Суть метода можно охарактеризовать следующим образом: суспензия бактерий вносится в лунки планшета, после инкубации в оптимальных условиях планктонная фаза популяции бактерий удаляется вместе с питательной средой, образовавшиеся биопленки окрашивают кристалл виолетом и проводят количественный учёт связанного красителя в спектрофотометре, что позволяет проводить количественные сравнения способности образования биоплёнки разными штаммами [10]. Этот метод до сих пор не потерял своей значимости, однако научный интерес отечественных исследователей к нему в последнее время значительно снизился, а практическое значение так и не получило должной оценки в нашей стране. В первую очередь, это связано с тем, что для этого метода не разработаны стандарты, позволяющие унифицировать его в разных лабораториях.

Уже в ранних работах была отмечена разная адгезивная способность одних и тех же штаммов микроорганизмов к различным поверхностям. Данный факт связан с тем, что все микроорганизмы обладают способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям, а адгезия является пусковым механизмом в развитии инфекционного процесса. Адгезию разделяют на неспецифическую и специфическую[2]. Первая обусловлено физикохимическими процессами взаимодействия бактерий с поверхностью: электростатические и гидрофобные взаимодействия, броуновское движение. Неспецифическое прикрепление осуществляется к биотическим и абиотическим объектам и в большей степени обратимо. Специфическое прикрепление происходит после молекулярных взаимодействий между молекулами-адгезинами и рецепторами клеток хозяина. Немаловажную роль в адгезии микроорганизмов к различным поверхностям играют также электрические заряды. Бактериальная поверхность заряжена отрицательно, причем у грамположительных микроорганизмов это обусловлено наличием в клеточной стенке тейхоевых и липотейхоевых кислот, а у грамотрицательных - присутствием кислых липополисахаридов и белков.

Таким образом, использование планшетов даже одного производителя может приводить к получению значительно различающихся результатов, что обусловлено их физико-химическими особенностями . Так, например, некоторые производители выпускают планшеты со специфическим связыванием углеводов, аминов, ДНК, сульфгидрильных групп; со специальной обработкой поверхности для клеточной адгезии, в том числе и покрытые полилизином для белковой кристаллизации. Необходимо учитывать тот факт, что к поверхности лунок планшетов микроорганизмы прикрепляются за счет неспецифических факторов.[5]

Помимо особенностей поверхности планшета, на формирование биопленок в данной группе методов влияют состав питательных сред (микронутриентный и электролитный) и степень аэрации.

Одной из модификаций планшетного метода исследования формирования биопленок является ALI-метод (air-liquid interface). Его суть заключается в культивировании микроорганизмов в планшете, который находится под углом 30°-50° таким образом, чтобы мениск жидкой питательной среды соприкасался с серединой дна лунки. Середина лунки является наиболее оптически чистой зоной планшета. В месте соприкосновения жидкой питательной среды с этой зоной формируются максимально благоприятные условия для формирования биопленки.

Этот метод позволяет визуализировать биопленки без необходимости использования красителей с помощью фазово-контрастной микроскопии, а мониторинг можно проводить в режиме реального времени.[12] Его недостатком является возможное уменьшение объема питательной среды в лунке и, как следствие, высыхание места контакта адгезированных микроорганизмов со средой. По этой причине, возникает необходимость постоянного внесения питательной среды в лунки, либо уменьшения времени инкубации. ультраструктура биопленка внеклеточный матрикс

В связи с возрастающим интересом стоматологов к проблеме биопленок был разработан метод их формирования на гидроксиапатитовых дисках. Материал дисков был выбран из-за высокой пористости и схожести его строения с тканями зуба. В дальнейшем метод был стандартизирован и в нем стали использовать поликарбонатные диски.

Суть метода заключается в следующем: на поверхность плотной питательной среды помещают диск, на который наносят суспензию исследуемой культуры. Питательные вещества поступают к клеткам путем диффузии через поры поликарбонатного диска.[11]

Таким образом, это единственный из разработанных статических методов, при котором к биопленке питательные вещества поступают из плотной среды. Этот метод рекомендуется авторами исследований как основной для выявления влияния антимикробных веществ на формирование

биопленок.

Отдельно следует указать на метод, разработанный D.E. Kadouri с соавт., который занимает промежуточное положение между статическими и динамическими методами. В методе используются 6-луночные планшеты, к каждой лунке которых подведена система подачи и отвода питательной среды. После определенного времени инкубации, достаточного для адгезии бактерий на поверхности лунки, подключается система микроциркуляции, которая обеспечивает оптимальное поступление питательных веществ к формирующейся биопленке.[9]

2.2 Генетические методы изучения биоплёнок