Характеристика и методы использования ферментов

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Основная часть

Ферменты и ферментативные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и т.д.

Возможности применения ферментов осложнены, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов. По этой причине практическое использование ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний день найдены пути решения и этих проблем.

Для исследований 50 - 60-х годов характерна уже достаточно чёткая осознанность практической значимости развиваемого направления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам Г. Манеке и Э. Качальского. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для которых на первой конференции инженерной энзимологии в Хенике в 1971г., был узаконен термин «иммобилизированные ферменты». В литературе встречаются и другие термины, например «нерастворимые ферменты», «матрицированные ферменты» и т.д., смысл которых достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментов, связанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммобизизация» можно и нужно понимать шире, а именно, как любое ограничение свободы движения белковых молекул (или их фрагментов) в пространстве. Помимо связывания с нерастворимым носителем этого можно также достичь, например, внутримолекулярной или межмолекулярной «сшивки» белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными реагентами или же присоединения фермента к растворимому полимеру. Такие препараты называют ферментами, модифицированными «сшивающими» или, соответственно, полимерными реагентами.

Иммобилизированные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-первых, гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что даёт возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязнённым ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.

Во-вторых, использование гетерогенных катализаторов позволяет производить ферментативный процесс непрерывно, например, в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путём изменения скорости потока.

В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от кислотной среды, ионного состава и других параметров среды и, очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям.

В-четвёртых, иммобилизация ферментов даёт возможность регулировать их каталитическую активность путём изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов (свет, звук). На этой основе создаются звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов и бессеребряные фотографические процессы.

В результате внедрения нового класса - иммобилизированных ферментов, перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути развития для многих областей. Важно отметить, что успех практического использования препаратов иммобизированных ферментов в значительной степени определяется подготовительным этапом работы - выбором подходящего носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенностей катализа иммобилизированными ферментами.

Иммобилизированными ферментами называются ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.

2. Классификация ферментов

Официальная классификация ферментов была принята в 1961г. В соответствии с этой классификацией название фермента должно отражать тип катализируемой им реакции. Все ферменты подразделяются при этом на шесть основных групп. До этого ферменты называли по имени субстрата, просто добавляя к нему суффикс «аза». Соответствующие названия продолжают использовать и в настоящее время, но одновременно с ними для большого числа ферментов пользуются названиями, происходящими от типа катализируемой реакции, добавляя к ним тот же суффикс «аза».

1.Оксиредуктазы. Эти ферменты катализируют реакции окисления и восстановления. Значение их очень велико, мы с ними познакомимся в ходе изучения тканевого окисления. Большая часть оксиредуктаз имеет коферменты.

Некоторые из них используют молекулярный кислород, это оксидазы. Гидроксилазы в присутствии молекулярного кислорода преобразуют:

-СН₃ в -СН₂ОН

-СН₂ в -СНОН-

Дегидрогеназы катализирует отщепление водорода от окисляемых субстратов.

Цитохромы содержат кофермент типа гема, включающий ион, способный находиться в двух состояниях окисления, благодаря чему они служат переносчиками электронов:

Fе²+- Fе³=В

2.Трансферазы. Один из очень важных для биологии типов реакций состоит в переносе химических групп. Химическая группа может быть отделена от одной молекулы и перенесена на другую молекулу, не проходя при этом через свободное состояние. Ферменты, катализирующие такого рода реакции - трансферазы, отрывают химическую группу от одного соединения, связывают ее, а затем присоединяют к другому соединению.

- Трансметилазы, например, отщепляют метильную группу от таких соединений, как метионин или бетаин, и переносят ее на другие соединения. В этих реакциях участвуют тетрагидро-фолиевая кислота и кофермент В12.

- Трансформилазы производят аналогичную операцию со следующими окисленными одноуглеродными группами: - фор-мильной группой, -СНО и оксиметильной группой, -СН₂ОН (тетрагидрофолиевая кислота принимает участие и в этих реакциях).

- Трансацетилазы переносят ацетильную группу, -СН₂СООН. Кофактором этой реакции служит кофермент А.

- Трансаминазы переносят аминогруппы от аминокислот на кетокислоты. Они играют основную роль в метаболизме аминокислот. Коферментом является пиридоксальфосфат.

- Фосфокиназы, или просто киназы, переносят остаток фосфорной кислоты на молекулу АДФ или от молекулы АТФ на субстрат. Для работы этих ферментов необходимо присутствие ионов Мg²⁺.

- Фосфомутазы перебрасывают остаток фосфорной кислоты с одной части молекулы на другую.

3. Гидролазы. Эти ферменты катализируют разрыв химической связи с присоединением элементов молекулы воды,

а) Эстеразы гидролизуют сложные эфиры с образованием кислоты и спирта:

R-СОО-СН₂-R'+ Н₂0 > R-СООН+НОН₂С-R'

б) Липазы гидролизуют глицериды на глицерин и жирные кислоты.

в) Гликозидазы ведут гидролиз гликозидов на сахарид и спирт.

Их названия происходят от моносахарида, на производное которого они действуют, - глюкозидаза, галактозидаза и т. п. Они обладают специфичностью по отношению к а- или b-конфигурации сахара. Особую категорию составляют ферменты, гидролизующие дисахариды: мальтаза, лактаза, сахараза.

4. Лиазы катализируют разрыв связей С--С, С--N. С--О, С--5 с образованием двойных связей.

Среди лиаз отметим:

-- декарбоксилазы кетокислот, коферментом которых служит тиамин пирофосфат. Они катализируют реакцию:

R-СО- СООН > R-СНО + С0₂

-- декарбоксилазы аминокислот, катализирующие превращение аминокислот в амины; коферментом является пиридок-сальфосфат;

-- альдолазы, катализирующие разрыв гексозофосфатов на две молекулы триозофосфатов.

5. Изомеразы. Эти ферменты катализируют самые различные процессы изомеризации.

-- Рацемазы катализируют превращение L-аминокислот в D-аминокислоты.

-- Эпимеразы вызывают взаимные переходы сахаров, например галактоза>глюкоза.

-- Мутазы катализируют перенос химических групп с одной части молекулы на другую. В качестве кофермента здесь часто выступает кофермент В12. Метилмалонил КоА > сукцинил КоА.

6. Лигазы катализируют процессы конденсации двух сочетающихся молекул за счет энергии распада АТФ:

-- аминоацил-тРНК синтетазы присоединяют аминокислоту к молекуле транспортной РНК; это первый этап белкового синтеза;

-- ацетил-КоА синтетаза катализирует конденсацию уксусной кислоты и кофермента А:

СН₃--СООН + КоА--SН >СН₃--СО--SКоА+Н₂0

-- карбоксилазы связывают С0₂ с кетокислотой:

СН₃--СО--СООН + С0₂ > НООС--СН₂--СО--СООН

3. Применение в промышленности ферментных препаратов

Благодаря высокой активности и специфичности некоторые ферменты уже давно нашли применение в ряде областей промышленности (табл. 1). В основном это пищевая промышленность, где применяются главным образом комплексные ферментные препараты для гидролиза природных полимеров -- белков, крахмала, пектинов. По имеющимся данным, примерно половина общей стоимости ферментов, производимых в США, приходится на ферментные препараты, расщепляющие белки, а еще четверть идет на производство амилолитических ферментов, гидролизующих крахмал.

Таблица 1. Примеры использования ферментов в промышленности

Более широкое технологическое применение ферментов до последнего времени сдерживалось рядом причин, из которых важнейшими являются: а) трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции после завершения процессов, в результате чего ферменты используются, как правило, однократно; б) неустойчивость (лабильность) ферментов при хранении, а также при различных воздействиях (главным образом тепловых); в) трудоемкость очистки ферментов и получение их в достаточно активном виде и, как следствие, высокая стоимость активных ферментов.

В последнее десятилетие определились пути преодоления этих трудностей. Они связаны с получением так называемых иммобилизованных ферментов, а также иммобилизованных клеток микроорганизмов.

4. Продуценты ферментов

Прокариоты.

Благодаря высокой скорости роста, сравнительно простому строению клеток и несложной структуре генетического аппарата бактерии стали одним из наиболее удобных объектов в биохимических исследованиях низших организмов. Многие бактериальные культуры хорошо известны как активные продуценты внеклеточных гидролаз и применяются при промышленном получении ферментов. Практическое использование бактериальных ферментов в значительной степени способствовало интенсификации исследований по изучению условий их продуцирования, а также локализации.

Эукариоты

Локализация внеклеточных ферментов у простейших представителей эукариот -- микромицетов и дрожжей -- интенсивно изучается особенно в последние годы. Интерес исследователей к экзоферментам грибов объясняется, по-видимому, как высокой продуцирующей способностью этих организмов, так и тем, что они являются весьма интересной моделью при изучении регуляторных механизмов секреции.

В настоящее время происходит лишь накопление фактов о локализации ферментов, преимущественно гидролаз, у грибов. Несомненно, что эти факты после их систематизации позволят более полно представить себе состояние вопроса в целом. Существенным недостатком в большинстве работ является отсутствие данных о ферментных белках. Имеется в виду преимущественно наличие той или иной активности и ее величина.

5. Методы культивирования продуцентов ферментов

В зависимости от источника технология получения ферментных препаратов имеет свои особенности. При извлечении ферментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микробного происхождения более сложная, так как дополнительно включает этапы культивирования микроорганизмов -- продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного материала и производственной культуры соответствующего микроорганизма.

Для производства посевного материала используют исходный штамм продуцентов, получаемый из лабораторных чистых культур, который выращивают разными способами на предварительно стерилизованной твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста. Посевной материал консервируют (высушиванием или хранением при низких температурах) вплоть до дальнейшего использования. Производственные культуры продуцента получают, выращивая посевной материал микроорганизмов как на поверхности твердых или жидких сред, так и в глубине жидких питательных сред.

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И.Такамине еще в 1894г., состоит в культивировании микроорганизмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постоянном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов чаще используют более экономный -- глубинный метод культивирования. В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. Для предотвращения инфекции в ферментере поддерживают повышенное давление наряду с оптимальными значениями рН, температуры, редокс-потенциала и другими условиями культивирования.

В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточный метод культивирования микроорганизмов, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментер как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и биосинтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментер. Такой ферментер представляет собой вращающийся трубкообразный реактор, через один конец которого в него поступает питательная среда и культура микроорганизмов, а из другого -- выводятся ферменты, продукты жизнедеятельности и бактериальная масса. Основное достоинство метода -- возможность длительное время поддерживать в автоматическом режиме рост культуры микроорганизма. Например, культура ацетонобутиловых бактерий находилась в таком реакторе в состоянии непрерывного размножения в течение 200 суток (И.Д.Иерусалимский с сотр., 1986).

Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное требование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей рост продуцента и биосинтез целевого фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соединениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены минеральные соединения, содержащие Мg, Са, Р, S, Fе, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делятся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и количественному составу набора индивидуальных веществ. В комплексные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экстракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использованию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств.

фермент иммобилизированный продуцент микроорганизм

6. Получение ферментных препаратов

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко применяют коммерческие препараты ферментов, чистота которых составляет всего 0,1 % (т.е. 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промышленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой химии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивоварении, представляет собой высушенную биомассу плесневых грибов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практике научных исследований и особенно в медицине используют только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактеризованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.

Неочищенные ферментные препараты получают путем высушивания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной среды. Такие препараты получают и путем упаривания экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов). Распространен также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше 16-10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошкообразного состояния продукты, либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50%-м содержанием сухой массы веществ.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их энзимами -- лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Размещено на Allbest.ru