Характеристика та використання бактерій Nocardia mediterranea

Размещено на http://www.allbest.ru/

Зміст

Вступ

Розділ 1. Теоретичний аспект бактерій nocardia mediterranea

1.1 Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних та цитотоксичних речовин

1.2 Характеристика мутантів штаму Streptomyces sioyaensis

1.3 Характеристика рифаміцину або рифампіцину

Розділ 2. Практичне значення бактерій nocardia mediterranea

2.1 Використання представників роду Nocardia у процесах біотрансформації

2.2 Використання представників роду Nocardia для деградації нафтових забруднень

2.3 Біосинтез антибіотиків бактеріями роду Streptomyces

2.4 Патенти Streptomyces і Аmycolatopsis

Висновки

Список використаної літератури

Вступ

Антибіотики - це речовини мікробного, рослинноно або тваринного походження, їх напівсинтетичні та синтетичні аналоги й похідні, що вибірково пригнічують життєздатність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин. Термін «антибіотик» був введений в літературу Ваксманом у 1942 році.

Широкий спектр дії різних антибіотиків обумовлює їх різноманітне застосування в медицині, різних галузях народного господарства, в наукових дослідженнях.

Актиноміцети - прокаріотичні міцеліальні грам-позитивні мікроорганізми, природнім місцем існування яких є грунт.

Як грунтові мікроорганізми, актиноміцети відіграють важливу екологічну роль. Однак увагу дослідників вони привертають насамперед як одні з найважливіших обєктів біотехнології. Більше 60% біологічно активних сполук мікробного походження і дві третини антибіотиків - це метаболіти актиноміцетів. Так, 80% з них синтезують представники роду Streptomyces.

Серед антибіотиків актиноміцетного походження важливе місце займають протипухлинні препарати.

В результаті багаторічного використання антибіотиків ракові клітини розвинули мутаційну стійкість до них. Також природні штами актиноміцетів характеризуються відносно низькою антибіотичною продуктивністю. Тому ведеться пошук, як нових протиракових антибіотиків, так і нових штамів, які б володіли більш високим рівнем антибіотичної продуктивності.

Висока вартість цих препаратів зумовлена порівняно низькою антибіотичною активністю штамів-продуцентів та їх здатністю синтезувати складні суміші кінцевих продуктів, з яких лише один або два мають терапевтичну цінність.

Підвищений рівень біосинтезу антибіотиків може залежати, як від генів, що відповідають за синтез, так і від генів, що забезпечують стійкість до власного та інших антибіотиків. Особливий інтерес викликають мутації стійкості до антибіотиків, які впливають на процеси транскрипції, трансляції, транспорту метаболітів та морфогенез актиноміцетів (аміноглікозиди, рифампіцин, макроліди)

Об'єкт дослідження - бактерії Nocardia mediterranea

Предмет долідження - характеристика та викорстання бактерій Nocardia mediterranea.

Курсова робота складається з вступу, двох розділів, восьми підрозділів, висновків та списку використаної літератури.

Розділ 1. Теоретичний аспект бактерій nocardia mediterranea

1.1 Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних та цитотоксичних речовин

Однією з глобальних проблем сьогодення є виникнення мультирезистентних форм патогенних мікроорганізмів, стійких до більшості використовуваних на практиці антибіотичних речовин. Актуальним є пошук сучасних ефективних антимікробних сполук, зокрема синтезованих рідкісними та патогенними представниками актиноміцетів. Так, велику кількість метаболітів з антибіотичними властивостями було виявлено у представників роду Nocardia [6, ст. 92]

Штам Nocardia levis MK-VL 113, що синтезував біс-(2-етилгексил)-фталат та біс-(5-етилгептил)-фталат.

Цим сполукам була притаманна антимікробна дія щодо низки бактерій, дріжджів та грибів, причому більшу активність виявляв біс-(2-етилгексил)-фталат. Найчутли ві шими до дії цих метаболітів були Staphуlococcus aureus, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermis -- серед бактерій, Candida albicans, Epidermophyton floccosum -- серед дріж джів та Aspergillus niger, Fusarium oxysporum -- серед мікроміцетів. Мінімальніінгібуючі концентрації (МІК) біс-(2-етилгексил)-фталату при цьому становили 30-50, 40-50, 50-70 мкг/мл, відповідно. Хоча є досить багато даних про біосинтез біс-(2-етилгексил)-фталату мікроорганізмами, для роду Nocardia здатність синтезувати цю сполуку було показано вперше, як і здатність мікроорганізмів продукувати біс-(5-етилгептил)-фталат.

Синтез штамом Nocardia sp. ALAA 2000 хризофанолу 8-метилового ефіру, асфоделін-4,7-біхризофанолу, юстицидину Б та нової біологічноактивної сполуки аяміцину (1,1-дихлоро-4-етил-5-(4-нітрофеніл)-гексан-2-он), особливість структури якої полягає в наявності одночасно як дихлор-, так і нітрогруп

Було проведено масштабування процесу культивування штаму ALAA 2000 на біотехнологічне обладнання. Утворення метаболітів починалося на 3-тю добу культивування і досягало максимуму на 7-му. Синтезованому Nocardia sp. ALAA 2000 аяміцину (0,1-0,5 мг/мл) була притаманна антимікробна активність щодо широкого спектра мікроорганізмів (Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Bacil -lus subtilis ATCC 6051, Bacillus cereus ATCC 9634, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Micro coccus luteus ATCC 9341, Mycobac terium smegmatis ATCC 607, Corynebacterium xerosis NRRL B-1397, Rhodotorula acuta, Pichia angusta, Candida albicans)

Патогенний для людини мікроорганізм Nocardia brasiliensis утворює велику групу речовин з антимікробними властивостями. Так, бразилібактин А є найвідомішим антибіотиком, що синтезується N. brasiliensis IFM 0995; за хімічною будовою це -- індоловий алкалоїд. Встановлено антимікробну активність бразилібактину. А щодо Micrococcus luteus та Sta phylo coccus aureus (МІК 0,73 і 4,5 мг/мл, відповідно), потенційну цитотоксичність щодо клітин лейкозу мишей L1210 та раку шкіри людей KB (загибель 50% клітин за концентрації (СД50) 0,02 і 0,04 мкг/мл), а також здатність посилювати каспазну активність (0,3-3 мкМ) в клітинах лінії HL60.

Штам N. brasiliensis IFM 0667 -- продуцент нокарацинів A, B, C та бразиліхінону D [36]. Показано, що компоненти А, B та D пригнічували розвиток грампозитивних бактерій, зокрема кислотостійких Nocardia asteroides (MIК 3,13, 1,56 і 1,56 мкг/мл відповідно), Gordonia bronchialis (MIК 0,39, 0,78 і 0,78 мкг/мл відповідно) та Mycobacterium smegmatis (MIК 6,25, 6,25 і 12,5 мкг/мл відповідно). Нокарацинам A, B, C була притаманна цитотоксична дія in vitro щодо клітин промієлоцитарного лейкозу людини HL-60 (СД50 0,91, 0,51 і 0,60 мкг/мл відповідно), а бразиліхінону D -- щодо клітин лейкозу мишей L1210 (СД50 11 мкг/мл) та раку шкіри людей (СД50 20 мкг/мл) [10, ст. 177]

Нокатіацини І-ІІІ ефективно діяли на представників родів Staphylococcus, Strep tococcus, Enterococcus та Moraxella, у тому числі й на мультирезистентні патогенні штами Staphylococcus aureus (МІК 0,003-0,007 мкг/мл), Enterococcus faecium (0,015-0,03 мкг/мл), Streptococcus pneumoniae (0,0005-0,002 мкг/мл).

Показано ефективність цих антибіотиків у організмі мишей щодо Staphylococcus aureus.

Досліджено антибіотик феназин, синтезований штамом Nocardia dassonvillei BM-17, виділеним з Північно-Льодовитого океану. Встановлено, що цій сполуці притаманна сильна антифунгальна активність щодо Candida albicans (МІК 64 мкг/мл), а також цитотоксичність щодо онкологічно транс- формованих клітин HepG2, A549, HCT-116 та COC1.

Сильна антимікробна активність щодо метицилінрезистентного стафілокока притаманна також антибіотику наргеніцину А1, синтезованому Nocardia sp. CS682. Окрім того, цей антибіотик за присутності 1,25-дигідроксивітаміну D3 або ретинолової кислоти пригнічував проліферацію та стимулював диференціацію клітин лейкозу HL-60.

Антибіотик трансваленцин А, що є комплексом цинку з органічною кислотою, яка містить фенол як замісник, та синтезується патогенним штамом Nocardia transvalensis IFM 10065. Транс валенцин А виявляв антимікробну дію щодо грибів Trichophyton mentagrophytes IFM 10489, Paecilomyces variotii IFM 40913 і Cryptococcus neoformans ATCC 92112 (МІК 16,0, 2,0 та 4,0 мкг/мл відповідно) і бактерій Micrococcus luteus IFM 2066 (МІК 16,0 мкг/мл)

1.2 Характеристика мутантів штаму Streptomyces sioyaensis

Сьогодні в центрі уваги генетичних досліджень знаходиться хімічний мутагенез, що має дуже важливе значення для екології, сільського господарства та медицини. Перші хімічні мутагени були відкриті в 30-х В.В. Сахаровим, М.Ю. Лобашовим і С.М. Гершензоном. Через деякий час ці дослідження досягли широкого розмаху завдяки дослідженням І.А. Рапопорта і Ш. Ауербах, які вперше виявили 100-% мутагенний ефект у окремих хімічних сполук - супермутагенів. Хімічні мутагени - це речовини, які викликають хімічні перетворення, що супроводжуються змінами у структурі ДНК.метил-N-нітро-N-нітрозогуанідин (НГ) належить до сполук, які алкілюють ДНК, - найсильніший з хімічних мутагенів. До цієї групи належать також диалкілсульфати (диметилсульфат, диетилсульфат), алкілалкансульфати (метилметансульфонат, етилметансульфонат), N-нітрозосполуки та діазоалкани (N-алкіл-N-нітрозосечовина, N-алкіл-N-нітро-N-нітрозогуанідин, пропіленоксид), бетапропіолактон, етиленіміни, іприти (сірчистий іприт, азотистий іприт). Ці сполуки є електрофілами, спорідненими до нуклеофільних центрів біологічних макромолекул. НГ утворює конюгати з глутатіоном. У відповідному стані глутатіон є нуклеофілом і реагує з електрофільними сполуками. Реакція НГ з цистеїновим залишком глутатіону призводить до утворення діазометану - високореактивної метилуючої сполуки, яка власне, й спричиняє мутагенний ефект [3, ст. 242]

В азотистих основах ДНК є багато сайтів, здатних реагувати з алкілуючими агентами. У залишку аденіну це N1, N3, N6 та N7; гуаніну - N1, N2, N3, N6, N7 та О6; цитозину - N3, N4 та О2; тиміну - N3, О2 та О4. Загалом атоми основ азоту є більш нуклеофільні, ніж атоми кисню. Найбільш реактивними є сьомий атом азоту в гуаніні та третій атом азоту в аденіні. Підлягають алкілуванню також й залишки фосфорної кислоти, у результаті чого виникають фосфотриефіри. Близько 85% пошкоджень ДНК, спричинених НГ, це метильовані азотисті основи, а 14% - фосфотриефіри.

Першим тіопептидним антибіотиком, який вдалося виділити у 1954р. був тіострептон (продуцент Streptomyces azureus). Цей вторинний метаболіт виявився ефективним проти грам-позитивних бактерій і за своїм ефектом був схожий на пеніцилін. Проте, незважаючи на свою перспективність, він так і не був впроваджений для клінічного використання через токсичність та низьку розчинність у воді. Згодом було відкрито ще цілий ряд тіопептидних антибіотиків, серед яких були сіоміцин (продуцент Streptomyces sioyaensis), тіопептин (продуцент Streptomyces tateyamensis).

Головну роль в процесі диференціації відіграє Rel-контроль, опосередкований продуктами генів relA та relC. Цими продуктами є ppGpp синтаза ти рибосомний білок L11, що необхідний для активації попереднього. Ініціація початкових шляхів синтезу вторинних метаболітів починається після розвитку повітряного міцелію та формування спор.

Представники роду Streptomyces є особливо цікавими, оскільки вони синтезують велику кількість антибіотиків, важливих в промисловості та медицині. Ініціація продукції антибіотика, часто згадується як «фізіологічна диференціація», зазвичай відбувається протягом переходу між вегетативним ростом і морфологічною диференціацією організму. Розпізнавання сигналів, що запускають процес диференціації є важливим в регуляції початку морфологічної і фізіологічної диференціації. Було відкрито, що морфологічна диференціація запускається зменшенням кількості ГТФ, тоді як фізіологічна - збільшенням вмісту ppGpp [7, ст. 311]

Отже, для отримання високоактивних штамів - продуцентів антибіотиків, необхідно вивчити та вміло використовувати метод направленого індукованого мутагенезу, для зміни структури та експресії генів біосинтезу антибіотиків та первинних метаболітів. Також важливим моментом для отримання мутантів з високою антибіотичною активністю є вивчення генів, які контролюють стійкість до власного та інших антибіотиків, а також механізму їх дії.

Таким чином, використання селекційних підходів та сучасних генно-інженерних маніпуляцій є важливим моментом у конструюванні штамів - продуцентів протипухлинних антибіотиків. А висока вартість цих препаратів, зумовлена порівняно низькою антибіотичною активністю штамів-продуцентів та їх здатністю синтезувати складні суміші кінцевих продуктів, з яких лише один або два мають терапевтичну цінність, надає все більшої актальності пошуку надпродуцентів цих антибіотиків.

Спонтанні рифампіцин-резистентні (Rifr) мутанти штаму S. sioyaensis відбирали на середовищі, яке містило 0,5 мкг/мл рифампіцину. Частота виникнення Rifr-мутантів становила 10-6. Відомо, що спонтанні мутанти бактерій, стійкі до антибіотиків, виникають із частотою 10-5-10-7. Було отримано 210 спонтанних Rifr-мутантів. Мутанти S. sioyaensis поділили на групи за рівнем стійкості до рифампіцину за допомогою методу відбитків. До I групи увійшли мутанти, які були стійкими до концентрації рифампіцину 5-20 мкг/мл туди увійшло 96,2% мутантів. До II групи увійшли мутанти стійкі до 50-100 мкг/мл, їх кількість становила 3,8%. Серед Rifr-мутантів II групи було виділено мутанти Rif49S і Rif50S, які росли на середовищі із концентрацією рифампіцину 100мкг/мл [2, ст. 4]

У Streptomyces спори утворюються в два етапи:

1. Апікальна ділянка повітряної гіфи відділяється септою, нуклеоїд витягується.

2. Майже одночасно клітина ділиться септами на ділянки, нуклеоїд ділиться в тих же місцях, клітинна стінка стає в 2 рази товща, спори округляються і їх стінка стає в 7 разів товща за стінку гіфи.

Актиноміцети (роду Streptomyces, Streptosporangium, Micromonospora, Actinomadura) є постійними мешканцями кишечнику дощових черв'яків, термітів і багатьох інших безхребетних. Руйнуючи целюлозу і інші біополімери, вони є їх симбіонтами. У організмі людини мешкають в ротовій порожнині, в кишечнику, в дихальних шляхах, на шкірі, в зубному нальоті, в каріозних зубах, на мигдалинах. Геноми представників роду Streptomyces представлені лінійними молекулами ДНК. Хромосома Streptomyces coelicolor A3(2) є лінійною молекулою ДНК розміром 8667507 п.н., що містить 7825 гена, які кодують білки, відсоток Г+Ц пар складає 72,1 %. Геном Streptomyces avermitilis також представлений лінійною молекулою ДНК розміром 9025608 п.н., що містить 7581 гена, які кодують білки, відсоток Г+Ц пар складає 70,7 %.

1.3 Характеристика рифаміцину або рифампіцину

Рифампіцин (INN) і рифампіцин (USAN) є бактерицидний антибіотик групи рифамицина. Це напівсинтетичне з'єднання, отримані від Amycolatopsis rifamycinica (раніше відома як Amycolatopsis mediterranei і Streptomyces mediterranei). Рифампіцин може бути скорочено R, RMP, Вірменії, Російської Федерації, або РІФ (США).

У 1957 році зразок грунту з сосновим лісом на Французькій Рив'єрі був доставлений на аналіз в Lepetit фармацевтичної дослідної лабораторії в Мілані, Італія. Там, дослідницька група під керівництвом професора П'єро Sensi (1920 -) і д-р Марія Тереза Timbal (1925 - 1969) відкрив нову бактерію.

Це нові види з'явилися відразу великий науковий інтерес, оскільки він був створення нового класу молекул антибіотика діяльності. Тому що Sensi, Timbal і дослідники особливо любив французьке детектив Rififi (близько пограбування коштовності і змагаються бандами), вони вирішили назвати ці сполуки "рифампіцинів" [8, ст. 346]

Після двох років спроб отримати більш стабільні напівсинтетичні продукти, нові молекули з високою ефективністю і хорошою переносимістю був проведений в 1959 році і був названий «рифампіцин».

Рифампіцин також відомий як rifondazione, R / AMP, rofact (в Канаді), а рифампіцин в Сполучених Штатах. Існують різні типи рифампіцинів з яких це відбувається, але рифампіцин формі, з 4-метил-1-piperazinaminyl групи, на сьогоднішній день є найбільш клінічно ефективним.

Рифампіцин інтенсивно червоний твердий, і невелика частка яких досягає рідинах організму, як відомо для додання нешкідливі червоно-оранжевий колір сечі (і в меншій мірі, а також піт і сльози) користувачів, протягом декількох годин після прийому. Максимальні концентрації в крові знизився приблизно на третину, коли антибіотик приймати під час їжі.

Рифампіцин використовується при лікуванні ряду бактерій, але найвідомішим за активністю щодо Mycobacterium штами, такі як туберкульоз і причини хвороби Хансена.

Рифампіцин може бути використаний в якості монотерапії протягом декількох днів в якості профілактики проти менінгіту, але опір швидко розвивається при тривалому лікуванні активних заражень, тому препарат завжди використовується проти активної інфекції в поєднанні з іншими антибіотиками.

Дані про препарат:

- Назва продукту: рифампіцин (рифампіцин)

- № КАС 13292-46-1

- Хімічна назва: 3 - {[(4-метил-1-піперазиніл) іміно] метил} рифамицина

- Молекулярна формула: C43H58N4O12

- Молекулярний вага: 822,95

- Застосування: Антибіотики для лікування туберкульозу.

- Зовнішній вигляд: червонувато-коричневого до коричнево-червоні кристалічний порошок.

- Технічні характеристики: BP / USP / EP.

- Густина: 0.3g / ml; 0.5g / ml; 0.7g / ml; 0.8g / ml

- Стандартна упаковка: 5kgs / drum; 25kgs / drum; 25kgs / carton

Рифампіцин був введений в 1967 році, в якості основної поряд з коктейль-медикаментозне лікування туберкульозу та менінгіту, неактивні, а також ізоніазид, етамбутол, піразинамід і стрептоміцин.

Це вимагає рецепта в Північній Америці. Він повинен бути введений регулярно щодня протягом декількох місяців без перерви, в іншому випадку, ризик лікарсько-стійким туберкульозом значно збільшується. Справді, це основна причина, що вона використовується в тандемі з трьох вищезазначених препаратів, зокрема, ізоніазид.

Це також є основним мотивом терапії під безпосереднім спостереженням за туберкульозом.

Рифампіцин опір швидко розвивається під час лікування і монотерапії рифампіцином не повинні бути використані для лікування цих інфекцій - його необхідно використовувати в комбінації з іншими антибіотиками.

Рифампіцин також використовується в лікуванні холестатичного свербежу.

Рифампіцин, як правило, використовуються для лікування інфекцій, мікобактерій, включаючи туберкульоз і хвороби Хансена. Він може бути використаний для лікування БЦЖ-OMA, який слід як незвичайне ускладнення вакцинації БЦЖ проти туберкульозу.

З лікарської терапії використовується в якості стандарту лікування хвороби Хансена, рифампіцин завжди використовується в комбінації з дапсон і клофазімін, щоб уникнути виявлення лікарської стійкості.

Рифампіцин також відіграє певну роль у лікуванні метицилін-стійкий золотавий стафілокок (MRSA) у поєднанні з фузидієвої кислоти, хоча останні питання були підняті питання у зв'язку з відсутністю досліджень з ефективності цього лікування. Він використовується в профілактичної терапії проти Neisseria meningitidis (менінгококова інфекція).

Він також використовується для лікування інфекції Listeria видів, гонококів, гемофільна паличка і Legionella Pneumophila. Для цих нестандартних показань, чутливість тестування має бути зроблено (якщо можливо), перш ніж почати терапію рифампіцину.

Enterobacteriaceae, Acinetobacter, Pseudomonas і види внутрішньої стійкі до рифампіцину [1, ст. 196]

Крім того, вона була використана з амфотерицином В основному невдалі спроби лікування первинний амебний менінгоенцефаліт викликано Naegleria fowleri.

Рифампіцин пригнічує ДНК-залежної РНК-полімерази в клітинах бактерій шляхом зв'язування його бета-субодиниці, що перешкоджає транскрипції РНК і подальший переклад з білками. Його ліпофільних природа робить його гарним кандидатом для лікування менінгіту, форма туберкульозу, яка вимагає розподілу центральної нервової системи і проникнення через гематоенцефалічний бар'єр.

Рифампіцин впливає безпосередньо на синтез РНК. Він пригнічує тільки прокариотических ДНК-РНК-полімерази гарантувати, особливо ті, які є грам-позитивні плям і мікобактерій туберкульозу. Велика частина цієї мембрани кислоти швидко позитивних бактерій є міколових кислота в комплексі з пептидогликана, який дозволяє легким рухом препарату в клітину. Опыт показывает, что в пробирке ДНК обрабатывают концентрации в 5000 раз выше, чем нормальная доза остались незатронутыми, в естественных условиях эукариотических образцы "РНК и ДНК-полимеразы пострадали несколько проблем.

Рифампіцин взаємодіє з в субодиниць РНК-полімерази, коли він знаходиться в б2в тример. Це зупиняє транскрипцію мРНК, тому запобігання переклад поліпептидів. Це повинно бути ясно, що він не може зупинити подовження мРНК раз прив'язки до шаблону-ДНК була розпочата.

Рифампіцин-РНК-полімерази комплекс надзвичайно стабільною і в той же експерименти показали, що це не через будь-якої форми ковалентного зв'язку. Можна припустити, що водневі зв'язки і р-р зв'язок взаємодії між нафтохінона і ароматичні амінокислоти є основними стабілізаторами, але це вимагає окислення naphthohydroquinone який знаходиться найчастіше в рифампіцин [9, ст. 178]

Саме ця остання гіпотеза, яка пояснює вибух з лікарсько-стійкими бактеріями: мутації в гені, який Гров замінити фенілаланін, триптофан, тирозин і з неурядовими організаціями, ароматичних амінокислот результаті кислоти в бідних зв'язок між рифампіцином і РНК-полімерази.

Рифампіцин-стійких бактерій виробляти РНК-полімерази з тонко різних в субодиниці структур, які не завжди пригнічується препарату. У молекулярних біологічних досліджень, плазміди, що містять рифампіцин-стійких генів часто використовуються для скринінгу колонії.

1.4 Причини, симптоми та особливості хвороби нокардіоз

Нокардіоз (лат. - Nocardiosis; стрептотріхоз) - хронічна хвороба домашніх і сільськогосподарських тварин, що характеризується гнійним запаленням лімфатичних вузлів, лімфатичних судин і молочної залози.

Історична довідка, поширення, ступінь небезпеки і збиток. Нокардіоз великої рогатої худоби вперше описав Суанайон в 1829 р. у Франції. Загальноприйнятий термін «нокардіоз» пов'язаний з ім'ям французького вченого Е. Нокар, вперше виділив і дав детальну характеристику збудника. Нокардіоз зустрічається в Європі, Африці, Америці.

Економічний збиток складається з витрат на лікування хворих тварин, проведення профілактичних заходів і втрат від зниження продуктивності.

Збудник хвороби. Збудники нокардіозу - гриби Nocardia asteroides і Nocardia brasiliensis. При вирощуванні збудника на середовищі Сабуро або мясопептонном агарі в аеробних умовах при температурі 28 ... 37 "З N. asteroides формує гладку або зернисту колонію тістоподібної консистенції з вираженою складчастістю. До 20-го дня діаметр колонії досягає 8 ... 10 мм. Колір колонії жовтуватий, оранжевий, а іноді навіть червоний. При мікроскопічному дослідженні (забарвлення за Грамом) видно тонкі нитки товщиною до 1 мкм, з чітко вираженою сегментацією, швидко розпадаються на паличкоподібні і кокова елементи діаметром близько 1 мкм. Обидва представники грампозитивні і кислотостійкі, чутливі до пеніциліну і стійкі до лізо-ЦВМП. Nocardia brasiliensis не росте на середовищах з додаванням 7% NaCl, Nocardia asteroides - зростає.

Епізоотологія. Сприйнятливі велика рогата худоба, зебу, коні, вівці, мавпи , собаки, кішки, хутрові звірі, кролики, свійська птиця.

З довкілля збудник нокардіозу проникає в організм через травми шкірного покриву, слизової оболонки. Залежно від місця впровадження розвиваються різні захворювання: мастити, лімфангіти і пр.

Патогенез. Вивчено недостатньо. Оскільки збудники знаходяться в грунті, тварини мають постійний контакт з ними. Проникнення грибів в організм не завжди приводить до розвитку хвороби. Вона виникає тільки тоді, коли організм ослаблений внаслідок порушення правил годівлі й утримання, тривалого лікування антибіотиками та ін. При незначних ураженнях вимені машинне доїння викликає роздратування паренхіми вимені, знижуючи її резистентність, і за наявності збудника розвивається нокардіозний мастит.

Збудник, проникаючи в тканину тваринного, викликає некроз.

Некротизованих ділянку инфильтрируется великими одноядерними лімфоїдними клітинами, що утворюють надалі вал з багатоядерних гігантських лімфоцитів. Молоді вузлики обростають сполучнотканинною капсулою. Надалі окремі вузлики зливаються і виникають великі пухлиноподібні маси, які некротизируются, розм'якшуються, і вміст їх через свищі виділяється назовні. Іноді в центрі вузлика збудник петрифікуються.

Перебіг і клінічний прояв. У великої рогатої худоби захворювання протікає хронічно у вигляді виразкового лімфангіта і маститів. У першому випадку на різних ділянках тіла з'являються лімфангітние вузли і виразки. Вузли спочатку тверді, потім розм'якшуються, з них виділяється гній.

При маститах молоко змінює свою консистенцію і містить клубки міцелію. Вим'я хворобливе, запалене. Уражаються одна або відразу кілька часткою.

У собак в більшості випадків спостерігають висцеральную форму но-кардіоза з ураженням легень і симптомами з боку нервової системи. Рідше зустрічаються випадки захворювання, що супроводжуються ураженням лімфатичних вузлів і появою флегмон [4, ст. 212]

Патологоанатомічні ознаки. У підшкірній клітковині множинні абсцеси з вмістом білуватого кольору або какаоподобним кров'янистим гноєм без запаху, в шкірі свищі. У овець і ягнят часто виявляють гнійники в області суглобів, в міжм'язових тканинах, фістули в області остистих відростків хребців (шийних , спинних та ін.) При ураженні суглобів в синовіальних сумках і сухожильних піхвах знаходять гнійну рідину.

Мастити характеризуються збільшенням вимені, набряком підшкірної клітковини. Молочний канал і цистерна містять сіро-жовті густі пастоподібна маси, змішані з сіро-білої молокоподобной рідиною. На розрізі тканина вимені випинається, часточки її мармурової забарвлення, що залежить від відмінності в кольорі залізистої і інтерстиціальної тканини. При натисканні з паренхіми виділяється пастоподібна секрет сіро-білого кольору, без запаху. Більшість часточок сіро-червоного або сіро-жовтого кольору, сало-або тестоподобной консистенції. Сіро-білий секрет знаходиться і в молочних ходах. У більшості випадків в області цистерни знаходять розм'якшені брудно-сірі вогнища, що переходять без різкої межі в нормальну тканину. внутрідолькових тканину драглисто-набрякла, цегляного або темно-червоного кольору. Лімфатичні вузли сильно збільшені. Такі зміни характерні для гостро протікає маститу.

При хронічному маститі шкіра вимені потовщена, тверда, заліза жовтого кольору, з безліччю вузликів, стінки сосків потовщені, молочний синус розтягнутий вузькому гноєм.

Температура тіла підвищується до 38--38,5° З, потім хвороба поступово прогресує, звичайні терапевтичні призначення виявляються неефективними. Стан хворого продовжує погіршуватися. Температура тіла сягає 39--40° З, температурна крива неправильного типу з більшими на добовими размахами. Підвищення температури тіла супроводжується ознобом, який змінюється почуттям спека, а на ранок хворий починає пітнітиме. Хворий слабшає, зникає апетит, вагу тіла неухильно знижується, розвивається анемизация, посилюється біль голови, розвивається безсоння. Кашель посилюється, мокроту спочатку слизисто-гнойная, потім стає гнійної, нерідко з додатком крові, які зазвичай спостерігається під час розпаду легеневих інфільтратів, освіті порожнин. У таких випадках, крім домішки крові, мокроту містить також эластические волокна. На відміну від актиномикоза, друз (невеликих жовтуватих зерняток) в мокроті немає. При опорожнении порожнин то, можливо одномоментне виділення великої кількості мокроти. При залученні у процес плеври з'являються колючі біль у грудній клітці, все частіші під час вдиху. Може выслушиваться шум тертя плеври [1, ст. 116]

Патологічний процес легке може переходити на плевру, середостіння, перикард, грудну стінку. У цьому можливо освіту фистульных ходів, проникаючих в перикард, эндокард, вони розкриваються свищами на поверхню шкіри, виділяючи гній.

Лікування. Необхідна тривала хіміотерапія. Призначають бактрим (Bactrimum), синоніми: Co-trimoxazole, Берлоцид, Бисептол-480; Орибакт, Ориприм, Септрин. Випускається в таблетках (в упаковці 20 прим.). Призначають по 2 таблетки 2 десь у день була в перші 14 днів лікування, потім дають по1 таблетці 2 десь у добу. Можна також використовувати також сульфадимезин в первые4 дня по 2 р через 4 год, з 5-го дня дають по 1,5 р через 4 год, з 10-го дня -- по 1 р через 4 год. Курс лікування 2--3 міс. Потім призначають підтримує терапію диафенилсульфоном (DDS), яку продовжують у протягом 5--6 міс. Препарат призначають по 0,05--0,1 р 2 десь у день. Через кожні 6 днів роблять одноденний перерву. З нові іноземні препаратів рекомендується призначати фаназил (Fanasit). Його застосовують всередину, внутримышечно і внутрішньовенно по 2 р одноразово в 1-ї день, потім 1 р раз на тиждень. Ампициллин по 150 мг/кг щодня, еритроміцин. При эмпиеме, абсцесах мозку, підшкірних нагноениях потрібно хірургічне лікування.

Прогноз. При сучасних методах терапії вдається врятувати близько 90 відсотків% хворих на ізольованими ураженнями легких. При абсцессе мозку -- лише 50%. У ВІЛ-інфікованих прогноз серйозніше.

Розділ 2. Практичне значення бактерій nocardia mediterranea

2.1 Використання представників роду Nocardia у процесах біотрансформації

Існує можливість застосування цитохрому P 154, виділеного з Nocardia farcinica IFM10152, для здійснення трансформації ізофлавоноїду формонетину (100 мкМ) у частіше застосовувані продукти -- даїдзен (естрогенподібна сполука з протипухлинною активністю) та 3?,4?,7-тригідроксіізо-флавон (антиоксидант) (рис. 2). Встановлено, що ефективність перетворення формонетину на даїдзен та 3?,4?,7-тригідроксіізофлавон становить 2,09% та 3,62% відповідно [6, ст. 104]

Уперше показано, що клітини Nocardia corallina B-276 можуть бути використані у процесі дерацемізації ібупрофену. Клітини штаму B-276 у фосфатному буфері (0,1 М, рН 7,0) ефективно гідролізували ібупрофену нітрил до ібупрофену аміду, який далі перетворювався на ібупрофен з ефективністю 99%. У роботі описано ензим цис-епоксисукцинатгідролазу (КФ 3.3.2.3) бактерій Nocardia tartaricans, що бере участь у трансформації цис-епоксисукцинату в L(+)-тартарову кислоту. Nocardia globerula NHB-2 розглядають як продуцент нікотинової кислоти, яка утворюється з 3-ціанопіридину за участю високоактивної нітрилази (ензим нітриламіногідролаза, КФ 3.5.5.1, 6,67 од/мг АСБ, 18,7 од/мл). Пока за но, що з додаванням дослі джуваного ензиму (10 од/мл) відбувалася повна трансформація 300 мМ 3-ціанопіридину в нікотинову кислоту упродовж 1 год.

2.2 Використання представників роду Nocardia для деградації нафтових забруднень

Нафта являє собою комплекс різних вуглеводнів (аліфатичних, аліциклічних, ароматичних) та інших сполук гетероциклічної і металоорганічної природи [5, ст. 22]. Процеси видобутку, транспортування, перероблення нафти постійно супроводжуються аварійними викидами сировини у навколишнє середовище. На сьогодні вона є основним забруднювачем довкілля. Біоремедіація належить до пріоритетних методів очищення довкілля від забруднення нафтопродуктами. До потенційних переваг штамів роду Nocardia у деградації нафтових забруднень можна віднести: широкі катаболічні можливості, високу стійкість до несприятливих чинників зовнішнього середовища та здатність синтезувати ПАР.

Не розгалужені алкани є одним з найменш реакційноздатних класів органічних сполук. Проте, незважаючи на нерозчинність їх у воді, гідрофобність та високу частоту забруднення ними довкілля, вони є цілком придатним джерелом вуглецю для низки мікроорганізмів. Проблема природного забруднення нафтою також загострюється у зв'язку з наявністю у її складі розгалужених алканів. Останні є стійкішими до біодеградації, ніж лінійні алкани. Однією з причин стійкості може бути ускладнене споживання цих сполук у зв'язку з тим, що через розгалуженість вуглецевого ланцюга їм складно потрапити до клітини. Іншою при чиною є те, що ці сполуки погано піддаються в-окисненню [7, ст. 263]

Досліджено здатність мікроорганізмів, ізольованих із забрудненого внаслідок аварійного розливу нафти піщаного узбережжя Середземного моря, до деструкції вуглеводнів нафти. У складі мікробного угруповання ідентифіковано п'ять видів, з яких один -- представник роду Nocardia, два -- Rhodo coccus і ще два -- Gordonia. Встановлено, що штам Nocardia sp. SoB асимілював дизельне паливо, лінійні алкани (С12-С16), н-октан, октан, пентадеканол, проте не ароматичні сполуки, що можна пояснити відсутністю необхідних ензиматичних систем. Ступінь деструкції ейкозану (С20), октакозану (С28) та гексатриаконтану (С36), початкова концентрація яких становила 1 г/л, досягала 95-98% на 28-му добу за умов культивування в рідкому живильному середовищі. У подальших дослідженнях встановлено, що біодеградація вуглеводнів штамом SoB у ґрунті залежала від його фізико-хімічних властивостей, а максимальний ступінь деструкції становив 75% на 28-му добу. антимікробний штам рифампіцин нокардіоз

В інших дослідженнях виявлено високу здатність Nocardia cyriacigeorgica SBUG 1472, виділеного із забруднених нафтою зразків піску пустелі в Саудівській Аравії, до деградації широкого спектра вуглеводнів: н-алканів з довжиною ланцюга С6-С16, розгалужених алканів, зокрема пристану, а також ароматичних сполук. Було встановлено залежність ефективності споживання н-алканів від довжини вуглеводневого ланцюга.

Так, на С12-С16-сполуках ріст спостерігався вже з першої доби культивування, тимчасом як для коротших гомологів (С6-С12) -- з третьої. Для визначення можливого шляху споживання алканів у безклітинних екстрактах, одержаних з клітин, вирощених на тетрадекані, аналізували проміжні продукти метаболізму. Наявність тетрадеканолу, тетрадеканової, додеканової і деканової кислот свідчить про функціонування в N. cyriacigeorgica SBUG 1472 монотермінального шляху окиснення вуглеводнів.

До складу нафти входять ароматичні сполуки, наприклад бензен, а також поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАР), які є найбільш екологічно небезпечними і надзвичайно стійкими до біодеструкції. Відомо, що представникам родини Nocardiaceae притаманна здатність до деструкції ароматичних вуглеводнів. Актуальним на сьогодні залишається вивчення особливостей метаболізму ароматичних субстратів у клітинах деструкторів, що дасть змогу регулювати метаболічні процеси та інтенсифікувати біоремедіацію [3, ст. 241]

Лінійні алкілбензени (ЛАБ) з ароматичною структурою є також небезпечними забруднювачами довкілля. Було селекціоновано штам Nocardia amarae MB-11, здатний використовувати ці сполуки як ростові субстрати. Ступінь деградації ЛАБ з довжи ною ланцюга С11-С14 та С10-С13 становив 70% на 96-ту год та 57% на 144-ту год культивування штаму MB-11 відповідно.

У забруднених екосистемах часто наявні нітроароматичні сполуки -- органічні речовини, що містять щонайменше одну нітрогрупу, приєднану до ароматичного кільця (нітробензен, 3-нітронафтален, 3-нітробіфеніл, а також різноманітні нітрополіароматичні вуглеводні). На сьогодні відомо, що в клітинах мікроорганізмів-деструкторів на першому етапі катаболізму нітроароматичних сполук відбувається відновлення нітрогрупи, після чого вони перетворюються на відповідні феноли, хінони або катехоли, з яких у подальшому утворюються інтермедіати циклу трикарбонових кислот (ЦТК)

Поряд з аліфатичними й ароматичними вуглеводнями небезпеку для довкілля становлять також гетероциклічні сполуки, зокрема піридин та його похідні. Ці сполуки є стійкими до біодеструкції та добре розчинними у воді, тому часто ідентифікуються в забруднених екосистемах, особливо у ґрунтових водах.

У роботі показано здатність штаму Nocardia sp. до росту на середовищі з піридином та б-піколіном (0,05-0,2 мг/л). Тривалість подвоєння біомаси Nocardia sp. за умов культивування на піридині й б-піколіні становила 8,25-16,9 та 6,9-9,05 діб відповідно. У процесі біодеградації піридину азот, що міститься у гетероциклі, перетворюється на аміак. За збільшенням концентрації амонійного азоту оцінювали ефективність споживання піридину. Згідно з теоретичними розрахунками було встановлено, що за умови 98%-ї деструкції піридину (200 мг/л) має утворитися 35,08 мг/л амонійного азоту. Проте експериментально показано, що за умов росту Nocardia sp. на піридині утворювалося 22 мг/л аміаку, що свідчить про деструкцію 61,5% субстрату.

2.3 Біосинтез антибіотиків бактеріями роду Streptomyces

Перше завдання при пошуку продуцентів антибіотиків - виділення їх з природних джерел. Разом з тим для цих цілей широко застосовується метод зміни геному виділеного продуцента антибіотика шляхом мутагенезу та генної інженерії [1, c. 126].

В основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено принцип виділення чистої культури мікроба і безпосереднього випробування його по відношенню до використовуваних тест-організмів. Більшість сапрофітних бактерій добре розвивається на багатих за складом натуральних середовищах (м'ясопептонний агар, картопляний агар, сусло-агар та ін.) при рН близько 7,0 і температурі 30-37°C.

У цих же умовах розвиваються актиноміцети і деякі гриби, але для них вони менш сприятливі, ніж для бактерій. Актиноміцети ростуть повільніше, ніж бактерії, вони можуть використовувати такі джерела живлення, які не дуже добре засвоюються бактеріями. Значення рН середовища після стерилізації встановлюється в межах 6,8-7,1.

Міцеліальні гриби краще розвиваються на середовищах з дещо зниженим значенням рН (4,5-5,0), на яких погано ростуть багато бактерії і актиноміцети.

Технологічний процес виробництва антибіотиків починається зі стадії біосинтезу антибіотичниx речовин в умовах глибинного культивування продуцента - мікроорганізму (ферментера) в спеціально підібраною поживному середовищі при строго контрольованiй температурі та інтенсивнiй аерації зі збереженням повної стерильності під час всього процесу ферментації [5, c. 203]. Якість антибіотиків, що отримуються в результаті промислового виробництва, значною мірою залежить від рівня біосинтетичнoї активності штаму-продуцента. У промисловості використовують тільки високопродуктивні штами мікроорганізмів, вирощені в процесі тривалої селекційної роботи.

Тривалість вирощування штаму-продуцента коливається від 48 годин до кількох діб. Після завершення процесу культивування продуцента культуральну рідину піддають спеціальній обробці і наступнiй фільтрації (відокремлення від біомаси продуцента). Потім в залежності від властивостей антибіотика і його хімічної будови застосовують різні методи виділення і очищення. В якості основних методів використовують екстракцію, осадження, сорбцію на іонообмінних матеріалах, упарювання і сушку [5, c. 243].

Ферментаційні процеси одержання антибіотиків ще не досягли тої досконалості, що могла б бути забезпечена завдяки комп'ютерній техніці й розумінню фізіології продуцентів. Своєрідним гальмом удосконалювання технології виступають самі клітинні популяції мікроорганізмів, які змінюються якісно й кількісно протягом усього продуктивного циклу. Тому не вдається одержувати повністю ідентичних результатів навіть у двох суміжних ферментаціях, так само як і всьому технологічному процесі вдається порівняно добре проводити лише в періодичному режимі.

Тому що антибіотичні речовини є вторинними метоболітами, то біосинтез їх сполучений з переходом культури продуцента в ідіофазу. Отже, тут доцільне лімітування росту продуцента. Таким фактором, що лімітує, при біосинтезі пеніциліну виступає глюкоза, тоді як при біосинтезі антибіотиків стрептоміцетами - фосфати. Все це важливо при компановці живильних середовищ, підгодівлі штаму - продуцента в процесі біосинтезу антибіотика. Так, середовище для продукції пеніциліну (вона ж придатна для нагромадження інокулюму) включає глюкозу - 1,5%, лактозу - 5% (лактоза знімає катаболітну репресію глюкози), амонію сульфат і фосфати - 0, 5-1%, кукурудзяний екстракт - 2-3%, попередники антибіотика - фенокси- або фенілоцтова кислота - 0, 3-0,6%, крейда - 0, 5-1%, піногасник - 0, 5-1%; температуру ферментації підтримують на рівні 22-26 С при рн від 5,0 до 7,5 і аерації 1 м3 повітря на 1 м3 середовища в 1 хвилину; тривалість ферментації - 4 доби.

Так звана "всеїдність" актиноміцетів забезпечує ним здатність рости й продуціювати антибіотики на середовищах, що містять білки (соєве борошно, рибне борошно, білок клейковини пшениці та ін.), крохмаль. Проте, стосовно до кожного продуцента є свої особливості, звичайно відмічувані в регламентній документації. Наприклад, посівний матеріал Streptomyces kanamyceticus одержують на соєво-крохмальному середовищі й на ній же проводять основну ферментацію при 27-28 С протягом 4-5 доби при підтримці рн на рівні 7, 1-7,6.

При ферментації Str. floridae (продуцент віоміцину, або флориміцину) рекомендують середовище, що містить глюкозу або гідрол, соєве борошно, кукурудзяний екстракт, нітрати, крейду; температуру підтримують у межах 27-29 С, рн на рівні 7, 0-7,3.

У випадку ферментації Str. erythreus у живильне додавати середовище пропиловий спирт, як попередник антибіотика еритроміцину.

Продуцент ністатину Str. noursei інтенсивно споживає амонійний азот (не нітратний), і т.д.

Перед виділенням антибіотика з культуральної рідини необхідно відокремити тверду, або щільну фазу від рідкої. У цих випадках, як правило, використовують фільтрацію. Якість твердої фази помітно позначається на ефективності фільтрації. Тут можна відзначити наступну закономірність - натівна бактеріальна маса фільтрується гірше міцеліальної [19]. З урахуванням того факту, що вищі актиноміцети здатні формувати ниткові структури, то їхнє відділення при фільтрації відбувається трохи легше, ніж інших бактерій [7, ст. 318]

Шляхи поліпшення фільтрації: обробка ростових середовищ електролітами, теплова коагуляція, додавання фільтруючих наповнювачів, кислотна коагуляція й деякі інші.

2.4 Патенти Streptomyces і Аmycolatopsis

Штам streptomyces violarus, який має комбіновану антагоністичну активність стосовно фітопатогенних мікроорганізмів та нематод



Спосіб уведення реплікативних та інтегративних плазмід у штами amycolatopsis japonica dsm44213 i amycolatopsis sp. lv42-5



Штам streptomyces violarus, який має комбіновану антагоністичну активність стосовно фітопатогенних мікроорганізмів та нематод



Висновки

В результаті багаторічного використання антибіотиків ракові клітини розвинули мутаційну стійкість до них. Також природні штами актиноміцетів характеризуються відносно низькою антибіотичною продуктивністю. Тому ведеться пошук, як нових протиракових антибіотиків, так і нових штамів, які б володіли більш високим рівнем антибіотичної продуктивності.

Висока вартість цих препаратів зумовлена порівняно низькою антибіотичною активністю штамів-продуцентів та їх здатністю синтезувати складні суміші кінцевих продуктів, з яких лише один або два мають терапевтичну цінність.

Підвищений рівень біосинтезу антибіотиків може залежати, як від генів, що відповідають за синтез, так і від генів, що забезпечують стійкість до власного та інших антибіотиків. Особливий інтерес викликають мутації стійкості до антибіотиків, які впливають на процеси транскрипції, трансляції, транспорту метаболітів та морфогенез актиноміцетів (аміноглікозиди, рифампіцин, макроліди) [4, ст. 173]

В даний час культивування штамів-продуцентів відкриває все нові можливості для отримання широкого кола біологічно активних сполук, в тому чiслi i антибіотиків. У зв'язку з цим перспективні біотехнологічні процеси, в яких для зростання ефективностi використовують стійкі штами продуценти. Зростаюча роль застосування антибіотиків у медицині висуває важливе завдання пошуку зручних та економічних продуцентів [4, cт. 51].

Серед мікроорганізмів, що використовуються в промисловості, особливе місце займають ґрунтові бактерії роду Streptomyces, які є важливим джерелом багатьох вторинних метаболітів з широким діапазоном біологічної дії (вітаміни групи В, гетероауксини, гібереліни, імуномодулятори, антибіотики тощо) [Орлова Т.И. и др., 1999; Hobbs G. et al., 1992; Егоров Н.С., 1994]. Пошук нових біологічно активних речовин у стрептоміцетів залишається актуальним в сучасній біотехнології.

Список використаної літератури

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. - Москва, «Химия» - «Колос», 2004 г. - 296 с.

2. Варт А.В. Інфекції й імунодефіцити - пріоритети сьогодні // Практикуючий лікар. - 1997. - № 9. - С. 3-4.

3. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процесов. М.Высшая школа, 1990.

4. Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. - К.: Либідь, 2001. - 312 с.

5. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. - 6-е изд., 2004. - 528 c.

6. Костінов М.П. Нове в клініці, діагностиці і вакцинопрофилактиці керованих інфекцій. - М., 1997. - 110 с.

7. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. - М.: Медицина, 1978. - 394 с

8. Никитин Г.А. Биохимические основы микробиологических производств. Киев, Вища школа, 1992

9. Паренти Ф., Ланчини Д. Антибиотики. - Издательство: Мир, 1985. - 272 с.

10. Федоренко В. О., Осташ Б. О., Гончар М. В., Ребець Ю. В. Великий практикум з генетики, генетичної інженерії та аналітичної біотехнології мікроорганізмів. Львів: Видавн. центр ЛНУ імені Івана Франка, 2007. 277 с.

Размещено на Allbest.ru