Перспективная наука геномика

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Список используемых сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

и-РНК - информационная рибонуклеиновая кислота

т-РНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

р-РНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

мя-РНК - малая ядерная рибонуклеиновая кислота

ГЦ- палиндром - гуанин-цитозиновый палиндром

ТА-зона - тимин-адениновая зона

dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты

ddNTP - дидезоксирибонуклеотидтрифосфаты

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Введение

В конце ХХ века началось интенсивное развитие молекулярной биологии, что создало предпосылки для планомерного изучения структуры геномов разных видов живых существ, включая человека. Одной из наиболее значимых целей этих проектов является определение полной нуклеотидной последовательности геномных дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) различных видов организмов. Таким образом, родилась новая, перспективная, стремительно развивающаяся наука - геномика.

Что такое наука геномика и что она изучает

Геномика - наука, которая изучает геномы различных видов организмов и отдельные гены на молекулярном уровне, их структуру (структурная геномика) и функции (функциональная геномика), а также их использование в генной инженерии, биотехнологии и генной терапии.

В задачи геномики входит:

полное секвенирование геномов, сопоставление и оценка их генетической сложности как молекулярных систем;

выявление ранее неизвестных генов, сравнительный анализ функционального и структурного сходства различных генов и геномов;

выявление общих принципов организации сложных клеточных молекулярно-генетических систем управления.

По образному выражению новосибирского генетика В. А. Ратнера, геномика является одной из главных точек роста современной молекулярной генетики. Объектом исследования геномики является геном.

Геном - совокупность генов, локализованных в гаплоидном наборе хромосом данного организма. Геном человека состоит из 23 хромосом и содержит примерно 3*109 нуклеотидных пар

Понятие ген

Структурной и функциональной единицей генома является ген. Ген контролирует развитие определенного признака или свойства организма. Совокупность генов передается потомкам во время размножения. Понятие гена не ограничено только кодирующей белок или РНК последовательностью нуклеотидов, оно включает в себя:

промоторный участок (участок ДНК, содержащий от 30 до 60 пар нуклеотидов, который узнает фермент полимераза и начинает транскрипцию гена, ассиметричность промотора позволяет полимеразе начать транскрипцию в правильном направлении и указывает на то, какая из двух цепей ДНК будет служить матрицей для синтеза РНК);

регуляторный участок (последовательность нуклеотидов, не кодирующих гены, необходима для регуляции экспрессии гена. Располагается в разных местах гена: внутри последовательности промотора, в интронах, нетранскрибируемых участках);

терминаторный участок (состоит из трех участков: терминирующего кодона, гуанин-цитозинового палиндрома, тимин-адениновой-зоны. Терминирующие нуклеотидные триплеты ТАА, ТГА, ТАГ на информационной РНК (и-РНК) будут стоп-кодонами UAA, UGA, UAG, которые останавливают синтез белка, так как не кодируют ни одну аминокислоту. Палиндромы представляют собой инвертированные (повёрнутые на 180 градусов) последовательности, преимущественно из ГЦ- и ЦГ-пар, которые на ДНК способны образовывать крестовую, а на РНК - шпилечную структуру. Для палиндромов характерна комплементарность по горизонтали и вертикали. Именно ГЦ-палиндром в составе терминатора гена (оперона) приводит к замедлению продвижения по данному участку РНК-полимеразы, ведущей синтез и-РНК, т.е. тормозит транскрипцию. ТА-участок на ДНК составлен из повторяющихся остатков тимина и аденина, между тимином и аденином только две водородные связи, в отличие от ГЦ-пар, поэтому в ТА-зоне происходит легкое отсоединение и-РНК от ДНК-матрицы.

Структура генов прокариот и эукариот отличается друг от друа. В генах эукариот кроме кодирующей белки экзонной части есть интронная, некодирующая, функции которых практически не изучены. Транскриптон прокариот содержит несколько последовательно расположенных структурных генов заключенных между точкой инициации и точкой терминации, в то время как у эукариот в одном транскриптоне только один структурный ген между точкой инициации и транскрипции. Эти точки есть на обеих цепях ДНК. В клетках эукариот генетический материал имеется не только в ядерном аппарате, но и в органоидах, поэтому геном состоит из нескольких разных компонентов, в то время геном прокариот содержит около 1000 генов, локализованных в одной кольцевой хромосоме.

Классификация генов

Существует несколько классификаций генов. Большинство ученых придерживается двух приведенных ниже классификаций. Первая постулирует о наличии двух типов генов.

Гены «домашнего хозяйства» (house-keeping genes);

Гены «роскоши».

Гены «домашнего хозяйства постоянно находятся в активном состоянии. Их активность в малой степени зависти от состояния внешней среды (организма), т.е. практически не регулируется. Эти гены кодируют белки-ферменты, которые принимают участие в жизненно важных для клетки метаболических процессах. Например, таких как гликолиз, цепь передачи электронов, синтез ДНК, аминокислот и т.д. В сущности, эти гены полностью обеспечивают жизнедеятельность клетки.

Гены «роскоши» контролируют строго специализированные, специфические функции клетки. Эти гены контролируют белки, которые обеспечивают функционирование физиологических систем организма - его защитных свойств, процессов дыхания, выделения, кровоснабжения, пищеварения и т.д.). К таким генам относятся гены, контролирующие синтез гемоглобина, иммуноглобулина и др. В отличии от генов «домашнего хозяйства» «гены роскоши» находятся под жёстким контролем организма и имеют сложный аппарат регуляции.

Вторая классификация генов предусматривает наличие двух типов генов:

Структурные гены;

Регуляторные гены.

Оба типа генов транскрибируют различные типы РНК.

Структурные гены Все структурные гены транскрибируют несколько видов РНК - информационная РНК,транспортная РНК( тРНК),рибосомальная РНК (рРНК) и т.д. В зависимости от типа синтезируемых (или транскрибируемых) на них РНК они подразделяются на:

Гены, на которых синтезируется иРНК. Таких генов около 30 тысяч. Именно эти гены несут информацию о последовательности аминокислот в полипептиде. Многие из них уникальные. Однако есть гены имеющие копии. Как правило, число копий не превышает двух.

Гены, с которых транскрибируется тРНК. Эти гены не несут информацию о структуре белка. Их функция заключается в синтезе достаточного количества тРНК способных обеспечить транспорт аминокислот в рибосомы для синтеза белка. Число индивидуальных тРНК - около 50. Столько же и типов генов, кодирующих тРНК. Однако, общее число генов тРНК значительно больше. Это связано с тем, что каждый ген, кодирующий тРНК, представлен не в одном экземпляре, а повторяется множество число раз.

Гены, с которых транскрибируются рРНК. Эти гены, также как и предыдущие, не кодируют структуру полипептида, а синтезируют несколько разновидностей РНК (на генах эукариот синтезируется три разновидности РНК). Однако число генов, кодирующих рРНК, намного больше трёх. Как и в предыдущем случае, это связано с высокой повторяемостью каждого типа гена.

Все три типа гена объединяет одно - все они являются активными участниками синтеза белка.

В настоящее время в геноме человека насчитывается примерно 30 тысяч структурных генов. Длина всей ДНК в клетке человека примерно 1,5 метра, ДНК всех генов в ней занимает всего 3 - 10 %. Остальную часть ДНК составляет протеин-некодирующие гены или по-другому регуляторные гены. В одну группу эти гены объединяет то, что они регулируют активность структурных генов. Пока нет общепризнанной классификации этих генов, но можно выделить:

Гены, с которых транскрибируются регуляторные РНК. Они не принимают непосредственного участия в синтезе белка, а регулируют отдельные стороны этого процесса (транскрипцию, процессинг и т.д.). Так, например, относительно недавно открыт новый класс регуляторных РНК, которые назвали - малые ядерные РНК (мяРНК). Эти РНК имеют небольшой молекулярный вес, их несколько десятков, но и с каждым годом открываются новые. Удивительным оказалось то, что мяРНК обладают ферментативной активностью и принимают участие в разнообразных генетических процессах, например в процессе созревания РНК. Как ферменты они получили название - рибозимы.

Так выяснено, что РНК транскрибируемая с гена Н19 влияет на злокачественное перерождение клеток. А РНК синтезируемая на гене HFF участвует в метаболизме железа. В последнем случае интересно то, что РНК синтезируется одновременно на обеих нитях гена (на смысловой и антисмысловой). Рибозим, синтезированный на смысловой нити, регулирует синтез мРНК, которая транскрибируется с противоположной (антисмысловой) нити.

Гены, которые несут информацию о структуре регуляторного белка. На них транскрибируется иРНК. Этим они похожи на структурные гены. Однако, есть одно существенное отличие - на этих генах кодируется информация о регуляторномбелке, который принимает участие в регуляции активности различных генетических процессов (транскрипции, трансляции, репликации, репарации и т.д.) протекающих в клетке. Эти белки способны взаимодействовать с регуляторными областями ДНК (например с оператором) или связываться с РНК- или ДНК-полимеразой. Белки носят различные название, например факторы транскрипции, трансляции, терминации и др.

Участки гена, на которые садятся регуляторные белки. Например, к таким генам они относят промотор (на нём осаждается РНК-полимераза), оператор (на нём осаждаются регуляторные белки), терминатор (в некоторых случаях на нём осаждается белки прекращающие синтез иРНК) и т.д.Сразу же отметим, что последний тип генов не подходит под классификацию генов Сингера М. и Берга П. (1998). И вопрос, считать ли такие последовательности ДНК генами, остаётся открытым. Некоторые авторы относят такие последовательности к «регуляторным зонам». Мы так же будем придерживаться этого положения.

Наука геномика изучает геном в разных направлениях:

структурная геномика занимается секвенированием геномов, выделение и изучением генов

сравнительная геномика изучает сходства и различия в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования.

функциональная геномика необходима для изучение геномов с целью определения биологической функции всех генов и их продуктов, а также взаимодействий между генами.

Экологическая геномика изучает изменения генома в процессе приспособления организма факторам среды;

Метагеномика изучает геном микроорганизмов из природных выборок, биопленок и также исследует палеогеномные остатков вымерших животных.

Рассмотрим методы структурной геномики.

Сравнительная геномика и ее методы

Сравнительная геномика занимается созданием и сравнением различных типов геномных карт и крупномасштабным секвенированием ДНК. Проект по изучению человеческого генома (Human Genome Project) и менее известная Программа по изучению растительных геномов (Plant Genome Research Program) являются самыми масштабными исследованиями структурной геномики. Кроме картирования и секвенирования геномов, в задачи структурной геномики входят идентификация, локализация и составление характеристик генов. Это стало возможным благодаря открытию в 70-х годах прошлого столетия методов секвенирования. Первым методом секвенирования был метод Маскама и Гилберта (химический), основанный на химической деградации ДНК.

Метод Маскама и Гилберта (химический)

Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время используют флюоресцирующую метку, при этом каждый нуклеотид можно пометить разными цветами. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Разрушение идет в 2 этапа. На первом этапе происходит модификация азотистого основания и последующее выщепление его химическими реагентами, которые выщепляют определенный нуклеотид (обработка диметилсульфатом, гидрозином). Можно использовать и другие реакции химической модификации оснований и расщепления по ним молекул ДНК. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках, после этого с помощью блоттинга переводят содержимое электрофорезного геля на нитроцеллюлозу, закрепляют и затем проводят радиоавтографию. Те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание - его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку.

Метод Сэнгера

Второй метод, наиболее известный и популярный, разработанн Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I, фермент, который участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок - праймер, с которого начинается синтез Были также синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3- ОН отсутствует, которые затем включает в ДНК ДНК-полимераза. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост данной цепи останавливается в том месте, где в ДНК включился модифицированный dNTP. Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи исследуемой ДНК, прамеров, одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов, длина которых зависит от местоположения дефектного. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле, проводят радиоавтографию и устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК. В 1990-х годах метод был усовершенствован и автоматизирован. Вместо радиоактивной метки стали использовать флуоресцентные, что позволило использовать для каждого нуклеотида определенный цвет.

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины быстрая, и не слишком трудоемкая задача. Так как появились секвенаторы нового поколения. К таким относятся illumine, SOLiD и другие. Также есть информация о появлении секвенаторов третьего поколения, но они пока уступают по эффективности второму поколению.

В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. - геном арабидопсиса, в 2000 году - геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы. На современном этапе любой человек за «кругленькую»сумму может сделать свою генетическую карту за неделю.

Метод гибридизации

Гибридизация - метод выделения специфических последовательностей нуклеотидов. При нагревании водного раствора ДНК до 100оС и доведения рН до 13 происходит денатурация ДНК - диссоциация на 2 цепи, но если затем выдержать раствор ДНК при 65о происходит ренатурация (гибридизация) - восстановление структуры двойной спирали. При этом могут связаться нити любой комплиментарной последовательности: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК. Метод гибридизации основан на гибридизации определенного чистого одноцепочечного фрагмента ДНК, комплиментарной последовательности (ДНК-зонд), которую необходимо обнаружить (например с мутацией, кодирующей заболевание) с ДНК, выделенной из клеток, человека, предположительно, имеющего рецессивный признак заболевания. В случае, если гибридизация проходит успешно, значит тест положительный.

В медицине используют ДНК-зонды иммобилизированные на чипах с флуоресцентными метками. Эти ДНК-зонды расположены в определенном порядке. При спаривании последовательности ДНК образца и комплиментарной последовательности ДНК зонда появляется флуоресцентная окраска. Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод заключается в том, что к анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3-концов фрагмента ДНК. При нагревании разделяются цепи ДНК, а затем при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплиментарными участками нитей ДНК и начинается синтез остальной последовательности нити ДНК ферментом Taq-полимеразой, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Он термостабилен, выдерживает перепады температуры от 70°С до 100°С, оптиум работы фермента - 70°С. Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n -- число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Полученные фрагменты разделяют гель-электрофорезом, интересующий фрагмент выявляют с помощью специфичного генного зонда. Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин. Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала. Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования.

геномика молекулярный клонирование мюллис

Заключение

Благодаря тому, что генетический код универсален и все живые организмы способны расшифровывать генетическую информацию других организмов и осуществлять заложенные в ней биологические функции, любой ген, идентифицированный в ходе того или иного геномного проекта, может быть использован в широком спектре практических приложений.

Знание полной или частичной последовательности нуклеотидов определенных генов служит для исследователей источником очень полезной информации, даже если тонкости функционирования генов остаются неизученными. Например, информация об отдельных генах и кодируемых ими белках может:

- помочь селекционерам не наугад, а целенаправленно изменять свойства растений и убеждаться в наличии желаемых признаков, не дожидаясь появления плодов (последнее особенно важно для селекции деревьев);

- использоваться для выделения специфических рекомбинантных молекул или микроорганизмов, уникальных с биохимической точки зрения;

- применяться для идентификации генов, участвующих в осуществлении сложных процессов, контролируемых множеством генов, а также зависящих от влияния окружающей среды;

- применяться для обнаружения микробных заражений клеточных культур.

Список источников

Абрамова З.И. Введение в генетическую инженерию: Учебное пособие для самостоятельной внеаудиторной работы студентов по курсу «Генная инженерия» /З.И.Абрамова. - Казань: Казанский университет, 2008.- 169 с.

Чугунов А., Полет бабочки или немного о пользе структурной геномики /Наука и жизнь // Т. 1, 2010

Размещено на Allbest.ru