Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» (ФГБОУ ВПО «КубГУ») Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА

Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами

Работу выполнила А.Е. Клименко

Факультет биологический

Направление 06.03.01 Биология

Краснодар 2015

РЕФЕРАТ

Работа выполнена на 53 листах машинописного текста. Содержит 4 таблицы и 18 рисунков, включает 40 источников литературы.Ключевые слова: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, МИЦЕЛИЙ, МАЛДИ, ВСЕРОССИЙСКАЯ КОЛЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПЦР, ШТАММ, ГЕН 16S рРНК, Секвенирование ДНК

Цель работы: выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов, полученных из различных мест обитания, и их классификация в соответствии с современной филогенетической систематикой.

Объектом исследования служили 57 штаммов бактерий, их них 31 штамм микроорганизмов, отобранных при бурении скважины 3/09 в районе реки Средняя Чукочья Колымской низменности из образцов вечномерзлых отложений (возраст 1,8-2 млн. лет), 14 штаммов, выделенных в разные годы из почв Волгоградской, Курской, Московской, Оренбургской, Ростовской, Рязанской, Саратовской областей, Калмыкии, Мордовии, Краснодарского края, а также 12 штаммов кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета (г. Краснодара), выделенные из нефтезагрязненных грунтов.

Были выделены чистые культуры микроорганизмов, определены морфологические и культуральные признаки. Проведена идентификация методами МАЛДИ-МС и ПЦР с последующим секвенированием нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК.

На основании полученных результатов можно сказать, что данные штаммы относятся к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli.

СОДЕРЖАНИЕ

• Введение
• 1. Аналитический обзор
• 1.1 Всероссийская коллекция микроорганизмов
• 1.2 Характеристика микроорганизмов, выделенных из многолетнемерзлых отложений
• 1.3 Современное состояние систематики микроорганизмов
• 1.4 Генетические признаки бактерий
• 2. Материал и методы исследований
• 2.1 Объект исследования
• 2.2 Выделение чистых культур микроорганизмов
• 2.3 Морфологические и культуральные признаки
• 2.4 Среды и реактивы
• 2.5 МАЛДИ масс-спектрометрия
• 2.6 Выделение и очистка ДНК
• 2.7 Амплификация фрагментов генов 16S рРНК
• 2.8 Определение нуклеотидного состава ДНК
• 2.9 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК
• 3. Идентификация коллекционных культур бактерий современными масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами
• Заключение
• Список используемых источников
• Приложение 1
• Приложение 2

ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы играют огромную роль в природных процессах и в течение многих лет являются «полигоном», где современная наука исследует фундаментальные основы живой материи. Интерес к изучению и практическому использованию микроорганизмов, мир которых чрезвычайно многообразен и динамичен, непрерывно возрастает, особенно в последние десятилетия. На развитие данного направления оказывает существенное влияние наличие коллекционных штаммов микроорганизмов, постоянно поддерживаемых и изучаемых. Поэтому не случайно проблема долгосрочного хранения микроорганизмов без утраты их свойств признана первостепенной во всех странах мира.

Характеристика микробных сообществ разных мест обитания актуальна в связи с изучением биоразнообразия экосистем. В последние годы несомненный интерес вызывает изучение микрофлоры в многолетнемерзлых осадочных породах разного возраста и генезиса. Мёрзлые подпочвенные отложения и погребённые подкурганные почвы, которые рассматриваются как закрытые, а ранее активно функционирующие системы, являются природными резервуарами длительно (тыс. - млн. лет) законсервированных сообществ микроорганизмов, хранилищами древних генов и биомолекул [ Psychrophiles: from..., 2008; Margesin, Miteva, 2011]. Вечномёрзлые отложения широко распространены на Земле и могут рассматриваться как одна из её оболочек - криосфера.Коринеформные актинобактерии являются доминирующим компонентом культивируемой микрофлоры ряда исследованных образцов вечной мерзлоты и отмечалась тенденция к увеличению доли таких бактерий с увеличением возраста образца [Длительность сохранения…,1990].

Цель работы: выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов, полученных из различных мест обитания, и их классификация в соответствии с современной филогенетической систематикой. микроорганизм генетический нуклеотидный ген

Исходя из поставленной цели данной работы, нами были обозначены следующие задачи:

· Определение морфологических и культуральных признаков исследуемых штаммов;

· Идентификация методам МАЛДИ масс - спектрометрии;

· Анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1 Всероссийская коллекция микроорганизмов

Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ) функционирует как центр сбора, изучения, поддержания и предоставления широкого спектра непатогенных микроорганизмов и информации о них для научных, образовательных, производственных и других учреждений. Фонд ВКМ является самым крупным в РФ по численности и таксономическому разнообразию поддерживаемых микроорганизмов и широко востребован специалистами различного профиля в связи с фундаментальными и прикладными исследованиями. Фонд содержит около 20000 тыс. штаммов разнообразию (более 3300 видов 750 родов) поддерживаемых культур на 2008 год микроорганизмов, представителей всех основных надцарств (бактерии, археи, грибы), выделенных из различных природных источников широкой географии. Фонд включает типовые (эталонные) штаммы видов, культуры пока не описанных новых таксонов, организмы с уникальными свойствами и биотехнологическим потенциалом.

Для гарантированного сохранения фонда используются азотные криохранилища и другое специализированное оборудование, обеспечивающее реализацию более 25 различных режимов консервации, известные и разработанные специалистами ВКМ оригинальные методы консервации, а также многолетний опыт специалистов разных поколений по их использованию [www.vkm.ru].

ВКМ сегодня располагает полным комплексом современных методов и оборудования, необходимых для точной идентификации микроорганизмов ( в том числе, на уровне вида), обнаружения и описания новых таксонов различных групп микроорганизмов (бактерии, археи, мицелиальные и дрожжевые грибы) в соответствии с международными стандартами. В числе новых методов ВКМ (2012) - метод МАЛДИ масс-спектрометрии.

Впервые метод описан во второй половине 80-х годов XX века [Karas, Bachmann, Hillenkamp, 1985]. Метод заключается в облучении короткими лазерными импульсами образца, представляющего собой твердый раствор анализируемого соединения в органической матрице. Матрица выбирается таким образом, чтобы ее молекулы активно поглощали фотоны, эмитируемые УФ- или ИК-лазером. Над поверхностью образца создается плотная высокотемпературная плазма, в которой наряду с молекулами и ионами матрицы оказываются и молекулы анализируемого соединения. Ионизация последних путем поглощения энергии фотонов или в результате ионно-молекулярных реакций приводит к образованию положительных и отрицательных ионов, которые вытягиваются высоким потенциалом из области ионизации и направляются в анализатор. Метод характеризуется интенсивными пиками молекулярных ионов разного типа и низкой фрагментацией. Наиболее термолабильные, труднолетучие, высокомолекулярные соединения стали доступны масс-спектрометрическому анализу. В современной науке МАЛДИ МС - основной аналитический метод в биохимии и химии полимеров [Лебедев, 2003].

Рисунок 1 - Взаимодействие лазерного импульса с образцом [Василюк, 2009]

Его достоинствами являются чувствительность (несколько фемтомолей (1 М^-15)вещества)), простота пробоподготовки и экспрессность (анализ занимает несколько минут) [Fenselau, Demirev, 2001]. Несмотря на ряд факторов, оказывающих влияние на результаты анализа клеток бактерий с использованием МАЛДИ МС (например, условия культивирования), при оптимизации условий эксперимента, получаемые спектры отражают сходство (и родство) бактерий, в особенности на уровне «вид-штамм». Было показано, что наилучших результатов можно добиться, исследуя микроорганизмы в стационарной фазе роста [Monitoring the growth…, 1999].

1.2 Характеристика микроорганизмов, выделенных из многолетнемерзлых отложений

Криолитозона представляет собой лучший природный палеобанк биологических, геологических, экологических, климатических и других данных [Gilichinsky, Rivkina, Samarkin , 1993].Имеются сведения об обнаружении в многолетнемерзлых субстратах разного состава и возраста организмов класса Actinobacteria. Представители этого класса выделяются среди других прокариот высоким содержанием ГЦ-пар в ДНК (более 50%), сложной организацией и размерами генома (до 12 млн. п.о.) разнообразием морфологии клеток и жизненных циклов, химического состава клеточной оболочки [Goodfellow, O`Donnell, 1994; Gao & Gupta, 2012]. Актиномицеты превосходят другие группы организмов по способности синтезировать биологические активные соединения [Anderton & Wilkinson, 1980].Активно изучаются поверхностные слои биосферы на предмет обитания в них микроорганизмов [Bacterial recovery …,2003]. В криогенных образованиях (льды, вечномерзлые грунты и погребенных в них почвы) разного возраста (до 3 млн. лет) обнаружены в жизнеспособном состоянии различные микроорганизмы от неспороносных и спорообразующих бактерий до актиномицетов, микроводорослей, дрожжей и мицелиальных грибов [Длительность сохранения …, 1985; Количественная оценка …, 1990 ].

Микробиота глубоких слоёв биосферы и, особенно, вечной мерзлоты интересна также в качестве “банка древних генов”. Предполагается, что вечная мерзлота, особенно наиболее раннего геологического времени, представляет собой резервуар наиболее древних на земле «законсервированных» природных сообществ микроорганизмов.

1.3 Современное состояние систематики микроорганизмов

Систематика микроорганизмов - наука, изучающая разнообразие видов микроорганизмов и взаимоотношения между ними [Goodfellow, O`Donell, 1993]. Основной таксономической единицей бактериальной классификации является вид [Report of the …, 2002]. Вид - основная таксономическая категория в классификации любой группы организмов. Так как биологическая концепция вида неприменима к прокариотам, бактериальный вид обычно рассматривается как прагматическая категория, которая описывает генотипически обособленные группы индивидуальных изолятов/штаммов, характеризующихся высокой степенью сходства по многим независимым свойствам, определённым при стандартизированных условиях [Rassello-Mora & Amann, 2001; Report of the…, 2001].К одному виду обычно относят организмы, уровень ДНК сходства между которыми приблизительно 70% или выше [Report of the…, 2002]. Для прокариот и архей общепринятой является филогенетическая концепция вида. Из неё следует, что различные геновиды (т.е. группы штаммов, различаемые только на геномном уровне) не должны называться новыми видами до тех пор, пока не будут найдены фенотипические особенности, дифференцирующие их от описанных видов.

В настоящее время нет удовлетворительного филогенетического определения рода. Границы и критерии выделения родов могут отличаться для разных групп организмов [Murray, 1990; Rassello-Mora, Amann, 2001]. В случае, если уровень филогенетического сходства около 97% и выше, то организмы могут быть отнесены как к одному, так и к разным родам [Lechevalier, 1989].В последнее время классификация бактерий во всё большей степени основывается на данных геносистематики [Stackebrandt, Rainey, Ward-Rainey, 1997], способствующих переходу таксономических исследований на более высокий уровень. Современная систематика бактерий является полифазной, т.е. базируется на интегрированном использовании различной информации о микроорганизмах, полученной с помощью молекулярно-биологических, химических и нумерических методов [Евтушенко, 1996].

1.4 Генетические признаки бактерий

В настоящее время в систематике бактерий осуществляется пересмотр сложившихся представлений, который благодаря своему бурному характеру и значению происходящих перемен, справедливо называется революцией, её результатом является переход таксономических исследований на новый более высокий уровень [Goodfellow, Mordaski, Cross, 1989].

Нуклеотидный состав ДНК-первая характеристика генома, которая стала использоваться в систематике прокариот. Определение процентного содержания гуанина и цитозина в ДНК (моль % ГЦ) является частью обязательного стандартного описания бактериальных таксонов, в том числе и актиномицетов [Goodfellow, O`Donnell, 1994].

ДНК-ДНК гибридизация, этот метод всё ещё остается основным при определении видовой принадлежности штаммов прокариот. Данные, накопленные в течение нескольких десятилетий, показали высокую корреляцию между результатами ДНК-ДНК гибридизации и фенотипическими характеристиками [Stackebradt, Goebel, 1994]. Уровень ДНК - ДНК гибридизации свидетельствуют о степени, в которой одноцепочечные молекулы ДНК различного происхождения могут реассоциироваться в двойную цепь [Rossello-Mora, Amann, 2001].

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК продемонстрировал высокую степень разрешения этого метода при рассмотрении родства между организмами на надвидовом уровне. В первую очередь это связано с высокой консервативностью молекулы 16S рРНК. Данные по нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК практически всех представителей родов и большинства видов имеются в соответствующих базах данных - Рибосомальной Базе Данных (RDB II) и Национального Центра Биологической Информации (NCBI) [Stackebrandt, Goebel, 1994].

Методы ДНК-типирования широко используются в различных областях микробиологии. Вместе с фенотипическими подходами, они направлены на выявление разнообразия среди близкородственных организмов в основном на уровне вид-подвид-штамм [Amplified-fragment length…, 1999].

Все методы генотипирования можно объединить в несколько групп. Первая включает методы и подходы, основанные на анализе фрагментов рестрикции целого генома - LFRFA (Low Frequency Restriction Fragment Analysis - анализ низкочастотных рестрикционных фрагментов) [Interpreting…,1995; Polyphasic taxonomy…, 1996].

Вторая группа методов генотипирования связана с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и включает:

Методы, основанные на амплификации ДНК с произвольными праймерами - это RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) [DNA polymorphisms…, 1990; Amplified polymorphic…, 2002].

Методы REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic sequence - повторяющиеся экстрагенные палиндромные последовательности) основаны на использовании праймеров, комплементарных консервативным повторяющимся последовательностям в ДНК. Эти последовательности рассеяны по геному бактерий [Olive, Bean, 1999; Box-PCR fingerprinting…, 2004].

Третья группа методов объединяет как ПЦР, так и рестрикционный анализ ДНК. Эти методы можно использовать для анализа рестрикционных фрагментов определенных генов - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorhpism - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК), генов 16S рРНК - ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis - рестрикционный анализ амплифицированных рибосомальных ДНК) [Vaneechoutte, 1996] или целого генома - AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - полиформизм длины амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК) [AFLP: a new…, 1995].

Проведенные сравнительные исследования показали, что описанные методы генотипирования дают полезную информацию о штаммовых вариациях внутри видов [Ecology…, 2000].

Таким образом, современная систематика прокариот, располагается богатым и мощным арсеналом методов, используемых при решении широкого круга классификационных и идентификационных задач. Проблема заключается в выборе методов в зависимости от конкретных задач исследования, согласовании полученных данных и взвешенности таксономических предложений, сделанных на основе полученных результатов.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК продемонстрировал высокую степень разрешения этого метода при рассмотрении родства между организмами на надвидовом уровне. В первую очередь это связано с высокой консервативностью молекулы 16S рРНК. Данные по нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК практически всех представителей родов и большинства видов имеются в соответствующих базах данных - Рибосомальной Базе Данных (RDB II) и Национального Центра Биологической Информации (NCBI).

Методы генотипирования находят все более широкое применение в различных областях биологии, медицины, сельского хозяйства и биотехнологии вследствие и высокой разрешающей способности, простоты анализа, быстроты получения конечного результата, возможности автоматизации процесса, создания банков данных и др.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа проводилась на базе Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К. Скрябина РАН.

2.1 Объект исследования

Объектом исследования служил 31 штамм (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92, 3.93, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.134, 3.135) микроорганизмов, отобранных при бурении скважины 3/09 в районе реки Средняя Чукочья Колымской низменности из образцов вечномерзлых отложений (возраст 1,8-2 млн. лет), 14 штаммов (38137, 38140, 38152, 38154, 38157, 38166, 38191, 38273, 38678, 38604, 38678, 38447, 38724, 41138), выделенных в разные годы из почв Волгоградской, Курской, Московской, Оренбургской, Ростовской, Рязанской, Саратовской областей, Калмыкии, Мордовии, Краснодарского края, а также 12 (№1, №3, №7, №6, 8(Р9), К5, К8, №4, Р20, PD4, №5, №2) штаммов кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета (г. Краснодара), выделенные из нефтезагрязненных грунтов.

Выбранные штаммы были взяты из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии, с целью перепроверки их таксономической принадлежности. Все изученные штаммы поддерживаются в ВКМ, включены в каталог ВКМ [www.vkm.ru], где представлена также их номенклатурная история.

2.2 Выделение чистых культур микроорганизмов

Штаммы, используемые в работе, находились в лиафилизированном состоянии. Лиофилизация ? процесс высушивания под вакуумом из замороженного состояния. Для выделения чистой культуры использовали плотную среду R2A, после чего осуществлялся смыв культур из ампул стерильной водой. Для посева на плотную питательную среду в чашках Петри небольшое количество материала набирали стерильной петлей и втирали в поверхность среды возле края чашки, далее использовался метод штриховых посевов. Инкубация проводилась при температуре 28С.

2.3 Морфологические и культуральные признаки

Морфологические и культуральные признаки изучаемых штаммов определяли, выращивая культуры на плотной среде (R2A агар) при температуре 28С. Форма клеток, размер и образование мицелия учитывались приготовлением препарата « раздавленная капля », выращенных на среде R2A в чашках Петри, при использовании светового микроскопа.

2.4 Среды и реактивы

Состав среды R2A (HiMedia) : пептон 0,5 г, казаминовые кислоты - 0,5 г, дрожжевой экстракт - 0,5г, растворимый крахмал - 0,5 г, пируват натрия - 0,3 г, K2HPO4 - 0,3 г, декстроза - 0,5 г, MgSO4 - 0,05 г, агар - 15 г, вода дист. -1 л, pH 7,2. Культуральные признаки изучали после инкубирования в течение 3-7 дней.

Cреда ВКМ №55: пептон - 2 г, дрожжевой экстракт - 1 г, MgSO₄Ч7H₂O - 0.2 г на 1 л дистиллированной воды. рH раствора доводили до 6.2-7.0 5М NaOH перед внесением агара (Difco) до конечной концентрации 1.5% [www.vkm.ru].

2.5 МАЛДИ масс-спектрометрия

Для анализа масс-спектральных белковых профилей культуры выращивали на среде R2A (28С,48 ч). Клетки (~ одну колонию) переносили с помощью тонкого стерильного шпателя на стальную пластинку-мишень, сверху наносили 0,7 мкл раствора матрицы (б-циано-4-гидроксикоричная кислота [HCCA] в 50%-ном водном растворе ацетонитрила, содержавшем 2.5% трифторуксусной кислоты) и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов на приборе “Autoflex Speed” (“Bruker Daltonics”). Время задержки - 350 нс, ускоряющее напряжение - 20 кВ.

Запись спектров проводили в режиме положительных ионов; диапазон регистрируемых масс составлял 2-20 кДа. Внешнюю калибровку прибора проводили по смеси белков “Bruker Bacterial Test Standard” (“Bruker Daltonics”); разрешение спектров составило ±2 Да (200 ppm). Результирующие спектры каждого препарата штаммов получали суммированием спектров, зарегистрированных в 10-15 точках анализируемых препаратов при 500 ударах лазера.

Обработку масс-спектров производили с помощью программных пакетов “Flex analysis 3.3” и “Biotyper 3.0” (“Bruker Daltonics”). Использовались параметры оценки значения.

Таблица 1 - Оценка значения

Диапазон	Описание	Цвет
2,300 …3,000	Идентификация до вида	Зеленый
2,000 …2,299	Безопасная идентификация до рода, вероятная до вида	Зеленый
1,700 …1,999	Вероятная идентификация до рода	Желтый
0,000 …1,699	Не надежная идентификация	Красный

2.6 Выделение и очистка ДНК

Выделение и очистку ДНК проводили методом по (Current protocols in, 1994). Для проведении ПЦР культуры выращивали в пробирках на среде ВКМ №55 при температуре 28 єС в течение 48 ч. В пробирку с чистой культурой вносили 1 мл буфера ТЕ[Трис-HCl - 10мМ, ЭДТА - 1мМ, pH 8.0, H₂O], не вынимая пипетку перемешивали. Полученную суспензию клеток микроорганизмов помещали в пробирку типа «Eppendorf» на 1.5 мл, далее добавляли лизоцими оставляли на час при температуре 37 єС в твердотельном термостате «Гном» («ДНК-Технология»). Затем ресуспендировали 200 мкл в микроцентрифужную пробирку. Объем доводили до 280 мкл буфером ТЕ. Добавляли 7 мкл 20%-ого SDS (sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия), выдерживали 1.5 ч при температуре 37 єС. Затем вносили 1.5 мкл фермента РНКазы А (10 мг/мл), выдерживали 1.5 ч при 37 єС, и 6 мкл фермента ПроК (протеиназа К) (10 мг/мл), выдерживали 1 ч при 37 єС. Добавляли 22 мкл 20%-ого SDS, оставляли на 15 мин при 55 єС. Добавляли 44 мкл 5М NaCl до конечной концентрации 0.7М и 36 мкл СТАВ, выдерживали 30 мин при 65 єС. Экстракцию проводили 400 мкл смеси фенол/хлороформа (1:1), перемешивали 5-10 мин до получения однородной эмульсии и центрифугировали при 14500 об/мин в течение 10 мин, затем отбирали верхнюю водную фазу в отдельную микроцентрифужную пробирку. Проводили экстракцию равным объмом хлороформа, также перемешивали в течение 5-10 минут и центрифугировали при 14500 об/мин 10 мин, отбирали верхнюю водную фазу. Осаждали ДНК 0.6V изопропилового спирта, промывали 70%-ым этанолом два раза (по 700 мкл) в течние 2 ч и один раз 150 мкл 96%-ого этанола в течение 5-10 мин.

2.7 Амплификация фрагментов генов 16S рРНК

ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе «Gene Amp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США) с использованием бактериальных праймеров: прямого 27F и обратного 1492R. Реакционная смесь из расчета на 25 мкл содержала: 2,5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера для Taq ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва); 2.5 мкл дНТФ; 1.5 мкл MgCl₂ ( 25 мМ); 0.5 мкл праймера 27F (10 pM); 0.5 мкл праймера 1492R (10 pM); 1 мкл Taq ДНК-полимеразы LC («Fermentas», Литва); 1 мкл геномной ДНК; 15.5 мкл деионизированной H₂O. ПЦР проводили в следующем режиме: предварительная денатурация при 95єС 5 минут; 30 циклов: денатурация при 94єС 30 сек; отжиг при 55єС 30 сек; синтез при 72єС 1 мин 20 сек; конечная элонгация при 72єС 4 минуты. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 1%-м агарозном геле с добавлением флюоресцирующего красителя - бромистого этидия - в электрофорезной камере «Bio - Rad» в однократном ТВЕ буфере [ Трис-HCI-89 мМ, борная кислота - 89 мМ, ЭДТА - 2 мМ, pH 8.3, H₂O] в течение 20 мин. Разделение фрагментов ДНК контролировали с помощью УФ-трансиллюминатора.

2.8 Определение нуклеотидного состава ДНК

Нуклеотидный состав ДНК определяли методом тепловой денатурации (Marmur, Doty, 1962) с использованием спектрофотометра «Beckman DU800» («Beckman Coulter»), снабженным термостатирующим устройством. В качестве буферного раствора применяли 0.1Ч SSC. Концентрацию ДНК доводили до ~25 мкг/мл (ОD₂₆₀ 0.2-0.5). Откачивали воздух 15 мин вакуумным насосом. Измеряли температуру плавления при длине волны 260 нм в 1-см кварцевых кюветах с герметичными крышками и термопарой (фиксирующей температуру). Устанавливали температуру 25⁰С и регистрировали поглощение в опытной кювете против контрольной с растворителем. Температуру медленно повышали (0.5^0С/мин) и проводили постоянную регистрацию изменения поглощения. Значение температуры, дающее 50%-ное увеличение поглощения, соответствовало значению температуры плавления (Т_m) для данной ДНК. Нуклеотидный состав ДНК рассчитывали по формуле (Frank-Kamenetskii, 1971; Owen et al., 1969; Schildkraut, Lifson, 1965): ГЦ, мол% = 2.08Т_m - 106.4.

2.9 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК

Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК использовали универсальные эубактериальные праймеры: прямой 27F и обратный 1525R. Очистку ПЦР-продукта проводили с применением GeneJET^TM Gel Extraction Kit #K0691, #K0692 («Fermentas», Литва). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе «CEQ2000 XL» («Beckman Coulter», США) в соответствии с предлагаемой фирмой инструкцией.

3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ СОВРЕМЕННЫМИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМИ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

В работе было использовано 45 (204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.15, 3.16, 3.17, 3.25, 3.26, 3.28, 3.58, 3.59, 3.70, 3.74, 3.73, 3.76, 3.92, 3.93, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.134, 3.135, 38137, 38140, 38152, 38154, 38157, 38166, 38191, 38273, 38678, 38604, 38678, 38447, 38724, 41138) штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и 12 (№1, №3, №7, №6, 8(Р9), К5, К8, №4, Р20, PD4, №5, №2) штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии. Были изучены культуральные и морфологические признаки, получены МАЛДИ масс-спектры и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов 16S рРНК.

У всех 57 штаммов изучены морфологические и культуральные признаки (таблица 2).

Таблица 2 - Морфологическая и культуральная характеристика штаммов

Номера Штаммов	Источник выделения	Культуральные Особенности	Морфология
204,205,210,222, 223	Почва, Колымская низменность	белёсые, гладкие, вязкие, Г +	Палочки неправильной формы, V-формы
250,207	Почва, Колымская низменность	бесцветные, гладкие, Г +	Кокки, располагающиеся парами, палочки неправильной формы
224	Почва, Колымская низменность	белёсые, гладкие, Г +	Палочки с булавовидными концами
251	Почва, Колымская низменность	блестящие, гладкие, Г +	Кокки, образующие скопления неправильной формы
8(Р9)	Краснодарский край	бесцветные, Г +	Длинные прямые и короткие палочки, подвижные, споры
Р20	Краснодарский край	белесые, Г ?	Длинные палочки
PD4	Краснодарский край	бесцветные, Г ?	Прямые палочки
K8	Краснодарский край	красные, гладкая поверхность, Г +	Палочки неправильной формы
K5	Краснодарский край	розовато-оранжевые, Г ?	Очень короткие палочки
3.15	Колымская низменность	бесцветнее, Г +	Палочки, подвижные
3.16	Колымская низменность	белесые, Г +	Палочки неправильной формы
3.17	Колымская низменность	прозрачные, Г +	Палочки, обнаружены споры
3.25, 3.26	Колымская низменность	светло-желтые, Г +	Короткие палочки с закругленными концами
3.28	Колымская низменность	белесые, Г ?	Короткие палочки и кокки
3.59, 3.70, 3.74	Колымская низменность	желтые, Г ?	Палочки
3.73	Колымская низменность	бежевые, Г ?	Короткие палочки
3.76	Колымская низменность	желтые, Г +	Кокки, гроздевидное расположение
№1	Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт	белёсые, шероховатые, Г +	Короткие палочки
№3	Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт	розовые, маслянистые, Г +	Присутствуют палочки и кокки
№7	Краснодарский край Нефтезагрязненный грунт	белёсые, гладкие, вязкие, Г +	Присутствуют кокки
№2, №4	Краснодарский край	белёсые, Г ?	Короткие палочки, подвижные
№5	Краснодарский край	безцветные, Г ?	Короткие палочки
№6	Краснодарский край	розовые, пористая поверхность, Г ?	Короткие ровные палочки
38137	Почва, луг, Саратовская обл.	белесые, блестящие, при пересеве - шероховатые, воздушный мицелий, Г +	Фрагменты мицелия, отдельные палочки.
38140	Почва, луг, Саратовская обл.	белесые, гладкие блестящие,воздушный мицелий, Г +	Слабо фрагментированный мицелий.
38152, 38157	Чернозем, Ростовская обл.	белесые, матовые, шероховатые,воздушный мицелий, Г +	Фрагменты мицелия, мало отдельных клеток.
38154	Чернозем, Ростовская обл.	белесые, блестящие, Г +	Фрагменты мицелия, V-формы.
38166	Почва, Волгоградская обл.	белесые, гладкие, блестящие, воздушный мицелий, Г +	Фрагменты мицелия, мало отдельных клеток.
38191	Почва, Серпухов, Московская обл.	белесые, гладкие, воздушный мицелий, Г +	Хорошо развитый мицелий.
38678	Почва, Южный Урал	белесые, блестящие, воздушный мицелий, Г +	Лизированный мицелий, фрагменты мицелия.
38604, 38273, 38447	Почва, берег р. Кубань, Краснодарский край	белесые, шероховаты, матовые, воздушный мицелий, Г +	Фрагменты мицелия.
38724	Почва, Южный Урал	белесые, гладкие, блестящие, воздушный мицелий, Г +	Слабо фрагментируемый мицелий, отдельных клеток мало.
41138	Почва, лесополоса, ст. Старо-Минская, Краснодарский край, 2002	белесые, шероховатые, воздушный мицелий, Г +	Фрагменты мицелия, тонкий мицелий, мало отдельных клеток.
3.92	Колымская низменность	белёсые, Г ?	Короткие палочки, подвижные
3.93	Колымская низменность	белесые, гладкие, вязкие, Г +	Палочки неправильной формы, V-формы
3.127	Колымская низменность	бесцветные, Г +	Длинные прямые и короткие палочки, подвижные
3.128	Колымская низменность	белесые, Г ?	Палочки, подвижные
3.129	Колымская низменность	кремовые,гладкие, Г ?	Палочки
3.130	Колымская низменность	кремовые,гладкие, Г ?	Палочки с суженным центром
3.131	Колымская низменность	белесые, гладкие, Г ?	Палочки
3.132	Колымская низменность	безцветные, Г ?	Короткие палочки
3.134	Колымская низменность	белесые, Г ?	Палочки
3.135	Колымская низменность	светло-желтые, Г +	Короткие палочки с закругленными концами

Для идентификации штаммов методом МАЛДИ (таблица 3) было взято 45 штаммов из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН и 12 штаммов из музея коллекционных культур кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии.

Таблица 3 - Результаты идентификации методом МАЛДИ масс-спектрометрии с использованием программы Biotyper 3.0 (Bruker).*

Номер анализируемого образца	Ближайший штамм из базы данных Bruker	Оценка значения	Описание
№7	Rhodococcus erythropolis	1.887	Вероятная идентификация до рода
№3	Rhodococcus erythropolis	1.836	Вероятная идентификация до рода
№1	Rhodococcus erythropolis	1.96	Вероятная идентификация до рода
№6	Ненадежная идентификация**	1.634	Ненадежная идентификация
№5	Acinetobacter schindleri	2.144	Безопасная идентификация до вида
K5	Gordonia rubripertincta	1.878	Вероятная идентификация до рода
К8	Dietzia maris	1.988	Вероятная идентификация до рода
№4	Pseudomonas mendocina	1.71	Вероятная идентификация до рода
№2	Pseudomonas kilonensis	1.758	Вероятная идентификация до рода
Р20	Pseudomonas stutzeri	1.849	Вероятная идентификация до рода
PD4	Pseudomonas sp.	1.707	Вероятная идентификация до рода
3.28	Roseomonas mucora	1.985	Вероятная идентификация до рода
3.59	Methylobacterium rhodesianum	1.874	Вероятная идентификация до рода
3.70	Methylobacterium extorquens	2.362	Идентификация до вида
3.73	Pseudomonas beteli	1.79	Вероятная идентификация до рода
3.74	Methylobacterium extorquens	2.002	Безопасная идентификация до вида
3.76	Staphylococcus epidermidis	2.111	Безопасная идентификация до вида
3.92	Pseudomonas stutzeri	2.359	Идентификация до вида
3.127	Bacillus firmus	2.161	Безопасная идентификация до вида
3.128	Providencia rettgeri	2.18	Безопасная идентификация до вида
3.130	Brevundimonas vesicularis	2.317	Идентификация до вида
3.131	Ненадежная идентификация	1.427	Ненадежная идентификация
3.132	Acinetobacter Iwoffii	1.837	Вероятная идентификация до рода

* В таблице представлены выборочные данные

** Штаммы с ненадежной идентификацией в таблицу не включены

Метод МАЛДИ масс - спектрометрии ориентирован на идентификацию патогенных и условно - патогенных микроорганизмов, поэтому почвенные бактерии и близкие им виды в базе данных МАЛДИ находятся в меньшем количестве. Именно поэтому многие штаммы не были идентифициованы этим методом.

На основании спектров (приложение А), полученных методом МАЛДИ масс-спектрометрии, из всех исследуемых штаммов удалось идентифицировать до вида 10 штаммов и до рода 23 штамма. Данные штаммы отнесены в соответствии с современной филогенетической систематикой [Bergey Manuales, 2007] к следующим таксонам:

3.70, 3.74 - Methylobacterium extorquens, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria;

3.92 - Pseudomonas stutzeri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria;

№5 - Acinetobacter schindleri, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.15 - Bacillus Licheniformis, порядок Bacillales, класс Bacilli;

3.17 - Paenibacillus glucanolyticus, порядок Bacillales, класс Bacilli;

3.76 - Staphylococcus epidermidis, Bacillales, класс Bacilli;

3.127 - Bacillus firmus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.128 - Providencia rettgeri, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

№1,№3, №7 - род Rhodococcus, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; К5 - род Gordonia, порядок Actinomycetales, род Gordonia, класс Actinobacteria;

К8 - род Dietzia, подпорядок Corynebacterineae, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria;

№2, №4, P20, РD4, 3.73, 3.92 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria ;

3.28 - род Roseomonas, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria;

3.59, 3.70, 3.74 - род Methylobacterium, порядок Rhizobiales, класс Alphaproteobacteria;

3.132, №5 - род Acinetobacter, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria;

3.15, 3.127 - род Bacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.130 - Brevundimonas vesicularis, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria;

3.17 - род Paenibacillus, порядок Bacillales, класс Bacilli; 3.76 - род Staphylococcus, Bacillales, класс Bacilli;

3.128 - род Providencia, порядок Enterobacteriales, класс Gammaproteobacteria.

Штаммы: 204, 205, 207, 210, 222, 223, 224, 250, 251, 3.16, 3.25, 3.26, 3.58, 3.93, 3.129, 3.131, 3.134, 3.135, №6, 8(Р9), не удалось идентифицировать методом МАЛДИ, поэтому для дальнейшей их идентификации был использован сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (таблица 4). По финансовым соображениям этот метод не мог быть использован для всех неидентифицированных штаммов. В связи с этим были отобраны штаммы, представляющие возможность пополнения коллекций микроорганизмов ВКМ и КубГУ.

Таблица 4 - Уровни сходства по генам 16S рРНК исследуемых штаммов с ближайшими типовыми штаммами

№ штамма	Род	Ближайший типовой штамм	% сходства
3.16	Janibacter sp.	Janibacter holey DSM 21601(T)	99.82
3.25	Microbacterium sp.	Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468(T)	100.0
3.26	Microbacterium sp.	Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468(T)	100.0
3.58	Sphingomonas sp.	Sphingomonas mucossima CP 173-2(T)	98.44
3.93	Arthrobacter sp.	Arthrobacter citreus DSM 20133(T)	99.83
3.129	Brevundimonas sp.	Brevundimonas halotolerans MCS 24(T)	99.81
3.131	Brevundimonas sp.	Brevundimonas vesicularis LMG 2350(T)	98.25
3.134	Belnapia sp.	Belnapia soli PB-K8(T)	99.09
3.135	Microbacterium sp.	Microbacterium hydrocarbonoxydans DSM 16089(T)	99.69
№6	Pseudomonas sp.	Pseudomonas stutzeri ATCC 17588(T)	98.77
8(P9)	Bacilus sp.	Bacilus beringensis BR035(T)	99.74

Таким образом, все указанные (таблица 4) коллекционные штаммы были идентифицированы до рода по генетическим признакам.

На основании результатов, полученных при анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК (приложение Б) удалось систематизировать следующие штаммы: 3.16 - род Janibacter , порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.25, 3.26, 3.135 - род Microbacterium, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.58 - род Sphingomonas, класс Alphaproteobacteria; 3.93 - род Arthrobacter, порядок Actinomycetales, класс Actinobacteria; 3.129, 3.131 - род Brevundimonas, порядок Caulobacterales, класс Alphaproteobacteria; 3.134 - Belnapia, порядок Rhodospirillales, класс Alphaproteobacteria; №6 - род Pseudomonas, порядок Pseudomonadales, класс Gammaproteobacteria, 8(P9) - род Bacilus, порядок Bacillales, класс Bacilli.

Все идентифицированные до вида или рода штаммы переданы в коллекции ВКМ и КубГУ. Штаммы с ненадежной идентификацией, но изученными морфолого-культуральными свойствами, отнесены к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli и подлежат дальнейшему исследованию с целью их систематизации.

Во всех исследуемых образцах было обнаружено большое микробное разнообразие представителей различных видов и родов. Изоляты из колымской низменности были представленные в основном актиномицетами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:

1. На основании полученных морфологических и культуральных признаков микроорганизмов, выделенных из различных регионов России, все изоляты были отнесены к классам: Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli.

2. Из 57 штаммов методом МАЛДИ удалось идентифицировать 23 штамма до рода (Rhodococcus, Gordonia, Roseomonas , Dietzia, Pseudomonas, Methylobacterium, Bacillus, Brevundimonas, Acinetobacter, Paenibacillus, Staphylococcus, Providencia) и 10 штаммов до видов (Methylobacterium extorquens, Pseudomonas stutzeri, Brevundimonas vesicularis, Acinetobacter schindleri, Bacillus Licheniformis, Paenibacillus glucanolyticus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus firmus, Providencia rettgeri.)

3. С помощью анализа фрагментов гена 16S рРНК удалось установить следующие рода (Janibacter, Microbacterium, Sphingomonas, Arthrobacter, Brevundimonas, Belnapia, Pseudomonas, Bacilus).

4. Штаммы с ненадежной идентификацией, но изученными морфолого-культуральными свойствами, отнесены к классам Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Gammaproteobacteria и переданы в коллекции ВКМ и КубГУ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Василюк Н.В. Применение методов масс-спектрометрии для характеристики микроорганизмов.Установление путей биологической деструкции пиридина.Москва, 2009.С.67.

2 Евтушенко Л.И. Современная систематика актиномицетов и близких бактерий // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрОРАН. - Пермь, 1996. С. 34-35.

3 Длительность сохранения микроорганизмов в постоянно мерзлых осадочных породах и погребенных почвах / Звягинцев Д.Г. [и др.] // Микобиология. 1985. Т.54. Вып. 1 . С. 155-161.

4 Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.:Бином. Лаборатория знаний. 2003. 493с.

5 Количественная оценка микроорганизмов многолетнемерзлых отложнениях и погребенных почвах / Хлебникова Г.М. [и др.] // Микробиология. 1990. Т.59. Вып. 1.С.148-155.

6 Сравнительная характеристика микробных сообществ многолетнемерзлых пород различного возраста и генезиса / Звягинцев Д.Г [и др.] // Микробиология . 1990. Т. 59. Вып.3. С. 491-498.

7 AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos [et al.] // Nucleic Acids Res. 1995. N23. P. 4407-4414.

8 Amplified polymorphic DNA PCR in the Microbiology Teaching Laboratory / J. Baker [et al.] // Biochim. And Mol. Biol. Education 2002. Vol. 30. N 6. P. 394-397.

9 Amplified-fragment length polymorphism analisis: the state of an art / P.H. Saveikoul [et al.] // J. Clin. Microbiol. 1999. N37. P.3083-3091.

10 Anderton,W.J & S.G. Wilkinson. Evidence for pretence of a new class of teichoic acids in the cell wall of bacterium NCTC9742 // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. P. 343-351.

11 Bacterial recovery from ancient glacial ice / Christner B.C [et al.] // Environmental microbiology. 2003. V. 5. P. 433-436.

12 Bergey`s Mannual of Systematic Bacteriology 2ed. 2007.

13 Box-PCR fingerprinting as a powerful Tool to reveal Synonymous Names in the Genus Streptomyces. Emended Descriptions are proposed for the species Streptomyces cinereorectus, S. frabiae, S. tricolor, S. colombiensis / B. Lanoot [et al.] // Syst. Appl. Microbiol. 2004. N27. P. 84-92.

14 Current protocols in Molecular Biology/ Ausubel F.M.//N.Y.: John Wiley and Sons. 1994.

15 DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G. Williams [et al.] // Nucl. Acids Res. 1990. N18. P. 6531-6535.

16 Fenselau C., Demirev P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry // Mass Spectr. Rev. 2001. V.20, pp.157-171

17 Frank-Kamenetskii M.D. Simplification on the empirical relationship between melting temperature of DNA, its GC content and concentration of sodium ions in solution // Biopolymers. 1971. V.10, pp. 2623-2624.

18 Gao B. & Gupta R.S. Phylogenetic framework and molecular signatures for te main clades of the phylum Actinobacteris // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2012. V. 76(1). P. 66-112.

19 Gilichinsky, D.A., and E.M. Rivkina, V.A. Samarkin. The microbiological and biogeochemical research in permafrost: Paleoecological implication // Proceeding of the 6 Int. Conf. on permafrost .1993. P. 869-874.

20 Goodfellow M. & O`Donnell A.G. Handbook of new bacterial systematic // London: Academic Press. 1993.

21 Goodfellow M. & O`Donnell A.G. Roots of bacterial systematic // In: Handbook of new bacterial systematic. 1994. P. 3-56.

22 Goodfellow M. The biology Actinomycetes / M. Goodfellow, M. Mordaski, T. Cross. // The biology of biology - Academic Press, London, 1984. P.7 - 164.

23 Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing / F.C. Tenover [et al.] // J.Clin. Microbiol. 1995. N33. P. 2233-2239.

24 Karas M., Bachmann D., Hillenkamp F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules.// Anal. Chem. 1985. V.57. P. 2935-2939.

25 Lechevalier H.A. A practical guide to genetic identification of actinomycetes. In: Bergey`s manual of systematic bacteriology. Edited by Williams S.T., Sharpe M.E., Holt J.G. // Baltimore: Williams and Wikins. 1989. V. 4, pp. 2344-2347.

26 Marmur J., Doty P. Determination of the dase composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation //J. Mol. Biol. 1962. V.5, pp.109-118.

27 Margesin R., Miteva V. Diversity and ecology of psychrophilic

28 microorganisms // Res. Microbiol., 2011, vol. 162, No. 3, p. 346-361.

29 Monitoring the growth of bacteria culture by MALDI-MS of whole cells / Arnold R.J[et al.] //Anal. Chem. 1999. V.71, pp.1990-1996.

30 Murray R.G.E. Report of the Ad Hoc Committee on Approches to Taxonomy within the Proteobacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40, pp. 213-215.

31 Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. N37. P. 1661-1669.

32 Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. Determination of DNA base compositions from melting profiles in dilute buffers // Biopolymers. 1969. V.7, pp.503-516.

33 Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematic / P. Vandamme [et al] // Microbiol. Rev. 1996. N.60. P. 407-438.

34 Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology / Gilichinsky D.A [et al] // 2008, p. 83-102.

35 Rassello-Mora R. & Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39-67.

36 Report of the ad hoc committee for the revaluation of te species definition in bacteriology / Stackebrandt E [et al ] // Int. J. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1043-1047.

37 Schildkraut C., Lifson S., Dependence of the melting temperature of DNA on the salt concentration // Biopolymers. 1965. V.3, pp.195-208.

38 Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA - DNA reassociation and 16S rRNA sequence analisis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. V.44, pp.846 - 849.

39 Stackebrandt E., Rainey F., Ward-Rainey N. Proposal for a new hierarchic classification system Actinobacteria classis now // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997.P. 79-491.

40 Welker M., Moore E.R.B. Applications of whole-cell matrix-assisted laser-desorpsion/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic microbiology // Syst. Appl. Microbiol. 2011. V. 18. P.7213-7218.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Для 36 штаммов методом МАЛДИ масс-спектрометрии были получены масс-спектры клеток на матрице HCCA (a-циано-4-гидроксикоричная кислота).

Рисунок А1 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов №1 и К8

Рисунок А2 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов №7 и К5



Рисунок А3 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов №2 и №6

Рисунок А4 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов №3 и №4



Рисунок А5 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов №5 и Р20

Рисунок А6 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов Р9 и РD4



Рисунок А7 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.15 и 3.16

Рисунок А8 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.17 и 3.25



Рисунок А9 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.26 и 3.28

Рисунок А10- МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.58 и 3.73

Рисунок А11 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.59 и 3.70

Рисунок А12 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.70 и 3.74

Рисунок А13 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.73 и 3.76

Рисунок А14 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.92 и 3.93

Рисунок А15 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.127 и 3.128

Рисунок А16 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.129 и 3.130

Рисунок А17 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.131 и 3.132

Рисунок А18 - МАЛДИ масс-спектры целых клеток штаммов 3.132 и 3.135

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Обработка данных секвенирования последовательностей фрагментов генов 16S рРНК изолированных штаммов.

Сиквенс фрагмента гена 16S рРНК штамма 3.16

TGAGAGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGNGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACNGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAAATCCGGGGCTCAACCCCGGACTTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCACTACTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACTCATTCCACGAGTTCCGTGCCGCAGCTAACGCATAGCGCCCGCTGG

Сиквенс фрагмента гена 16S рРНК штамма 3.25

CTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAAСGCCCAGCTTGCTGGGTGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATACGAGTAGCGACCGCATGGTCAGTTACTGGAAAGATTTATTGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATТAAGTTCCCCGCCTG

Сиквенс фрагмента гена 16S рРНК штамма 3.26

TGAGCAACCTGCCCCTGACTcTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATTACGAGTAGCGACCGCATGGTCAGTTACTGGAAAGATTTATTGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATТAAGTТCCCCGCТTG