Молекулярная и генетическая организация плазмид

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. История исследования плазмид

2. Классификация плазмид

2.1 Распространение плазмид

3. Несовместимость и группы несовместимости

4. Молекулярная и генетическая организация плазмид

5. Генетическая организация факторы переноса

6. Общая характеристика и механизмы действия

7. Плазмиды бактериоциногении

7.1 Плазмиды и патогенность бактерий

Заключение

Список использованных источников

Введение

Плазмиды - внехромосомные генетические элементы, способные к автономному поддержанию в цитоплазме бактерий или существованию в нтегрированном в хромосому состоянии, откуда они могут свободно выходить в цитоплазму (иногда с фрагментами хромосомы). Некоторые хромосомы могут распространяться в бактериальной популяции между ее членами. Плазмиды определяют ряд важных свойств бактерий:

-являются факторами фертильности - определяют донорский фенотип клетки;

-контролируют резистентность к антибиотикам, сульфаниламидам, катионам тяжелых металлов, бактериоцинам, бактериофагам, к сыворотке крови;

-чувствительность к бактериоцинам;

-синтез тиамина, пролина, внеклеточной ДНКазы и др.;

-синтез антибиотиков и бактериоцинов;

-метаболизм углеводов, углеводсодержащих соединений, галогеновых соединений, белков;

-фиксацию азота;

-продукцию токсинов, гемолизина, антигенов колонизации, капсулы;

-в последнее время природа факторов внехромосомной наследственности.

Микроорганизмы приобрели особый интерес в связи с появлением данных о возможности использования плазмид в качестве векторов эукариотных генов. Такая возможность открывает неограниченные перспективы для генетического моделирования не только при решении проблем молекулярной биологии, но и в практическом аспекте, в частности в медицинской микробиологии и иммунологии (создание новых бактерийных профилактических и лечебных препаратов) и микробиологической промышленности.

Большой опыт экспериментального мутагенеза на модели бактерий и вирусов способствовал раскрытию генетических и молекулярных механизмов регуляции функций внехромосомных элементов. Их способность включаться в хромосому и формировать комплексы «замещенных» плазмид широко используется в экспериментальной биологии и генетике.

Замещенные плазмиды несут фрагменты хромосомы бактерии-хозяина и в автономном состоянии функционируют под контролем регуляторных механизмов бактериальной клетки. Расширение методических и технических возможностей экспериментальных исследований в области молекулярной биологии позволяет целенаправленно использовать генетические модели в решении важных практических задач.

Определились реальные пути более гибкого вмешательства в процессы физиологически нормального генетического обмена у бактерий, осуществляемого с участием внехромосомных элементов, способствующих конъюгации, формированию рекомбинантов, передаче генетического материала путем трансдукции умеренными фагами, мобилизации нетрансмиссивных элементов плазмидами, имеющими в своей структуре «гены трансмиссивности», и сочетания с этими генами фрагментов хромосомы с последующим переносом вновь формирующихся структур и их ассоциаций в клетки реципиентов. Актуальное значение приобретает исследование механизмов взаимодействия внехромосомных элементов с хромосомой и между собой в естественных или сконструированных искусственно полиплазмидных системах. Подчинение этих систем общим регуляторным механизмам на уровне клетки и популяции микроорганизмов выдвигает новые проблемы: изучение специфических особенностей полиплазмидных популяций при наличии дополнительных генетических факторов, не обязательных для воспроизведения жизнеспособного потомства, и возможностей практического использования искусственно обогащенного генома популяций бактерий.

В последнее десятилетие интенсивно накапливаются данные о генетической природе и биологических особенностях плазмид, с которыми непосредственно связана патологическая активность бактерий. Это - элементы Hly, Ent, Vir, сведения о которых в мало обобщены. Практическое значение в инфекционной патологии приобретают «вторичные» процессы при ожоговых заболеваниях и постхирургических осложнениях, возникающих в связи с неограниченно возрастающей множественностнной лекарственной устойчивостью возбудителей этих процессов, контролируемой трансмиссивными и нетрансмиссивными факторами инфекционной резистентности. Менее полно изучены, но не менее важны плазмиды, контролирующие патогенные свойства стафилококков, стрептококков, псевдомонад.

В настоящее время на основе использования трансмиссивных эписом интенсивно разрабатывается новое направление исследований «генетическая инженерия» и как специальный раздел этого направления -- «генная инженерия». Последняя представляет собой область прикладной молекулярной генетики и биологии, развитие которой только начинается. Однако первоисточником «сырья» для осуществления конкретных задач конструирования новых биологически активных молекул являются внехромосомные элементы, способные функционировать в виде самостоятельных оперонов и репликонов. Они сохраняют эту функцию в гетерологичных системах микроорганизмов и, что особенно привлекает «биоинженеров», -- в системах эукариотов.

1 История исследования плазмид

Начало исследования плазмид относят к 20 гг. XX века. В 1921 г. Bourdet и Ciuca открыли лизогенные бактерии, способные спонтанно лизироваться. В 1925 г. Gratia обнаружил фактор, подавлявший рост некоторых видов энтеробактерий - «принцип V». Wollman в 1928 г. высказал предположение о трансмиссивности факторов лизогенности. В 1932 г. Gratia идентифицировал обнаруженный им фактор, обладавший антагонистической активностью как белковоподобное вещество. Это исследование дало начало изучению колициногенности -способности бактерий E. Coli продуцировать колицины - вещества, подавляющие рост близкородственных бактерий.

В 1946 г. Д. Ледерберг и Э. Татум использовали смешанное культивирование ауксотрофных мутантов E. Coli K12 и открыли конъюгацию бактерий. В дальнейшем было доказано, что при конъюгации часть клеток являются донорами, а часть реципиентами, что зависит от присутствия внехромосомного фактора фертильности: F-фактора, откуда следовал вывод об односторонности механизма и наличия F+ и F -- фенотипов. Дальнейшие исследования показали возможность превращения клеток F -- в F+ в смесях клеток обоих типов, что указывало на трансмиссивность F-фактора. Было также доказано существование внехромосомных элементов - «плазмид». Как оказалось позднее, плазмида (фактор) F является чистым фактором генетического переноса, так как обладает лишь генами переноса и генами репликации. Внехромосомная природа фактора F была доказана на основании результатов обработки бактерий F+ акридиновыми красителями, что приводит к «удалению» фактора F из клеток популяции и превращает их из доноров в реципиентов. Работы 50-х годов показали, что плазмида F может находиться как автономном состоянии (в цитоплазме), так и в интегрированном в хромосому.

В 1952 г. Lwoff систематизировал материалы по лизогении и впервые предложил термин «плазмиды» для обозначения «внехромосомных симбиотических организмов». В настоящее время этот термин рекомендуется в качестве основного для определения внехромосомных наследственности у бактерий.

Открытие во второй половине 50-х годов японскими исследователями генетических элементов, контролирующих множественную трансмиссивную устойчивость бактерий к наиболее широко применявшимся антибиотикам и синтетическим химиотерапевтическим препаратам сульфаниламидного ряда, ознаменовало новый этап в изучении внехромосомных факторов наследственности бактерий. Она передавалась в результате клеточных контактов, независимо от переноса бактериальной хромосомы. Для обозначения детерминантов резистентности Mitsuhashi S. предложил символ R. Многочисленные исследования в 60 -70-е гг. показали, что R-плазмиды присутствуют в бактериях многих видов, широко распространены географически, отличаются друг от друга и по генетическому составу и по фенотипическим проявлениям. В середине 60-х годов английские исследователи Datta, 1965; Anderson, 1965; Datta, Meynell, 1965 г. представили данные о природе фактора трансмиссивности--RTF, и его аналога--фактора А, способных существовать в свободном состоянии и формировать комплексы с детерминантами резистентности к отдельным антибиотикам, не обладающим собственными генами трансмиссивности. Эти исследователи установили функциональную гомологию фактора передачи резистентности к антибиотикам, а также показали филогенетические связи плазмид резистентности с другими трансмиссивными плазмидами.

В 70-е гг. появляются сведения о детерминированной резистентности к тяжелым металлам, о контроле плазмидами метаболизма липополисахаридов и других компонентов клеточной стенки бактерий, синтеза токсинов, бактериоцинов, синтеза различных ферментов. В 80-е гг. были открыты полиплазмидные системы переноса плазмид. В России исследования плазмид были начаты в конце 50-х гг. в лабораториях Д. Г. Кудлай и А. П. Пехова.

2. Классификация плазмид

В 50-е гг. плазмиды R стали классифицировать на fi+ и fi- (по способности ингибировать перенос плазмиды F). Далее стали, в зависимости от различия в пилях, выделять F и I-подобные плазмиды. Современные подходы к классификации плазмид основаны на комплексном учете их генетических свойств.

Еще в ранних работах по изучению плазмид было замечено, что существуют факторы, препятствующие конъюгационному переносу плазмид от доноров к реципиентам, содержащим одинаковые и сходные плазмиды. Один из таких факторов - поверхностное исключение: в скрещиваниях плазмида не переходит из клеток доноров в клетки реципиенты, содержащие сходную плазмиду. В результате поверхностного исключения перенос снижается в 10-400 раз по сравнению с нормой. Следующий фактор был открыт в 60-е гг. - летальный зигозиз. Смешивание клеток доноров с клетками реципиентами, добавленными в смесь в значительно меньшем количестве, чем клетки доноры, сопровождается снижением числа жизнеспособных зигот, наследующих донорский генетический материал. Наконец результативность переноса зависит от несовместимости плазмид. В наиболее простом виде несовместимость заключается в том, что при переносе одна из плазмид элиминируется. Если в клетке обе плазмиды сохраняются, то это указывает на их совместимость. Обычно несовместимы те плазмиды, контроль репликации которых одинаково.

2.1 Распространение плазмид

Плазмиды в диких бактериальных популяциях распространены очень широко и их можно выявить у бактерий по всей планете. Плазмиды выявляются во многих видах грамотрицательных анаэробов и аэробов, неспоровых анаэробов, кокков, коккобацилл, грамположительных неспоровых палочковых форм и кокков, споровых палочек и кокков, актиномицетов и родственных форм, микоплазм, спирилл, миксококков, фототрофов, цианобактерий, одноклеточных водорослей, дрожжей, трипаносом и т. д.

3. Несовместимость и группы несовместимости

К одной группе несовместимости (inc-группа) относят плазмиды, которые несовместимы между собой, но совместимы с любой плазмидой из другой группы. Существует более 30 inc-групп (таблица 3.1).

Таблица 3.1 - представители inc-группы

Когда плазмиды не трансмиссивны в E. Coli их классифицируют в бактериях тех видов, в которых они выявлены. Плазмиды псевдомонад, не способные к переносу в E. Coli, классифицированы в Pseudomonas aeruginosa и других псевдомонадах на 11 групп. Плазмиды стрептококков и стрептомицетов также классифицированы на несколько inc-групп. Для плазмид одной группы исключения сходна молекулярная масса, гомологичны многие последовательности нуклеотидов, сходны конъюгационные процессы, синтезируются серологически родственные пили. Как полагают многие исследователи, принадлежность плазмиды к той или иной группе несовместимости является отражением филогенеза последней.

Иногда проявляется атипичная несовместимость, когда плазмиды оказываются несовместимыми с плазмидами других групп несовместимости. Иногда одну плазмиду относят к нескольким inc-группам.

4. Молекулярная и генетическая организация плазмид

Генетическая организация разных плазмид отличается большим разнообразием, так как среди плазмид, на основе их функциональной специфичности, различают факторы генного переноса, представляющие собой структуры, содержащие лишь гены репликации и переноса, благодаря которым обеспечивается непрерывность поддержания плазмид этого типа и распределение их между дочерними клетками, а так же их трансмиссивность и генетические детерминанты различных свойств.

Конъюгационные коинтегративные плазмиды - коинтеграты, состоящие из фактора генного переноса(RTF) и генов, детерминирующих фенотипические свойства бактерий. Каждый из составных компонентовтакой плазмиды содержит в своем геноме гены репликации.

Неконъюгационные плазмиды -- генные детерминанты различных свойств. В бактериальных клетках они лишены способности придавать клеткам свойства генных доноров (они не способны к самостоятельной передаче, но, благодаря наличию генов репликации, стабильно поддерживаются в клетке и передаются дочерним клеткам).

Плазмиды - молекулы ДНК, с размерами от 1  350 МД и более (1000 550000 нуклеотидов). Чаще всего размеры лежат в пределах от 3  6 МД и от 50 70 МД (последнее множество размеров принадлежит конъюгационным плазмидам). Молекуле плазмидной ДНК присущи различные конформации: может быть 2-х цепочечная кольцевая форма (в результате смыкания одной из цепей ДНК - «релаксированная» форма), в результате смыкания обеих цепей образуется ковалентно закрытая сверхспиральная кольцевая форма.

Для большинства бактерий и плазмид обычна суперспирализированная форма. У микроорганизмов ряда видов встречаются плазмиды в линейной форме, например, у стрептомицетов - плазмида SCP1. Значительная часть сверхспиральной ДНК отдельных плазмид находится в «релаксационном» комплексе с белком.

Кольцевая форма молекулы ДНК плазмиды характерна лишь для бактерий, но не для грибов и растений, где она существует в линейной форме.

5. Генетическая организация факторов переноса

К чистым факторам переноса относят, например, факторы F и F-подобные (pAP22-4, pAP38, pAP39, pAP41) и pTRA1, фактор T, идентифицированный в E. coli, Shigella, Salmonella, Proteus, Klebsiella, Aerobac-ter, фактор D, обнаруженный в S. typhimurium, и pAA1000 - в S. suipestifer (Пехов А. А. 1981), в Pseudomonas - фактор АP, а в Vibrio - фактор P и др. Наиболее полно их генетическая организация изучена на примере F-плазмиды, у которой не только изучены гены переноса - tra, репликации - rep, несовместимости - inc и др. но и картированы. Имеется 22 гена tra: M, J, A, L, E, K, B, V, C, W, U, N, F, H, G, S, T, D, I, Y, Q, Z. Гены tra A, L, E, K, B, V, C, W, F, Q, H, G - детерминируют синтез белков F-пилей, например, F-подобные PED208 - детерминируют синтез 17 пилей (в случае 0.5 - 1.5 пили в среднем на клетку), гены tra N и G детерминируют устойчивость конъюгационных пар клеток (донор - реципиент), tra M, Y, G, P, I, R, U - контролируют метаболизм конъюгации, tra S, T - поверхностное исключение, tra J -- генетическая регуляция переноса плазмид.

6. Общая характеристика и механизмы действия

По данным японских исследователей, первый случай выделения бактерий, устойчивых к нескольким лекарственным веществам с различными механизмами действия, был отмечен в 1955 г. в клинике при обследовании женщины, больной дизентерией. От нее была выделена шигелла, устойчивая к действию сульфамидов, стрептомицина, хлорам феникола и тетрациклина. Вскоре после этого в 1956 г. было выделено большое количество дизентерийных штаммов, обладавших резистентностью к тем же четырем лекарственным веществам, причем во многих случаях лечение проводилось лишь одним из них. Вслед за японскими работами появились сообщения о множественной резистентности, выявленной у других представителей семейства энтеробактерий и стафилококков. Японские ученые доказали возможность передачи всего комплекса устойчивости от его носителей к чувствительным бактериям. Для обозначения комплекса генетических детерминантов множественной лекарственной устойчивости японские исследователи предложили символ R.

R-плазмиды детерминируют резистентность бактерий к лекарственным веществам - главным образом антибиотикам и сульфаниламидам. В широком плане к плазмидам резистентности относят плазмиды, кодирующие резистентность бактерий к бактериофагам, бактериоцинам, сыворотке, ионизирующему излучению, тяжелым металлам и др. Наиболее полно изучены R-плазмиды грамотрицательных бактерий. Большинство из них конъюгативные, а R-плазмиды грамположительных - неконъюгативные.

Большинство генов устойчивости транспозонного происхождения. Их отличительная особенность в том, что они включаются в определенных местах. Такие последовательности именуются интегронами, а их носителями являются обычно транспозоны.

ДНК R-плазмид представлена в виде ковалентно закрытых кольцевых молекул, предположительно в суперспирализированной форме. Молекулярная масса, копийность, и другие свойства некоторых R-плазмид (таблица 6.1).

Таблица 6.1 - Свойства некоторых R-плазмид

Резистентность бактерий, содержащих R-плазмиды, обычно зависит, от вида бактерий и типа антибиотиков. Например, клетки E. coli в большинстве устойчивы к стрептомицину при его концентрации в среде 10 -- 25 мкг/мл, тогда как шигеллы - при концентрации 10000 мкг/мл, сальмонеллы резистентны к тетрациклину при концентрации 10 мкг/мл, тогда как шигеллы - при концентрации 100 - 250 мкг/мл.

Для плазмидных детерминантов резистентности часто характерно повышенная экспрессивность. Повышение копийности плазмид в результате мутаций генов репликации сопровождается значительным повышением уровня резистентности и подчиняется закономерности «доза-эффект». Повышении экспрессии плазмидных детерминантов лекарственной устойчивости может происходить также и посредством других механизмов: амплификация, приобретение множественных копий транспозонов, повышение интенсивности транскрипции генов.

При смешанном культивировании бактерий различной видовой принадлежности возможен межродовой перенос некоторых плазмид. Например, S. typhimurium ® V. cholerae, S. marcescens ® Y. pestis, P. aeruginosa ® E. coli.

В результате систематического мониторинга лекарственной резистентности кишечных бактерий разных видов, предпринятого в 60-х гг. в Японии, были получены результаты, свидетельствующие, что клетки ~ 58% штаммов, устойчивых к тетрациклину, канамицину, стрептомицину, сульфаниламидам, содержат плазмиды. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что и конъюгативные и неконъюгативные R-плазмиды, детерминирующие резистентность к антибиотикам и сульфаниламидам, присутствуют в бактериях многих видов, в разных зонах мира.

Лекарственная резистентность энтеропатогенных штаммов E. coli, выделенных в Англии в 1980-81 гг. (таблица 6.2).

Таблица 6.2 - Лекарственная резистентность энтеропатогеннных штаммов

7. Плазмиды бактериоциногении

Бактериоцины - вещества, летальные для клеток бактерий. Их названия определяются названиями микроорганизмов-продуцентов. Это термостабильные белки, массой от 10000 до 90000 дальтон. Плазмиды колициногении (col) наиболее изучены. Они содержатся в 20% штаммов E. coli. Колицины подразделяют на группы: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, S1, S2, S3, S4, S5, V. Группа E делится на E1, E2, E3 и тд. E1 вносит непоправимые изменения в цитоплазматическую мембрану. E3 разрушительно воздействует на РНК, E2 вызывает деградацию ДНК.

Плазмиды тоже делятся на 2 группы: I (col E1, col E2, col E3, …E4, …E5, …E6, …E7, …E8, ..E9, col N, col K, col A) и II (col Ib, col B, col V) Среди плазмид колициногении встречаются как конъюгативные, так и неконъюгативные. Некоторые способны мобилизовать хромосомные гены. Все плазмиды колициногении постоянно находятся в автономном состоянии.

Колицины действуют только на близкие по виду клетки, адсорбируясь на специальных рецепторах на их поверхности. Для того, чтобы убить чувствительную клетку достаточно нескольких молекул колицинов.

Бактериоцины продуцируются и другими клетками. Так Bacillus megaterium продуцируют три вида мегатериоцинов: A, B, C.

7.1 Плазмиды и патогенность бактерий

Патогенность - комплексный полигенный (мультифакторный) признак бактерий, представляющий собой биохимические механизмы, посредством которых бактерия вызывает болезнь макроорганизма. В любом случае участие в патогенности принимают плазмиды.

Заключение

В ходе данной курсовой работы видно, какую большую роль играют плазмиды в существовании бактерий и, следовательно, человека.

Актуальные задачи генетики микроорганизмов в настоящее время невозможно представить без систематического изучения роли и механизмов действия внехромосомных факторов наследственности. Исследование генетической природы, молекулярной структуры и регуляции функций плазмид представляет собой одну из фундаментальных проблем современной биологии.

Перспектива использования плазмид и эписом в связи с их исключительной биологической пластичностью оценивается молекулярными биологами трезво и объективно. Интенсивно ведется изучение в области генной инженерии. Исследователи отчетливо понимают сложность таких исследований, которые могут привести к непредсказуемым результатам. Природа может «отомстить» за слишком свободное вмешательство в ее секреты. Именно поэтому важно знать диапазон природных вариаций в формировании заведомо вредных для человека форм микроорганизмов, условия, способствующие стабилизации вновь создаваемых биологических систем или ограничивающие ее.

Список использованных источников

плазмида бактерия генетический наследственность

1 Штерншис, М.В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России / М.В. Штерншис // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2012. - № 2 (18). С. - 92-100.

2 Нетрусов, А.И. Общая микробиология : учебник для студ. высш. учеб. Заведений / А. И. Нетрусов, И. Б. Котова. - М.: Издательский центр «Академия», 2007. - 47-57 с.

3 Феклистова, И.Н. Создание на основе штаммов- продуцентов биологически активных соединений биопрепаратов для защиты растений / И.Н. Феклистова // Молекулярная генетики и биотехнологии. -2013. -№7. - С. 56-60.

4 Научная электронная библиотека eLIBRARY.RU [Электронный ресурс]: крупнейший российский информационно- аналитический портал в области науки, технологии, медицины и образования. - Электрон. дан. ( 2800 электронных версий журналов ). -М.,2013 - . Режим доступа: http://elibrary.ru/defaultx.asp. - Загл. с экрана.

5 Микробиологические средства защиты растений [Электронный ресурс]: науч. журн. / Белорусский государственный университет . - Белорусь 2014. - : Режим доступа http://veterinarua.ru/mikrobiologiya/466-mikrobiologicheskie-sredstva-zashchity-rastenij.html, свободный.

Размещено на Allbest.ru