Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

03.00.19 - Кріобіологія

Автореферерат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кріочутливість еритроцитів різних видів ссавців

Денисова Ольга Миколаївна

Харків - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Харківській державній зооветеринарній академії

Міністерства аграрної політики України та Інституті проблем кріобіології і

кріомедицини Національної Академії наук України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Жегунов Геннадій Федорович, Харківська державна зооветеринарна академія МАП України, завідувач кафедри хімії та біохімії, м. Харків

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Гулевський Олександр Кирилович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу біохімії холодової адаптації, м. Харків

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович, Харківський біотехнологічний центр УААН, головний науковий співробітник, м. Харків

Провідна установа: Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, відділ експериментальних клітинних систем, м. Київ

Захист відбудеться "16'' травня 2006 р. о "13-30" годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків - 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків-15, вул. Переяславська. 23

Автореферат розіслано '' 12" квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради--член-кореспондент НАН України Гольцев А. М.

Размещено на http://www.allbest.ru//

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Вивчення механізмів кріопошкодження та кріозахисту біологічних об'єктів є однією з актуальних проблем сучасної кріобіології. Виявлення загальних закономірностей змін структури і функцій клітин в стресових умовах надасть можливість розробити ефективні методи кріоконсервування клітинних суспензій.

У ветеринарній практиці останнім часом для лікування тварин широко використовують метод переливання крові. Собакам в зарубіжній практиці застосовують гемотрансфузію з 50-х років, зокрема, при гострій крововтраті, гострій гемолітичній анемії, хронічній анемії, тромбоцитопенії та інш. Гемотрансфузія є також високоефективним методом інтенсивної терапії. Багато ветеринарних лікарів використовують кров, заготовлену на цитратратному буфері або “Глюгіцирі”. Проте така кров при позитивних температурах може зберігатися протягом обмеженого часу. При гіпотермічному зберіганні погіршуються морфофункціональні властивості клітин. Тому створення запасів донорської крові тварин можливе лише при довгостроковому зберіганні клітин в замороженому стані.

Існують численні роботи по вивченню впливу кріопротекторів різного механізму дії на збереження еритроцитів людини і ефективності різних способів їх кріоконсервування.

Зараз розроблено методи низькотемпературного консервування крові людини для її збереження протягом тривалого часу. Для клітин тварин таких технологій не існує.

Однак еритроцити різних видів ссавців мають особливості структури мембрани: мембранно-цитоскелетного комплексу, фосфоліпідного складу і регуляції іонного гомеостазу. Зокрема, було показано, що в мембрані еритроцитів коня відсутній білок смуги 4,2 в еритроцитах бика виявлено високий рівень сфінгомієліну та відсутність фосфотидилхоліну. Особливістю еритроцитів собаки та бика є велика концентрація іонів в клітинах.

Це багато в чому може визначати їх різну реакцію на дію кріопротекторів та інших факторів кріоконсервування. Тому дослідження стійкості еритроцитів, що відрізняються особливостями будови та організації мембрани, при дії кріопротекторів і інших чинників низькотемпературного консервування дозволить чіткіше виявити причини кріочутливості та розробити методи, спрямовані на підвищення збереженості клітин в умовах заморожування-відігрівання. Таким чином, вивчення механізмів кріозахисту і кріопошкодження еритроцитів різних видів ссавців дозволить розробити низькотемпературні технології зберігання і створити банк крові тварин, що надасть можливість завжди мати запас крові, особливо рідкісних їх груп.

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи кафедри хімії і біохімії Харківської державної зооветеринарної академії МАП України в рамках теми: “Експериментальне обґрунтування та розробка методів кріоконсервування клітин та тканин домашніх і сільськогосподарських тварин”, № держреєстрації 0104U009818 та у відділі кріоцитології та кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою: “Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської і кордової крові людини під впливом температурно-осмотичних ефектів і кріпротекторів різного механізму дії”, № держреєстрації 0104U006436, де автор самостійно виконувала окремі розділи.

Мета і задачі дослідження.

Мета роботи - вивчити чутливість еритроцитів різних видів ссавців (кінь, бик і собака) до кріоконсервування під захистом кріопротекторів різного механізму дії і оцінити структурно-функціональний стан деконсервованих клітин.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Оцінити збереження еритроцитів коня, бика і собаки після кріоконсервування з проникаючими (гліцерин, ДМСО) і непроникаючим (ПЕО-1500) кріопротекторами, а також після повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов;

2. Визначити коефіцієнти проникності мембран еритроцитів для проникаючих кріопротекторів;

3. Охарактеризувати морфологічні зміни еритроцитів коня, бика і собаки на етапі інкубації з кріопротектором, після заморожування-відігрівання і оцінити оборотність цих трансформацій;

4. Визначити основні метаболічні показники клітин (АТФ, 2,3-ДФГ) після низькотемпературного консервування з кріопротекторами різного механізму дії; кріочутливість еритроцит кріопротектор

5. Вивчити характер модифікації просторового упакування білків мембранно-цитоскелетного комплексу еритроцитів коня, бика і собаки за даними гель-електрофорезу після інкубації еритроцитів з кріопротекторами, заморожування-відігрівання і повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов.

Об'єкт дослідження - кріоконсервування еритроцитів коня, бика і собаки.

Предмет дослідження - кріочутливість еритроцитів коня, бика і собаки до факторів низькотемпературного консервування.

Методи дослідження: спектрофотометричний, фотоколориметричний, світлової мікроскопії, малокутового розсіяння, електрофорезу в ПААГ.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше показано, що ДМСО в концентрації 10% забезпечує достатньо високий рівень захисту еритроцитів коня, бика і собаки в процесі кріоконсервування. Встановлено, що гліцерин не має захисного ефекту на досліджені клітини при низькотемпературному консервуванні. Доведено, що ДМСО проникає в еритроцити коня, бика і собаки набагато швидше, ніж гліцерин. Відзначено, що ПЕО-1500 здатний захищати еритроцити ссавців від пошкодження при заморожуванні-відігріві. Проте перенесення таких клітин до фізіологічних умов приводить до підвищення їх осмотичної крихкості і значного гемолізу.

У роботі встановлено, що кріопротектори (ДМСО і ПЕО-1500) істотно впливають на форму еритроцитів коня, бика і собаки. Після кріоконсервування клітин у присутності ДМСО (10%) і подальшого видалення кріопротектора вони набувають форми ехіноцитів. При перенесенні таких клітин до аутоплазми вони трансформуються у початкові форми. Кріоконсервування з ПЕО-1500 (15%) супроводжується утворенням стоматоцитоподібних форм, які не зникають при поверненні їх до фізіологічних умов.

Доведено, що після кріоконсервування еритроцитів коня, бика і собаки з ДМСО і ПЕО-1500 рівень основних макроергів (АТФ і 2,3-ДФГ), які визначають функціональні показники еритроцитів, не змінюється.

Використання методу електрофорезу в ПААГ у присутності діаміду дозволило встановити, що кріоконсервування еритроцитів з кріопротекторами ПЕО-1500 і ДМСО веде до перерозподілу окремих фракцій у білковому спектрі, який відображає модифікацію структурного стану і зміни просторової упаковки білків мембрани еритроцитів. Виявлено, що модифікація мембрани еритроцитів, кріоконсервированих з ДМСО, менша, ніж модифікація з ПЕО-1500, що відповідає показникам збереження клітин крові тварин після моделювання трансфузії.

Практичне значення одержаних результатів.

В результаті дослідження кріочутливості еритроцитів різних видів ссавців одержані дані, які дозволять розробити нові ефективні технології кріоконсервування цих клітин зі збереженням їх структурно-функціональних показників на достатньо високому рівні. Це надасть можливість надалі створити банк крові домашніх тварин.

Експериментальні дані щодо порівняльного вивчення еритроцитів ссавців можуть бути рекомендовані для вивчення у ВУЗах зі спеціальностями біохімії та фізіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Разом з науковим керівником дисертант сформулює мету і визначив задачі дослідження. Претендентом одержано експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведено їх статистичну обробку. Автором роботи самостійно проаналізовано отримані результати і зроблено висновки.

В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

- у роботі у вивченні впливу процесів кріоконсервування і кріопротекторів на морфологічні зміни еритроцитів коня, бика і собаки;

- у роботах у визначенні рівня АТФ і 2,3-ДФГ в еритроцитах досліджуваних тварин після заморожування-відігрівання;

- у роботах у вивченні впливу кріоконсервування і кріопротекторів на збереження еритроцитів ссавців, а також у вивченні кріочутливості еритроцитів тварин;

- у роботі у вивченні зміни білків мембрани і цитоскелета еритроцитів після кріоконсервування.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень доповідались на конференції “Дні науки 2005” (Дніпропетровськ, 2005), конференції “Молодь і поступ в біології ” (Львів, 2005), конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод в биологии и медицине” (Харків, 2005), конференції молодих учених “Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии - 2005” (Київ, 2005), конференції “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини.

Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур ” (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт, з яких 5 - у спеціалізованих фахових виданнях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 169 сторінках друкованого тексту, з яких 126 сторінки основного змісту.

Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаної літератури (245 джерел, розміщено на 24 сторінках) і додатка (на 19 сторінках). Робота ілюстрована 10 таблицями, 19 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріалом дослідження були еритроцити донорської крові коня, бика, собаки, яку заготовляли на глюгіцировому консерванті.

Обробка еритроцитів кріопротекторами, заморожування-відігрівання і видалення проникаючих кріопротекторів. До еритроцитів тварин додавали кріоконсерванти на основі гліцерину, диметилсульфоксиду (ДМСО) або поліетиленоксиду мм. 1500 (ПЕО-1500) у співвідношенні 1:1 за об'ємом. Заморожування здійснювали до температури - 196°С шляхом занурення контейнера в рідкий азот.

Відігрівання після зберігання проводили на водяній бані при 42-45°С. Для видалення проникаючих кріопротекторів проводили триразове відмивання еритроцитів відповідно до стандартних (для еритроцитів людини) методик.

Моделювання трансфузії. Здійснювали перенесенням клітин до ізотонічного розчину NaCl, що містить 10 мм. фосфатного буфера, рН 7,4 або до аутоплазми при 37°С. Розведення еритроцитів складало 1:10 відповідно до встановлених процедур трансфузії доз крові реципієнтам.

Осмотична крихкість. Визначали за методом, оцінюючи стійкість клітин в гіпотонічних розчинах NaCl 0,1 - 0,9%. Індекс осмотичної крихкості визначали як концентрацію NaCl, коли відбувається 50%-й гемоліз.

Визначення рівня гемолізу еритроцитів. Визначали за вмістом вільного гемоглобіну в супернатанті спектрофотометричним методом на СФ-46 (ЛОМО, Росія) при довжині хвилі 543 нм.

Спосіб визначення коефіцієнта проникності еритроцитів для кріопротекторів. Визначали за методом на основі фізико-математичної моделі гіпотонічного гемолізу еритроцитів.

Мікроскопічні дослідження. Проводили за методом світлової мікроскопії на мікроскопах МБІ-15У (ЛОМО, Росія) і K. Zeiss (JENA, Німеччина) з фотографічною реєстрацією морфологічної картини крові. Загальний стан клітин після експериментальних дій оцінювали в краплі, яку поміщали між предметним і покривним стеклами, і рівномірно розподіляли тонким шаром. Для морфологічної оцінки особливостей форми і поверхневої структури еритроцитів використовували загальноприйняту класифікацію.

Неферментативний метод визначення 2,3-ДФГ еритроцитів. Визначення концентрації 2,3-ДФГ в еритроцитах проводили за методом.

Спектрофотометричний гексокіназний метод визначення вмісту АТФ. Рівень АТФ вимірювали спектрофотометрично за методом.

Отримання білих тіней еритроцитів. Білі тіні еритроцитів, піддані відповідним чином експериментальним діям, одержували гіпотонічним шоком за методом.

Обробка клітин діамідом. Після експериментальних дій аліквоти клітин інкубували при 37°С у присутності 2,5 мм. діаміду протягом 1 години, після чого одержували тіні, як описано вище.

Електрофорез білків мембран еритроцитів. Проводили в SDS-ПААГ за системою Лемлі. Використовували градієнтний гель 5-20Т4С. Для визначення молекулярної маси білків використовували маркери фірми Fluka. Оцінку відносного вмісту білків різних фракцій на доріжці SDS-ПААГ проводили за допомогою денситометрування (денситометр DM2120 “Solar”) і комп'ютерної програми Scion Image.

Статистична обробка результатів. Отримані результати обробляли за методом Стюдента-Фішера.

Збереження еритроцитів ссавців після кріоконсервування. Співвідношення захисної дії кріопротектора і його цитотоксичного ефекту залежить від багатьох факторів: умов інкубації, концентрації, температури, швидкості введення кріопротектора до клітинної суспензії. Тому на першому етапі роботи були проведені дослідження щодо вибору кріоконсервантів, умов їх введення і видалення з клітинної суспензії після заморожування-відігрівання. Доведено, що при кріоконсервуванні гліцерин мало ефективний для захисту еритроцитів собаки і взагалі не має захисного ефекту для еритроцитів коня і бика.

Використання ДМСО як кріопротектора довело, що його 10% концентрація здатна захищати еритроцити досліджених тварин від пошкоджувальної низькотемпературної дії.

Визначення коефіцієнта проникності еритроцитів тварин для проникаючих кріопротекторів показало, що гліцерин дуже повільно проникає в еритроцити коня, бика і собаки, на відміну від ДМСО. Перспективним напрямком розробки способів кріоконсервування еритроцитів є технології, засновані на застосуванні непроникаючих кріопротекторів. Враховуючи дані низькотемпературного збереження еритроцитів людини, були проведені експерименти щодо вивчення стійкості еритроцитів тварин до заморожування під захистом ПЕО-1500. Одержані дані показали, що відразу після кріоконсервування еритроцитів визначається незначний рівень гемолізу (~ 1-5%). Проте збереження клітин відразу після розморожування - це недостатня оцінка можливості застосування деконсервованих еритроцитів у практиці. Для успішного переливання крові клітини повинні бути стабільні у фізіологічних умовах і мати достатні механоеластичні властивості.

При перенесенні еритроцитів коня, бика і собаки, кріоконсервованих з ДМСО після видалення кріопротектора з клітин до ізотонічного середовища при 37°С, відзначається їх стабільність, тоді як після заморожування з ПЕО-1500 відбувається їх пошкодження, яке супроводжується зростанням гемолізу протягом 24 годин дослідження.

Індекс осмотичної крихкості еритроцитів тварин після низькотемпературного збереження з ДМСО не відрізняється від нативних клітин, тоді як для еритроцитів, кріоконсервованих з ПЕО-1500, відзначається достовірне збільшення даного параметра. Це свідчить про те, що в клітинах після заморожування-відігрівання з ПЕО-1500 значно порушуються механоеластичні властивості, і клітини стають крихкішими і менш еластичними. При порівнянні індексу осмотичної крихкості еритроцитів досліджених тварин можна зробити висновок, що еритроцити коня є менш осмотично стійкими та міцними, тоді як еритроцити собаки - найбільш осмотично стійкими в групі досліджуваних тварин. Аналогічні закономірності стійкості клітин до кріоконсервування були визначені після заморожування-відігрівання еритроцитів.

Видова специфіка стійкості еритроцитів до стресових дій, очевидно, пов'язана із структурними особливостями мембранно-цитоскелетного комплексу. Морфологічні показники еритроцитів ссавців під впливом кріопротекторів і заморожування-відігрівання. Трансформація клітин у розчинах кріопротекторів та після заморожування-відігрівання відбиває зміни фізико-хімічних властивостей цитоплазматичної мембрани і цитоскелета. Дослідження морфологічних характеристик еритроцитів дозволили оцінити зміни їх форми при експериментальних діях. Інкубація еритроцитів коня, бика і собаки в 10%-му розчині ДМСО призводить до трансформації клітин, які набувають форми здутих дисків. Після заморожування-відігрівання і відмивання клітин від кріопротектора основною формою в популяції є ехіноцити. Було відмічено, що еритроцити бика і собаки при перенесенні до плазми мають форму дискоцитів на фоні підвищеної кількості дискоехіноцитів і деформованих клітин, а еритроцитів коня в аналогічному експерименті утворюють “монетні стовпчики”. Взагалі форма еритроцитів тварин після перенесення до фізіологічних умов подібна тій, якої вони набувають у розчині “Глюгіцир” після нетривалого гіпотермічного зберігання. Застосування 15%-го розчину ПЕО-1500 веде до появи в процесі інкубації сплощених дисків. Стоматоцити з'являються після заморожування-відігрівання таких клітин і не зникають після перенесення до аутоплазми. Особливістю трансформації клітин в розчині ПЕО-1500 є посилення їх агрегації і утворення значних конгломератів. Дія заморожування-відігрівання і кріопротекторів на метаболічну стабільність деконсервованих клітин. Виконання основної функції еритроцитів можливо при нормальному енергетичному потенціалі, показником якої є вміст АТФ, та нормальному рівні 2,3-ДФГ, що відповідає за спорідненість гемоглобіну до кисню. У зв'язку з тим, що в еритроцитах бика низький рівень 2,3-ДФГ, концентрацію цього метаболіту в даних клітинах не визначали. Встановлено, що відразу після заморожування-відігрівання еритроцитів коня і собаки у всіх експериментальних варіантах відсутні відмінності концентрації АТФ і 2,3-ДФГ, а еритроцитів бика - у вмісті АТФ від контрольних показників. Одержані дані свідчать про те, що під час кріоконсервування, включаючи етап відмивання від кріопротектора, витік даних метаболітів не відбувався. При інкубації еритроцитів тварин, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, у фізіологічних умовах протягом 24 годин достовірно знижуються рівень цих макроергів, що не характерно для контрольних та кріоконсервованих у присутності ДМСО клітин.

Падіння концентрації даних метаболітів може бути пов'язано з декількома причинами. По-перше, це може бути результатом формування мембранних дефектів під час кріоконсервування, внаслідок чого в процесі інкубації з клітин елімінують макромолекули. По-друге, при перенесенні клітин до ізотонічних умов при 37°С відновлюються метаболічні процеси, зокрема гліколіз, який пов'язаний із витратою глюкози як природного енергетичного субстрату. По-третє, при фізіологічній температурі в клітинах, кріоконсервованих під захистом ПЕО-1500, може збільшитися витрачання енергії різними транспортними системами і ферментами, необхідне для відновлення клітинного гомеостазу.

Таким чином, рівень даних метаболітів в еритроцитах досліджуваних тварин, кріоконсервованих під захистом ДМСО, зберігаються на рівні контрольних величин впродовж всього часу при моделюванні трансфузії, що свідчить про структурно-функціональну повноцінність клітин.

Модифікація білкового складу мембран і цитоскелета еритроцитів під впливом кріоконсервування. Стійкість еритроцитів до заморожування після інкубації з кріопротекторами щонайбільше пов'язана з станом мембранно-цитоскелетного комплекса еритроцитів. При дослідженні модифікації білків цитоскелета методом електрофорезу в ПААГ не було виявлено значних відмінностей у всіх експериментальних варіантах, які оцінювалися традиційними методами.

Це свідчить про те, що характер змін білків мембранно-цитоскелетного комплексу еритроцитів під час кріоконсервування під захистом непроникаючого і проникаючого кріопротекторів важко виявити. Адекватним методичним підходом для вивчення структурних змін, що виникають в цитоскелетній білковій мережі під дією факторів кріоконсервування, є використання діаміду, який фіксує SH-групи білків, призводячи до формування дисульфідних містків.

В умовах заморожування-відігрівання і дії розчинів кріопротекторів можуть відбуватися зміни просторового розташування молекул цитоскелета, зближення окремих ділянок білків у рамках комплексів, об'єднаних взаємодіями типів „спектрин-актин”, „актин-актин”, „спектрин-актин-білок смуги 4.1”, „спектрин-актин-адуцин” і т. д.

Інкубація еритроцитів у розчині ПЕО-1500 і ДМСО та подальше заморожування-відігрівання призводить до деякого порушення просторового розташування білків цитоскелета, внаслідок чого з'являються доступні для діаміду SH-групи. При цьому змінюється і вміст білків в окремих фракціях: зокрема знижується вміст спектрину, анкирину, білків смуги 4.2, 4.9 і 5, а також відбувається повна втрата білків смуги 6 і 8. Зниження вмісту окремих фракцій білків пов'язана, насамперед, із залученням частини цих білків у процес агрегації під дією діаміду, про що свідчить утворення білкових агрегатів на старті гелю.

Модифікація мембранно-цитоскелетного комплексу виражена сильніше для еритроцитів, кріоконсервованих в присутності ПЕО-1500, і носить необоротний характер, оскільки не зникає після повернення деконсервованих клітин до фізіологічних умов.

Різний ступінь збереження еритроцитів всіх досліджених тварин після кріоконсервування, можливо пов'язаний з різним механізмом захисту клітин проникаючим і непроникаючим кріопротекторами від низькотемпературних пошкоджень. Непроникаючий кріопротектор здійснює захист еритроцитів шляхом дегідратації. Відсутність усередині клітин речовин, здатних стабілізувати структуру води, може приводити до негативних наслідків, пов'язаних з необоротною втратою зв'язаної води гідратних оболонок білків. Крім того, внаслідок дегідратації еритроцитів підвищується іонна сила розчину усередині клітин, що зрештою може викликати конформаційні зміни білкових макромолекул. Концентрування солей і дегідратація молекул здатні додатково підсилювати денатурацію білків, яка може бути необоротною, і після повернення клітин до нормальних фізіологічних умов приведе до метаболічного дисбалансу в результаті порушення ферментативних реакцій і зміни структурної цілісності мембрани і цитоскелета.

ВИСНОВКИ

Механізми кріочутливості еритроцитів людини достатньо вивчено та розроблено ефективні методи їх кріоконсервування, однак для еритроцитів тварин цей напрямок дослідження залишається досить актуальним. У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення наукової проблеми щодо порівняльного вивчення чутливості еритроцитів ссавців до кріоконсервування у присутності кріопротекторів проникаючого і непроникаючого типів, а також розробки підходів, спрямованих на зменшення пошкодження клітин в процесі кріоконсервування:

1. Встановлено, що гліцерин не здатний забезпечити захист еритроцитів досліджених тварин при низькотемпературному консервуванні. Високе збереження клітин досягається при використанні ДМСО і ПЕО-1500. Еритроцити, кріоконсервовані з ДМСО, порівняно з ПЕО-1500 проявляють високу стійкість (контролю) в моделі трансфузії з підтримкою нормальної осмотичної крихкості;

2. Коефіцієнт проникності мембран еритроцитів коня, бика та собаки для гліцерину значно нижчий, ніж для ДМСО;

3. Найбільш стійкими до процесу кріоконсервування у присутності кріопротекторів різного механізму дії є еритроцити собаки, найменш стійкими - еритроцити коня;

4. Виявлено морфологічні зміни клітин при кріоконсервуванні в присутності кріопротекторів. У випадку ДМСО після заморожування-відігрівання та видалення з клітин кріопротектора спостерігається ехіноцитоз, а після перенесення деконсервованих еритроцитів до аутоплазми відновлюється їх початкова форма. При кріоконсервуванні еритроцитів з ПЕО-1500 спостерігається стоматоцитоподібна трансформація, яка зберігається і після повернення клітин до фізіологічних умов;

5. При кріоконсервуванні еритроцитів ссавців з ДМСО і ПЕО-1500 вміст АТФ і 2,3-ДФГ зберігається на рівні контролю. При моделюванні трансфузії концентрації цих макроергів в еритроцитах, кріоконсервованих у присутності ПЕО-1500, достовірно знижується в процесі інкубації, що не характерно для контрольних і кріоконсервованих з ДМСО клітинами;

6. Кріоконсервування еритроцитів у присутності ПЕО-1500 і ДМСО призводить до модифікації білкового спектру мембран, яка виявляється методом електрофорезу із застосуванням діаміду. При кріоконсервуванні з ПЕО-1500 модифікація мембранно-цитоскелетеного комплексу більш виражена.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Денисова О.Н., Кулешова Л.Г., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Трансформация эритроцитов животных после криоконсервирования // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - Вип. 4. - С. 41-45.

2. Денисова О.Н., Жегунов Г. Ф., Бабийчук Л. А. Криоконсервирование эритроцитов животных под защитой диметилсульфоксида, полиэтиленгликоля, глицерина // Проблемы криобиологии. - 2005. - №2.

3. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н., Землянских Н.Г. Криоконсервирование и сохранность эритроцитов животных // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 3. - №3. - С. 566-569.

4. Денисова О.Н. Исследование уровня 2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах животных после низкотемпературного консервирования под защитой диметилсульфоксида и полиэтиленоксида мм. 1500 // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - Вип. 3. - С. 33-38.

5. Денисова О.М., Жегунов Г.Ф., Бабійчук Л.О. Кріоконсервування еритроцитів тварин під захистом поліетиленоксида // Біологія тварин. - 2004. - Т. 6. - №1-2. - С. 107-110.

6. Жегунов Г.Ф., Денисова О.Н. Резистентность эритроцитов домашних животных к криоконсервированию // Ветеринарна медицина. - 2005. - Т. 1. - С. 433-434.

7. Денисова О.М. Стійкість еритроцитів коня, бика, собаки до кріоконсервування: Тези доповідей 1 Міжнародної конференції студентів та аспірантів „Молодь та поступ в біології.” - Львів, 2005. - С. 13.

8. Денисова О.Н. Вивчення ефекту диметилсульфоксиду та поліетиленгліколя при кріоконсервуванні еритроцитів бика, коня: Тези конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження М.Ф. Гулого. - Київ, 2005. - С. 12.

9. Денисова О.Н., Землянских Н.Г., Жегунов Г.Ф. Структурные изменения мембран эритроцитов животных при криоконсервировании под защитой ПЭО-1500: Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції „Дні науки 2005”. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2005. - Т. 2. „Біологія.” - С. 17-18.

АНОТАЦІЇ

Денисова О.Н. Криочувствительность эритроцитов различных видов млекопитающих. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2006.

Диссертационная работа посвящена изучению чувствительности эритроцитов различных видов млекопитающих (лошадь, бык и собака) к криоконсервированию под защитой криопротекторов различного механизма действия и оценке структурно-функционального состояния деконсервированных клеток.

Эритроциты криоконсервировали в присутствии глицерина, ДМСО и ПЭО-1500. После замораживания-отогрева оценивали уровень гемолиза, осмотическую хрупкость, устойчивость клеток при моделировании трансфузии. Морфологические исследования проведены методом световой микроскопии. Модификацию метаболической стабильности определяли по изменению концентраций АТФ и 2,3-ДФГ. Перестройку белков мембранно-цитоскелетного комплекса изучали с использованием метода электрофореза в ПААГ.

Установлено, что при криоконсервировании глицерин не оказывает эффективного криопротекторного действия в отношении эритроцитов лошади, быка и собаки. Изучение влияния концентраций ДМСО 5 - 20 % на выживаемость эритроцитов млекопитающих в процессе криоконсервирования показало, что наиболее приемлемый уровень защиты клеток обеспечивается при 10 %-м содержании криопротектора в среде. Оценка коэффициента проницаемости мембран клеток исследованных животных для проникающих криопротекторов свидетельствует о соответствии данного показателя с их криопротекторной эффективностью. Низкий коэффициент проницаемости глицерина по сравнению с ДМСО согласуется с его малой криопротекторной эффективностью. Незначительный уровень гемолиза (1-5 %) эритроцитов лошади, быка и собаки достигается в присутствии 15 %-го ПЭО-1500 при замораживании до -196 °С.

Клетки, криоконсервированные с 10 %-м ДМСО, проявляют высокую устойчивость при моделировании трансфузии в отличие от эритроцитов, замороженных в присутствии ПЭО-1500. При оценке осмотической хрупкости деконсервированных эритроцитов лошади, быка и собаки были установлены аналогичные закономерности, свидетельствующие о нарушении данного функционального параметра при криоконсервировании под защитой непроникающего криопротектора и способности ДМСО эффективно сохранять клетки.

При морфологических исследованиях было подтверждено, что нативные эритроциты животных представлены дискоцитами. Анализ формы клеток, криоконсервированных под защитой 10 %-го ДМСО, показал, что после удаления криопротектора из клеток основная их часть представлена эхиноцитами, а после перенесения в аутоплазму они приобретают исходные формы. Эритроциты после замораживания-отогрева в присутствии 15 %-го ПЭО-1500 представлены в большей степени стоматоцитами, которые не исчезают после возвращения их в физиологические условия.

Физиологическая роль эритроцитов млекопитающих связана с газообменом. Эффективная доставка кислорода и удаление углекислого газа возможны в условиях нормального метаболического потенциала клетки, который обусловлен продукцией АТФ и 2,3-ДФГ. Следует отметить, что концентрация данных метаболитов сразу после криоконсервирования в присутствии ДМСО и ПЭО-1500 не отличается от контрольных величин. Однако с течением времени при инкубировании в физиологических условиях эритроцитов животных, подвергнутых замораживанию до -196 °С под защитой ПЭО-1500, отмечено достоверное снижение уровня АТФ и 2,3-ДФГ, что не характерно для клеток, криоконсервированных в присутствии ДМСО.

Криочувствительность эритроцитов лошади, быка и собаки к замораживанию после инкубации с криопротектором во многом зависит от состояния их мембранно-цитоскелетного комплекса. Исследование структурных белков мембраны нативных эритроцитов всех видов животных методом электрофореза в ПААГ показало, что общая картина белкового спектра характеризуется стандартным набором компонентов. Однако был отмечен ряд видовых отличий, касающихся, в частности дефицита белка полосы 4.2 и 6, а также более высокого содержания белка полосы 4.9 и 7 в эритроцитах лошади. При традиционном методическом подходе к анализу модификаций мембранно-цитоскелетного комплекса под влиянием криопротекторов, низких температур, возврате деконсервированных клеток в физиологические условия не было выявлено каких-либо отличий по сравнению с контролем. Использование диамида позволило обнаружить нарушение пространственного расположения белков цитоскелета эритроцитов исследованных животных после инкубации с криопротекторами и последующего замораживания-отогрева. При этом уменьшается относительное содержание белков в отдельных фракциях: в частности снижается относительное содержание спектрина, анкирина, белков полосы 4.2, 4.9 и 5, а также происходит полная потеря белков полосы 6 и 8. Снижение содержания отдельных фракций белков связана, прежде всего, с включением части белков в процесс агрегации под действием диамида, про что свидетельствует образование белковых агрегатов на старте геля. Модификация мембранно-цитоскелетного комплекса выражены сильнее для эритроцитов, криоконсервированных под защитой ПЭО-1500, и имеет необратимый характер, так как не исчезает после возврата деконсервированных клеток в физиологические условия, в отличие от ДМСО, где отклонения возвращаются к норме после перенесения в аутоплазму.

Ключевые слова: криоконсервирование, криочувствительность, эритроциты лошади, быка и собаки, криопротекторы, мембрана, цитоскелет, АТФ, 2,3-ДФГ.

Denisova O.N. Cryosensitivity of erythrocytes in different mammalian species.- A manuscript.

Thesis for the candidate of biological sciences degree in specialty 03.00.19 - Cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov - 2006.

Thesis covers study of erythrocyte sensitivity of different mammalian species (horse, bull, dog) to cryopreservation with cryoprotectants and estimation of structural and functional state of frozen-thawed cells.

The results obtained in the work testify to the fact, that DMSO is the most efficient cryoprotectant during cryopreservation for horse, bull and dog erythrocytes. PEO-1500 is capable to preserve cells during cryopreservation, but after transferring such frozen-thawed cells under physiological conditions they undergo damages. After cryopreservation with 10% DMSO in contrast to 15% PEO-1500 the cells preserve morphological indexes. ATP and 2,3-DPG concentrations after cryopresevation the control level keep. Investigation of erythrocyte membrane proteins of animals using electrophoresis method in PAG with protein-cross-linking reagent diamide demonstrated a disorder in their spatial location. Modifications of membrane-cytoskeletal complex are stronger manifested for erythrocytes, cryopreserved under PEO-1500 protection in contrast to DMSO.

Key words: cryopreservation, cryosensitivity, horse, bull and dog erythrocytes, cryoprotectants, membrane, cytoskeleton, ATP, 2,3-DPG.

Размещено на Allbest.ru