Влияние инокуляции семян растений на микоризацию корней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Глава 1. Литературный обзор. Влияние почвенной засухи на микоризу растений

1.1 Роль микоризы в жизни растений

1.2 Последствия влияние засухи на сельскохозяйственные растения

1.3 Перспективы использования эндофитных бактерии рода Bacillus subtilis

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Объект и предмет исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика посадки семян

2.2.2 Обработка семян бактериями Bacillus subtilis

2.2.3 Условия произрастания растений в условиях засухи

2.2.4 Методика сбора образцов

2.2.5 Методика окрашивания корней

2.2.6 Методика оценки колонизации арбускулярной микоризы растений

2.3 Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Влияние влажности почвы на показатели микоризации корней растений

3.2 Влияние засухи и бактерий Bacillus subtilis на морфометрические показатели растений

Вывод

Список литературы

Сокращения

ВАМ - везикулярно - арбускулярная микориза

АМГ - арбускулярные микоризные грибы

PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria) - бактерий, стимулирующие развитие растений

АМ - арбускулярная микориза

Введение

В последние годы внимание многих исследователей направлено на изучение влияния глобальных климатических изменений на растения. Это связано с тем, что влияние климатических и антропогенных факторов может негативно отразиться на жизнедеятельности живых организмов [Alam]. Повышение температуры воздуха на протяжении длительного времени может усилить испарение воды с поверхности почвы, и интенсивная транспирация приведет к иссушению корнеобитаемого слоя почвы.

Потепление с сопровождением почвенной и атмосферной засухи может сильно воздействовать на продукционные процессы сельскохозяйственных растений [Abdullaev]. Известно, что температурный и водный стресс приводят к нарушению метаболических процессов у растений, распаду белков, изменению коллоидно-химического состояния цитоплазмы и, в конечном итоге, к снижению количества накапливаемого растениями органического вещества [Эргашев]. Такие полигенные признаки, как продуктивность, устойчивость к стрессам, качество урожая и другие, могут сильно варьировать под влиянием условий среды.

В то же время недостаточно внимания уделяется изучению влияния засухи на везикулярно-арбускулярную микоризу (ВАМ) [Abbott, Robson, 1982, с. 389?408.]. засуха эндофитный bacillus subtilis

Везикуло - арбускулярная микориза (ВАМ) - широко распространенная в природе в виде микробо-растительного симбиоза, играющая важную роль в обеспечении растений питательными элементами, водой и способствующая выживанию растений при неблагоприятных условиях окружающей среды [Marulanda]. По некоторым данным, более 90% видов наземных растений вступают в симбиотические отношения с микоризными грибами (Glomeromycota) [Helgason]. Арбускулярные микоризные грибы являются облигатными симбионтами и не способны размножаться в культуре in vitro .

АМГ играют жизненно важную роль в обеспечении устойчивого сельского хозяйства, потому что они увеличивают водных отношений растений, которые улучшают засухоустойчивость растений-хозяев [Nelsen, 1987, c. 71-79]. Способности конкретных ассоциаций между растениями и AMГ переносить засуху, имеют большой интерес. Исследования на условиях засухи показали, что растительная биомасса, содержание хлорофилла, и интенсивность транспирации были больше в растениях, зараженных AMГ по сравнению с растениями без АМГ [Asensio, Rapparini, Peсuelas, 2012, c. 149-161]. Также у AMГ были обнаружены эффекты на проводимость устьиц с одинаковой частотой при обильном поливе и засухи [Awotoye, Atayese, Osonubi, Mulongoy, Okali, 1992, c. 67-77]. AMГ симбиоз также влияет на устьичную чувствительность к состоянию атмосферной влаги [Huang, Smith, Yost, 1985, c. 229-243].

Актуальность темы. Образование симбиоза с эндомикоризными грибами у большинства сельскохозяйственных культур - важный фактор улучшения минерального, в особенности фосфорного, питания растений и повышения их продуктивности. Однако в результате воздействия почвенной засухи симбиотрофность растений снижается(Тихонович).

Для повышения эффективности эндомикоризного симбиоза может быть усиление положительного взаимодействия симбионтов с ассоциативными ростстимулирующими бактериями (например, Azospirillum, Arthrobacter, Pseudomonas, Bacillus и др.), в современной литературе называемыми «бактерии, стимулирующие развитие растений» (от англ. Plant Growth Promoting Bacteria, PGPB) [Sood, 2003, c. 219-227; Compant, Duffy, Nowak, Clйment, Barka, 2005, c. 951-959]. Интерес к этому направлению вызван тем, что некоторые эндофитные штаммы бактерий используются в качестве основы препаратов для защиты растений от фитопатогенов, например Bacillus subtilis 26Д - основа биофунгицида, фитоспорин [Хайруллин, Минина, Иргалина, 2009, с. 133-137.]. Практически не изучены тройственные симбиозы, которые могут формировать растительные организмы, эндофитные бактерии и микоризообразующие грибы.

Как правило, такие штаммы должны подавлять рост и развитие грибов, и не исключено, что антагонизм может проявиться и по отношению к грибным микроорганизмам, формирующим ВАМ. Важными механизмами положительного воздействия бактерий на микоризу и микоризованные растения служат продукция биологических активных веществ, мобилизация питательных веществ в почвы, фиксация атмосферного азота и биоконтроль фитопатогенных грибов(Shtark).

Цель работы: определить влияние инокуляции семян растений эндофитными штаммами бактерий Bacillus subtilis на микоризацию корней в условиях имитации почвенной засухи.

В связи поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать морфометрические показатели (длину и биомассу побегов и корней) растений в условиях имитации почвенной засухи.

2. Изучить развитие арбускулярной микоризы в корневой системе растений в условиях имитации почвенной засухи.

3. Изучить влияние инокуляции семян растений эндофитными штаммами бактерий Bacillus subtilis на ростовые показатели и микоризацию корней в условиях имитации почвенной засухи.

4. Провести сравнительный анализ влияния почвенной засухи на рост растений и развитие арбускулярной микоризы у инокулированных и неинокулированных эндофитными бактериями Bacillus subtilis растений.

Новизна. Впервые было проведено исследование колонизации арбускулярной микоризации корней растений, обработанных эндофитными штаммами бактерий Bacillus subtilis шт.26 Д и 11 ВМ в условиях имитации почвенной засухи.

Практическая значимость. Полученные результаты дополняют теоретические сведения о взаимоотношениях микоризы и растений. Данные могут быть учтены в практике сельского хозяйства, с целью повышения урожайности сельскохозяйственных растений в условия засухи.

Структура дипломной работы. Работа состоит из введения, трех глав, заключение и списка использованной литературы.

Глава 1. Литературный обзор влияние засухи на микоризацию растений

1.1 Роль микоризы в жизни растений

Микориза - неотъемлемая часть большинства растений в природе. На инфицированных корнях грибы развивают внешний мицелий, который является мостом, соединяющим корень с окружающей почвой [Swift]. Одно из многих наиболее значительных влияний АМ-грибов на растение-хозяина - увеличение поглощения фосфора, главным образом, из-за способности микоризированных грибов поглощать фосфаты из почвы и передавать их корням хозяина. Кроме того, микоризная инфекция приводит к увеличению поглощения меди, цинка, никеля и др. Известно, что микориза уменьшает проблемы с болезнетворными микроорганизмами, которые инфицируют корни растений [Соколова, 1995, с. 13-15].

Арбускулярная микориза (AM) является наиболее экологически значимой формой растительно-микробных взаимодействий, образуемой большинством наземных растений с грибами типа Glomeromycota [Renker, Heinrichs, Kaldorf, 2003, c. 191-198]. Glomeromycota - это монофилетическая группа которая отошла от того же общего предка, как Ascomycota и Basidiomycota [Schьssler, 2001, c. 1413-1421]. AM-грибы характеризуются тем, что гифы образуют непрерывную цитоплазму, в которой ядра свободно распространяются, и каждый спор содержит несколько ядер, количество доходит до 100 и 200 ядер в одной споре [Marleau, 2011, с. 51]. Считается, что AM-источник биоразнообразия фитоценозов [Van der Heijden, Boiler, Wiemken, Sanders, 1998, c. 2082-2091]. На долю AM приходится не менее 20% объема круговорота веществ в наземных экосистемах [Каратыгин, 1993, c. 1-18]. В сельском хозяйстве AM является естественной альтернативой внесению больших количеств удобрений, в первую очередь фосфорных. Она может использоваться для восстановления нарушенных экосистем [Allen, 1996, c. 769-782], а также оказывать общестимулирующее влияние на растения, в результате которого значительно возрастает урожайность сельскохозяйственных культур [Маршунова, Якоби, 1988, c. 166-168]. AM обладает оздоравливающим эффектом, защищая растение от корневых патогенов путем синтеза антибиотиков или субстратной конкуренции, либо за счет индукции иммунных реакций у растения-хозяина [Marsh, Schultze, 2001, c. 525-532]. AM может изменять гормональный статус растений, влияя на содержание ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты и цитокининов [Danneberg, Latus, Zimmer, Hundeshagen, Schneider-Poetsch, Bothe, 1992 c. 33-39].

AM-грибы являются облигатными организмами и не могут завершить свой жизненный цикл без растения-хозяина, в то время как растения выживают без грибковых партнера, но симбиотические взаимодействия приводит к улучшению морфометрических показаний [Delano-Frier, Tejeda-Sartorius M, 2008, c. 936-944]. Показано, что действие AMГ наиболее четко проявляется в том, что она способствует усвоению растениями труднорастворимого фосфора, а сорта, используемые в исследованиях эффективности AM, часто имеют ослабленную способность к симбиотрофному питанию фосфором, так как их селекция проводилась на хорошем агрохимическом фоне, при полном минеральном питании (либо при низком содержании азота в почве). [Martennson, Rydberg, 1994, c. 13-19].

Низкая доступность растениям почвенных запасов фосфора обусловлена слабой избирательной поглотительной способностью корней и дефицитом анионов ортофосфорной кислоты в почвенном растворе, возникающих в силу химической природы фосфорных соединений. Именно поэтому усвояемость сельскохозяйственными культурами фосфора из удобрений не превышает 25%, а подавляющее его количество фиксируется почвой, превращаясь в труднодоступные для растений соединения [Минеев, Дебрецени, Мазур, 1993, c. 415]. Улучшить минеральное питание можно путем применения двойной инокуляции растений азотфиксирующими и фосфатмобилизующими организмами, что позволит более эффективно использовать почвенные элементы питания и сократить дозы внесения минеральных удобрений [Муромцев, Бутенко, Тихоненко, 1985, c. 29].

Значение микоризных грибов для растений заключается в улучшении водно-минерального питания и защите корневых систем от фитопатогенных организмов. При наличии микоризы растения более успешно развиваются, повышается их фитоценотический статус, снижается внутри- и межвидовая конкуренция и возрастает видовое богатство растительных сообществ. Для целого ряда филогенетических групп растений, например, для псилотовидных и орхидных, микориза считается необходимым условием существования [Комарницкий, Кудряшов,Уранов, 1975, c. 608].

Симбиотическое сожительство обеспечивает высшему растению и грибу взаимную пользу. Микоризные грибы получают от своего зеленого сожителя углеводы. Высший симбионт, в свою очередь, использует огромную всасывающую поверхность гриба для получения из почвы необходимой влаги и питательных веществ [Блэк, 1973,с.76]. Подсчитано, что поверхность соприкосновения клеток коры корня и гиф гриба в эктотрофной микоризе в 10 ? 14 раз больше, чем поверхность контакта с почвой клеток «голого» корня, а корневые волоски обеспечивают увеличение всасывающей поверхности корня лишь в 2 ?5 раз [Нетрусов, 2004,с.86].

По тому, как осуществляется контакт, различают три типа микориз: эктотрофную, эндотрофную и эктоэндотрофную.

1.Эктотрофная микориза или наружная микориза, характеризуется поверхностным обволакиванием корней мицелием, который образует вокруг корня грибной чехол, в виде параплектенхиматической оболочки покрывает корешки до конуса нарастания. Мицелий эктотрофной микоризы как правило, в ткани корня не проникает, но отдельные гифы внедряются между клетками коры корешка и разветвляются там, образуя тонкую изящную перепонку. Эктотрофная микориза характерна для многих деревьев (дуб, ель, сосна, берёза), кустарников (ива), некоторых кустарничков (дриада) и травянистых растений (гречиха живородящая) [Жученко, 2001, с. 480].

2. Эндотрофная или внутренняя микориза не имеет наружного чехла и характеризуется в основном внутренними признаками. У эндотрофной микоризы мицелий гриба распространяется внутри тканей корня, не выходя на его поверхность. Он сосредоточен в элементах коры, никогда не проникает в сосудистые пучки и в конус нарастания корня. В образовании микориза такого типа участвуют фикомицеты (роды Endogone, Pythium). У растений семейства орхидных гифы гриба из почвы проникают в семя, образуя клубки, перевариваемые затем клетками семени [Там же. С. 531].

3. Эктоэндотрофная, или смешанная микориза занимает промежуточное положение между эктотрофной и эндотрофной микоризами, отличается тем, что микоризный гриб распространяется по поверхности корня и проникает во внутренние ткани корневых окончаний. Эктоэндотрофная микориза широко представлена у большинства древесных пород, хотя для них она не является обязательной, появление ее зависит от экологических условий окружающей среды [Brede, 1998, с. 43].

Эндомикоризные грибы - облигатные симбионты, не растущие в культуре in vitro. В связи с этим изучение жизненного цикла грибов было всегда затруднено.

Элементы минерального питания из почвы поглощаются наружными гифами эндофита и транспортируются к внутренним грибным структурам, а оттуда попадают в растение. Благодаря многочисленным анастамозам, сеть из внешних гиф пронизывает почву на большие расстояния. В естественных растительных сообществах гифы ВАМ-грибов образуют связи между отдельными корнями одного вида растений и даже между корнями различных видов растений. Эти связи способствуют переносу элементов минерального питания между растениями. Благодаря наличию внешних гиф, микотрофные корни способны использовать значительно больший объем почвы.

Многие исследователи [Augй, 2001, с. 42] видят значение микоризообразующих грибов не только в простом увеличении поглощающей поверхности корня, но и в метаболических процессах, лежащих в основе обмена между грибом и клетками корня растений. Микоризные грибы, как гетеротрофные организмы, нуждаются в углеводах и, поселяясь в корнях растений, потребляют значительное количество растворимых сахаров, образующихся в листьях растения-хозяина. Вырабатывая физиологически активные вещества, микосимбионты увеличивают отток углеводов от растения-хозяина к грибу и увеличивают фотосинтез. Наблюдается усиление процесса дыхания у растений. Выделяющаяся при этом энергия используется на более активный синтез различных соединений (белков, углеводов). На активацию процессов анаболизма и катаболизма в тканях растений расходуется много минеральных соединений. Существуют два пути поглощения питательных минеральных веществ микоризными грибами: первый -метаболическая адсорбция из субстрата периферическими свободными гифами и транспорт во внутренние структуры ВАМ-грибов (арбускулы, везикулы и мицелий); второй путь - диффузия питательных веществ из почвенного раствора в гифы гриба за счет градиента концентраций. Микориза поглощает питательные вещества и воду из почвы с более высокой скоростью, чем обычные корни.

Накопившиеся в наружных гифах ВАМ-грибов фосфаты переводятся в полифосфаты и в таком виде транспортируются в гифы мицелия внутри корневых тканей растения. Полифосфаты локализуются в вакуолях по одной, реже по три гранулы. Гранулы присутствуют также в неразрушенных арбускулах. Цикл развития большинства эндофитов можно разделить на две фазы: биотрофную и сапротрофную. Биотрофная фаза связана с живым растением-хозяином, преимущественно, с его корневой системой. Сапротрофная фаза протекает в почве или на растительных остатках, где происходит формирование зигоспор, хламидоспор, спорокарпов, являющихся органами перенесения неблагоприятных условий внешней среды в отсутствие растений.

Развитие ВАМ можно разделить на три этапа: преинфекционные взаимодействия, формирование межклеточного мицелия, развитие внутриклеточной симбиотической структуры [Соколова, 1995, с. 13-15]. На первом этапе споры гриба прорастают в почве под действием растительных выделений и образуют специальные структуры прикрепления - апрессории. На втором этапе из апрессорий вовнутрь корня начинает расти инфекционная гифа, проникая через эпидермис в ткани кортекса, ветвится и образует мицелий. На третьем этапе в местах тесного контакта мицелия с клетками гифы проникают в растительные клетки, где образуются арбускулы - разветвленные впячивания сложной формы, содержащие гифу гриба, окруженную растительной плазмалеммой и клеточной стенкой. Арбускулы являются местами наиболее интенсивного обмена партнеров метаболитами, в частности передачи в растение минеральных элементов, поглощаемых грибом из почвы. Арбускулы существуют в течение нескольких дней, после лизируются хозяином, а взамен гифы в кортексе корня образуют новые арбускулы .

Первичное заражение у однолетних растений начинается в фазу 3-4 листьев, в дальнейшем количество эндофитов в корне возрастает, достигая максимума в период цветения и плодоношения, а затем интенсивность микоризной инфекции снижается. Проростки однолетних растений безмикоризны, что служит свидетельством того, что их инфицирование происходит из почвы [Немченкос. 348].

У многолетних растений в зимних условиях гриб сохраняется в тканях корня в форме гиф и многочисленных везикул. С возобновлением вегетации высшего растения сразу же возобновляется и рост эндофитного гриба в корнях. Гифы из перезимовавших участков корня постепенно внедряются во вновь формирующиеся ответвления корней. Но возможно также заражение микоризными грибами из почвы, где они сохраняются в виде хламидоспор и спорокарпов.

Наличие или отсутствие микориз, а также особенности их строения, зависят, преимущественно, от систематического положения растения-хозяина. Большинство папоротников и мохообразных микотрофны. У высших споровых растений не имеют микориз спорофиты плаунов и хвощей. Голосеменные все микотрофны. Среди покрытосеменных не имеют микориз осоковые, ситниковые, крестоцветные, маковые, гвоздичные, большинство гречишных и маревые. ВАМ-грибы также инфицируют деревья и кустарники: дуб, ясень, яблоню, лещину, жимолость и даже морские водоросли[Martennson, Rydberg, 1994, c. 13-19].

Везикулярно-арбускулярная микориза представляет собой наиболее распространенную форму консортивных связей высших растений с грибами. Ее образуют большинство культурных растений из хозяйственно важных семейств. Эндофиты обнаружены у таких культур, как пшеница, кукуруза, картофель, бобы, соя, томаты, чай, кофе, какао, сахарный тростник, каучуковое дерево. На территории нашей страны ВАМ представлена достаточно широко. Анализ микосимбиотических связей в растительном покрове ландшафтно-географических зон бывшего СССР и вертикальных поясов показывает, что в лесной и степной зонах, а также в большинстве высокогорных фитоценозов, микотрофные виды преобладают над немикотрофными. В тундрах и пустынях, в субнивальном поясе симбиотические связи высших растений с грибами заметно ослабевают[Там же. С. 16]. На морфологию корней везикулярно-арбускулярные микоризы влияют мало или совсем не влияют, но могут изменять их цвет. Микоризные корешки отличаются от не микоризных желтовато-бурой и зеленоватой окраской участков корня, где обычно развит эндофитный гриб.

Изучение эндомикоризы важно не только для выяснения фундаментальных вопросов эволюции, экологии растений, но и для решения практически значимых вопросов повышения продуктивности сельскохозяйственных растений, многие из которых (хлебные и кормовые злаки, бобовые, картофель и др.) образуют эндомикоризу. Поэтому в качестве перспективного способа повышения урожайности растений рассматривается разработка технологий, учитывающих наличие и специфику эндомикоризы у сельскохозяйственных растений [Рейвн, Эверт, Айкхорн, 1990, c. 348].

Штаммы АМГ уже давно изучаются и используются в сельском хозяйстве многих стран, особенно с теплым климатом (Америка, Турция, Индия, Кения и многие другие), тем самым заменяя традиционные удобрения. Однако, в отличие от многих грибов, участвующих в других типах микориз, АМГ не могут быть выращенными в культурах в отсутствие корней растений, что представляет огромные трудности по изучению их роста, развития и влияния на растения. В США на базе университета Западной Вирджинии даже существует Международная коллекция штаммов ВАМ-грибов (INVAM). Там проделывается колоссальная работа по выращиванию этих очень привередливых и нужных штаммов микроорганизмов [INVAM].

1.2 Последствия влияние засухи на сельскохозяйственные растения

Засуха характеризуется комплексом неблагоприятных условий, приводящих к глубокому дефициту воды в почве и в растении [ Третьяков С. 243-244]. Угнетающее действие засухи происходит из-за несоответствия потребности растения во влаге и поступлении её из почвы.

Среди экстремальных природных явлений засухи проявляются наиболее неблагоприятным воздействием на сельское хозяйство в большинстве земледельческихрайонов Российской Федерации. Так, в наиболее жестокую засуху 2010 года гибель посевов наблюдалась на площади 13,3 млн га, в менее интенсивную засуху 2012 г. погибло 5,5 млн га [Страшная, Максименкова, 2011, с. 194-214].

Засуха - это длительный бездождливый пери-од, сопровождаемый снижением относительной влажности воз-духа, влажности почвы и повышением температуры, когда не обеспечиваются нормальные потребности растений в воде. Наибольший вред засуха при-чиняет в весеннее и летнее время, когда идет формирование генеративных органов растений. В отдельные годы урожайность сельскохозяйственных культур, пострадавших от засухи, снижа-ется до минимальных величин (у зерновых до 0,3 - 0,4 т/га) [Володько, 1983, с.12].

Засухоустойчивость - способность растений переносить дли-тельные засушливые периоды, значительный водный дефицит, обезвоживание клеток, тканей и органов. При этом ущерб уро-жая зависит от продолжительности засухи и ее напряженности. Засухо-устойчивость обусловлена генетически определенной приспособ-ленностью растений к условиям места обитания, а также адапта-цией к недостатку воды. Засухоустойчивость выражается в спо-собности растений переносить значительное обезвоживание за счет развития высокого водного потенциала тканей при функци-ональной сохранности клеточных структур, а также за счет адап-тивных морфологических особенностей стебля, листьев, генера-тивных органов, повышающих их выносливость, толерантность к действию длительной засухи [Прокофьев, 1978, с. 3-6].

Для агронома особенно важно знание признаков и свойств, определяющих устойчивость к засухе растений - мезофитов. Многие физиологические факторы, механизмы устойчивости растений к засухе, характерные для ксерофитов, в той или иной степени представлены у растений-мезофитов. К мезофитам относятся основные виды злаковых и бобовых трав, зерновые и зернобобовые культуры, корне- и клубнеплоды, масличные и прядильные культуры, возделывае-мые в России. Мезофиты произрастают в условиях достаточного увлажнения. Осмотическое давление клеточного сока у них 1 - 1,5 тыс. кПа [Горышина, 1979, с.47-53].

Почвенная засуха прежде всего приводит к потере воды растением, обезвоживанию клеток, что сопровождается нарушением водного режима /88/, образованием водного дефицита. В засуху снижается подвижность и скорость обновления воды всех ярусов листьев [Уланова Е с. 304 с.].

Структура воды в живой клетке подвергается непрерывным изменениям, обусловленным реакциями метаболизма [Удовенко С. 3-4..].О состоянии воды в клетке судят обычно, разделяя её на две фазы при помощи различных водоотнимающих факторов. Отнятая вода условно называется свободной, менее структурированной, более подвижной. Оставшаяся вода - связанной, более упорядоченной, прочно удерживаемой, более структурированной, менее подвижной [Удовенко.]. На выход воды из клеток влияет не только состояние воды в них и мощность водоотнимающего фактора, но и состояние (водопроницаемость) клеточных мембран [Гусев С. 78-89.].

А. М. Алексеевым [Алексеев 355 с.] в качестве показателя напряжения водного режима, способного достаточно хорошо характеризовать состояние воды в растениях, была предложена активность воды. Под активностью понимается способность вещества участвовать в химических реакциях, поверхностных явлениях, фазовых переходах, механических перемещениях.

Поскольку молекулы связанной воды имеют пониженную подвижность, их механическое перемещение затруднено, она менее интенсивно участвует в химических реакциях, является худшим растворителем, чем свободная вода. Следовательно, при равных прочих условиях связанная вода обладает меньшей активностью, чем свободная [Гусев С. 78-89.].

Различием свойств свободной и связанной воды определяется разное физиологическое значение этих водных фаз. Повышенное содержание свободной воды способствует интенсификации физиологических процессов, а связанной - повышению устойчивости к неблагоприятным факторам среды /150/. Увеличение содержания свободной воды связано с усилением процессов роста, обмена веществ, дыхания и тем самым ведёт к повышению продуктивности растений в оптимальных условиях существования. Однако наличие большого количества свободной воды в растении может способствовать при засухе более сильному обезвоживанию, так как свободная вода испаряется легче, чем связанная [Гусев С. 78-89.].

Потеря воды тканями вызывает глубокие изменения физико-химических свойств протоплазмы [Давид 211 с..], что проявляется в увеличении проницаемости её мембран, и в первую очередь плазмалеммы. Об увеличении проницаемости протоплазмы под влиянием обезвоживания даёт представление электропроводность водной вытяжки исследуемого объекта. Степень изменения проницаемости плазмалеммы (этот показатель можно назвать и "прочность клеточных структур") при обезвоживании также является критерием оценки устойчивости растений к засухе [Удовенко С. 3-4..]. Увеличение количества веществ, выделяющихся из клеток вследствие экзосмоса, является признаком слабой устойчивости организма к действию неблагоприятных факторов среды [Алпатьев 248 с. ].

Физиологические функции растительного организма тесно связаны с его морфологическими и анатомическими признаками. Характер функционирования каталитических систем, которыми располагает живая клетка, зависит от состояния морфологических структур. Вместе с тем, процессы, осуществляющиеся при участии этих систем, и природа возникающих в ходе этих процессов метаболитов непосредственно воздействуют на состояние самих структур [Сатарова . С. 28-69. ].

Обезвоживание тканей, возникающее во время засухи, изменяет ход физиолого-биохимических процессов, что в свою очередь отражается на ростовых процессах, анатомии и морфологии растения. Даже кратковременное обезвоживание уменьшает интенсивность роста растений. При этом у злаков сокращается- длительность процесса кущения, уменьшаются размеры колоса, длина листьев и междоузлий [Cooper M P. 965-984.].

Торможение ростовых процессов, уменьшение размеров вегетативных органов и прежде всего листьев является одним из первых и важнейших проявлений засухи. Кроме того, засуха ускоряет процесс старения и отмирания листьев, сокращает вегетационный период растений [Алпатьев 248 с. ].

Преждевременное пожелтение и отмирание нижних листьев или даже только падение тургора указывает на недостаточность водоснабжения растений. Недостаток воды в почве влияет на рост очередных листьев, особенно на рост листьев верхних ярусов, когда дефицит влаги в почве часто особенно велик.

Водный дефицит и завядание в разной мере влияют на физио-логическую деятельность растения в зависимости от длительнос-ти обезвоживания и вида растения. Последствия водного дефи-цита при засухах многообразны. В клетках снижается содержание свободной воды, возрастает концентрация и снижается рН вакуолярного сока, что влияет на гидратированность белков цито-плазмы и активность ферментов. Изменяются степень дисперс-ности и адсорбирующая способность цитоплазмы, ее вязкость. Резко возрастают проницаемость мембран и выход ионов из клеток, в том числе из листьев и корней (экзоосмос); эти клетки теряют способность к поглощению питательных веществ[Martennson, Rydberg, 1994, c. 13-19].

При длительном завядании снижается активность ферментов, катализирующих процессы синтеза, и повышается ферментов, катализирующих гидролитические процессы, в частности распад (протеолиз) белков на аминокислоты и далее до аммиака, полисахаридов (крахмала на сахара и др.), а также других биополиме-ров. Многие образующиеся продукты, накапливаясь, отравляют организм растения. Нарушается аппарат белкового синтеза. При возрастании водного дефицита, длительной засухе нарушается нуклеиновый обмен, приостанавливается синтез и усиливается распад ДНК. В листьях снижается синтез и усиливается распад всех видов РНК, полисомы распадаются на рибосомы и субъеди-ницы. Прекращение митоза, усиление распада белков при про-грессирующем обезвоживании приводят к гибели растения [Прокофьев, 1978, с. 3-6].

Засуха во все фазы развития приводит к нарушению или перестройке физиолого-биохимических процессов, что в конечном итоге сказывается на продуктивности. Однако наиболее уязвимо растение к действию засухи в ювенильном возрасте, в период появления и начала развития всходов, когда в молодом организме весьма интенсивно идут ростовые процессы и все обусловливающие их синтетические реакции, так как стресс прежде всего повреждает те звенья метаболизма, которые связаны с активизацией роста. Таким же уязвимым является и период формирования генеративных органов [Cooper M P. 965-984.].

Засуха приводит к адаптивным изменениям гормональной системы регуляции растений. Содержание гормонов - активато-ров роста и стимуляторов роста фенольной природы уменьшает-ся, а абсцизовой кислоты и этилена возрастает. Все это обеспе-чивает остановку ростовых процессов, а следовательно, выжива-ние растений в жестких условиях засухи. В первый период засухи стремительно возрастает содержание АБК в листьях, обеспечи-вающей закрывание устьиц, уменьшение потери воды через транспирацию [Уоринг, Филлипс, 1984, с. 15-21].

При развитии засухи АБК, активируя синтез пролина, способ-ствует запасанию гидратной воды в клетке, тормозит синтез РНК и белков, накапливаясь в корнях, задерживает синтез цитокинина, способствует переводу обмена веществ клеток в режим покоя. В условиях водного дефицита отмечаются увеличение биосинтеза и выделения этилена, у многих растений накаплива-ются ингибиторы роста фенольной природы (хлорогеновая кис-лота, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты). Снижение содер-жания ИУК происходит вслед за остановкой роста [Там же, с. 14-16].

Недавние исследования показали, что другие организмы и экосистемы могут также попасть под влияние засухи. Практически все исследованные таксоны растений, имеют хорошо образованный симбиоз с большим разнообразием микроорганизмов [Brundrett, 2009, c. 37-77]. Некоторые из них могут быть нейтральным или патогенным для их хозяев [de Bary, 1879, c. 301-309], в то время как другие, как известно, могут стимулировать рост растений и повысить устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессам [Bent, 2006, c. 225-258]. Перемена условий окружающей среды, скорее всего, могут вызвать изменения в физиологии растений и экссудацию корней. А именно изменения концентрации хемоаттрактантов или соединения сигналов, а также наличие питательных веществ [Haase, Neumann, Kania, Kuzyakov, Kandeler, 2007, c. 2208-2221]. Это приведет к изменению в составе, численности или деятельности растительных и микробных сообществ. [Drigo, Kowalchuk, van Veen, 2008, c. 667-679]. Микоризы и эндофиты а также PGPB могут применяться в качестве агентов биологических биоудобрений и фитостимуляторов в сельском хозяйстве [Lugtenberg, Kamilova, 2009, c. 541-556].

Эндофитные грибы придают конкурентное преимущество их растения-хозяина путем повышения устойчивость к экологическим стрессам [Clay, Holah, 1999, c. 1742-1744].

Ряд исследований показали, что AMГ может повысить
засухоустойчивость растений [Aug'e, 2001, c. 3-42]. Этот положительный эффект был отмечен у различных видов растений и, как сообщается,
это введет к увеличению биомассы и урожайности сельскохозяйственных культур [Al-Karaki, McMichael, Zak, 2004, c. 263-269]. Симбиоз между некоторыми штаммами AMГ и растений могут уменьшить тяжелые последствия ограниченности воды. Кроме того, некоторые AM может противостоять засухи лучше, чем другие. Таким образом, применение микоризы может быть перспективным для производительности продуктов питания под условия засухи.

1.3 Ростстимулирующие бактерий и их влияние на продуктивность и устойчивость растений

Сложные организмы, к которым относятся не только животные, но и высшие растения, существуют в природе в виде многоорганизменных сообществ, что достигается обильной колонизацией макроорганизма-хозяина бактериями, грибами, вирусами и в некоторых случаях археями. Что касается растений, их здоровье и продуктивность во многом зависят от того, какие микробы и в каком количестве колонизируют поверхность и внутренние компартменты растения [Антонюк C. 6].

Жизненный цикл растений осуществляется в тесном контакте с микроорганизмами. Бактерии, в свою очередь, развили ряд стратегий, позволяющих им использовать растения как своеобразную экологическую нишу. Эти взаимоотношения в одних случаях формируются по типу антагонизма, в других - мы наблюдаем взаимовыгодное симбиотическое сосуществование, позволяющее им выжить в среде обитания [Игнатов 262 с].

Патогенетические взаимоотношения с растениями формируют вироиды, вирусы, бактерии и грибы. Описано около 11 тыс. заболеваний растений, вызванных 120 видами грибов, 30 типами вирусов и 80 родами бактерий.

В зоне прямого влияния растений, прилегающей к корням почве обитают ассоциативные микрорганизмы, формирующие на корнях растений сложные по таксономическому составу и структурно-функциональной организации сообщества, которые оказывают на растения полифункциональное воздействие [Бухарин 264 с.]. Изучение ассоциативных бактерий началось в 70-х годах прошлого столетия, когда было впервые установлено, что некоторые бактерии в растительно-микробных ассоциациях способны стимулировать рост и развитие растений. Это дало возможность для использования ассоциативных ризобактерий для разработки на их основе биопрепаратов и использования в сельском хозяйстве. В настоящее время спектр бактерий, оказывающих положительное влияние на растения, расширяется благодаря активным исследованиям в этой области. Но вопрос о взаимоотношениях бактерий и растений растительно-микробных ассоциациях требует фундаментального изучения.

Растительно-бактериальные ассоциации подразделяют на трофический тип, обеспечивающий питание растений, и защитный, способствующий устойчивости растений к фитопатогенным микробам и фитофагам [Проворов С. 521-525.]. При трофической ассоциации главную роль играют бактерии родов Azospirillum, Flavobacterium, Enterobacter. При защитном симбиозе ассоциантами являются Pseudomonas fluorescens, P. chloraphis, P. putida, Serratia marcestens, Bacillus subtilis [Шапошников С. 16-22.].

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn, широко используются в микробиологической и медицинской промышленности как продуценты ферментных препаратов, антибиотиков и пробиотиков. В сельскохозяйственном производстве их применение ограничивалось лишь в качестве основы инсектицидных препаратов. В последнее время, в связи с насущной проблемой перехода к биологическому земледелию, интенсивно разрабатываются методы биологической защиты растений от болезней и соответствующие биопрепараты, призванные минимизировать применение химических пестицидов. Бактерии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. Бактерии синтезируют цианистый водород, который лизирует часть клеточных стенок многих патогенных
грибов [Frankowski, Lorito, 2001, с. 421 - 426]. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бацилл-антагонистов.

Bacillus subtilis ? грамположительная спорообразующая аэробная почвенная бактерия широко распространена в природе, благодаря способности образовывать эндоспоры и переносить неблагоприятные условия окружающей среды в течение продолжительного периода. Первоначально были описаны в 1835 Эренбергом как Vibrio subtilis, в 1872 были переименованы Коном в Bacillus subtilis. Название «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры этого микроорганизма получают из сенного экстракта. Является продуцентом некоторых полипептидных антибиотиков, а также ферментов (амилазы, протеазы), получаемых промышленно. Сенная палочка (Bacillus subtilis) широко распространена в природе, имеет палочковидную форму. В присутствии кислорода образует споры, что позволяет ей длительный период сохраняться во внешней среде. Высокая биологическая активность является ее отличительной особенностью. Согласно данным литературных источников, сенная палочка имеет высокую изменчивость, что затрудняет ее идентификацию по культуральным свойствам. Так, у B. subtilis отмечается до 10 типов колоний при выращивании на различных агаризированных средах [Красилышков, 1952, с. 48].

Бактерии Bacillus способны к синтезу широкого спектра антибиотических соединений и гидролитических ферментов [P.Nielsen, J.Sorensen, 1997, c. 183-192]. Могут осуществлять прямую стимуляцию роста растений за счет индукции резистентности к фитопатогенам, снижения уровня этилена, синтеза регуляторов роста. Ризобактерии улучшают фосфорное питание растений посредством гидролиза органических фосфатов под действием фосфатаз, а так же способствует фиксации атмосферного азота диазотрофами.

Показан положительный эффект бактериальных ауксинов на инициацию и удлинение корней, развитие боковых корней и корневых волосков, что может иметь значение для ускоренного роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам [Bais H. P P. 233-266.]. Стресс у растений сопровождается активацией биосинтеза АЦК и этилена. Аминокислота АЦК служит непосредственным предшественником при биосинтезе фитогормона этилена. Этилен вовлечен во многие звенья процессов роста и развития растений, включая прорастание семян, инициацию и удлинение тканей и органов, цветение, созревание плодов, старение тканей и реакции на стрессовые факторы. В стрессовых реакциях этилен выступает как негативный регулятор ростовых процессов [Белимов С. 23-28.]. Бактерии повышают адаптацию растений к стрессу, вызванному дефицитом влаги в почве, стимулируя рост корней и увеличивая доступ к дополнительным ресурсам находящейся в почве влаги. В этих условиях АЦК-утилизирующие бактерии способны стимулировать рост корней за счет регуляции уровня этилена. Концентрация гормона абсцизовой кислоты при этом остается высокой, что ограничивает потери воды листьями за счет транспирации [Белимов А. А 2009. 320 с.].

Внедрение штаммов эндофитных бактерий во внутренние структуры семян рассматривают как перспективный способ расширения физиологических возможностей семян. В литературе данный метод биологической обработки семян получил название биопрайминга.

В последнее десятилетие отмечается устойчивый рост применения биопрепаратов в растениеводстве в России, производственные испытания которых подтверждают их высокую экономическую эффективность. К преимуществам микробиологических препаратов в отличие от химических можно отнести безопасность использования, снижение химической нагрузки на агроценоз и ландшафт прилегающих территорий, восстановление нормальной структуры микробиоценоза обрабатываемых почв.

В связи с этим другим перспективным способом применения эндофитных бактерий растений могут стать микробиологические препараты для сельского хозяйства, поэтому их разработка и применение является весьма актуальной и своевременной [Meyer P. 188-205.].

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1 Объект и предмет исследования

В качестве объекта исследования была выбраны сельскохозяйственные культуры: горох ((Pisum sativum L.), сорта Чишминская-99) , кукуруза ((Zea mays L.), сорта РИК-340).

Предметом исследования служила арбускулярная микориза растений и влияние засухи.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика посадки семян

Для посадки были отобраны крупные ровные семена (по 3 г. семян пшеницы). После отбора и предварительной обработки бактериями производили посев семян в почву. Для эксперимента использована черноземная почва (верхний гумусовый слой) Стерлитамакского района. Поливали почву дистиллированной водой, и накрывали полиэтиленом до наклевывания. На 3-й день, когда семена наклюнулись, убирали пленку. Выращивали в течение 60 дней.

2.2.2 Обработка семян бактериями Bacillus subtilis

Обработку семян бактериями проводили в стерильных условиях (в ламинар-боксе). Готовый препарат бактерий B. subtilis 26Д 109 кл/мл разводили в растворе KCl (0,01%) до концентрации 106 кл/мл. Семена обрабатывали раствором бацилл из расчета на 1г семян 20 мкл клеток бактерий, выдерживались в течение часа, затем производили посадку семян в почву.

Штаммы B.subtilis 26Д (ВНИИСХМ №128) и 11ВМ (ВНИИСХМ №519) предоставлены сотрудниками Башкирского государственного аграрного университета г. Уфа. Разведением в стерильном 0,9%-ном растворе NaCl получали культуры с такой концентрацией, чтобы в сосудах с водорослями число клеток бацилл составляло 10⁶ в 1 см³ .

2.2.3 Условия произрастания растений в условиях засухи

Почвенную засуху имитировали следующим способом. После посева семян почву во всех сосудах поливали дистиллированной водой до влажности 70% от полной полевой влагоемкости, которую определяли расчетным методом [ГОСТ Р 53764-2009 (ИСО 11461:2001). Качество почвы. Определение содержания почвенной влаги в виде объемной доли с применением трубок для отбора пробы грунта. Гравиметрический метод, 2010].

После появления всходов контрольными растениями служили те, которые поливались из расчета создания 70% влажности почвы. Опытные растения (имитация засухи) выращивались в сосудах, в которых влажность почвы поддерживалась на расчетном уровне 30%. Полив проводили через каждые три дня (или по мере начала визуального завядания листьев). Растения выращивали на светоплощадке с фотопериодом 16 ч, при температуре воздуха 22-25оС.

2.2.4 Методика сбора образцов

Через 60 дней извлекали растения из земли аккуратно, не повреждая корней и листьев, промывали в проточной воде. На весах определяли массу побегов. Корни отмывали, окрашивали и анализировали на наличие микоризы.

2.2.5 Методика окрашивания корней

Окрашивание корней производилось по следующему методу [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson, 1986, с. 217-221]:

1. Отбирали корни 10-20 шт. с одного образца.

2. Промывали под проточной водой (при помощи сита), помещали в марлевые мешочки.

3. Раствор 10% КОН доводили до кипения, выключали плитку, помещали марлевые мешочки с образцами в этот раствор на 10 мин. Покоричневение раствора свидетельствовало о процессе очистки.

4. Промывали водой 4-5 раз.

5. Большинство гистологических красителей являются кислыми, поэтому подкисляли корни 2% НСl в течение 15-20 мин.

6. Готовили краситель трепановый синий и добавляли в приготовленный раствор (вода, глицерин, молочная кислота в соотношении 1:1:1 по объему). Нагревали его до кипения, выключали плитку, помещали образцы на 3-4 мин.

7. Промыли 4-5 раз водой. Краситель используется несколько раз.

8. Образцы хранили при температуре 4°С в воде.

2.2.6 Методика оценки колонизации арбускулярной микоризы растения

Окрашенные корни помещали в чашку Петри и рассматривали корни под микроскопом.

Оценку колонизации микоризы и распространенности арбускул проводили согласно [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson, 1986, с. 220].

1. Из образца корней на 2 предметных стекла вырезали по 15 фрагментов корней в 1 см. длиной.

2. Эти фрагменты рассматривали под микроскопом, и оценивали колонизацию микоризы по рис. 1

3. Результаты записывались в «Шахматку» расчета (рис. 2):

4. Далее вычисляли при помощи компьютерной программы "Mycocalc" следующие параметры: F%, M%, m%, A%, a% , согласно Trouvelot. 1986 год.

F% - Частота микоризы в корневой системе

F% = (NB фрагментов мико / общая NB) ? 100

M% - Интенсивность колонизации микоризы в корневой системе

M% = (95n5 70 N4 30 n3 5 n2 + n1) / (NB общее)

где N5 = число фрагментов оценили 5; N4 = число фрагментов 4 т.д.

m% - Интенсивность колонизации микоризы в корневом фрагменте

m% = M ? (NB общее) / (NB мико)

а% - Изобилие арбускул в микоризованной части корневого фрагмента

а% = (100mA3 50 mA2 10 mA1) / 100

где mA3, mA2, которые mA1% м, номинальная A3, A2, A1, соответственно, с mA3 = ((95n5A3 70 n4A3 30 n3A3 5 n2A3 + n1A3) / NB мико) ? 100 / м и тот же для А2 и A1.

А% - Изобилие арбускул в корневой системе

А% = а (M/100)

V% - Изобилие везикул в корневой системе

V% = а (M/100)

V% - Изобилие везикул в микоризованной части корневого фрагмента

V% = (100mA3 50 mA2 10 mA1) / 100



Рис. 2.1. Оценка колонизации микоризы и распространенности арбускул согласно [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson,1986, с. 217-221].

Рис.2.2 Шахматка расчета по методике [Там же. С. 220].

2.3 Статистическая обработка результатов

Эксперимент проводили три раза, в трех биологических повторностях. Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с использованием Microsoft Excel. Для определения зависимости биологических показателей между собой и от влияния почвенной засухи и бактерий использовали многофакторный дисперсионный анализ. В таблицах приведены средние значения и их стандартные отклонения.

Глава 3. Результаты и обсуждение влияние почвенной засухи и бактерий bacillus subtilis на рост и микоризацию корней растений

3.1 Влияние засухи и бактерий Bacillus subtilis на морфометрические показатели растений

В проведенных исследований были получены следующие результаты. Длина побегов у необработанных растений гороха (растущих при влажности почвы 70%) составляла 40,81 см. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д и 11 ВМ длина побегов уменьшалась на 6% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл.1), (рис 3.1.1.).

Рис 3.1.1. Длина побегов растений гороха при разной влагоемкости почвы

Длина побегов гороха (выросшей в условиях почвенной засухи) уменьшалась на 50%. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д и выросших в условиях засухи длина уменьшалась …… по отношению к собственному контролю , но увеличивалась примерно на 27%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 8% по сравнению с необработанными растениями, выросшими при засухе (рис 3.1.1.).

Таблица 1.

Морфометрические показатели растений

Вариант	Pisum sativum L	Zea mays L.
	70%	30%	70%	30%
Длина побегов, см
Контроль	40,81±0,9	20,11±1,14	44,26±2,07	26,16±1,25
B. subtilis 26Д	38,35±1,22	25,53±0,9	45,08±1,15	26,02±1,2
B. subtilis 11 ВМ	38,39±1,35	21,79±0,78	43±0,78	28,48±1,79
Масса побегов* , г
Контроль	0,95±0,06	0,55±0,03	1,4±0,1	0,70±0,03
B. subtilis 26Д	0,83±0,05	0,64±0,02	1,38±0,05	0,69±0,02
B. subtilis 11 ВМ	0,92±0,09	0,54±0,03	1,28±0,07	0,79±0,09
Масса корней* , г
Контроль	0,38±0,03	0,31±0,01	0,91±0,03	0,98±0,02
B. subtilis 26Д	0,35±0,04	0,36±0,03	0,98±0,02	1,40±0,09
B. subtilis 11 ВМ	0,37±0,01	0,36±0,02	0,94±0,04	1,46±0,07

*Примечание - данные суммы 100 растений.

Различия показателей при разной степени влажности почвы достоверны при p 0,05

У необработанных растений кукурузы длина побегов (растущих при влажности почвы 70%) составляла 20,14 см. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д на 2%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ уменьшалась на 3% по сравнению с контрольными растениями, необработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл.1), (рис 3.1.2.).



Рис 3.1.2. Длина побегов растений кукурузы при разной влагоемкости почвы

Длина побегов кукурузы (выросшей в условиях почвенной засухи) уменьшалась на 41%. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д длина побегов уменьшалась примерно на 1%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ увеличивалось - 9% по отношению к собственному контролю (рис 3.1.2.).

У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса уменьшалась на 13%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 3% (рис 3.1.3).