Функціональні зв’язки КоА-синтази із компонентами сигнальних шляхів клітини?
Проведення біоінформатичного аналізу та з’ясування можливостей існування додаткових ізоформ коа-синтази, мотивів, що відповідають за взаємодію із сигнальними білками, та потенційних сайтів фосфорилування в молекулі. Координована регуляція метаболізму.
Рубрика | Биология и естествознание |
Вид | автореферат |
Язык | украинский |
Дата добавления | 26.09.2015 |
Размер файла | 70,2 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національна академія наук України
Інститут молекулярної біології та генетики
УДК 577.218 577.217
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
Функціональні зв'язки КоА-синтази із компонентами сигнальних шляхів клітини
03.00.03 - молекулярна бiологiя
Бреус Оксана Сергіївна
Київ - 2009
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі сигнальних шляхів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Філоненко Валерій Вікторович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу сигнальних шляхів клітини.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Матишевська Ольга Павлівна, Київcький національний університет імені Tapaca Шевченкa, професор кафедри біохімії;
доктор біологічних наук, профессор Негруцький Борис Сергійович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації. біоінформатичний метаболізм молекула
Захист відбудеться “22” грудня 2009 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.
Автореферат розіслано _20_ листопада 2009 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В.Підпала
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Існування багатоклітинного організму не можливе без координованої регуляції метаболізму, росту, загибелі та диференціації клітин що входять до його складу. Таку функцію на молекулярному рівні виконують сигнальні системи клітини. Найкраще вивченими на сьогодні є механізми передачі сигналів від позаклітинних стимулів, які сприймаються рецепторами цитоплазматичної мембрани та передаються до білків ефекторів шляхом ініціації каскадів білково-білкових взаємодій та посттрансляційних модифікацій сигнальних молекул. Тим не менш, регуляція фізіології клітини у відповідь на екзогенні стимули залежить від їхньої інтеграції із внутрішньоклітинними сигналами, що надають інформацію щодо метаболічного стану та енергетичного статусу (Lee et al., 2007; Vander Heiden et al., 2009).
Розуміння молекулярних механізмів здійснення такої інтеграції залишається фрагментарним, адже вивчення метаболічних процесів та механізмів сприйняття і передачі сигналів довгий час досліджували відокремлено. Згідно класичних уявлень, метаболічні процеси та ферменти є ефекторами, що сприймають та виконують команди регуляторних систем клітини, підтримуючи необхідний баланс фізіологічних процесів. Нещодавні дослідження молекулярних основ виникнення метаболічних розладів, нейродегенеративних захворювань та канцерогенезу продемонстрували невідповідність такої моделі реальності.
З'ясувалось, що низка метаболічних ферментів, метаболітів та кофакторів безпосередньо залучені до регуляції транскрипції генів (Zheng et al., 2003; Takahashi et al., 2006), поділу та виживання клітин (Afshar et al., 2001; Christofk et al., 2008), передачі сигналів (Swinnen et al., 2006; Resh, 2008) та ін. Окрім того, певні фізіологічні процеси, наприклад поділ клітини, супроводжуються кардинальними змінами метаболічного стану (DeBerardinis et al., 2008). Найвідомішим прикладом таких змін метаболізму є характерний для клітин, що проліферують, але спершу описаний для ракових клітин ефект Варбурга, або окисний гліколіз.
Несподіваним виявився той факт, що зміна рівня експресії або експресія альтернативних ізоформ певних метаболічних ферментів може впливати не тільки на метаболічний стан, але і на регуляторні системи, зокрема сигнальні шляхи, та, таким чином, переводити клітину в інший фізіологічний стан. Найяскравішими прикладами такого впливу є ферменти ліпогенезу de novo, зокрема синтаза жирних кислот (Swinnen et al., 2006) та М2 ізоформа піруват кінази (Christofk et al., 2008).
Зазначені відкриття продемонстрували тісний взаємозв'язок метаболізму та регуляторних процесів і визначили необхідність подальших досліджень механізмів їхньої інтеграції для розуміння фізіологічних процесів, що відбуваються в нормі та при патології на рівні клітини та організму в цілому.
Кофермент А (КоА) є універсальним переносником активованих ацил- радикалів у клітинах живих організмів, що зумовлює ключову роль цієї молекули в ліпідно-вуглеводному та енергетичному обміні. Окрім того, КоА залучений до процесів ацилюванння білків, та таким чином до регуляції активності та/або субклітинної локалізації компонентів сигнальних шляхів, транскрипційних факторів, іонних каналів та ін. (Leonardi et al., 2005). Молекулярні механізми регуляції біосинтезу КоА залишаються недостатньо дослідженими, значною мірою внаслідок того, що для вищих еукаріот ферменти, які здійснюють цей біосинтез, та їхні гени було ідентифіковано тільки нещодавно. Коензим А-синтаза (КоА-синтаза, фосфопантетеїн-аденелілтрансфераза EC 2.7.7.3/ дефосфо-КоА-кіназа EC 2.7.1.24) є біфункціональним ферментом, що здійснює дві останні із п'яти реакцій de novo біосинтезу КоА із пантотенату. Ген КоА-синтази ссавців було ідентифіковано декілька років тому трьома незалежними групами дослідників із застосуванням різних підходів (Daugherty et al., 2002; Zhyvolup et al, 2002; Aghajanian et al., 2002). При цьому в одному із трьох випадків ген КоА-синтази було ідентифіковано методом двогібирдного дріжджового скринінгу як білковий партнер кінази S6 рібосомного білка (S6K). Існування комплексу між КоА-синтазою та S6K було підтверджено також у клітинах ссавців (Nemazanyy et al., 2004). Оскільки фосфопантетеїн-аденелілтрансферазна (ФПАТ) активність КоА-синтази здатна обмежувати швидкість біосинтетичного шляху КоА, КоА-синтаза є ймовірним пунктом його регуляції.
Отже, беручи до уваги важливу роль коферменту А в метаболічних та регуляторних процесах у клітині, недостатню вивченість регуляції його біосинтезу, той факт, що біохімічні властивості КоА-синтази вказують на неї як на фермент на рівні якого здійснюється регуляція даного шляху, та існування взаємодії цього ферменту із сигнальним білком S6K, актуальним є подальше дослідження функціональних зв'язків КоА-синтази із компонентами сигнальних шляхів клітини.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу сигнальних систем клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ і виконувалась в рамках бюджетної теми №2.2.4.10 - «Дослідження структурно-функціональної організації РІ3-кіназного сигнального шляху та пухлино-асоційованих антигенів» (номер державної реєстрації - 0105U005342, 2006-2010 рр.) а також у рамках співробітництва із відділом структурної та молекулярної біології Лондонського університетського коледжу (Велика Британія).
Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи було ідентифікувати функціональні зв'язки між ферментом КоА-синтазою та компонентами сигнальних шляхів клітини. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
1. Провести біоінформатичний аналіз та з'ясувати можливість існування додаткових ізоформ КоА-синтази, мотивів, що відповідають за взаємодію із сигнальними білками, та потенційних сайтів фосфорилування в молекулі КоА-синтази.
2. Перевірити існування ідентифікованих за допомогою біоінформатичного аналізу ізоформ КоА-синтази в клітинах ссавців.
3. На основі даних біоінформатики експериментально ідентифікувати потенційні сигнальні білки-партнери КоА-синтази.
4. Перевірити існування виявлених взаємодій методом імунопреципітації білкових комплексів із екстрактів клітин та тканин із використанням відповідних антитіл.
5. Дослідити наявність фосфорилування КоА-синтази в клітинах ссавців.
6. Дослідити залежність активності сигнальних шляхів та фенотипу клітин в культурі in vitro від рівня експресії КоА-синтази.
Об'єкт дослідження - молекулярні механізми функціонування сигнальних систем клітини та їхній взаємозв'язок із метаболічними процесами.
Предмет дослідження - функціональні зв'язки між КоА-синтазою та шляхами передавання сигналів у клітинах ссавців.
Методи дослідження - біоінформатичний аналіз, афінна хроматографія, тимчасова та стабільна трансформація клітин ссавців кДНК конструкціями та кіРНК (коротка інтерференційна РНК), імунопреципітація білків та Вестерн-блот аналіз, конфокальна імунофлуоресцентна мікроскопія, субклітинне фракціонування, тест на здатність клітин до утворення колоній в напіврідкій агарозі та ін. Наукова новизна одержаних результатів. Ідентифіковано нову ізоформу КоА-синтази. Ідентифіковано сигнальні білки, що утворюють комплекси із КоА- синтазою в клітинах ссавців, - тирозин фосфатазу Shp2 та регуляторну субодиницю PI3K, p85б. Вперше показано, що фракція КоА-синтази у клітинах ссавців зазнає фосфорилування по тирозину, і таке фосфорилювання може впливати на її ФПАТ активність. Показано, що рівень експресії КоА-синтази впливає на активність PI3K-залежного сигнального шляху та активність тирозинових кіназ. Вперше продемонстровано, що рівень експресії КоА-синтази впливає на фенотипічні прояви злоякісної трансформації клітини, а саме незалежний від контактів із позаклітинним матриксом ріст та виживання за умов відсутності ростових факторів у культурі in vitro.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати дають можливість поглибити наші уявлення щодо механізмів, які лежать в основі інтеграції сигналів від позаклітинних стимулів із метаболічними процесами клітини, зокрема біогенезом коферменту А. Такі знання відкривають перспективу для розробки препаратів для корекції патологічних змін, які пов'язані із порушенням функціонування сигнальних систем клітини та метаболічних розладів. Матеріали дисертації можуть бути використані у спецкурсах з молекулярної біології та біохімії для студентів біологічних факультетів.
Особистий внесок здобувача. Всі дослідження виконувались за безпосередньої участі здобувача. Особисто здобувачем було виконано біоінформатичний аналіз амінокислотної послідовності КоА-синтази; експерименти із афінної хроматографії та ідентифікації нових потенційних білків партнерів КоА-синтази; експерименти із імунопреципітації білкових комплексів із екстрактів клітин та тканин; аналіз фосфорилування по тирозину КоА-синтази; вивчення впливу тирозин кіназ на фофорилування КоА-синтази; аналіз впливу тирозин фосфатази Shp2 на фосфорилування по тирозину КоА-синтази; експерименти із субклітинного фракціонування; створення стабільних клітинних ліній; експерименти із впливу рівня експресії КоА-синтази на активність PI3K-залежного сигнального шляху та тирозин кіназ; проведення експериментів із вивчення впливу рівня експресії КоА-синтази на незалежний від контактів із екстраклітинним матриксом ріст та життєздатність клітин.
Обробку і аналіз отриманих результатів виконано особисто пошукачем. Експерименти з ідентифікації нової ізоформи КоА-синтази виконано спільно із к.б.н. І.О. Немазаним та к.б.н Г.Г. Панасюк; біоінформатичний аналіз амінокислотної послідовності КоА-синтази виконували із к.б.н. І.О. Немазаним; експерименти із афінної хроматографії виконували разом із Г.Г Панасюк; дослідження фосфорилування по тирозину КоА-синтази тирозин кіназами в умовах in vitro та визначення впливу на ФПАТ активність КоА-синтази її дефосфорилування протеїн фосфатазою Shp2, виконували спільно із к.б.н. І.О. Немазаним; дослідження впливу КоА-синтази на поведінку клітин у культурі in vitro виконувались разом із к.б.н. Г.Г.Панасюк. Автор щиро вдячний к.б.н. Г.Г. Панасюк та к.б.н. І.О. Немазаному за допомогу в плануванні та проведенні експериментів, д.б.н., проф. В.В. Філоненку за керівництво, к. мед. н., с.н.с. І.Т. Гуту за корисні поради та обговорення отриманих результатів. Одержані результати обговорено та опубліковано в спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на Конференції молодих вчених присвяченої 185-й роковині Грегора Менделя, 2007, Інститут молекулярної біології та генетики НАНУ, (м.Київ); VI Парнасівській конференції (м.Краків, Польща, 2007); Міжнародній конференції Європейської Організації Молекулярної Біології “EMBO Meeting 2009” (м. Амстердам, Нідерланди), a також засіданнях відділу сигнальних шляхів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАНУ (м. Київ, 2007, 2009) та відділу структурної і молекулярної біології Лондонського університету (м. Лондон, Велика Британія, 2008).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 праць, з них 4 статті у фахових наукових журналах, та тези 7 доповідей у збірниках матеріалів з'їздів і конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 178 найменувань, додатків. Дисертацію викладено на 168 сторінках стандартного машинопису, вона містить 34 рисунки та 7 таблиць.
Основний зміст
Матеріали і методи дослідження. Біоінформатичний аналіз баз даних EST клонів на наявність ізоформ КоА-синтази проводили за допомогою програми ASAP (Lee et al., 2003). Амінокислотну послідовність КоА-синтази аналізували із використанням пакетів програм Scansite 2.0 (Obenauer et al., 2003) та GPS2.0 (Xue et al., 2008).
У роботі застосовували методи афінної хроматографії із використанням метало-афінного носія (Ni-NTA) або глутатіон сефарози. Афінні носії підготовлювали згідно рекомендацій компаній виробників. Після цього їх розділяли на необхідну кількість аліквот та додавали білки, що містили 6His- або GST- таг у кількості 1-2 мкг на зразок, інкубували 1-2 год із перемішуванням при 4оС. До афінного носія із іммобілізованими білками додавали білки взаємодію яких вивчали (0,5 - 1 мкг), або білкові екстракти тканин чи клітин (500-2000 мкг), та інкубували 12-16 год при 4оС із перемішуванням. Після цього зразки відмивали, елюювали із носія кип'ятінням у буфері Лемлі, розділяли методом електрофорезу за денатуруючих умов та аналізували методом Вестерн-блоту із використанням відповідних антитіл.
Імунопреципітацію білків здійснювали інкубуючи екстракти клітин із відповідними антитілами і протеїн-G, -(А) сефарозою (“Amersham”, Велика Британія). Імунні комплекси відмивали, елюювали кип'ятінням у буфері Лемлі та розділяли в ДСН-ПААГ методом електрофорезу. Білковий вміст імунних комплексів визначали методом Вестерн-блот аналізу.
При виконанні роботи використовували лінії клітин ембріональної нирки людини (НЕК293) та гепатокарциноми людини (HepG2). Клітини культивували в середовищі DMEM, яке містило 10 % ембріональної сироватки теляти, 2 мМ L-глутамін, 10 мкг/мл пеніциліну і 0,25 мкг/мл стрептоміцину.
Трансфекцію клітин HEK293 плазмідними ДНК здійснювали, використовуючи реагент ExGen500 (“Fermentas”, Литва), згідно з рекомендаціями виробника. Для транзієнтної експресії використовували дволанцюгову кільцеву супер-скручену плазмідну ДНК. У разі стабільної трансформації клітин плазмідну ДНК попередньо переводили в лінійну форму відповідною рестриктазою (у випадку плазмід на основі вектору pcDNA3.1 використовували рестриктазу Mun1).
Трансфекцію клітин HEK293 та HepG2 дволанцюговими РНК олігонуклеотидами (кіРНК) здійснювали реагентом “INTERFERin™ siRNA transfection reagent” (“PolyPlus Transfection”, Франція), згідно рекомендаціям виробника. Для трансфекції використовували кiРНК КоА синтази в кількостях 100, 200 або 400 pmol або контрольну РНК (scrambled) у відповідних концентраціях.
Для визначення здатності клітин утворювати колонії в напіврідкій агарозі в плашки заливали підтримуючий шар 1 % агарози шляхом розведення 4 % легкоплавкої агарози (“Gibco”, США) середовищем DMEM. Клітини рахували за допомогою гематоцитометру та додавали рівну кількість клітин кожного типу до 0,6 % агарози виготовленої із використанням DMEM та додавали поверх підтримуючого агаризованого шару. Плашки з клітинами культивували за стандартних умов. На 14-21 день колонії, що утворювались забарвлювали МТТ (3-(4,5-диметилтіазол-2-ил)-2,5-дифенілтетразоліум бромід) в концентрації 0,5 мг/мл та рахували. Для визначення життєздатності, порцію клітин в середовищі DMEM в співвідношенні 1:5 (v\v) ресуспендували в 0,4 % розчині трипанового синього (“Sigma”, США) в ЗФР буфері. Після 10 хв інкубації кількість живих та мертвих клітин у кожному із зразків оцінювали із використанням гемацитометру та інвертованого світлового мікроскопу.
Фосфопантетеїн-аденелілтрансферазну реакцію проводили згідно протоколу описаному в (Aghajanian et al., 2002). Кількість АТФ, що продукувалось внаслідок реакції, вимірювали за допомогою Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assay (“Promega”, США), згідно рекомендаціям виробника, із використанням люменометру Mithras LB 940 (“Berthold Technologies”, США).
Для імунофлуоресцентних досліджень використовували клітини NIH3T3, що були трансфіковані відповідними плазмідами. Клітини культивували 24 год та обробляли 100 nM MitoTracker Orange CMTMRos (Molecular Probes), після цього фіксували 4 % параформальдегідом, інкубували у розчині 0,2 % Triton X-100 та обробляли відповідними антитілами. Флуоресцентно мічені клітини аналізували за допомогою конфокального лазерного сканувального мікроскопу Zeiss LSM510 (“Zeiss”, Німеччина) та програми LSM510.
Збагачені фракції мітохондрій отримували згідно протоколу (Frezza et al., 2007), або із використанням Mitochondria Isolation Kit (“Pierce”, Франція).
Статистичний аналіз проводили за допомогою програми Statistica 6.0. Достовірність різниці між вибірками оцінювали із використанням критерію Стьюдента та Т-тесту для незалежних вибірок. За критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали Р = 0,05.
Результати досліджень та їх обговорення
Пошук сплайсових варіантів КоА-синтази ссавців із залученням біоінформатичних підходів та ідентифікація нової в ізоформи КоА-синтази. Аналіз баз даних EST клонів ASAP та NCBI за допомогою програми ASAP дозволив виявити нову ізоформу КоА-синтази, що була позначена як КоА-синтаза в. Аналіз мРНК, ізольованої із тканин щура методом ЗТ-ПЦР, із використанням праймерів специфічних щодо КоА-синтази в, показав присутність даної послідовності в деяких тканинах. Вестерн-блот аналіз білкових екстрактів тканин щура, із використанням антитіл до пептиду, що є специфічним для цієї ізоформи, підтвердив експресію КоА-синтази в в тканинах головного мозку щура.
Ідентифікована в даній роботі в ізоформа КоА-синтази відрізняється від вже відомої б ізоформи тільки наявністю подовження в 29 амінокислот, розташованого на N- кінці молекули. Отже, наступним завданням було спробувати з'ясувати функціональне значення даного подовження та відповідної ізоформи КоА- синтази.
Аналіз in silico амінокислотних послідовностей КоА-синтази б та в. З метою виявлення консенсусних амінокислотних послідовностей у складі КоА- синтаз б та в, що можуть опосередковувати їхні білково-білкові взаємодії із сигнальними білками та потенційних сайтів фосфорилювння, ми проаналізували амінокислотну послідовність КоА-синтази б та в за допомогою програм Scansite 2.0 та GPS 2.0. Нами встановлено, що обидві ізоформи мають у своєму складі мотиви, що можуть опосередковувати їхню взаємодію із SH3 та SH2 доменами сигнальних білків. При цьому, N-кінцеве подовження КоА-синтази в має в своєму складі мотиви, що є потенційними сайтами зв'язування з низкою додаткових SH3/SH2 доменів. Крім того, КоА-синтази б та в містять низку тирозинових залишків, що є потенційними сайтами фосфорилування. КоА-синтаза б має в своєму складі одинадцять залишків тирозину, що можуть бути сайтами фосфорилування тирозинових кіназ. КоА-синтаза в має у складі N-кінцевого подовження тирозиновий залишок (Тир15), що є потенційною мішенню для фосфорилування дев'ятьма тирозиновими кіназами.
Вивчення взаємодії б та в ізоформ КоА-синтази із SH2 та SH3 доменами сигнальних білків із застосування афінної хроматографії. Подальшим етапом роботи було тестування здатності ендогенної КоА-синтази із екстрактів тканин щура, а також лізатів клітин, взаємодіяти із SH3/SH2 доменами. З цією метою рекомбінантні GST-злиті SH3 та SH2 домени різних сигнальних білків іммобілізували на глутатіон-сефарозі та інкубували із екстрактами білків печінки, головного мозку, жирової тканини щура, клітин HEK293 або С6. Зв'язування КоА-синтази із GST-злитими білками визначали Вестерн-блот аналізом із використанням антитіл до C-кінцевої частини КоА-синтази. Всього було протестовано зв'язування КоА-синтази із шістнадцятьма SH3 та вісьмома SH2 доменами. Результати аналізу наведено у таблиці.
Таким чином, обидві ізоформи КоА-синтази можуть взаємодіяти із SH3 та SH2 доменами, що вказує на можливість утворення комплексів між ендогенними КоА- синтазами та сигнальними білками, що містять зазначені домени, в умовах in vivo.
Фосфорилювання по тирозину КоА-синтази б. Біоінформатичний аналіз та дані афінної хроматографії вказують на те, що КоА-синтази містять фосфорильовані залишки тирозину. Ми імунопреципітували ендогенну КоА-синтазу б із екстрактів печінки та мозку щура, а також клітин HEK293 та проаналізували імунопреципітати методом Вестерн-блоту антитілами, що специфічно розпізнають фосфорильовані тирозинові залишки у складі білків (анти-pY). Як видно в екстрактах, що тестували, фракція ендогенної КоА-синтази дійсно містить фосфорильовані залишки тирозину.
Надалі було проаналізовано здатність декількох нерецепторних тирозинових кіназ (ТК) фосфорилувати КоА-синтазу in vitro. Були використані препарати рекомбінантних очищених тирозинових кіназ сSrc, Lyn, Syk, Btk, та КоА-синтази. Кіназну реакцію проводили із використанням [гР32АТФ]. Всі чотири ТК були здатні фосфорилувати КоА-синтазу за умов in vitro. Хоча даний підхід не дозволяє робити висновків щодо фізіологічного значення виявленого фосфорилування, такі результати свідчать, що КоА-синтаза може бути субстратом зазначених тирозинових кіназ.
Для дослідження впливу тирозинової кінази сSrc на фосфорилування КоА-синтази, клітини HEK293 трансфекували векторами pcDNA3.1, що містили кДНК послідовності кінази сSrc дикого типу, або каталітично неактивної форми.
Встановлено, що надекспресія сSrc дикого типу (wt) призводить до значного збільшення фосфорилування КоА-синтази по тирозину порівняно із каталітично неактивною кіназою (KD). Таким чином, наведені дані вказують на те, що КоА-синтаза є потенційним субстратом тирозинової кінази сSrc в клітинах HEK293.
Дослідження взаємодії КоА-синтази б із тирозиновою фосфатазою Shp2. Аналізом взаємодії КоА-синтази б із SH2/SH3 доменами сигнальних білків встановлено, що тирозинова фосфатаза Shp2 є одним із гіпотетичних білків-партнерів КоА-синтази. Оскільки КоА-синтаза б може бути фосфорильованою по тирозину, було зроблено припущення, що Shp2 може регулювати рівень фосфорилування КоА-синтази за цими залишками. Для перевірки можливості існування комплексу між Shp2PTP та КоА-синтазою б було застосовано метод ко-імунопреципітації. Комплекс між Shp2 та КоА-синтазою б дійсно було виявлено в клітинах HEK293.
З метою дослідження здатності Shp2 дефосфорилувати КоА-синтазу б, ми провели реакцію in vitro дефосфорилування рекомбінантної КоА-синтази, що раніше було експресовано в клітинах Sf9, з використанням рекомбінантної, злитої із GST фосфатазою Shp2. В результаті експерименту було встановлено, що інкубація КоА-синтази із Shp2-GST, на відміну від інкубації тільки із GST або Shp2-GST у присутності інгібітора фосфатаз (Na3VO4), призводила до значного падіння рівня її фосфорилування по тирозину.
Таким чином, здатність тирозинової фосфатази Shp2 дефосфорилювати КоА-синтазу б in vitro, разом із фактом існування комплексу між цими білками, свідчить, що Shp2 може бути фосфатазою КоА-синтази в умовах in vivo.
Дефосфорилування КоА-синтази б тирозиновою фосфатазою Shp2 in vitro було застосовано для вивчення впливу фосфорилування по тирозину КоА-синтази на її каталітичну активність. В експерименті вимірювали ФПАТ активність КоА-синтази б у зворотному напрямку, а саме, за розкладанням дефосфо-КоА до 4'-фосфопантетеїну та АТФ. Рівень АТФ визначали за допомогою системи АТФ Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assay. За результатами експерименту, зворотна ФПАТ активність КоА-синтази підвищувалась внаслідок її дефософрилування Shp2 в середньому в два рази.
Таким чином, ми ідентифікували тирозинову фосфатазу Shp2 як новий білковий партнер КоА-синтази б та продемонстрували, що дана фосфатаза здатна дефосфорилувати КоА-синтазу по тирозиновим залишкам в умовах in vitro. Крім того, ми встановили, що дефосфорилування призводить до підвищення ФПАТ каталітичної активності останньої. Отже, можна припустити, що фосфорилування певних тирозинових залишків у складі КоА-синтази є механізмом регуляції каталітичної активності даного ензиму в умовах in vivo.
Дослідження взаємодії між КоА-синтазою б та регуляторною субодиницею PI3K, р85б. Дані біоінформатичного аналізу та експерименти з афінної хроматографії свідчать, що як SH3, так і SH2 домени р85б взаємодіють із ендогенною КоА-синтазою. Методом ко-імунопреципітації ми виявили, що комплекс між КоА-синтазою та p85б дійсно існує в клітинах HEK 293 та не є конститутивним. Присутність сироватки чи інсуліну стимулює формування комплексу, тоді як за відсутності сироватки в середовищі культивування комплекс дисоціює.
Дослідження функціонального зв'язку між КоА-синтазою та сигнальними шляхами у клітинах ссавців. З огляду на можливість існування комплексу між КоА-синтазою та PI3K in vivo, було досліджено, яким чином рівень експресії КоА- синтази впливає на активність PI3K-залежного сигнального шляху. З цією метою ендогенний рівень КоА-синтази в клітинах HEK293 було знижено за допомогою кіРНК та визначено в них активність компонентів PI3-кіназного сигнального шляху - серин/треонинових кіназ PDK1, AKT1, S6K 1/2, а також тирозинових кіназ. Вестерн-блот аналіз лізатів відповідних клітин антитілами, специфічними щодо фосфорильованих мотивів у білкових субстратах зазначених кіназ, показав, що зниження рівня КоА-синтази призводить до падіння рівня такого фосфорилування за дозо-залежним типом.
Наведені дані вказують на можливість існування невідомого раніше функціонального зв'язку між ферментом, залученим до біосинтезу коензиму А, та процесами передавання сигналів у клітинах. Механізм виявленого впливу, а також коло сигнальних шляхів, на функціонування яких впливає КоА-синтаза, залишаються предметом подальших досліджень.
Вищенаведені біохімічні дані спонукали нас дослідити наявність залежності між рівнем експресії КоА-синтази та активністю сигнальних шляхів на клітинному рівні. Для оцінки активності PІ3K-залежного шляху на моделі культури клітин in vitro, широко використовують тест на здатність клітин формувати колонії в напіврідкій агарозі. Відомо, що гіперактивність PІ3K-сигнального шляху сприяє проліферації та виживанню клітин навіть за умов втрати ними контактів із екстраклітинним матриксом. Як модель в даному експерименті використовували клітинну лінію, що походить від диференційованої гепатокарциноми людини (HepG2). Такі клітини трансфікували кiРНК до КоА-синтази, або контрольною (scrambled) кіРНК. Аналіз результатів 4-х незалежних експериментів дозволив встановити, що клітини, в яких суттєво зменшено рівень КоА-синтази, формували в середньому в 2 рази менше колоній, ніж клітини із нормальним рівнем білка.
На наступному етапі досліджували ефекти підвищеної експресії КоА-синтази б та в в клітинах ссавців. Встановлено, що здатність клітин лінії HEK293, що стабільно експресували Мус-таг злиту КоА-синтазу б або в, формувати колонії в напіврідкій агарозі статистично достовірно збільшувалась порівняно з контрольними клітинами в 2,02±0,1 та 3,12±0,15 разів відповідно.
Ключовим питанням у з'ясуванні механізмів впливу КоА-синтази на активність сигнальних шляхів є роль у цих процесах каталітичних активностей даного ферменту, а також його субклітинної локалізації, що є переважно мітохондріальною. Було перевірено здатність стабільних клітинних ліній HEK293, які експресували каталітично неактивну форму КоА-синтази б (H203A/G400A) або КоА-синтазу б із делецією N-кінцевого пептиду довжиною 28 а.к. (?TM), який необхідний для асоціації даного білка з мітохондріями, формувати колонії в напіврідкій агарозі. Експресія вищезазначених мутантних білків не призводила до статистично достовірного збільшення кількості колоній порівняно із контролем. Натомість, такі клітини навіть мали тенденцію до супресії даного фенотипу.
Наведені дані свідчать, що КоА-синтаза сприяє виживанню та проліферації клітин у відсутності контактів із компонентами екстраклітинного матриксу, що може бути наслідком її позитивного впливу на активність певних сигнальних шляхів клітини, зокрема РІ3К-залежного сигнального шляху. Як каталітична активність ферменту, так і асоціація його із мітохондріальною мембраною, вірогідно є необхідними для опосередкування зазначеного фенотипу.
Згідно вищевикладеного припущення, активація сигнальних шляхів клітини, що пов'язана із підвищеною експресією в них КоА-синтази, має призводити, у тому числі, до зростання життєздатності таких клітин у відсутності гуморальних стимулів. Ми оцінили здатність клітин, що надекспресують КоА-синтази б або в, виживати у відсутності сироватки у порівнянні із клітинами, що мають нормальні рівні КоА-синтаз. Життєздатність було пораховано як співвідношення загальної кількості клітин і мертвих клітин. Аналіз засвідчив, що надекспресія як б так і в ізоформи КоА-синтази приводить до статистично достовірного збільшення життєздатності клітин в 1,7 та 2,7 разів відповідно, порівняно із контролем.
Таким чином, КоА-синтаза має протекторний ефект на клітини за умов відсутності екзогенних стимулів, що в нормі підтримують життєздатність клітин. Такі результати узгоджуються з даними попередніх експериментів та підтримують гіпотезу щодо позитивного впливу КоА-синтази на сигнальні шляхи клітини, що сприяють виживанню, зокрема PI3K-залежний шлях.
Узагальнення результатів роботи. Узагальнюючи результати даної роботи можна констатувати, що КоА-синтаза, єдиною відомою функцією якої було участь в біосинтезі коферменту А, має ряд особливостей, що важко пояснити виходячи із суто метаболічної ролі даного ферменту. КоА-синтаза формує комплекси із сигнальними білками клітини (S6K, Shp2PTP, p85б PI3K), може бути фосфорильованою за тирозином, містить мотиви, що можуть опосередковувати її взаємодію із SH2/SH3 доменами, та впливає на активність PI3K-залежного шляху і активність тирозинових кіназ. Рівень експресії КоА-синтази має важливе значення для виживання клітин у відсутності ростових факторів та контактів із молекулами екстраклітинного матриксу.
Окрім того, в роботі отримано данні, що вказують на можливість регуляції рівня фосфорилування по тирозину КоА-синтази як засобу регуляції біосинтезу коферменту А у відповідь на екзогенні сигнали.
Отримані результати, на наш погляд, вказують на існування невідомого раніше функціонального зв'язку між КоА-синтазою (та/або шляхом біосинтезу КоА de novo) та сигнальними шляхами клітини і дають підстави висунути припущення, що КоА- синтаза є одним із можливих пунктів інтеграції внутрішньоклітинних та позаклітинних сигналів. Ідентифікація механізмів регуляції функціонування сигнальних шляхів клітини із залученням КоА-синтази є одним із найважливіших питань та потребує подальших експериментальних досліджень. Провідним пунктом в його розв'язуванні може стати з'ясування ролі утворення комплексів КоА-синтази із сигнальними білками, а також впливу коензиму А та його ацил-похідних на активність сигнальних білків, в тому числі в контексті багатоклітинного організму.
Висновки
У дисертаційній роботі досліджено та доведено існування функціонального зв'язку між ферментом КоА-синтазою та компонентами сигнальних шляхів клітини.
1. Ідентифіковано нову, в ізоформу КоА-синтази, що відрізняється від відомої б ізоформи N-кінцевим подовження із 29-ти амінокислотних залишків.
2. Методом афінної хроматографії показано, що КоА-синтази б та в здатні взаємодіяти з SH2 доменами білків: регуляторної субодиниці PI3К (р85б), білка-адаптера Shc, фосфоліпази PLCг, та SH3 доменами білків регуляторної субодиниці NADH-дегідрогенази (p67) та PI3К (р85б); КоА-синтаза б взаємодіє також з SH2 доменом тирозин фосфатази Shp2.
3. Підтверджено існування в клітинах ссавців комплексів між КоА-синтазою б та білками Shp2 та PI3K ( p85б).
4. Вперше показано, що ендогенна КоА-синтаза б в клітинах вищих еукаріот є фосфорильованою по залишках тирозину, та виявлено низку тирозинових кіназ, що здатні фосфорилувати КоА-синтазу in vitro. Для кінази cSrc показано вплив на рівень фософрилування КоА-синтази по тирозину в клітинах HEK293. Встановлено, що фосфорилування по тирозину впливає на ФПАТ активність КоА-синтази б.
5. Виявлено, що зниження рівня експресії КоА-синтази б в клітинах ссавців призводить до зниження активності компонентів PI3K-залежного сигнального шляху - протеїн кіназ PDK1, Akt1, S6K1/2, а також тирозин кіназ.
6. Встановлено, що підвищення рівня експресії КоА-синтаз б та в збільшує здатність клітин до росту за відсутності контактів із екстраклітинним матриксом та виживанню в збідненому на ростові фактори середовищі. Натомість, зменшення експресії КоА-синтази в клітинах ракового походження призводить до протилежного ефекту.
7. Встановлено, що надекспресія каталітично неактивної КоА-синтази б та КоА-синтази б із делецією N-кінцевого пептиду, що необхідний для мітохондріальної локалізації, не призводить до збільшення здатності клітин до росту за відсутності контактів із екстраклітинним матриксом.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Identification of a novel CoA synthase isoform, which is primarily expressed in the brain / I. Nemazanyy, G. Panasyuk, O. Breus, A. Zhyvoloup, V. Filonenko, I.T. Gout // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2006.- Vol.341, № 4.- Р. 995-1000. Особистий внесок здобувача - аналіз екстрактів тканин щура щодо експресії в них КоА-синтази бета.
2. Proline reach regions of coenzyme A synthase б and в interact with SH3 domains of signalling proteins in vitro / O. Breus, G. Panasyuk, V. Filonenko, I. Nemazanyy // Біополімери і клітина.- 2008.- Т.24, № 2.- С.123-129. Особистий внесок здобувача- клонування, бактеріальна експресія та очистка специфічного для КоА-синтази бета фрагмента. Біоінформатичний аналіз. Здійснення експериментів з афінної білкової хроматографії. Підготовка статті до друку.
3. CoA synthase is in complex with p85alpha PI3K and affects PI3K signalling pathway / O. Breus, G. Panasyuk, I. Gout, V. Filonenko, I. Nemazanyy // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2009.- Vol.385, № 4.- Р. 581-585. Особистий внесок здобувача - експерименти з афінної білкової хроматографії, ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА-синтази та р85б, субклітинного фракціонування та ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА-синтази та р85б із мітохондріальної фракції. Здійснення експериментів щодо впливу кіРНК опосередкованого зниження ендогенного рівня КоА-синтази на активність PI3K- сигнального шляху, та активність тирозинових кіназ. Підготовка статті до друку.
4. CoA Synthase influences adherence- independent growth and survival of mammalian cells in vitro / O. Breus, I. Nemazanyy, I. Gout, V. Filonenko, G. Panasyuk // Biopolymers and Cell. - 2009.- Vol. 25, № 5.- P. 384-389. Особистий внесок здобувача - створення стабільних клітинних ліній, їхній аналіз та проведення експертиментів із впливу надекспресії КоА- синтази на незалежний від екстраклітинного матриксу ріст клітин і виживання клітин за відсутності ростових факторів. Підготовка статті до друку.
5. CoA Synthase в interacts with SH3 domains of signaling proteins in vitro / O.Breus, I.Gout, V. Filonenko // Acta Biochimica Polonica.- 2007.- Vol. 54, Supl.2, Abstracts of 6th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signalling”.- Krakow, Poland. - P. 11. Особистий внесок здобувача - клонування, бактеріальна експресія та очистка специфічного для КоА синтази бета фрагмента, біоінформатичний аналіз, проведення експериментів з афінної білкової хроматографії.
6. Identification of a novel CoA synthase isoform and its interaction with SH3 domains of signaling proteins in vitro / O. Breus, I. Nemazanyy, V. Filonenko // Біополімери і клітина.- Collections of Theses on Conference of Young Scientists dedicated to the 184th anniversary of Gregor Mendel- 2007.- Т. 4, № 4.- С. 269. Особистий внесок здобувача - біоінформаційний аналіз, проведення експериментів з афінної білкової хроматографії.
7. Metabolic enzyme CoA Synthase is tyrosine phosphorylated and is a part of signaling network in the mammalian cells / O. Breus, G. Panasyuk, I. Gout, I. Namazanyy, V. Filonenko // Abstract book.- 2009.- The EMBO Meeting advancing the life sciences.- P. 107. Особистий внесок здобувача- експерименти щодо виявлення фосфорилювання по тирозину КоА-синтази. Виконання експериментів із афінної хроматографії та ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА-синтази та тирозин фосфатази Shp2. Дефосфорилування КоА-синтази Shp2 фосфатазою in vitro.
8. Coenzyme A Synthase interacts with PI3 kinase on mitochondria / I. Nemazanyy, O. Breus, V. Filonenko // Abstract book of FEBS Workshop on “Lipids as regulators of cell function”.- 2008.- P. 38. Особистий внесок здобувача - виконання експериментів із субклітинного фракціонування та ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА- синтази та р85б із клітинних фракцій.
9. Identification of a novel CoA synthase isoform / I. Nemazanyy, O. Breus, V. Filonenko // Abstract book of 6th parnas Conference «Molecular Mechanisms of Cellular Signalling» Krakow, Poland, 2007. Особистий внесок здобувача - Вестерн- блот аналіз екстрактів тканин щура антитілами специфічними щодо КоА- синтази бета.
10. CoA Synthase interacts with p85б regulatory subunit of PI3K in mammalian cells and promotes cell transformation in vitro / O. Breus, G. Panasyuk, I.T. Gout, V. Filonenko, I. Nemazanyy // 7th Parnas Conference. Український біохімічний журнал.- 2009.- Т.81, № 4.- С. 63. Особистий внесок здобувача - проведення експериментів із афінної білкової хроматографії, ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА-синтази та р85б, субклітинного фракціонування та ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА синтази та р85б із мітохондріальної фракції. Створення стабільних клітинних ліній, їхній аналіз та проведення експериментів із впливу надекспресії КоА-синтази на незалежний від екстраклітинного матриксу ріст клітин а також виживання клітин за відсутності ростових факторів.
11. CoA Synthase is phosphorylated on tyrosine(s) in mammalian cells, interacts with and is dephosphorylated by Shp2PTP / O. Breus, G. Panasyuk, I. Nemazanyy, V. Filonenko, I. Gout // 7th Parnas Conference. Український біохімічний журнал.- 2009.- Т.81, № 4.- С. 64. Особистий внесок здобувача - виявлення фосфорилування по тирозину КоА-синтази, експерименти із афінної хроматографії та ко-імунопреципітації білкових комплексів КоА- синтази та тирозин фосфатази Shp2, дефосфорилування КоА-синтази Shp2 фосфатазою in vitro. Експерименти із впливу тирозин-кінази cSRC на фосфорилування по тирозину КоА синтази.
Анотація
Бреус О.С. Функціональні зв'язки КоА-синтази із компонентами сигнальних систем клітини. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.
Робота присвячена дослідженню функціональних зв'язків між КоА-синтазою та компонентами сигнальних шляхів в клітинах ссавців. Ідентифіковано нову, в ізоформу КоА-синтази. Показано можливість взаємодії КоА-синтаз б та в із SH2/ SH3 доменами сигнальних білків. Виявлено існування комплексів КоА-синтази б із регуляторною субодиницею PI3К (р85б) та тирозин фосфатазою Shp2 в клітинах HEK293. Встановлено, що фракція КоА-синтази б є фосфорильованою по тирозину в клітинах ссавців. Виявлено вплив кінази cSrc на фософрилювання КоА-синтази. Встановлено залежність активності PI3K-залежного сигнального шляху від рівня експресії КоА-синтази б. Показано, що здатність клітин до росту та виживання за відсутності контактів із екстраклітинним матриксом або сироватки, залежить від рівня експресії КоА-синтази. Показано, що каталітична активність та наявність N-кінцевого пептиду (28 а.к.) КоА-синтази б, що відповідає за асоціацію із мітохондріями, є необхідними для опосередкування вищезазначених ефектів.
Ключові слова: КоА-синтаза, біосинтез КоА, сигнальні шляхи клітини, фосфоінозитид-3'-кіназа PI3K, тирозин фосфатаза із SH2 доменами Shp2.
Аннотация
Бреус О.С. Функциональные связи КоА-синтазы с компонентами сигнальных систем клетки. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.
Работа посвящена исследованию функциональных связей между КоА-синтазой и компонентами сигнальных систем в клетках млекопитающих. Идентифицировано новую, в изоформу КоА-синтазы. Показана возможность взаємодействия КоА-синтаз б и в с SH2/SH3 доменами сигнальных белков. Выявлено существование комплексов КоА-синтаза б с регуляторной субъеденицей PI3К (р85б) и тирозин фосфатазой Shp2 в клетках HEK293. Установлено, что фракция КоА-синтазы б фосфорилирована по тирозину в клетках млекопитающих. Показано влияние киназы на фосфорилирование КоА-синтазы. Выявлена зависимость активности PI3K-зависимого сигнального пути от уровня экспрессии КоА-синтазы б. Установлено, что способность клеток к росту и выживанию при отсутствии контактов с внеклеточным матриксом или сыворотки, зависит от уровня экспрессии КоА-синтазы. Показано, что каталитическая активность, а также наличие N-концевого пептида КоА-синтазы б (28 а.к.), необходимого для митохондриальной локализации, нужны для опосредования вышеуказаных эфектов.
Ключевые слова: КоА-синтаза, биосинтез КоА, сигнальные пути клетки, фосфоинозитид- 3'- киназа PI3K, тирозин фосфатаза с SH2 доменами Shp2.
Summary
Breus O.S. Functional links of CoA Synthase with components of cell signal transduction pathways. - Manuscript.
Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.
In the recent years the complex interplay between metabolism and cellular processes involved in regulation of cell physiology and behavior starts to emerge. A number of metabolic enzymes and small molecular metabolites were found to be integrated in the regulatory circuits which modulate cell proliferation, apoptosis, differentiation and functioning at the levels of cell and a whole organism.
CoA Synthase (CoASy) is a bifunctional enzyme which catalyses the last two steps in de novo Coenzyme A biosynthesis in higher eukaryotes. It has two catalytic domains - phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) and dephospho-CoA kinase (DPCK). The final product of CoASy enzymatic activity - Coenzyme A is ubiquitous carrier of activated acyl- moieties among all forms of life. CoA and acyl-CoA derivatives are indispensable in the metabolism of carbohydrates and lipids, they are essential components of energy production processes and obligate co-factors for activity of 4 % of cellular enzymes in eukaryotic cells. Moreover, CoA-derivatives are involved in the regulatory processes, such as proteins acylation. Analysis of phenotypes of Drosophila melanogaster with mutant hypomorphic alleles of de novo CoA biosynthetic enzymes - pantothenate kinase, phosphopantothenoylcysteine synthetase and CoASy, surprisingly revealed important roles this pathway plays in the maintenance of DNA integrity, oxidative stress protection, cytokinesis, actin cytoskeleton organization, along with already known importance for lipids homeostasis. It has been known for a long time that intracellular CoA levels are responsive to various extracellular stimuli including insulin, glucose, fatty acids, pyruvate, glucagon, glucocorticoids. Intracellular content and subcellular distribution of CoA and its acylated derivatives change in pathological conditions such as diabetes, Rye syndrome and cancer. Nevertheless, the biological role and regulation of this important biochemical pathway remain to be poorly investigated.
The objective of this work was to test existence of functional links between CoA Synthase and signal transduction pathways in mammalian cells. The possibility of such links was indicated by the finding that CoASy directly complexes with kinase of S6 ribosomal protein (S6K) in mammalian cells, and also by in silico analysis which revealed a multiple potential interaction sites with SH2/SH3 domains of signaling proteins and tyrosine phosphorylation sites inside CoASy molecule.
Because known mechanisms of CoA biosynthesis regulation are based on the differences in the biochemical properties of multiple isoforms of PanK, we supposed that CoASy also might have isoforms which can be differentially regulated. The search of human ESTs database allowed us to identify a novel CoASy isoform. This novel, в isoform, is similar to originally identified, б isoform, but possesses additional 29 amino-acids from the N-terminus. In contrast to б isoform, corresponding mRNA and protein are expressed in the limited range of rat tissues.
In silico data and affinity chromatography experiments with a panel of GST tagged SH3/SH2 domains of different signaling proteins, revealed that some of them precipitate б and в CoASy isoforms from extracts of rat tissues and cell lines. This finding indicates corresponding signaling proteins as potential interaction partners of CoASy in vivo.
Ability to interact with SH2 domains and in silico data indicate that CoASy should be phosphorylated on tyrosine in mammalian cells. We tested this possibility by probing endogenous CoASy with phospho-tyrosine specific antibody and proved that a fraction of this protein indeed is tyrosine phosphorylated. We also found that several non-receptor tyrosine kinases - cSrc, Lyn, Syk and Btk are able to phosphorylate CoASy in vitro. Influence of cSrc kinase activity on CoASy tyrosine phosphorylation was demonstrated also in vivo.
In co-immunoprecipitation experiments we showed CoASy association with two signaling proteins whose SH3/SH2 domains precipitated CoASy in affinity chromatography assays - protein tyrosine phosphatase Shp2 and regulatory subunit of PI3K (p85б). In vitro studies demonstrated ability of Shp2 to dephosphorylate CoASy, indicating possibility for Shp2 to be CoASy tyrosine phosphatase. We also have shown that such dephosphorylation increases CoASy PPAT activity that uncovers possible mechanism of its regulation by extracellular stimuli.
To explore functional links between CoASy and PI3K signaling pathway we knocked down its endogenous level using siRNA and tested the activities of down stream components of PI3K pathway - Ser/Tre kinases PDK1, Akt1, S6K1/2 and also activities of tyrosine kinases. We have revealed that CoASy knock down have striking influence at all tested pathways, which indicates necessity of endogenous level of this protein for the activities of the tested signaling pathways.
We also investigated mentioned above phenomenon on cellular level. As we found, siRNA mediated depletion of CoASy in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2) significantly decrease their ability to adherence independent growth, while CoASy б or в overexpression in HEK293 cells lead to the opposite effect and also enhance of ability of these cells to survive in serum depleted medium. Importantly, the overexpression of catalytically inactive mutant form of CoASy б or mutant with deleted N-terminal peptide, which is important for mitochondria localization, did not lead to mentioned above effects.
Collectively, our data reveal unknown before functional link between intracellular signalling and metabolism, and point on CoASy as a potential node of integration of intracellular metabolic signals with extracellular information.
Key words: CoA Synthase CoASy, CoA biosynthesis, signaling pathways, phosphоinositіde 3-kinase PI3K, Src homology domains containing protein-tyrosine-phosphatase Shp2, tyrosine phosphorylation.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Основні етапи процесу дихання. Будова органів дихання, їх функціональні фізіологічні особливості в дітей. Газообмін у легенях та тканинах. Дихальні рухи, вентиляція легенів та їх життєва й загальна ємність. Нервова і гуморальна регуляція дихальних рухів.
реферат [946,3 K], добавлен 28.02.2012Історія вивчення клітини, характеристика клітинної теорії. Дослідження будови рослинної клітини: ультра структура (мікроскопічна будова); біологічні мембрани та їх функції; цитоскелет, мікротрубочки і мікрофіломенти; ядро; ендоплазматична сітка; рибосоми.
реферат [5,7 M], добавлен 08.12.2010Сальні та потові залози, їх будова та функції. Епіфіз, його роль у птахів і ссавців як нейроендокринного перетворювача. Зв'язок епіфізу з порушеннями у людини добового ритму організму. Регуляція біологічних ритмів, ендокринних функцій та метаболізму.
контрольная работа [18,3 K], добавлен 12.07.2010Управління обміном вуглеводів. Математичний аналіз системи регуляції рівня кальцію в плазмі. Основна модель регуляції обміну заліза у клітинах. Управління обміном білків, жирів і неорганічних речовин. Баланс тепла в організмі. Регуляція температури тіла.
реферат [25,9 K], добавлен 09.10.2010Віруси як дрібні неклітинні частки, що складаються з нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) і білкової оболонки. Відкриття існування вірусів вченим Івановським. Склад вірусів. Проникнення вірусної частинки в клітину. Механізм інфікування, зараження клітини.
презентация [6,3 M], добавлен 04.05.2014Ультраструктура та механізм регенерації клітин. Просвічуюча та скануюча електронна мікроскопія. Об'ємне зображення клітин. Електронограма інтерфазного ядра. Проведення складних морфометричних вимірювань у клітини завдяки використанню цитоаналізаторів.
презентация [13,3 M], добавлен 24.02.2013Типи клітинної організації. Структурно-функціональна організація еукаріотичної клітини. Вплив антропогенних чинників на довкілля. Будова типових клітин багатоклітинного організму. Ракція клітин на зовнішні впливи. Подразливість та збудливість клітин.
курсовая работа [4,0 M], добавлен 02.12.2012Поняття і рівні регуляції експресії генів. Їх склад і будова, механізм формування і трансформування. Транскрипційний рівень регуляції. Приклад індукції і репресії. Регуляція експресії генів прокаріот, будова оперону. Огляд цього процесу у еукаріот.
презентация [1,7 M], добавлен 28.12.2013Фізико-хімічні, біологічні, фармакологічні властивості і застосування металів нанорозмірів. Методи отримання та характеристика наночастинок золота, їх взаємодія з білками, з бактеріальними клітинами; вплив на ферментативну активність пухлинних клітин.
презентация [362,3 K], добавлен 20.09.2013Розвиток ендокринології та вивчення ролі гормонів в пристосувальних реакціях організму. Структурно-функціональні особливості та патологічні стани наднирників у ембріонів та дітей, їх дослідження в процесі старіння у зрілих людей та осіб похилого віку.
дипломная работа [1,6 M], добавлен 12.02.2011