Кількісний аналіз цитогенетичних ефектів діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С в клітинах Allium cepa L

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА „НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КІЛЬКІСНИЙ АНАЛІЗ ЦИТОГЕНЕТИЧНИХ ЕФЕКТІВ ДІОКСИДИНУ, ТІОФОСФАМІДУ ТА МІТОМІЦИНУ С В КЛІТИНАХ ALLIUM CEPA L.

03.00.15 - генетика

ШКАРУПА ВОЛОДИМИР МИКОЛАЙОВИЧ

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України“ (м. Київ),

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Бариляк Ігор Романович, ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України”, завідувач відділу медичної генетики

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Дуган Олексій Мартем'янович, Національний технічний університет України “Київський політехнічний інститут”, декан факультету біотехнології і біотехніки, зав. кафедри промислової біотехнології;

доктор біологічних наук Дубровна Оксана Василівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, відділ генетичних основ гетерозису, старший науковий співробітник

Захист відбудеться “15” січня 2009 року о 13⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.02 в ДУ “Науковий центр радіаційної медицини АМН України” (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України” (04050, м.Київ, вул. Мельникова, 53).

Автореферат розісланий “11” грудня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.В. Стефанович

АНОТАЦІЯ

Шкарупа В.М. Кількісний аналіз цитогенетичних ефектів діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С в клітинах Allium cepa L. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - ДУ “Науковий центр радіаційної медицини АМН України”, Київ, 2008.

Дисертація присвячена застосуванню кількісних підходів в генотоксикології, які базуються на понятті доза-ефект і використанні моделювання для оцінки результатів. Досліджували цитогенетичні ефекти хімічних мутагенів: діокидину, тіофосаміду та мітоміцину С в Allium-тесті. Показана ефективність використання інтегрального комплексу цитогенетичних критеріїв для оцінки хромосомної нестабільності індукованої хімічними мутагенами, що може бути покладено в основи кількісної оцінки ризиків, розробки методичних підходів, які виходять за межі спрощеного “так/ні” визначення генотоксичності. Встановлені закономірності взаємозв'язку між параметрами токсичності та процесами індукованого хімічними генотоксикантами мутагенезу у рослинного об'єкту Allium cepa L. Визначені формальні та теоретичні моделі, які адекватно описують дозові залежності цитогенетичної дії досліджених мутагенів. Показано, що при дії хімічних мутагенів можливе існування двох субпопуляцій аберантних клітин, розподіл аберацій в яких обумовлений різними процесами (які описуються пуасонівським та геометричним розподілами). Проаналізовано динаміку змін співвідношення цих субпопуляцій в залежності від концентрації мутагенів та строку фіксації.

Ключові слова: хімічні мутагени, Allium cepa L., доза-ефект, спектр аберацій, поклітинний розподіл аберацій.

генотоксикологія цитогенетичний хімічний мутаген

АННОТАЦИЯ

Шкарупа В.Н. Количественный анализ цитогенетических эффектов диоксидина, тиофосфамида и митомицина С в клетках Allium cepa L. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - ГУ “Научный центр радиационной медицины АМН Украины”, Киев, 2008.

Диссертация посвящена использованию количественных подходов в генотоксикологии, основывающихся на понятии доза-эффект и использовании моделирования для оценки результатов. Исследовали цитогенетические эффекты химических мутагенов: диоксидина, тиофосфамида и митомицина С в Allium-тесте. Показана эффективность использования интегрального комплекса цитогенетических критериев и их комплексного количественного анализа для оценки хромосомной нестабильности, индуцированной химическими мутагенами, что может быть положено в основу количественной оценки рисков, разработки методических подходов, которые выходят за рамки упрощенного “да/нет” определения генотоксичности. Установлены закономерности взаимосвязи между параметрами токсичности и процессами индуцированного генотоксикантами мутагенеза у растительного объекта Allium cepa L. Выход кривых доза-мутагенный эффект для алкилирующих мутагенов (в отличие от диоксидина) не может быть обусловлен их токсичностью. Анализ значений относительной мутагенной эффективности препаратов указывает на то, что митомицин С и тиофосфамид в большей степени чем диоксидин ингибируют образование видимих перестроек хромосом из первичных повреждений ДНК. Установлено, что независимо от химической структуры, механизма действия и мутагенной эффективности, зависимости доза-мутагенный эффект исследованных препаратов адекватно описываются полиномными функциями четвертой степени. Анализ на основе теоретических моделей показал, что эти зависимости при алкилирующем и прооксидантном механизмах действия описываются разными моделями. Показано, что при действии химических мутагенов возможно существование двух субпопуляций аберрантных клеток, распределение аберраций в которых обусловлено разными процессами (которые описываются пуассоновским (П) и геометрическим (Г) распределениями). Проанализирована динамика изменения соотношения этих субпопуляций в зависимости от концентрации мутагена и сроков фиксации. Концентрационные зависимости частоты аберраций в П-субпопуляции (до выхода на плато) приближаются к линейным для всех мутагенов. При экспозиции с алкилирующими мутагенами концентрационные зависимости частоты аберраций в Г-субпопуляции имеют экспоненциальный характер. Выявлена высокая репарабельность повреждений ДНК, индуцированных митомицином С при увеличении срока фиксации. Однако, для диоксидина и митомицина С (на фоне уменьшения поврежденности аберрантных клеток) наблюдается увеличение частоты мультиаберрантных клеток при увеличении срока фиксации. При этом, значительно увеличивается доля субпопуляции клеток с геометрическим распределением. Высказано предположение, что формирование аберраций в П-субпопуляции происходит вследствие быстрой и сверхбыстрой репарации прервичных повреждений ДНК, а в Г-субпопуляции вследствие их замедленной репарации. Высказана гипотеза, что в основе отличия “одноцентровых” мутагенов от “двухцентровых” лежит индукция последними значительного количества повреждений ДНК, репарация которых происходит по механизмам приводящим к Пуассоновскому распределению аберраций по клеткам (например, при индукции свободно-радикальных процессов).

Ключевые слова: химические мутагены, Allium cepa L., доза-эффект, спектр аберраций, поклеточное распределение аберраций.

ANNOTATION

Shkarupa V. The quantitative analisis of cytogenetic effects of dioxidin, thiotepa, mitomycin C in cells of an Allium cepa L. - Manuscript.

The dissertation (manuscript) for the degree of candidate of biological science (PhD) in speciality 03.00.15 - genetics. - SI “Research Centre for Radiation Medicine, Academy of Medical Science of Ukraine”, Kyiv, 2008.

The dissertation is devoted to use of quantitative approaches in genotoxicology, based on concept a dose-response and use of modelling for an estimation of results. Efficiency of use of an integrated complex cytogenetics criteria for an estimation of the chromosomal instability induced chemical mutagens that can be necessary in a basis of a quantitative estimation of risks, development of methodical approaches which are beyond simplified "yes/no" definition genetic toxicity is shown. Investigated cytogenetic effects of chemical mutagens: dioxidin, thiotepa, mitomycin C in the Allium-test. Interrelations between parameters of toxicity and processes induced mutagenesis by researched substances in the Allium-test are established. Formal and theoretical models which adequately describe doze dependences cytogenetic actions of investigated mutagens are certain. It is shown, that at action chemical mutagens existence of two subpopulations aberrants cells is possible, distribution of aberrations in which is caused by different processes (which are described Poisson and geometrical by distributions). Dynamics of change of a parity of these subpopulations depending on concentration of mutagen and terms of fixing is analysed.

Key words: chemical mutagens, Allium cepa L., dose-response, spectrum of aberrations, distribution aberrations on cells.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Індукований мутагенез представляє реальну загрозу для життя і здоров'я людини як на індивідуальному так і на популяційному рівнях. Показана його роль у процесах онко- і тератогенезу, спадковій патології. Для України, в цілому, характерна несприятлива екологічна ситуація, обумовлена техногенним забрудненням генотоксикантами різних об'єктів навколишнього середовища та складним економічним становищем (Бариляк, 1996).

Генетична токсикологія, яка виникла 40-45 років тому, на теперішній час оперує набором окремих методів, часто не пов'язаних між собою. Разом з тим, ця наукова дисципліна, яка має чітко окреслені завдання - створення оптимізованої, у відношенні до витрат, методології оцінки потенційної генетичної небезпеки, може бути побудована як кількісна наука, як це має місце в класичній фізиці чи математиці (Тарасов, 2001). Інтегральна оцінка цитогенетичних критеріїв (частота аберацій та аберантних клітин, відносна мутагенна ефективність, спектр аберацій, пошкодженність аберантної клітини, частота мультиаберантних клітин, поклітинний розподіл аберацій, проліферативна активність, розподіл клітин по фазах мітозу) якісно змінює інформативність аналізу. Використання рослинної тест-системи дозволяє ефективно (у відношенні до можливості аналізу комплексу зазначених критеріїв, трудомісткості та витрат) вирішувати завдання такої оцінки. Комплексний кількісний аналіз дозових залежностей цитогенетичних ефектів хімічних мутагенів з різною структурою та механізмами дії, з використанням як формальних регресійних, так і біологічно обгрунтованих теоретичних моделей та статистичного аналізу поклітинного розподілу аберацій надає змогу розширити уявлення про закономірності формування перебудов хромосом, механізми реалізації мутагенних ефектів на хромосомному та клітинному рівнях. Він може бути покладений в основи кількісної оцінки ризиків та розробки методичних підходів, які виходять за межі спрощеного “так/ні” визначення генотоксичності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у рамках НДР “Еколого-генетична оцінка зон рекреації м.Киева”(№ державної реєстрації 0101U000394, шифр теми ВН 6.23.98). Разом з тим, було використано дані НДР: “Дослідження профілактичної дії фолієвої кислоти щодо вроджених вад нервової трубки у новонароджених” (№ державної реєстрації 0103U005715, шифр теми 369).

Мета роботи. З'ясування кількісних закономірностей цитогенетичних ефектів хімічних мутагенів з різними механізмами дії в рослинній тест-системі цибулі звичайної (Allium cepa L.).

Задачі дослідження:

1. В Allium-тесті дослідити закономірності взаємозв'язку між параметрами токсичності та процесами індукованого діоксидином, тіофосфамідом і мітоміцином С мутагенезу.

2. Визначити дозові залежності цитогенетичних ефектів, індукованих хімічними мутагенами, формальні і теоретичні моделі які адекватно їх описують.

3. Провести аналіз спектру аберацій, індукованих хімічними мутагенами та їх поклітинного розподілу.

4. Дослідити закономірності цитогенетичної дії хімічних мутагенів при різних строках фіксації матеріалу.

Об'єкт дослідження - цитогенетичні ефекти прооксидантного (діоксидин) та алкілуючих (тіофосфамід, мітоміцин С) хімічних мутагенів в клітинах кореневих меристем Allium cepa L.

Предмет дослідження - залежності доза-ефект, спектр індукованих аберацій та їх поклітинний розподіл при дії діоксидину, тіофосфаміду та мітоміцину С.

Методи дослідження - цитогенетичні, морфометричні, математичні (стандартні методи варіаційної статистики; математичне моделювання та регресійний аналіз дозових залежностей; статистичний аналіз поклітинного розподілу аберацій).

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Показано, що для тіофосфаміду і мітоміцину С (на відміну від діоксидину), вихід кривих доза-мутагенний ефект на „плато” не обумовлюється їх токсичністю. Аналіз значень відносної мутагенної ефективності показав, що алкілуючі мутагени здатні в більшій мірі ніж прооксидантний пригнічувати формування видимих аберацій хромосом з первинних пошкоджень ДНК.

2. Встановлено, що криві доза-мутагенний ефект, незалежно від механізмів дії досліджених препаратів адекватно описуються поліномними функціями четвертого ступеня. Однак, дія алкілуючих та прооксидантного мутагенів описується різними теоретичними моделями.

3. Виявлено, що незалежно від хімічної структури, механізмів дії та ефективності мутагенів в Allium-тесті, при перевищенні частоти аберантних клітин ? 5-7% змінюється характер дозової залежності. Мутагенна ефективність при цьому після точки переходу зменшується у 8-9 разів для всіх досліджених генотоксикантів.

4. Показана висока репарабельність пошкоджень ДНК, індукованих мітоміцином С при збільшенні строку фіксації. Разом з тим, виявлено зростання частоти мультиаберантних клітин, індукованих мітоміцином С і діоксидином при збільшенні строку фіксації.

5. Показано, що при дії хімічних мутагенів можливе існування двох субпопуляцій клітин, поклітинний розподіл аберацій в яких обумовлений різними процесами. Проаналізовано динаміку цих субпопуляцій (з Пуасонівським та геометричним типами розподілу) в залежності від концентрації мутагенів та строку фіксації.

6. Висунуто припущення, що характер поклітинного розподілу аберацій при хімічному мутагенезі залежить від дози мутагенного чинника.

7. Запропонована гіпотеза, відповідно до якої, основною причиною відмінності „багатоцентрових” мутагенів від „одноцентрових” є індукція ними значної кількості пошкоджень ДНК, репарація яких відбувається за механізмами, що призводять до Пуасонівського розподілу аберацій по клітинах (наприклад, при індукції вільнорадикальних процесів).

Практичне значення одержаних результатів. Показано ефективність використання інтегрального комплексу цитогенетичних критеріїв для оцінки хромосомної нестабільності, індукованої хімічними мутагенами. Запропоновано комплексний підхід кількісної оцінки цитогенетичних ефектів при хімічному мутагенезі. Отримані результати можуть бути використані при ретроспективному аналізі залежностей доза-ефект та поклітинного розподілу аберацій; у навчальному процесі при викладанні курсів “Цитогенетика”, “Мутагенез”.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостіним дослідженням здобувача. Автором самостійно поставлено всі експерименти, проведено їх обробку та інтерпретацію, проаналізовано літературу, написано наукові статті. Спільно з науковим керівником проведено вибір напрямку досліджень та обговорення результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено на: ІІ з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2002); міжнародній конференції: “Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005); конференції: “Актуальні проблеми фармакології і токсикології” (Київ, 2005); міжнародній науково-практичній конференції: “Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання” (Київ, 2007), міжнародній науково-практичній конференції: “Епідеміологія медичних наслідків аварії на Чорнобильській АЕС. 20 років по тому ” (Київ, 2007); ІV міжнародній науковій конференції: „Фактори експериментальної еволюції організмів” (Алушта, 2008); ІV з'їзді медичних генетиків України (Львів, 2008).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень опубліковані в 12 наукових працях, зокрема, 7 - статті в фахових журналах, 5 - в матеріалах та тезах конференцій, з яких - 3 міжнародних.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 142 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методики дослідження, результатів дослідженнь та їх обговорення, узагальнення отриманих даних, висновків, додатків та списку використаних джерел літератури, який включає 188 назв. Текст дисертації ілюстрований 57 рисунками та 48 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульовані мета та задачі дослідження, визначені наукова новизна та практична цінність одержаних результатів.

Перший розділ містить аналітичний огляд даних літератури щодо сучасних уявлень про механізми формування структурних перебудов хромосом, цитогенетичні критерії оцінки хромосомної нестабільності та методи їх кількісного аналізу.

Другий розділ присвячений характеристиці матеріалів та методів дослідження. Наведені основні класифікаційні параметри досліджених мутагенів. Використовували тест-систему клітин кореневої меристеми цибулі звичайної. Насіння Allium cepa L. пророщували протягом 72 год. (при 25єС) в водних розчинах мутагенів: діоксидин - 0,1-100 мг/л (14 концентрацій); тіофосфамід - 0,01-40 мг/л (12 концентрацій); мітоміцин С - 0,0005-1 мг/л (13 концентрацій). Для аналізу токсичності використовували ширші діапазони концентрацій мутагенів (діоксидин - до 1000 мг/л, тіофосфамід - до 160 мг/л, мітоміцин С - до 20 мг/л). При дослідженні цитогенетичної дії мутагенів за умов різних строків фіксації, останню проводили на 72 та 75 год. від початку замочування насіння. В усіх дослідах контролем було насіння, яке проростало за тих же умов, що й експериментальне, але без впливу мутагенного чинника. Проростки довжиною 5-10 мм фіксували в фіксаторі Кларка, для мікроскопічного аналізу готували тимчасові препарати, пофарбовані ацетоорсеїном за загальноприйнятими методиками (Паушева, 1988).

При аналізі токсичності визначали всхожість насіння та праметри відносного кореневого приросту: ЕС_10, ЕС₅₀, ЕС₉₀ - відповідно ініціальна, ефективна та сублетальна концентрації та діапазони діючих токсичних концентрацій ДЕС_90-10 (Довгалюк та ін., 2001). Цитогенетичний аналіз проводили ана-телофазним методом. Оцінювали наступні критерії: мітотичний індекс (МІ), розподіл клітин по фазах мітозу, частота аберантних ана-телофаз (ЧАА), кількість аберацій/100 клітин, пошкодженність аберантної клітини (ПАК), частота мультиаберантних клітин (МАК), відносна мутагенна ефективність на одиницю дози, відносна мутагенна ефективність (ВМЕ), формальні та теоретичні моделі дозових залежностей, коефіціент мутагенної ефективності, спектр аберацій, поклітинний розподіл аберацій та параметри його статистичного аналізу.

Мультиаберантними вважали клітини, які містили більше 5 аберацій та клітини з множинними невизначеними абераціями. Відносну мутагенну ефективність обчислювали за формулою: ВМЕ = С₂?А₁/С₁?А₂, де С₁ - концентрація препарату, що індукує мінімальний мутагенний ефект; С₂ - ініціальна токсична концентрація препарату; А₁ - ЧАА, індукованих препаратом в концентрації С₁; А₂ - ЧАА, індукованих препаратом в концентрації С₂. Вірогідність відмінностей між дослідними варіантами і контролем здійснювали за методом ч². Регресійний аналіз дозових залежностей проводили з використанням поліномних та експоненціальної функцій. Проводили аналіз відповідності експериментальних значень теоретичним моделям (Бочков, Чеботарёв, 1989), рішенням яких є функції:

модель №1: с = 1 - е ^{-(б + КС)} (експонента) (1)

модель №2: с = 1 - е ^{- (б + (КС І}/ ^{2 ) )} (S-подібна крива) (2)

модель №3: с = 1 - е ^{- (б + К1С)І} (S-подібна крива) (3)

модель №4: с = С² /( б + КС²) (гіпербола) (4)

де с - ЧАА, С - концентрація мутагену, К - коефіціент мутагенної ефективності, а - коефіціент, який вказує на зв'язок з очікуваним спонтанним рівнем ЧАА. Оцінку параметрів отримували кількісним методом мінімізації величини критерію ч² між експериментальними даними та очікуваними величинами (для адекватного визначення параметрів моделей проводили попередню оцінку параметрів б та К - знаходили рішення рівнянь 1-4 для експериментальних с_min та с_max, які потім визначали як стартові точки для функції мінімізації). За умов відповідності моделі №3, додатково оцінювали теоретичну можливість порогу дії мутагену. При б / К > 0 поріг дії відсутній, значення б / К < 0 обумовлені порогом дії.

Встановлені емпіричні розподіли аберацій по клітинах порівнювали з очікуваними частотами, виходячи з розподілів Пуасона (П), геометричного (Г) та двопопуляційної моделі (Д) - компаунда П+Г (Чеботарёв, 2000):

Р(x) = e^(-m) m^x / x! (розподіл Пуасона) (5)

Р(x) = и (1- и) ^x (геометричний розподіл) (6)

Р (x) = Р [(1- a) e^(-m) m^x / x! + a и (1- и )^x] (компаунд П+Г) (7),

де Р - загальна кількість проаналізованих клітин, a - частка клітин з Г розподілом аберацій, m - параметр розподілу П (середня кількість аберацій на клітину для клітин з П розподілом), и - параметр Г розподілу (частка клітин без аберацій для частки клітин, що розподіляються у відповідності до Г розподілу), х - кількість аберацій в клітині, Р (x) - кількість клітин з х абераціями. Визначення параметрів моделей розподілу отримували методом максимальної правдоподібності з оптимізацією оцінки параметрів (Шкарупа, 2007). Для обробки отриманих результатів було створено базу даних всіх клітин з абераціями хромосом в програмі Excel та використано пакети аналізу програм STATISTICA 6.0 i MATLAB 6.

У третьому розділі наведено результати дослідження токсичності хімічних мутагенів. Дозозалежний характер пригнічення кореневого приросту спостерігається при дії всіх мутагенів. За зростанням ЕС₅₀ мутагени розміщуються наступним чином: мітоміцин С, діоксидин, тіофосфамід. Аналіз значень ДЕС_90-10 дозволив побудувати інший ряд фітотоксичності: мітоміцин С > тіофосфамід > діоксидин. Це пояснюється різною динамікою прояву токсичних ефектів (табл.1). Ініціальні токсичні ефекти (ЕС₁₀) тіофосфамід проявляє при значно більших концентраціях, ніж діоксидин. Але з зростанням концентрації токсичність тіофосфаміду збільшується більш інтенсивно.

Таблиця 1. Порівняльна характеристика фітотоксичності хімічних мутагенів

Отримані результати, відповідно до існуючої класифікації (Довгалюк та ін., 2001], дозволили віднести мітоміцин С до середньотоксичних, а тіофосфамід і діоксидин до слаботоксичних щодо Allium cepa L. Мітотоксичність мутагенів зменшувалася в ряду: мітоміцин С, тіофосфамід, діоксидин. Динаміка змін МІ позитивно корелювала з кореневим приростом при дії всіх досліджених мутагенів. Однак ступінь цієї кореляції відрізнявся і зменшувався в ряду: діоксидин (r = 0,93; p < 0,0001), тіофосфамід (r = 0,87; p = 0,001), мітоміцин С (r = 0,73 p = 0,017).

Четвертий розділ. Аналіз дозових залежностей за умов пролонгованої дії хімічних мутагенів. Криві концентрація-ефект за критеріями ЧАА і частота аберацій для алкілуючих мутагенів мають S-подібний характер з виходом на „плато” при досягненні 84-90% рівня аберантних клітин. Для прооксидантного діоксидину притаманний гіперболічний характер кривих. Максимальний ефект мутагену при цьому не перевищує 40% аберантних клітин.

Для всіх досліджених препаратів спостерігається дозозалежне зменшення мутагенної ефективності в перерахунку на одиницю дози при збільшенні концентрації. ВМЕ тіофосфаміду та мітоміцину С є значно більшою, ніж у діоксидину (табл. 7). Це свідчить про те, що досліджені алкілуючі мутагени в більшій мірі, ніж прооксидантний здатні пригнічувати формування видимих перебудов хромосом з первинних пошкоджень ДНК в клітинах Allium cepa L.

Пролонгована експозиція з мутагенами призводить до дезінтеграції пулу мітотичних клітин. Найбільша частка клітин на стадії метафази (для алкілуючих мутагенів) - в точці переходу S-подібності кривої. При дії високих концентрацій мутагенів переважає тенденція збільшення профазного пулу клітин. Пригнічення проліферативної активності позитивно корелює з збільшенням концентрації мутагенів. Кореляція між МІ та ЧАА має більш виражений лінійний характер, ніж між МІ та концентрацією препаратів.

Регресійний аналіз кривих доза-ефект показав, що незалежно від структури і механізмів дії мутагенів, вони адекватно описуються поліномами четвертого ступеня. При низьких та середніх концентраціях мутагенів ці залежності наближаються до лінійно-квадратичних. Квадратичні коефіціенти при цьому мають від'ємний знак. Це вказує на те, що при збільшенні концентрації відбувається відхилення від лінійної залежності в сторону зменшення мутагенної ефективності, яке є квадратичною функцією від концентрації. При цьому слід зазначити, що коефіціенти при поліномах мають емпіричний характер і інтерпретація їх біологічного змісту є проблематичною.

Аналіз на основі теоретичних моделей виявив відмінності характеру дозових залежностей прооксидантного та алкілуючих мутагенів (табл. 2). Дію діоксидину адекватно описує модель №1: dA/dC = -KA (яка характерна для „багатоцентрових” хімічних мутагенів та радіації). Для тіофосфаміду дозові залежності адекватно описуються як моделлю №3: dA/dC = -K(C+С₀)A (притаманної для „одноцентрових” мутагенів), так і моделлю №1. Дію мітоміцину С адекватно описує модель№3. Для алкілуючих мутагенів така адекватність існує лише в діапазоні до виходу кривої доза-ефект на плато. Іншим наслідком аналізу є те, що для тіофосфаміду і мітоміцину С теоретично показано відсутність порогу дії мутагену в клітинах кореневої меристеми Allium cepa L. Це випливає з аналізу отриманих параметрів моделі №3 (значення б і К > 0). Для діоксидину, таке теоретичне обгрунтування відсутнє, оскільки модель, що адекватно описує його дозові залежності не передбачає врахування порогу дії мутагену. Слід зазначити, що теоретично очікувані рівні спонтанної ЧАА (с_0т) перевищують експериментальні (с_0е) (табл. 2).

Таблиця 2. Параметри теоретичних моделей дозових залежностей дії мутагенів

Привертає увагу, що при дії всіх досліджених мутагенів, в діапазоні ЧАА ? 5-7% відбувається різка зміна характеру дозової залежності. Мутагенна ефективність при цьому, для всіх препаратів зменшується в 8-9 разів. Це може свідчити про значну активацію захисних адаптивних механізмів при досягненні певного рівня цитогенетичних пошкоджень у Allium cepa L.

Спектр аберацій хромосом та особливості їх розподілу по клітинах за умов пролонгованої дії хімічних мутагенів. Спостерігали наступні морфологічні структури пошкоджень: фрагменти одинарні, фрагменти парні, одинарні мости, парні мости, мости з фрагментами (одинарними чи парними) або без них, МАК. Деякі з вказаних порушень. В спектрі перебудов хромосом, індукованих мутагенами переважали хроматидні аберації обмінного типу. Разом з тим, при зростанні концентрації мутагенів спостерігається зменшення частки всіх мостів порівняно з контролем при збільшенні частки парних мостів. В контролі частка мостів складала 80-84,61% (до загальної кількості аберацій). При дії високих концентрацій діоксидину (90 мг/л) та тіофосфаміду (10-40 мг/л) співвідношення мости/фрагменти - 1:1. При дії більшості концентрацій мітоміцину С співвідношення мости/фрагменти наближалось до 2:1. Отримані результати вказують на порушення процесів злиття центричних фрагментів під впливом досліджених мутагенів, що може бути обумовлено порушенням енергетичного обміну та зниженням ефективності репарації. При збільшенні діючих концентрацій мутагенів спостерігається також збільшення частки аберацій хромосомного типу.

Зміни кількості аберацій на аберантну клітину з дозою мутагенів не були такими значними, як за критерієм ЧАА. Наростання ПАК відбувалося набагато повільніше. Дія алкілуючих мутагенів призводить до більшої ПАК, ніж вплив діоксидину. Характерною особливістю цитогенетичної дії мутагенів була поява МАК. Проте, дозозалежне збільшення частоти МАК спостерігається лише за умов значного мутагенного навантаження.

Характерним для поклітинного розподілу аберацій хромосом при дії мутагенів в усіх діапазонах діючих концентрацій була його наддисперсність (S²/m > 1). При дії діоксидину емпіричний розподіл не відповідає теоретичним П чи Г розподілам в усьому діапазоні діючих концентрацій. Для тіофосфаміду і мітоміцину С відповідність Г розподілу спостерігали лише в певних діапазонах кластогенних ефектів (табл. 7). Спостерігається аномально підвищена кількість неаберантних та клітин з багатьма абераціями і диспропорція між кількістю неаберантних клітин та кількістю клітин з однією аберацією (порівняно з теоретичними розподілами). Найбільш адекватно експериментальні (Е) розподіли описуються двопопуляційною моделлю (компаундом розподілів: П+Г). Як приклад, наведено результати аналізу поклітинного розподілу аберацій при дії тіофосфаміду в діапазоні середніх концентрацій (табл. 3-4).

Таблиця 3. Порівняння емпіричного і теоретичних розподілів аберацій хромосом по клітинах при дії тіофосфаміду (в діапазоні середніх концентрацій)

Таблиця 4. Параметри відповідності експериментальних даних теоретичним розподілам при дії тіофосфаміду (в діапазоні середніх концентрацій)

Де S² - дисперсія розподілу; m - середня кількість аберацій на клітину; m_п(л) - середня кількість аберацій на клітину для субпопуляції з розподілом Пуасона; m_г - середня кількість аберацій на клітину для субпопуляції з геометричним розподілом; a - частка клітин з геометричним розподілом; p - частка клітин без аберацій в субпопуляції з геометричним розподілом

Компаунд розподілів адекватно описує появу МАК, більшість яких припадає на Г-субпопуляцію. Частота аберацій в цій субпопуляції значно перевищує таку в П субпопуляції. Спостерігається тенденція збільшення частки клітин Г-субпопуляції при збільшенні концентрації мутагенів. Проте, в діапазоні низьких концентрацій (при зміні характеру дозової залежності) та виходу кривої доза-ефект на „плато” спостерігається зменшення частки клітин з Г- розподілом.

Динаміка дозових залежностей частоти аберацій в різних субпопуляціях суттєво відрізняється. Зокрема, для П-субпопуляції крива дозової залежності має „плато”, а для Г-субпопуляції - ?-подібний характер. В діапазоні кривої до виходу на „плато” для П-субпопуляції спостерігається наближена до лінійної дозова залежність. В іншій субпопуляції (в діапазоні кривої до зменшення частоти аберацій) вона має експоненціальний характер для алкілуючих мутагенів, та більш складний для діоксидину.

Цитогенетичні ефекти хімічних мутагенів при різних строках фіксації. Було висловлено припущення, що різке зменшення частки клітин Г-субпопуляції при виході кривої доза-ефект на „плато” може бути обумовлено затримкою мітозу найбільш ушкоджених клітин. Кількісний аналіз цитогенетичних ефектів в залежності від строку фіксації проводили для двох мутагенів з різними механізмами дії - діоксидину та мітоміцину С.

Показана висока репарабельність пошкоджень ДНК, індукованих мітоміцином С. Для обох мутагенів зменшення частоти аберацій відбувається переважно за рахунок репарації в клітинах з невеликою кількістю аберацій. Разом з тим, спостерігається зростання частоти МАК, індукованих діоксидином і мітоміцином С при збільшенні строку фіксації. Характерно, що рівень ПАК індукований мітоміцином С при збільшенні строку фіксації зменшується на фоні збільшення частоти МАК. Отримані результати можуть свідчити про те, що при дії мутагенів, відбувається затримка мітозу пошкоджених клітин. Вона може відігравати роль захисного механізму, оскільки при цьому збільшується час можливої репарації пошкоджень ДНК. Репарація пошкоджень, які призводять до появи МАК або не відбувається або більш ускладнена.

Статистичний аналіз поклітинного розподілу аберацій виявив зростання частки клітин Г субпопуляції при збільшенні строку фіксації. Як приклад, наведено результати аналізу для мітоміцину С (табл. 5-6). Ймовірно, що затримка мітозу відбувається переважно для клітин з Г розподілом аберацій по клітинах. При цьому спостерігається зменшення частоти аберацій в обох субпопуляціях (таб. 6).

Таблиця 5. Порівняння емпіричного і теоретичних розподілів аберацій хромосом по клітинах при дії мітоміцину С (за умов різних строків фіксації)

Таблиця 6. Параметри відповідності експериментальних даних теоретичним розподілам при дії дії мітоміцину С (за умов різних строків фіксації)*

* - позначення ті ж, що й в табл. 4.

Аналіз і узагальнення результатів дослідження. Основні показники порівняльної характеристики генотоксичності досліджених мутагенів наведено в табл. 7. „Плато” на кривих концентрація - мутагенний ефект у більшості випадків пояснюють посиленням токсичності мутагенів при збільшенні їх концентрації. Те, що прооксидантний діоксидин не здатен індукувати високий рівень ЧАА притаманний дії алкілуючих мутагенів (табл. 7) може бути обумовлено, в тому числі, і його токсичністю. Оскільки вже при невисокому рівні індукованого мутагенезу (ЧАА = 12,3%) проявляються ініціальні токсичні властивості препарату. Проте, для алкілуючих препаратів наявність „плато” не може пояснюватись токсичністю, оскільки їх ЕС₁₀ лежать поза межами діапазону діючих концентрацій, які індукують кластогенні ефекти (табл.1).

Порівняння отриманих результатів з даними літератури дозволяє зазначити, що при пролонгованій дії досліджених мутагенів спостерігається значно більший цитогенетичний ефект (при значно менших нетоксичних концентраціях), ніж за умов короткочасної дії. Чим більшою є ефективність мутагену, тим більшою є різниця цитогенетичних ефектів за умов пролонгованої та короткочасної дії. Адекватність апроксимації дозових залежностей цитогенетичної дії хімічних мутагенів поліномом четвертого ступеня вказує на більш складні механізми реалізації їх мутагенного ефекту порівняно з іонізуючою радіацією (дозові залежності останньої описуються поліномом другого ступеня). Разом з тим, лише аналіз відповідності дозових залежностей теоретичним моделям дозволяє диференціювати можливий механізм дії хімічних мутагенів. Такий підхід дозволяє більш об'єктивно оцінити ефективність мутагену в широкому діапазоні діючих концентрацій. При цьому стає можливим порівняння ефективності різних мутагенів незалежно від їх концентрації, характеру дозової залежності та при використанні різних тест-об'єктів.

Виявлена залежність характеру поклітинного розподілу аберацій від концентрації мутагену, на перший погляд, суперечить даним літератури [Яковенко, 1974, Бочков,Чеботарёв, 1989, Chebotarev,Kosyakova, 2002]. Проте, більш детальний аналіз результатів досліджень, наведених в цих роботах показав, що незважаючи на різні висновки, отримані нами експериментальні дані принципово не відрізняються. Так, в культурі лімфоцитів людини відповідність Г розподілу аберацій при дії тіофосфаміду спостерігається лише для 4 з 6 концентрацій. При дії мітоміцину С відповідність геометричному розподілу спостерігалась для 5 з 6 концентрацій. При цьому, відповідність Г розподілу спостерігали в діапазонах кластогенних ефектів, аналогічним в наших експериментах. Невідповідність отриманих висновків, на нашу думку, обумовлена більшим діапазоном досліджених мутагенних ефектів та більшою кількістю концентрацій мутагенів в наших експериментах.

Таблиця 7. Порівняльна характеристика генотоксичності хімічних мутагенів

Відомо, що процеси репарації можуть відрізнятися швидкістю: надшвидка, швидка, та затримана (Козубек, Красавин, 1982). Саме при дії іонізуючої радіції, та АФК, притаманні репараційні процеси за участю ферментних систем характерних для надшвидкої та швидкої репарації. Репарації пошкоджень індукованих алкілуючими мутагенами притаманна багатоетапність. При першому наближенні, можна вважати, що формування аберацій хромосом відбувається у два етапи. Перший - індукція первинних пошкоджень ДНК. Другий - вплив процесів репарації на реалізацію первинних пошкоджень у аберації хромосом. Можна припустити, що розподіл первинних пошкоджень ДНК, індукованих мутагенами є випадковим і відповідає закону Пуасона. За умов надшвидкої та швидкої репарації процес реалізації первинних пошкоджень ДНК можна вважати миттєвим. В такому випадку частота аберацій зменшується в багато разів (порівняно з частотою первинних пошкоджень), що відповідає зменшенню параметру л в розподілі П, без зміни характеру розподілу. Коли ця умова не виконується, при затриманій у часі репарації пошкоджень ДНК з П розподілом - поклітинний розподіл аберацій хромосом буде відповідати геометричному. Результати аналізу цитогенетичної дії мутагенів при різних строках фіксації, які вказують на переважну затримку мітозу саме в клітинах Г субпопуляції підтверджують це припущення.

Характерним для дії досліджених мутагенів є збільшення частки „мостів”, зменшення ПАК та частки Г-субпопуляції клітин (частота аберацій при цьому зменшується в обох субпопуляціях) а також відсутність дозозалежного зменшення МІ в діапазоні зміни характеру дозової залежності (при дії низьких концентрацій мутагенів). Отримані результати опосередковано підтверджують припущення, що після перевищення певного рівня аберантних клітин (? 5-7%) у Allium cepa L. активуються адаптивні процеси, які призводять до зменшення відносної частки пулу аберантних клітин в кореневих меристемах. Якби такі процеси однаково впливали на обидві субпопуляції то їх співвідношення або не змінювалось, або відповідало б загальній тенденції зростання частки клітин з Г розподілом із збільшенням концентрації мутагенів. Проте, в експерименті спорстерігається зменшення частки клітин з цим розподілом. На нашу думку, такий феномен може бути обумовлений процесами репопуляції, які притаманні для меристем рослин (Гродзинський, 1989). Цей феномен полягає в тому, що після дії стресових факторів в низьких концентраціях відбувається вступ до мітозу клітин, які за нормальних умов не діляться. Частота аберацій та їх розподіл в таких клітинах найбільш ймовірно відповідає спонтанному рівню. Це може призводити до зменшення пулу аберантних клітин. Враховуючи, що частка Г-субпопуляції клітин при спонтанному мутагенезі є меншою, ніж при дії мутагенів, цілком зрозуміло її відносне зменшення при активації процесів репопуляції (Рис.9).

Дослідження закономірностей поклітинного розподілу аберацій при дії “одноцентрових” тіофосфаміду та мітоміцину С, прооксидантного діоксидину в наших експериментах, а також радіації та “двохцентрових” мутагенів за результатами аналізу аналогічних даних літератури дозволяє зробити наступні припущення. Подібність цитогенетичної дії іонізуючої радіації та “двохцентрових” хімічних мутагенів, обумовлюється, на наш погляд, індукцією значної кількості АФК (що пояснює наявність хромосомних обмінів в спектрі індукованих ними аберацій). Наявність обох механізмів первинних пошкоджень (проокcидантного та алкілуючого) і, відповідно, різні механізми їх реалізації у аберації хромосом і зумовлює, на нашу думку, не тільки відхилення розподілу аберацій хромосом при дії “двохцентрових” мутагенів від геометричного, але й адекватність опису дозових залежностей моделлю №1 та №4. Таким чином, відповідність лише моделі №1 вказує на прооксидантний механізм. Відповідність моделям №1 та №4 на значний вплив прооксидантних механізмів поряд з алкілуючими. Відповідність моделям №1 та №3 - про вплив на дозові залежності прооксидантних механізмів поряд з алкілуючими. А відповідність лише моделі №3 - на алкілуючі механізми у реалізації мутагенних ефектів (можлива незначна індукція АФК не впливає при цьому на характер дозових залежностей). Дані літератури щодо участі АФК у процесах алкілування ДНК та мутагенній дії алкілуючих агентів підтверджують ці припущення (Середенин, Дурнев, 1990).

ВИСНОВКИ

У дисертації показано ефективність використання інтегрального комплексу цитогенетичних критеріїв для оцінки хромосомної нестабільності, індукованої хімічними мутагенами. Запропоновано комплексний підхід кількісної оцінки цитогенетичних ефектів при хімічному мутагенезі.

1. Встановлені закономірності взаємозв'язку між параметрами токсичності та процесами індукованого діоксидином, тіофосфамідом і мітоміцином С мутагенезу у рослинного об'єкту Allium cepa L. Вихід кривих доза-мутагенний ефект тіофосфаміду і мітоміцину С на „плато” не обумовлюється їх токсичністю (на відміну від діоксидину). Досліджені алкілуючі мутагени здатні в більшій мірі, ніж прооксидантний пригнічувати формування видимих перебудов хромосом з первинних пошкоджень ДНК.

2. Формальна апроксимація дозових залежностей кластогенних ефектів хімічних мутагенів, незалежно від механізмів їх дії найбільш адекватна при використанні поліномів четвертого ступеню. Визначені теоретичні моделі, які адекватно описують дозові залежності цитогенетичної дії хімічних мутагенів. Дія алкілуючих та прооксидантного мутагенів описується різними теоретичними моделями.

4. Незалежно від хімічної будови, механізмів дії та ефективності мутагенів при перевищенні частоти аберантних клітин ? 5-7% в клітинах кореневої меристеми Allium cepa L. змінюється характер дозової залежності, мутагенна ефективність при цьому після точки переходу зменшується у 8-9 разів для всіх досліджених препаратів.

5. При дії хімічних мутагенів можливе існування двох субпопуляцій клітин, розподіл аберацій в яких обумовлений різними процесами (які описуються пуасонівським та геометричним розподілами). Проаналізовано динаміку змін співвідношення цих субпопуляцій в залежності від концентрації мутагенів та строку фіксації.

6. Аналіз поклітинного розподілу аберацій виявив відмінності мутагенезу індукованого прооксидантним та алкілуючими мутагенами. Для першого характерним є переважання частки субпопуляції клітин з Пуасонівським розподілом аберацій в усьому діапазоні діючих концентрацій. Висловлено припущення, що характер поклітинного розподілу аберацій при хімічному мутагенезі залежить від дози мутагенного чинника.

7. Встановлені закономірності мутагенезу, індукованого діоксидином та мітоміцином С у Allium cepa L. в залежності від строку фіксації. Виявлено високий рівень репарабельності цитогенетичних пошкоджень, індукованих мітоміцином С із збільшенням строку фіксації. Разом з тим, для обох мутагенів, при цьому, спостерігається збільшення частоти мультиаберантних клітин та частки субпопуляції клітин з геометричним розподілом.

8. Запропонована гіпотеза відповідно до якої, основною причиною відмінністі „багатоцентрових” мутагенів від „одноцентрових” є індукція ними значної кількості пошкоджень ДНК, репарація яких відбувається за механізмами, що призводять до Пуасонівського розподілу аберацій по клітинах (наприклад, при індукції вільнорадикальних процесів).

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Шкарупа В.М. Оцінка фіто- і цитогенотоксичної активності діоксидину в Allium-тесті / В.М.Шкарупа, Л.В.Неумержицька, І.Р. Бариляк // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Зб. наук. праць. - Київ-Луганськ-Харків. - 2005. Випуск 4(67). - С.33-40. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).

2. Шкарупа В.М. Мутагенез індукований діоксидином в Allium-тесті / В.М. Шкарупа, І.Р. Бариляк // Цитологія і генетика. - 2006, №5. - С.31-36. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).

3. Шкарупа В.М. Оцінка фітотоксичної і цитогенотоксичної активності алкілуючих протипухлинних препаратів / В.М. Шкарупа // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Зб. наук. праць. - Київ-Луганськ-Харків. - 2006. Випуск 1 (70). - С.30-40. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, написання статті).

4. Шкарупа В.М. Залежність концентрація - кластогенний ефект при дії мітоміцину С на клітини апікальної меристеми Allium cepa L. / В.М.Шкарупа, І.Р. Бариляк // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2006, Т.4. - № 2. - С.181-187. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).

5. Шкарупа В.М. Кількісний аналіз кластогенних ефектів, індукованих діоксидином. Характеристика кривої доза-ефект / В.М.Шкарупа, Л.В.Неумержицька, І.Р. Бариляк // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології. Зб. наук. праць. - Київ. - 2007. - Т.1 - С.555-560. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).

6. Шкарупа В.М. Кількісний аналіз цитогенетичних ефектів, індукованих мітоміцином С. Характеристика дозових залежностей / В.М. Шкарупа, І.Р. Бариляк // Вісник Українського товариства генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, №1. - С. 157-165. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).

7. Бариляк І.Р. Теоретичні моделі в аналізі дозових залежностей мутагенної дії мітоміцину C в дослідах на Allium cepa L. / І.Р. Бариляк, В.М. Шкарупа // Фактори експериментальної еволюції організмів. Зб. наук. праць. - Київ. - 2008. - Т.4 - С.362-368. (здобувачем проаналізовано літературу і здійснено експериментальну частину, участь у написанні статті).