Участь системи оксиду азоту в механізмах регуляції біохімічних процесів в динаміці розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.04 - біохімія

УЧАСТЬ СИСТЕМИ ОКСИДУ АЗОТУ В МЕХАНІЗМАХ РЕГУЛЯЦІЇ БІОХІМІЧНИХ ПРОЦЕСІВ В ДИНАМІЦІ РОЗВИТКУ І ЗАГОЄННЯ СТРЕС-ІНДУКОВАНИХ УРАЖЕНЬ СЛИЗОВОЇ ОБОЛОНКИ ШЛУНКА ЩУРІВ

МАКСИМОВИЧ ЯРОСЛАВА СЕРГІЇВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник:доктор біологічних наук, професор Остапченко Людмила Іванівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, декан біологічного факультету. Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, професор Берегова Тетяна Володимирівна, НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідувач відділу фармако-фізіології; кандидат біологічних наук Данилович Юрій Володимирович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, науковий співробітник відділу біохімії м'язів.

Захист дисертації відбудеться “23“ березня 2009 року о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано “20“ лютий 2009 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день досить інтенсивно вивчається участь оксиду азоту (NO) у патогенезі захворювань органів шлунково-кишкового тракту [Поленов С.А., 1998; Elliott S., 1998; Martin M.J., 2001; Kasparek M., 2008]. Експериментальними та клінічними дослідженнями показано, що за фізіологічних умов оксид азоту є унікальним модулятором багатьох фізіологічних процесів у шлунково-кишковому тракті, діє як ендогенний медіатор, відповідає за підтримання цілісності та відновлення тканин, виявляє гастропротекторні властивості, попереджуючи ураження слизової оболонки шлунка від різноманітних пошкоджуючих факторів [Поленов С.А., 1998; Barrachina M.D., 2001; Shah V., 2004]. Результати останніх досліджень дали можливість припустити, що активація синтази оксиду азоту (NO-синтази) і надмірна кількість NO проявляє як захисні так і цитотоксичні властивості і є однією з причин розвитку виразки шлунка, хронічного гастриту, онкопатології, бактеріальних гастроентеритів, а також гострих та хронічних запалень кишечника [Cho C.H., 2001; Kolios G., 2004; Wiley J.W., 2007].

Але на даний момент не існує єдиної думки щодо участі різних ланок системи оксиду азоту в механізмах розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів. В літературі є дані, що NO, синтезований конститутивними ізоформами NOS (cNOS) та індуцибельною ізоформою (iNOS) залучений як у розвиток пошкоджень, так і відновлення цілісності тканин [Yasutada A., 1998; Yoshida Y., 2000; Takeuchi К., 2007].

З літературних джерел відомо, що за умов запалення активуються процеси ліпопероксидації на фоні зниження захисних властивостей антиоксидантної системи, внаслідок чого накопичуються токсичні продукти перекисного окиснення ліпідів [Сосунов А.А., 2000; Kwiecie Т.S., 2002; Kountouras J., 2001; Скляров О.Я., 2007]. Підвищення рівня оксиду азоту та супероксидного радикалу сприяє утворенню пероксинітриту - сильного окисника, високоактивної та токсичної сполуки, що бере участь в багатьох хімічних реакціях у біологічних системах, у тому числі в нітруванні залишків тирозину в білках, окисленні біологічних тіолів, внаслідок чого порушується енергетичний метаболізм клітини, виникають розриви ланцюгів ДНК. Ці процеси можуть призвести до формування структурно-геморагічних уражень слизової оболонки шлунка [Недоспасов А.А., 2005; Gyires K., 2005].

Тому, на сьогоднішній день актуальним є дослідження механізмів розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка і участь в цих процесах оксиду азоту та його похідних.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у науково-дослідній лабораторії «Фізико-хімічної біології» біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми «Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції і профілактики» (№ д/р 0106U005750).

Мета і завдання дослідження. З'ясувати участь системи оксиду азоту в механізмах розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів.

Для досягнення мети досліджень було поставлено такі завдання:

1. Дослідити активність NO-синтази в клітинах слизової оболонки шлунка щурів в динаміці формування і загоєння стрес-індукованих уражень.

2. Вивчити вплив неселективного і селективних інгібіторів NO-синтази на формування і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка в експерименті.

3. Дослідити експресію ізоформ NO-синтази на різних етапах формування і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів.

4. Дослідити стан процесів пероксидного окиснення ліпідів і функціонування системи антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази, каталази, глутатіонзалежних пероксидази, трансферази, редуктази) в клітинах слизової оболонки шлунка щурів в то.

5. Дослідити часову динаміку вмісту пероксинітриту на різних етапах формування і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів.

Об'єкт досліджень - механізми функціонування системи оксиду азоту в клітинах слизової оболонки за умов експериментальної стресової моделі виразки шлунка у щурів.

Предмет досліджень - система оксиду азоту за умов формування і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів.

Методи досліджень - спектрофотометричні (визначення активностей синтази оксиду азоту, антиоксидантних ферментів та вмісту ТБК-активних продуктів тощо), флуориметричні (вміст відновленого глутатіону та пероксинітриту), молекулярно-біологічні (ПЛР), радіоізотопні (визначення активності сGMP-залежної протеїнкінази) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження функціонування системи оксиду азоту та виявлено її модулюючий вплив на систему антиоксидантного захисту клітин слизової оболонки шлунка. Встановлено, що в біохімічні механізми формування стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка задіяний оксид азоту, який продукується конститутивними ізоформами NO-синтази, а в процеси загоєння структурно-геморагічних дефектів залучений оксид азоту, який генерує індуцибельна ізоформа NO-синтази. Показано підвищення вмісту високотоксичної похідної оксиду азоту пероксинітриту, що супроводжується накопиченням ТБК-активних продуктів. Вперше показано, що при короткотривалому впливі стресового чинника (30 хвилин) збільшується активність сGMP-залежної протеїнкінази, яка залучена у процеси вазодилатації, активації і адгезії тромбоцитів, що може бути однією із причин формування структурно-геморагічних уражень слизової оболонки шлунка щурів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані поглиблюють існуючі уявлення про участь оксиду азоту в механізмах розвитку і загоєння стрес-індукованих виразкових дефектів. Результати досліджень свідчать про участь різних ізоформ NO-синтази в процесах деструкції і загоєння слизової оболонки шлунка, що сприяють розробці направленої корекції виявлених порушень із застосуванням специфічних інгібіторів відповідних ізоформ. Виявлені порушення антиоксидантно-прооксидантної рівноваги, що призводять до накопичення токсичних похідних вільнорадикального окислення, зокрема ТБК-активних продуктів та пероксинтіриту, можуть бути основою для впровадження науково обґрунтованих рекомендацій щодо застосування модуляторів антиоксидантно-прооксидантного статусу клітин для підвищення загальної резистентності.

Особистий внесок здобувача. Планування та розробка методичних підходів щодо виконання лабораторних досліджень, узагальнення результатів експериментів і редагування дисертаційної роботи виконані дисертантом з науковим керівником. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, обробка та теоретичне обґрунтування результатів досліджень виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні теоретичні положення та результати досліджень були представлені на 6-th PARNAS conference “Molecular mechanisms of cellular signaling” (Кrakow, 2007), VII Всеукраїнській науковій конференції студентів та аспірантів «Біологічні дослідження молодих учених в Україні» (Київ, 2007), VІ Міжнародній науково-практичній конференції молодих учених «Шевченківська весна» (Київ, 2008), IV міжнародній конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (Львів, 2008), 5th International Symposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/Organoprotection (Yalta, 2008) та обговорені на наукових семінарах кафедри біохімії.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць, з яких: 4 - статті у фахових періодичних виданнях, затверджених переліком ВАК України, 7 - тези у матеріалах міжнародних та всеукраїнських конференцій, з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що включає 188 джерел. Дисертація викладена на 148 сторінках і проілюстрована 21 рисунком та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

У дослідах використовували нелінійних білих щурів-самців масою 250-270 г. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. За добу до проведення експерименту щури мали доступ лише до води. Експериментальну виразку шлунка у піддослідних тварин викликали методом імобілізаційного водно-імерсійного стресу [Takagi K., 1968]. Неселективний інгібітор NO-синтази метиловий ефір NG-нітро-L-аргініну (L-NAME) у дозі 2,5 мг/кг [Takeuchi K., 1998], селективні інгібітори ферменту аміногуанідин - 50 мг/кг [Takeuchi K., 2007] та 7-нітроіндазол -50 мг/кг [Москвин А. Н., 2002] вводили внутрішньо-очеревинно за 10 хв до початку дії стресового чинника. Тварин забивали методом дислокації шийних хребців. Візуально досліджували стан слизової оболонки шлунка щурів і розраховували ступінь та індекс виразкового ураження застосовуючи систему балів [Стефанов О.В., 2001]. Визначення активності NO-синтази проводили згідно з методом [Hevel J.M., 1991]. Активність ферменту виражали в нмоль продуктів аеробного окислення оксиду азоту, утворених ферментом за 1 хв з розрахунку на 1 мг білка. Визначення вмісту пероксинітриту проводили методом реєстрації пероксинітритзалежного окислення дигідрородаміну 123 до родаміну 123, який має здатність до флуоресценції [Kooy N.W., 1997]. Вміст нітрит-іонів визначали за методом Гріса з модифікаціями [Green L.C., 1982]. РНК отримували згідно з методом [Chomczynski P.,1987]. Отримання кДНК та полімеразну ланцюгову реакцію проводили згідно з [Маниатис Т., 1984]. Для ампліфікації фрагментів ДНК використовували такі послідовності праймерів: 5?- GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3? (iNOS - прямий), 5?- CTC CTG CCC ACT GAC TTC GTC-3? (iNOS - зворотній), 5?- CTA CAA GGT CCG ATT CAA CAG-3? (nNOS - прямий), 5?-CCC ACA CAG AAG ACA TCA CAG-3? (nNOS - зворотній), 5?- TAC GGA GCA GCA AAT CCA -3? (eNOS - прямий), 5?- CAG GCT GCA GTC CTT TGA TC-3? (eNOS - зворотній). Вміст ТБК-активних продуктів визначали згідно з методом [Гаврилов В.П., 1987]. Активність супероксиддисмутази (далі СОД) у клітинах визначали згідно з методом [Чевари С., 1985] і виражали в умовних одиницях за хвилину на мг білка. Активність каталази в клітинах визначали згідно з методом [Королюк М.А., 1988] перераховували на 1 мкмоль Н2О2 за хвилину на мг білка. Вміст відновленого глутатіону вимірювали за допомогою флуориметричної мітки - ортофталевого альдегіду за методом [Lewis C. 1984] і виражали в нмоль на 1 мг білка. Активність глутатіонзалежних ферментів визначали відповідно до рекомендацій [Власова С.Н., 1990; Колесниченко Л.С., 1987]. Активність сGMP-залежної протеїнкінази (ПК G) визначали за включенням 32Р з г-32Р-АТФ до відповідного специфічного білкового субстрату. Радіоактивність вимірювали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107, питому активність ферментів виражали в пмоль 32Р за 1 хвилину на 1 мг білка.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики на основі 7 - 12 повторів (М±m, n=7 - 12) [Брандт Т.А., 1975]. Одержані результати досліджень перевіряли на нормальність розподілу за допомогою U-тесту Шапіро-Вілка. Якщо дані відповідали нормальному розподілу, то для їх порівняння використовували t-критерій Стюдента для незалежних вибірок. У випадку, коли ряди даних не підлягали нормальному розподілу, статистичну обробку здійснювали, використовуючи непараметричний метод - тест Мана-Вітні. Статистичні розрахунки та побудову діаграм проводили з використанням програм “Microsoft Excel 2007” та “StatisticSoft 6.0”.

Результати досліджень та їх обговорення

У динаміці розвитку стресової моделі виразки шлунка візуальне дослідження дало можливість встановити, що ступінь ураженості слизової оболонки залежить від тривалості дії пошкоджуючого фактора. Через 12 та 24 год після припинення дії стресу спостерігалося відновлення уражених ділянок слизової оболонки шлунка (табл. 1).

Таблиця 1. Ступінь виразки (СВ) та виразковий індекс (ВІ) в динаміці розвитку та загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка та при введенні інгібіторів синтази оксиду азоту (n=7-12)

Час, год СтресСтрес + L-NAME, 2,5 мг/кгСтрес + 7-нітроіндазол, 50 мг/кгСтрес + аміногуанідин, 50мг/кгСВ, M±mВІСВ, M±mВІСВ, М±mВІСВ, M±mВІ0,50,10±0,100,0100000,10±0,100,0110,70±0,260,35000,72±0,140,521,10±0,101,1021,87±0,481,900,44±0,18#0,191,20±0,131,201,80±0,231,8033,77±0,223,771,50±0,22#1,501,50±0,67#1,503,10±0,233,10121,71±0,18*1,770,90±0,10#0,810,82±0,13#0,672,60±0,22#2,60240,43±0,20*0,1800001,30±0,21#1,17* - р ? 0,05 порівняно з групою тварин після 3-х годинного впливу стресу

# - р ? 0,05 порівняно з тваринами, що піддавалися дії стресу

Дослідження функціонування NO-синтази показало підвищенням її активності, яка досягала максимальних значень на 3 годину дії пошкоджуючого чинника. Процеси загоєння характеризувалися зменшенням активності ферменту, але даний показник не досягав контрольних значень. Активація NO-синтази в клітинах слизової оболонки шлунка супроводжувалась зростанням вмісту нітрит-аніону (NO2? ) у ці ж терміни досліджень. Через 12 та 24 год після припинення дії пошкоджуючого чинника нами було відмічено зниження рівня NO2?.

Надмірні кількості оксиду азоту, продуковані синтазою оксиду азоту, можуть викликати ураження слизової оболонки шлунка внаслідок порушення енергетичного обміну клітин та індукції утворення активних форм кисню, сприяти розвитку запальних процесів, а також формуванню високотоксичних похідних NO, зокрема пероксинітриту (ONOO?).

Нами було визначено вміст пероксинітриту за умов розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів. Встановлено, що під впливом стресового чинника рівень ONOO? в слизовій оболонці шлунка збільшувався порівняно з контрольною групою тварин на всіх етапах дослідження.

Додатковим свідченням того, що за дії стресу оксид азоту залучений в патогенетичні механізми ульцерогенезу є те, що при застосуванні неселективного інгібітору - L-NAME, спостерігався гастропротекторний ефект: виразковий індекс у цієї групи був нижчим, ніж у тварин, які піддавалися дії стресу. За цих умов активність NO-синтази була статистично достовірно нижчою відносно показників тварин, що піддавалися 1, 2, 3 годинному впливові пошкоджуючого чинника, однак залишалась підвищеною порівняно з контрольними значеннями. Зростання активності NO-синтази в клітинах слизової оболонки шлунка супроводжувалося підвищенням вмісту нітрит-іону у ці ж терміни досліджень. Дані показниками через 12 та 24 год після припинення дії стресу залишались на тому ж рівні. За умов введення L-NAME нами не було відмічено значних змін рівня пероксинітриту в клітинах слизової оболонки шлунка щурів.

Отримані нами результати дають підстави припустити, що підвищення активності NO-синтази призводить до збільшення рівня оксиду азоту, накопичення пероксинітриту, що може бути однією з додаткових причин розвитку структурно-геморагічних уражень слизової оболонки шлунка за дії стресу.

Оксид азоту, як відомо, синтезується трьома ізоформами синтази оксиду азоту - ендотеліальною (eNOS), нейрональною (nNOS) та індуцибельною (iNOS) [Gorren A., 2007]. З метою з'ясування ролі кожної з них у патогенезі стрес-індукованого виразкоутворення нами було застосовано селективні інгібітори нейрональної та індуцибельної NO-синтаз.

Введення інгібітору нейрональної ізоформи синтази оксиду азоту 7-нітроіндазолу приводило до зменшення ступеню ураженості слизової оболонки шлунка порівняно з групою тварин, які піддавалися дії лише стресового чинника. Активність NO-синтази за цих умов збільшувалася порівняно з контролем і досягала максимальних значень на 2 годину дії пошкоджуючого чинника (у 3 рази). Слід відмітити, що порівняно з показниками тварин, які піддавалися дії лише стресу, на всіх етапах розвитку структурно-геморагічних уражень активність ферменту була нижчою. Через 12 та 24 год після припинення дії пошкоджуючого фактору активність NO-синтази була в межах контрольних величин.

Рівень нітрит-іону в слизовій оболонці шлунка за цих умов також зростав порівняно з контролем, однак відносно значень 30-хвилинного, 1, 3 годинного впливу пошкоджуючого фактору досліджуваний показник був нижчим. Через 12 та 24 год після припинення дії стресу вміст нітрит-іону не відрізнявся від контрольних значень. Нами не було зафіксовано значних відхилень вмісту пероксинітриту від фізіологічної норми при введенні 7-нітроіндазолу.

Відомо, що нейрональна ізоформа NО-синтази присутня у нітрергічних нейронах, які іннервують судини органів шлунково-кишкового тракту. Отже, надмірні кількості оксиду азоту, генеровані nNOS, можуть призводити до незворотної релаксації гладеньких м'язів і порушення кровопостачання слизової оболонки шлунка. Це, в свою чергу, може спричинити розвиток тканинної гіпоксії, ацидоз та некроз клітин епітелію, утворення крововиливів [Yasuhiro T., 1997]. Крім того нейрональна NO-синтаза здатна продукувати супероксидний радикал [Dawson V.L., 1996] та залучена в ранні етапи розвитку запалення [Сомова Л.М., 2006]. Застосування селективного інгібітору має гастропротекторну дію, пригнічуюючи вище вказані процеси.

Для визначення участі індуцибельної ізоформи NO-синтази у розвитку та загоєнні стрес-індукованих уражень нами було застосовано її селективний інгібітор аміногуанідин. При його введенні візуальні дослідження показали, що ступінь ураженості слизової оболонки шлунка щурів залишався на рівні, характерному тваринам за умов дії стресу. Однак вплив аміногуанідину спричинював пригнічення регенераторних процесів (табл. 1).

Активність NO-синтази за цих умов була статистично достовірно вищою відносно контрольних значень на 44, 203, 464, 90, 76 та 37% у всі терміни досліджень. На третю годину дії пошкоджуючого фактору було зафіксовано зниження активності ферменту порівняно з показниками тварин, що піддавалися дії лише стресу у цей же термін досліджень.

При введенні аміногуанідину рівень нітрит-іону підвищувався відносно контролю у всі терміни досліджень, однак у порівнянні з показниками тварин, що піддавалися лише дії стресу, достовірне зниження вмісту NO2? спостерігалося лише після 3 годинного впливу пошкоджуючого чинника та через 12 год після припинення дії стресу. Змін вмісту пероксинітриту при введенні аміногуанідину нами не було зафіксовано. Можна припустити, що розвиток структурно-геморагічних уражень за цих умов при відсутності пероксинітриту спричинюють надлишкові кількості оксиду азоту, а також надмірна кількість вільнорадикальних сполук, що утворюються під час запалення.

Крім того, отримані нами дані дають можливість припустити, що оксид азоту, синтезований іNOS, відіграє позитивну роль у загоєнні стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка, оскільки він здатен викликати пригнічення запальних процесів, зменшення викиду активних форм кисню та активувати певним чином процеси ангіогенезу, що надзвичайно важливо для перебігу загоєння виразкових уражень.

Оскільки при визначенні вмісту нітрит-іону в плазмі крові нами не було виявлено суттєвих змін як при дії стресу, так і за умов введення інгібіторів, то можна припустити, що генерований NO-синтазою оксид азоту залишається в тканинах слизової оболонки шлунка, де може спричинювати різноманітні пошкодження клітинних структур [Kendall H.K., 2001; Shah V., 2004].

У зв'язку з тим, що застосування інгібіторів синтази оксиду азоту не дозволило точно встановити роль кожної з ізоформ NOS в процесах ульцерогенезу, наступним етапом нашого дослідження було встановити рівень експресії ендотеліальної, нейрональної та індуцибельної NO-синтаз за умов розвитку та загоєння стрес-індуковоних уражень слизової оболонки шлунка.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що експресія мРНК iNOS у слизовій оболонці інтактних щурів, а також у тварин, що піддавалися короткотривалій дії стресу, не відбувається. Лише після 2 годинного впливу пошкоджуючого чинника було зафіксовано експресію мРНК iNOS, інтенсивність якої продовжувала зростати і в наступний період дії стресового фактора. Рівень мРНК iNOS залишався таким же і під час регенерації ушкоджених ділянок слизової оболонки шлунка. Активацію експресії індуцибельної NO-синтази можна пояснити зростанням рівня прозапальних факторів в крові піддослідних тварин під впливом стресу [Bal-Price A., 2000]. У той же час нами не було зафіксовано змін експресії мРНК нейрональної та ендотеліальної ізоформ синтази оксиду азоту на всіх етапах досліджень.

Отже, на основі отриманих нами результатів можна припустити, що у випадку розвитку стрес-індукованих уражень слизової оболонки основний внесок у гіперпродукцію оксиду азоту роблять конститутивні ізоформи синтази оксиду азоту, а у процеси загоєння залучений оксид азоту, синтезований індуцибельною ізоформою ферменту.

Відомо, що на функціонування сGMP-залежної протеїнкінази опосередковано впливає оксид азоту [Murthy K., 2004]. Тому нами було досліджено активність цього ферменту і встановлено, що максимальне збільшення активності ПКG (у 2,7 рази порівняно з контролем) відбувається після 30 хвилин дії стресу. У подальші терміни дослідження спостерігалося пригнічення активності ферменту. Так, після 1, 2 та 3 годинного впливу пошкоджуючого фактору активність ПKG знижувалася, однак контрольних значень вона не досягала. Надмірна активація цього ферменту може бути додатковим чинником формування масивних крововиливів внаслідок уповільнення процесів адгезії та агрегації тромбоцитів, а також призводити до порушень кровопостачання, пригнічення моторики гладеньких м'язів, що є додатковими цитотоксичними факторами під час ульцерогенезу [Martin M.J., 2001]. азот оксид слизовий шлунок

Для визначення механізму порушення кровопостачання слизової оболонки шлунка в стрес-індукованому ульцерогенезі нами був використаний серотонін як вазоконстрикторний агент. В результаті проведених нами досліджень було встановлено, що при введенні серотоніну ступінь ураженості слизової оболонки шлунка та активація синтази оксиду азоту не такі інтенсивні як при дії стресу.

Оксид азоту разом з іншими вільнорадикальними сполуками може ініціювати пероксидне окиснення ліпідів [Hughes M.N., 2008]. Порушення окисного гомеостазу, яке характеризується накопичення ліпідних радикалів, гідропероксидів на фоні зниження функціональних можливостей антиоксидантної системи є одним з патогенних факторів виникнення та рецидивів різних захворювань в організмі [Kountouras J., 2001]. Тому наступним етапом наших досліджень стало визначення основних показників системи пероксидного окиснення ліпідів та антиоксидантного захисту.

Показано, що за умов стрес-індукованого виразкоутворення вміст ТБК-активних продуктів підвищувався протягом всього періоду досліджень і досягав максимального значення за 3 годинної дії пошкоджуючого чинника (у 2 рази вище від контролю). Процеси загоєння супроводжувалися зниженням вмісту вторинних продуктів окислення ліпідів, але порівняно з контрольними величинами досліджуваний показник залишався підвищеним.

У результаті проведених досліджень встановлено, що дія стресового фактору призводить до зниження активності супероксиддисмутази. Зниження активності цього ферменту можна пояснити окисними модифікаціями гістидинових залишків, які відповідають за зв'язування іонів міді та цинку у активному центрі СОД [Uchida K., 1994]. Порушення функціонування супероксиддисмутази сприяє накопиченню супероксидного радикалу, який, взаємодіючи з оксидом азоту, призводить до утворення пероксинітриту. Оскільки зниження активності ферменту співпадає із зростанням вмісту пероксинітриту, то можна припустити, що саме внаслідок пригнічення функцій однієї з ланок антиоксидантного захисту відбувається накопичення ONOO?, який є додатковим цитотоксичним фактором при розвитку структурно-геморагічних уражень слизової оболонки шлунка.

Припинення дії стресу призводить до відновлення каталітичної функції СОД, про що свідчить підвищення її активності до контрольних значень. При цьому спостерігається зниження рівня пероксинітриту.

З літературних джерел відомо, що супероксиддисмутаза продукує пероксид водню, який є субстратом для каталази. Незважаючи на встановлене нами зниження активності СОД під дією стресового фактору, було зафіксовано підвищення активності каталази у ці ж терміни дослідження. Таке явище можна пояснити тим, що пероксид водню може утворюватись внаслідок спонтанної дисмутації супероксидного радикалу, а також під час реакції супероксидного радикалу з радикалом пероксилу (*НО2?) [Liochev S., 2002].

Оскільки глутатіон вважають одним з найважливіший антиоксидантів в шлунково-кишковому тракті, який може знешкоджувати оксид азоту та його високотоксичні похідні [Walkner K.W., 1997], наступним етапом нашої роботи стало дослідження стану глутатіон-залежної антиоксидантної системи.

У результаті проведених досліджень було встановлено, що під дією стресового фактору відбувається зміна вмісту відновленого глутатіону у клітинах слизової оболонки шлунка. Хоча на ранніх етапах дії пошкоджуючого чинника даний показник практично не змінюється, однак, 2 та 3 годинний

вплив пошкоджуючого чинника призводив до статистично достовірного зменшення вмісту відновленого глутатіону порівняно з контрольними величинами. Процеси загоєння структурно-геморагічних уражень слизової оболонки супроводжуються поверненням даного показника до фізіологічної норми.

Активність глутатіонпероксидази знижувалася на 2 та 3 годину впливу стресового фактору. Через 12 год після припинення дії пошкоджуючого чинника спостерігалося певне підвищення активності глутатіонпероксидази, а через 24 год - рівень активності ферменту досягав контрольних показників. Оскільки глутатіонпероксидаза має пероксинітритредуктазну дію [Arteel G.E., 1999], то пригнічення її активності може призводити до порушень функціонування одного з механізмів знешкодження пероксинітриту.

Нами були встановлено, що навіть короткотривала дія стресу призводить до зниження на 30% порівняно з контролем активності глутатіонтрансферази - ферменту, який відповідає за знешкодження токсичних продуктів пероксидації, шляхом трансформації, нековалентного зв'язування і ковалентного приєднання реактивних метаболітів та ксенобіотиків. У наступні терміни дії пошкоджуючого чинника досліджень активність ферменту суттєво не змінювалась. Процеси відновлення цілісності слизової оболонки шлунка супроводжувалися зростанням активності глутатіонтрансферази.

Рівень відновленого глутатіону в клітині підтримується двома шляхами: синтезом de novo з амінокислот-попередників та шляхом відновлення окисленого глутатіону специфічним ферментом - глутатіонредуктазою [Барабой В.А, 2006]. У результаті проведених нами досліджень було встановлено, що при дії стресового фактору активність глутатіонредуктази знижується. Процеси загоєння супроводжувалися відновленням активності ферменту спочатку до фізіологічної норми, а потім навіть певним зростанням порівняно з контрольними значеннями. Оскільки ці дані співвідносяться з показниками рівня відновленого глутатіону, можна припустити, що однією з причин зниження рівня відновленого глутатіону є порушення функціонування глутатіонредуктази, очевидно внаслідок модифікації пероксинітритом тирозинового залишку, який знаходиться у безпосередній близькості від сайту зв'язування окисленого глутатіону [Francescutti D., 1996].

На підставі проведених досліджень нами встановлено, що в складні механізми стрес-індукованого виразкоутворення залучений оксид азоту і його похідна - пероксинітрит. Можна припустити, що конститутивні ізоформи синтази оксиду азоту виявляють цитотоксичні властивості, тоді як індуцибельна NOS сприяє відновленню ушкоджених ділянок слизової оболонки шлунка. Однією з причин накопиченя пероксинітриту та інших вільнорадикальних сполук може бути зафіксоване нами порушення функціонування антиоксидантної системи.

ВИСНОВКИ

1. Показано участь різних ланок системи оксиду азоту у відповідних етапах формування і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів.

2. Розвиток стрес-індукованих уражень протягом трьох годин супроводжується постійним підвищенням активності NO-синтази і накопиченням нітрит-іонів в клітинах слизової оболонки шлунка щурів.

3. Встановлено, що застосування селективного інгібітору нейрональної ізоформи NO-синтази при дії стресу має гастропротекторний ефект, що проявляється у зменшенні ступеню ураженості слизової оболонки шлунка. Застосування аміногуанідину - селективного інгібітору індуцибельної ізоформи синтази оксиду азоту - не мало помітного впливу на розвиток стрес-індукованих пошкоджень, однак призводило до уповільнення процесів відновлення уражених ділянок слизової оболонки шлунка.

4. Встановлено активацію експресії мРНК індуцибельної NO-синтази на другу годину дії пошкоджуючого фактору, однак рівень експресії мРНК ендотельної та нейрональної ізоформ ферменту не відрізнявся від контрольних показників.

5. Дослідження функціонування антиоксидантної системи захисту в динаміці розвитку стрес-індукованих уражень показали зниження активності її основних ферментів (супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, глутатіонтрансферази, глутатіонредуктази) спряжене з виснаженням пулу відновленого глутатіону та накопиченням ТБК-активних продуктів. Процеси відновлення уражених ділянок слизової оболонки шлунка характеризувалися нормалізацією вищезазначених показників.

6. Показано, що розвиток стрес-індукованих деструктивних уражень слизової оболонки шлунка щурів супроводжувався зростанням вмісту пероксинітриту на всіх етапах досліджень.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Максимович Я.С. Участь оксиду азоту в процесах виразкоутворення / Л.І. Остапченко, О.В. Дробінська, Я.С. Максимович, [та ін.] // Проблеми екологічної та медичної генетики і клітинної імунології. - 2006. - №5. - С. 177-181. (Особистий внесок здобувача - визначення активності синтази оксиду азоту, підготовка матеріалів до друку).

2. Максимович Я.С. Вплив інгібіторів синтезу оксиду азоту на процеси виразкоутворення / Дробінська О.В., Максимович Я.С., Остапченко Л.І. // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». - 2006. - Т. 20 (59), № 1. - С. 74-76. (Особистий внесок здобувача - проведено дослідження активності нейрональної та індуцибельної ізоформ синтази оксиду азоту, статистичну обробку та аналіз даних).

3. Максимович Я. Оксид азоту в патогенезі виразки шлунка / Я. Максимович, О. Дробінська, Ю. Гавриленко // Вісник Київського Національного університету імені Тараса Шевченка. Серія «Біологія» - 2007. - № 49-50. - С. 73-75. (Особистий внесок здобувача - проведено пошук та аналіз літературних даних).

4. Максимович Я.С. Роль ізоформ синтази оксиду азоту в ульцерогенезі / Максимович Я.С., Дробінська О.В., Остапченко Л.І. // Фізика живого. - 2008. - Т.16, №1. - С. 130-134. (Особистий внесок здобувача - визначення активності ізоформ синтази оксиду азоту, аналіз отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку).

5. Maksymovych I.S. The role of nitric oxide synthase isoforms in processes of ulceration / Maksymovych I.S., Ostapchenko L.I., Drobinska L.V. // 6th Parnas сonference мolecular mechanism of cellular signalling, 30th may - 2nd june 2007. : abstracts. - Krakow, 2007. - P. 60-61.

6. Максимович Я.С. Роль оксиду азоту в ульцерогенезі, спричиненого стресом / Максимович Я.С., Берник О.О., Остапченко Л.І. // Біологічні дослідження молодих учених в Україні : VII всеукраїнська наукова конф. студентів та аспірантів, 20-21 вер. 2007 р.: матеріали конф. - К., 2007. - С. 16.

7. Maksymovych I.S. Nitric oxide in processes of gastric ulcer development / Maksymovych I.S., Drobinska L.V., Ostapchenko L.I. // Neuro-humoral and cellular regulatoty mechanisms of digestion processes : III International conference, 4th -6th Oct. 2007 : abstracts - Lviv, 2007. - P. 36-37.

8. Максимович Я. Вплив неселективного інгібітору синтази оксиду на процеси розвитку виразок слизової оболонки шлунка щурів / Максимович Я., Берник О., Дробінська О. // Шевченківська весна : IV Міжнародна науково-практична конф. студентів, аспірантів та молодих вчених, 20-23 бер. 2008 р. : збірник тез. - К., 2008. - С. 9-10.

9. Максимович Я. Участь оксиду азоту в процесах розвитку та загоєння виразок слизової оболонки шлунка щурів / Максимович Я., Дробінська О., Різун О. // Молодь і поступ в біології : IV міжнародна наукова конф. студентів та аспірантів, 7-10 квіт. 2008 р. : збірник тез. - Л., 2008. - С. 48.

10. Maksymovych I.S. Nonselective nitric oxide syntase inhibitor influence on processes of gastric mucosal ulcer development / Maksymovych I.S., Drobinska O.V., Ostapchenko L.I. // 5th International symposium on cell/tissue injury and cytoprotection/organoprotection, 17-19 sep. 2008 : abstracts. - Yalta, 2008. - P. 20.

11. Максимович Я.С. Активность синтазы оксида азота и протеинкиназы G в динамике развития стресс-индуцированных поражений слизистой оболочки желудка крыс / Максимович Я.С., Дробинская О.В., Остапченко Л.И. // Биология - наука ХХІ века : 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, 10-14 нояб. 2008 г. : сб. тезисов. - Пущино, 2008. - С. 92 - 93.

АНОТАЦІЯ

Максимович Я.С. Участь системи оксиду азоту в механізмах регуляції біохімічних процесів в динаміці розвитку і загоєння стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка щурів - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Досліджено активність синтази оксиду азоту в слизовій оболонці шлунка за умов розвитку та загоєння стрес-індукованих уражень. Встановлено, що під впливом пошкоджуючого фактору відбувається активація NOS, яка супроводжується підвищенням рівня нітрит-іонів та пероксинітриту в тканинах. Вище вказані біохімічні зміни в слизовій оболонці шлунка супроводжувалися розвитком структурно-геморагічних уражень. Введення неселективного інгібітору L-NAME мало значний гастропротекторний ефект та призводило до зниження активності синтази оксиду азоту, зниження рівня нітрит-іонів та пероксинітриту порівняно з показниками тварин, що піддавалися дії лише стресу. При застосуванні селективних інгібіторів нейрональної та індуцибельної NOS, а також при дослідженні характеру експресії мРНК кожної з ізоформ було встановлено, що основний внесок у гіперпродукцію оксиду азоту роблять конститутивні ізоформи синтази оксиду азоту, а у процеси загоєння залучений оксид азоту, синтезований індуцибельною ізоформою ферменту. Також було відмічено, що під впливом пошкоджуючого фактору відбувається активація сGMP-залежної протеїнкінази.

Було показано інтенсифікацію процесів перебігу перекисного окислення ліпідів та порушення функціонування ферментів антиоксидантної системи захисту під час розвитку стрес-індукованих уражень слизової оболонки шлунка та нормалізація досліджуваних показників під час процесів загоєння.

Ключові слова: стрес-індукований ульцерогенез, NO, NO-синтаза, пероксинітрит, сGMP-залежної протеїнкінази.

АННОТАЦИЯ

Максимович Я.С. Участие системы оксида азота в механизмах регуляции биохимических процессов в динамике развития и заживления стресс-индуцированных повреждений слизистой оболочки желудка крыс - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Работа посвящена исследованию активности синтазы оксида азота и состоянию антиоксидантной системы в слизистой оболочке желудка при развитии и заживлении стресс-индуцированных поражений. Установлено, что под влиянием повреждающего фактора происходит активация NOS, которая сопровождается повышением уровня нитрит-иона и пероксинитрита в тканях. Такие биохимические изменения сопровождались развитием структурно-геморрагических повреждений слизистой оболочки. Введение неселективного ингибитора NOS L-NAME имело гастропротекторный эффект и сопровождалось уменьшением активности фермента, уровня нитирит-иона и пероксинтрита в сравнении с показателями животных, которые подвергались действию только стресса. Применение селективного ингибитора нейрональной изоформы NO-синтазы 7-нитроиндазола также имело определенный гастропротекторный эффект и сопровождалось уменьшением активности фермента, уровня нитрит-ионов в сравнении с животными, которые подвергались действию только стресса, но относительно контрольных значений оставались несколько повышенными. Введение аминогуанидина, селективного ингибитора индуцибельной синтазы оксида азота не влияло на развитие стресс-индуцированных повреждений, однако степень пораженности после прекращения действия повреждающего фактора была больше, чем у животных, которые подвергались действию только стресса. Уменьшение активности фермента и уровня оксида азота под действием ингибитора наблюдалось только через 3 часового влияния повреждающего фактора. Содержание пероксинитрита при этих условиях не менялось.

Исследования уровня экспрессии мРНК всех изоформ синтазы оксида азота показало, что содержание мРНК эндотелиальной и нейрональной изоформ NOS не меняется на всех этапах исследования и не отличается от контрольных показателей, в то время, как экспрессия мРНК индуцибельной синтазы оксида азота в норме и на ранних этапах действия повреждающего фактора не обнаружена. Только после 2-х часового воздействия стресса было отмечено появление мРНК данной изоформы фермента, интенсивность экспрессии которой возрастало с увеличением длительности влияния повреждающего фактора и оставалась на таком же уровне и в период заживления.

Исследование активности сGMP-зависимой протеинкиназы показало, что после 30 минутного действия стресса данный показатель возрастает, но с увеличением длительности повреждающего фактора, активность фермента постепенно уменьшается, но все же не достигает контрольных значений.

Нами установлено, что под действием стресса нарушается липопероксидное равновесие, о чем свидетельствует увеличение количества ТБК-активных продуктов. Процессы регенерации поврежденных участков слизистой оболочки желудка сопровождались снижением исследуемого показателя.

Важную роль в защите клетки от свободных радикалов, в том числе и от пероксинитрита, играет антиоксидантная система. Под влиянием стресса снижается активность супероксиддисмутазы, но возрастает активность каталазы, что может быть опосредованным доказательством увеличения содержания супероксидного радикала, который вступая в реакцию с оксидом азота, образовывает пероксинитрит. Глутатионзависимые ферменты и сам трипептид имеют большое значение в обезвреживании этого высокотоксического соединения, однако содержание восстановленного глутатиона и активность глутатионзависимых ферментов под влиянием стресса уменьшались, что может свидетельствовать о нарушении функционирования системы детоксикации свободных радикалов и быть дополнительным цитотоксическим фактором при развитии структурно-геморрагических поражений слизистой оболочки желудка.

Полученные результаты подтверждают немаловажную роль системы оксида азота как в развитии, так и в заживлении стресс-индуцированных повреждений слизистой оболочки желудка.

Ключевые слова: стресс-индуцированный ульцерогенез, NO, NO-синтаза пероксинитрит, сGMP-зависимая протеинкиназа.

ANNOTATION

Maksymovych I.S. Participation of nitric oxide system in mechanisms of regulation of biochemical processes in dynamics of stress-induced gastric ulcer development and healing. - A manuscript.

Dissertation for the candidate biological sciences degree in speciality 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2009.

The activity of nitric oxide synthase (NOS) was investigated under development and healing of stress-induced gastric mucosa injuries. It was established, that disturbing factor activated NOS and increased the levels of nitrite and peroxynitrite in the tissues. These biochemical changes were accompanied by the development of gastric mucosa damages. Administration of NOS non-selective inhibitor L-NAME had gastroprotective effects and caused decreasing of nitric oxide synthase activity, reduction of nitrite and peroxynitrite concentrations. While using selective inhibitors of neuronal and inducible NOS, and also during the research of the mRNA expression character of each isoform it was discovered that the main contribution to the nitric oxide hyperproduction is made by the constitutive isoforms of nitric oxide synthase and during the regenerative process nitrogen oxide is involved, which is synthesized by inducible isoform of the ferment. It was registered enlargement protein kinase G activity under stress-induced ulceration.

It was detected lipids peroxidation intensification and disturbances of functioning of ferments of antioxidant protection under development and healing of stress-induced gastric mucosa injuries.

Key words: stress-induced ulceration, nitric oxide, nitric oxide synthase, peroxynitrite, protein kinase G.

Размещено на Allbest.ru