Размещено на http://allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ЦІАНІНОВІ БАРВНИКИ ЯК ФЛУОРЕСЦЕНТНІ ЗОНДИ ДЛЯ ДЕТЕКЦІЇ ФІБРИЛЯРНОГО -СИНУКЛЕЇНУ

03.00.20 - біотехнологія

ВОЛКОВА Катерина Дмитрівна

Київ-2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор Ярмолюк Сергій Миколайович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу комбінаторної хімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Солдаткін Олексій Петрович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії біомолекулярної електроніки відділу механізмів трансляції генетичної інформації;

доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Костянтинович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, провідний науковий співробітник відділу хімії білків та пептидів.

Захист дисертації відбудеться 23 червня 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

Автореферат розіслано 23 травня 2009 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Патогенез ряду нейродегенеративних розладів, серед яких хвороби Паркінсона, Альцгеймера, а також пріонні захворювання, супроводжується накопиченням у тканинах мозку нерозчинних агрегатів білкової природи -- -складчастих амілоїдних фібрил. Поява амілоїдних включень у нервових клітинах спричинює часткову дегенерацію нейронів і порушення їх функціонування. Амілоїдні агрегати мають різний білковий склад залежно від типу нейродегенеративного захворювання. Зокрема, при хворобі Паркінсона основним компонентом білкових включень є агрегований у фібрили -синуклеїн (АСН).

Найзручнішим методом визначення амілоїдних фібрил є флуоресцентна спектроскопія. Нині існує обмежена кількість барвників, які практично використовуються як флуоресцентні зонди для детекції агрегованих у фібрили білків, найвідоміший серед них Ї Тіофлавін Т. Однак, всі барвники для визначення амілоїду є недосконалими. Зокрема, детекція фібрилярних білків з використанням Тіофлавіну Т має низьку відтворюваність результатів, що ускладнює кількісне визначення агрегованого білка. Таким чином, розробка нових барвників для детекції амілоїдних фібрил і дослідження можливості їх застосування для вивчення процесу фібрилоутворення є актуальними завданнями.

На сьогодні не вивчені закономірності взаємодії ціанінових барвників з агрегованим у фібрили білком, тому дослідження комплексу барвник/амілоїдна фібрила дасть змогу розробити нові, більш ефективні флуоресцентні зонди для детекції амілоїдних утворень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках бюджетної теми відділу комбінаторної хімії Інституту молекулярної біології та генетики НАН України 2.2.4.16 «Синтез мезо-заміщених в поліметиновому ланцюгу триметинціанінів та вивчення механізму їхньої взаємодії з нуклеїновими кислотами та білками» (№ державної реєстрації 0103U000070, 2003-2007 рр.), в рамках гранту Європейської федерації біохімічних товариств (FEBS) (2007 р.) і гранту Міжнародного наукового фонду УНТЦ, № 4936 (2008-2010 рр.). амілоїдний ціаніновий флуоресцентний

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи -- пошук нових флуоресцентних зондів на основі ціанінових барвників для специфічної детекції фібрилярного АСН і вивчення структури комплексу барвник/амілоїдна фібрила.

Для досягнення цієї мети було поставлено та вирішено такі завдання:

1. Дослідити спектрально-люмінесцентні характеристики серії ціанінових барвників у вільному стані та у присутності нативних і агрегованих білків в-лактоглобуліну (БЛГ) та АСН.

2. Вивчити залежність між здатністю барвників специфічно підвищувати інтенсивність флуоресценції у присутності амілоїдних фібрил та їх хімічною структурою.

3. Охарактеризувати комплекс барвник/фібрилярний АСН за допомогою спектральних методів та атомної силової мікроскопії.

4. Вивчити зв'язування ціанінових барвників із фібрилами, що утворені білками різного амінокислотного складу.

5. Запропонувати можливу структуру комплексу ціаніновий барвник/фібрилярний АСН.

6. Дослідити можливість застосування найефективніших із досліджених барвників для кількісного визначення фібрилярного АСН і моніторингу кінетики процесу фібрилоутворення in vitro.

Об'єкт дослідження: взаємодія ціанінових барвників з амілоїдними фібрилами АСН.

Предмет дослідження: спектрально-люмінесцентні властивості ціанінових барвників у вільному стані та у присутності амілоїдних фібрил БЛГ і АСН, комплексоутворення барвників з амілоїдними фібрилами.

Методи дослідження: електронна спектроскопія поглинання та випромінювання, флуоресцентна спектроскопія з розділенням у часі, поляризаційна флуоресцентна спектроскопія, атомна силова мікроскопія, напівемпіричний метод АМ1.

Наукова новизна одержаних результатів:

Дослідження комплексів барвник Т-284/фібрила АСН методом флуоресцентної спектроскопії з розділенням у часі. Нами було виміряно час життя збудженого стану вільного монометинціаніну Т-284 і його комплексів з АСН. Показано, що згасання флуоресценції барвника у вільному стані має дві складові: швидка ф₁ ~0,04 нс (внесок у загальний час життя 91 %) та більш довготривала ф₂ ~2,43 нм (внесок 9 %). Ґрунтуючись на літературних даних, ми припускаємо, що компонент ф₁ з домінантним внеском належить транс-ізомеру барвника, а довше живучий ф₂ Ї цис-конформації Т-284. Загальний час життя для вільного Т-284 становив ф ~0,25 нс (табл.5).

У присутності фібрил АСН спостерігали збільшення загального часу життя збудженого стану Т-284 майже на порядок (до ~2,50 нс), що свідчить про утворення комплексу барвник фібрилярний АСН. Крім того, після зв'язування з фібрилами в затуханні флуоресценції Т-284 з'являвся новий повільний компонент ф₃ ~4,05 нс із домінантним внеском 43 % (табл. 5).

Таблиця 5

Час життя флуоресценції збудженого стану Т-284 у вільному стані та у присутності фібрил АСН

Примітки: ф₁, ф₂, ф₃ -- складові часу життя флуоресценції збудженого стану для Т-284; A₁, A₂, A₃ -- відносні внески компонентів часу життя ф₁, ф₂, ф₃ відповідно; ф -- загальний час життя флуоресценції; ч² -- середньоквадратичне відхилення.

Ми вважаємо, що новий компонент ф₃ належить зв'язаній формі барвника Ї комплексу барвник/фібрила. Таким чином, вірогідно, що у присутності агрегованих білків Т-284 може існувати у трьох різних формах Ї транс-ізомеру (ф₁), у цис-конформації (ф₂) і в комплексі з фібрилою («зв'язана форма» барвника, ф₃).

Візуалізація комплексів Т-284/фібрилярний АСН методом атомної силової мікроскопії (АСМ). Було отримано АСМ-зображення фібрил АСН за відсутності та у присутності барвника Т-284. Показано, що діаметр фібрил АСН у вільному стані становив близько 6,3±1,0 нм. Водночас, при формуванні комплексу барвник Т-284/фібрила АСН спостерігали статистично достовірне (р<0,05) збільшення діаметра фібрил майже до 8,0 нм. Подібну закономірність було описано для Тіо-Т у комплексі з фібрилами інсуліну (Khurana et al., 2005).

Таким чином, формування комплексу барвник/фібрила супроводжується збільшенням діаметра фібрили АСН на ~20%, якщо порівняти з фібрилою у вільному стані.

Моделювання структури комплексу барвник/фібрилярний АСН серії моно- та триметинціанінових барвників. У ході агрегації АСН утворюються _складчасті фібрили, в яких амінокислотні ланцюги білка лежать перпендикулярно осі фібрили й утворюють «канали зв'язування», які розташовані вздовж фібрили.

Ширина каналу дорівнює відстані між кожним другим радикалом амінокислоти в поліпептидній послідовності та становить у середньому 6,5 Е. Згідно з літературними даними, молекула барвника фіксується в цьому каналі найдовшою віссю (Х) паралельно осі фібрили за типом зв'язування 1 чи 2. Така жорстка фіксація у «каналі зв'язування» фібрили обмежує обертання гетерозалишків молекули барвника навколо метинового зв'язку, що супроводжується зростанням інтенсивності флуоресценції.

Щоб визначити, чи існує кореляція між розмірами ціанінових барвників та їх здатністю підвищувати флуоресценцію в комплексі з фібрилою АСН, нами обчислено розміри молекул серії моно- (T-414, T-284, PO, Cyan-40, TO, SH-21305) і триметинціанінових (Т-49 та SH-516) барвників (табл. 1-3) по осях X, Y і Z. Ґрунтуючись на запропонованій у літературі моделі (Krebs et al., 2005), ми припускаємо, що для фіксації в «каналі зв'язування» розміри барвника по осях Y чи Z (або обох із них) мають не перевищувати ширини каналу (~6,5 Е). За результатами розрахунків визначено, що розміри всіх досліджуваних ціанінових барвників потенційно дають їм змогу увійти в канал фібрили відповідно до цієї моделі.

Більшість із досліджених барвників (за винятком монометинціанінів PO і Cyan-40) по осях X і Y перевищують ширину «каналу зв'язування», тому можна припустити, що фіксуватися в каналі вони можуть лише за розташування молекули барвника віссю Z перпендикулярно осі фібрили (тип зв'язування 1).

Аналізуючи підвищення інтенсивності флуоресценції у присутності агрегованого білка, такі барвники можна умовно поділити на три групи.

Барвники першої групи (тіахіномонометинціаніни ТО і Т-196, бензотіазольний триметинціанін Т-49) практично не підвищували інтенсивність флуоресценції у присутності агрегованого АСН. Ураховуючи невеликі розміри молекул цих ціанінів уздовж осі Z (< 2 Е), можна припустити, що ці барвники є надто пласкими для щільної фіксації в «каналі зв'язування» фібрили.

Водночас, барвники другої групи (монометинціаніни T-414, T-284, SH-395 і триметинціанін SH-516) специфічно підвищували інтенсивність флуоресценції у присутності агрегованого АСН (I_Ф/I_М ~3,4-9,5). Отже, можна припустити, що їх розміри по осі Z (від ~3 до ~4,5 Е) дозволяють їм не лише розміститися в каналі фібрили згідно з типом зв'язування 1, але і щільно зафіксуватися там.

Барвники третьої групи (несиметричні монометинціаніни Cyan-40 і РО) також підвищували інтенсивність флуоресценції у ході зв'язування з фібрилярним АСН, але їх розміри, на відміну від ціанінів другої групи, гіпотетично дозволяють їм розташуватися в «каналі зв'язування» як за типом зв'язування 1, так і за типом зв'язування 2. Оскільки невеликі розміри цих барвників по осі Z (до ~2 Е) є недостатніми для жорсткої фіксації у каналі за типом зв'язування 1, найімовірніше, барвники цієї групи зв'язуються з фібрилою за типом зв'язування 2.

Можна припустити, що барвники з об'ємними гетерозалишками здатні щільніше фіксуватися в «каналі зв'язування» фібрил АСН, ніж більш пласкі молекули. Однак ця здатність є обмеженою так званими «критичними» розмірами барвника, оскільки надто об'ємні молекули не можуть увійти в канал унаслідок стеричних утруднень.

Наші розрахунки дають змогу припустити, що для оптимальної фіксації в «каналі зв'язування» фібрили АСН барвники мають бути ~3-4,5 Е по осі Z та не перевищувати 6,5 Е по осі Y.

Отже, в результаті зв'язування ціанінових барвників із фібрилами утворюється високофлуоресцентний комплекс барвник/фібрила. Доказами утворення такого комплексу є суттєве зростання значень флуоресцентної анізотропії (~0,28) і часу життя збудженого стану (до ~2,5 нс) ціанінів у присутності фібрил, порівняно з барвниками у вільному стані чи у присутності мономерного білка. Крім того, у комплексі з барвником спостерігали збільшення діаметра фібрили АСН на ~20 %, якщо порівняти з фібрилою у вільному стані. На основі комп'ютерного моделювання нами запропоновано модель зв'язування ціанінових барвників з амілоїдними фібрилами і визначено оптимальні розміри ціанінів для щільної фіксації в «каналі зв'язування» фібрили.

Дослідження зв'язування ціанінових барвників з фібрилами, утвореними білками різного амінокислотного складу. Агреговані у фібрили інсулін і лізоцим є широко розповсюдженими модельними білками для дослідження процесу фібрилогенезу. Тому для того, щоб дослідити можливість використання ціанінових барвників Т-284 і SН-516 для специфічного визначення в розчині різних фібрилярних білків, нами вивчено спектральні властивості цих ціанінів у присутності нативних та агрегованих у фібрили інсуліну й лізоциму. Отримані значення інтенсивності емісії барвників у присутності цих білків порівнювали з відповідними значеннями для комплексів барвник/фібрила АСН. Потрібно зазначити, що у робочому розчині концентрація барвників була у 5разів нижчою, порівняно з іншими експериментами.

Показано, що барвники Т-284 і SН-516 виявляють істотне підвищення інтенсивності флуоресценції у присутності не лише агрегованого АСН, а й фібрилярних інсуліну та, меншою мірою, лізоциму, порівняно з відповідними мономерними білками.

Незважаючи на те, що барвник Т-284 мав найбільшу «чутливість» до фібрилярного АСН, він також підвищував інтенсивність флуоресценції у присутності фібрил інсуліну й лізоциму (І_Ф/І_М ~5,0-9,0). Підвищення інтенсивності емісії SH_516 у присутності агрегованого АСН та інсуліну було практично однаковим (І_Ф/І_М ~12,5-16,0), тоді як «чутливість» до фібрил лізоциму у цього барвника була дещо нижчою. Варто зазначити, що для обох ціанінів підвищення інтенсивності емісії у присутності фібрил було близьким до цього показнику у Тіо-Т. Отже, флуоресцентні барвники Т-284 і SH-516, на наш погляд, можуть бути використані для специфічного визначення не лише фібрил АСН, а й інших агрегованих у фібрили білків, зокрема модельних інсуліну та лізоциму.

Дослідження можливості використання барвників Т-284 і SH-516 для кількісної детекції фібрил АСН. Для визначення лінійного діапазону детекції фібрилярного АСН для барвників T-284 і SH-516 нами проведено флуоресцентне титрування цих ціанінів агрегованим білком. Криві титрування апроксимовано лінійною залежністю отриманих даних методом найменших квадратів. Показано, що обидва ціанінові барвники можна використовувати для кількісного визначення як мінімум ~1,5 мкг/мл фібрилярного АСН. Верхні межі детекції для Т-284 і SH_516 становили ~19 мкг/мл і ~28 мкг/мл фібрилярного білка відповідно. Для Тіо-Т діапазон детекції АСН становив від ~2 до ~35 мкг/мл. Отже, ціанінові барвники Т_284 і SH-516 можна використовувати для кількісної детекції АСН, агрегованого у фібрили.

Застосування ціанінових барвників T-284 і SH-516 для дослідження процесу фібрилоутворення АСН in vitro. Для отримання фібрил розчин мономерного АСН у буфері інкубували при 37 єС протягом 180 год. Щоб з'ясувати, чи можна використовувати ціанінові барвники T-284 і SH-516 для моніторингу реакції фібрилоутворення, кожні ~24 год від інкубованої суміші відбирали аліквоти, додавали до них барвники і вимірювали інтенсивність флуоресценції ціанінів. Тіо-Т використовували для порівняння. Кожну реакцію агрегації повторювали тричі. Утворення фібрил підтверджували методом атомної силової мікроскопії.

Показано, що інтенсивність емісії барвників Т-284, SH-516 і Тіо-Т зростала пропорційно часу інкубування АСН. На основі здобутих даних будували графіки залежності інтенсивності емісії барвників від часу інкубування білка.

Обидва ціанінові барвники мали високу відтворюваність результатів у серії проведених експериментів. Для Тіо-Т відтворюваність результатів була суттєво нижчою. Завдяки високій відтворюваності результатів ці барвники можуть бути запропоновані для розробки на їх основі скринінгової платформи для пошуку інгібіторів процесу агрегатоутворення.

ВИСНОВКИ

Уперше на основі ціанінових барвників розроблено нові флуоресцентні зонди для специфічної детекції амілоїдних фібрил in vitro і запропоновано модель зв'язування ціанінів із фібрилами -синуклеїну.

1. З'ясовано, що моно- та триметинціанінові барвники у присутності фібрил _лактоглобуліну та -синуклеїну підвищують інтенсивність флуоресценції у 10-100 разів, тоді як додавання агрегованого у фібрили білка майже не впливало на інтенсивність емісії пента-, гептаметинціанінів і сквараїнів.

2. Показано, що наявність у гетерозалишках ціанінових барвників стирильних, амінних, метиламінних чи диметиламінних замісників і метильного заміснику в -положенні триметинціанінів сприяє їх зв'язуванню з фібрилярними білками.

3. Про утворення комплексу ціанінів із фібрилярним -синуклеїном свідчить зростання значень флуоресцентної анізотропії (до ~0,28) та часу життя збудженого стану (до ~2,5 нс) барвників, порівняно з ціанінами у вільному стані чи у присутності мономерного білка. Обчислено константи зв'язування барвник/фібрила -синуклеїну (К_зв) для ціанінів Т-284 (~1,8Ч10⁶ М^-1) і SH-516 (~1,5Ч10⁶ M^-1).

4. На основі комп'ютерного моделювання запропоновано модель комплексу барвник/фібрила, згідно з якою барвник розміщується в «каналі зв'язування» своєю віссю паралельно довгій осі фібрили.

5. Обчислення розмірів молекул барвників дає змогу припустити, що для оптимальної фіксації в «каналі зв'язування» фібрили розмір барвників не повинен перевищувати 6,5 Е по основних осях і бути від ~3 до ~4,5 Е по осі Z.

6. Вперше запропоновано монометинціаніновий барвник Т-284 і триметинціанін SH-516 для кількісного визначення фібрилярного -синуклеїну. Лінійний діапазон детекції агрегованого білка становив 1,5-19 мкг/мл (Т_284) і 1,5_28 мкг/мл (SH-516). Показано можливість практичного застосування цих барвників для флуоресцентного визначення не лише фібрилярного _синуклеїну, а й агрегованого у фібрили інсуліну та лізоциму.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Cyanine dye-protein interactions: looking for fluorescent probes for amyloid structures / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, Yu. L. Slominskii, S. M. Yarmoluk // J. Biochem. Biophys. Methods. Ї 2007. Ї Vol. 70, № 5. Ї P. 727-733. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії моно-, три-, пента- і гептаметинціанінових барвників у присутності мономерного та фібрилярного БЛГ.

2. Specific fluorescent detection of fibrillar alpha-synuclein using mono- and trimethine cyanine dyes / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, A. G. Golub, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, O. I. Tolmachev, S. M. Yarmoluk // Bioorg. Med. Chem. Ї 2008. Ї Vol. 16, № 3. Ї P. 1452-1459. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії ціанінових барвників у присутності АСН, обчислення константи зв'язування барвників з фібрилою.

3. Дослідження серії моно- та триметинціанінових барвників як флуоресцентних зондів для визначення фібрилярного -лактоглобуліну / К. Д. Волкова, В. Б. Ковальська, А. О. Баланда, Ю. Л. Сломінський, О. І. Толмачов, В. Субраманіам, С. М. Ярмолюк // Ukrainica Bioorganica Acta. Ї 2008. Ї Т. 6, № 2. Ї С. 15-21. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії моно- і триметинціанінових барвників у присутності мономерного і фібрилярного БЛГ, виявлення хімічних груп, які сприяють зв'язуванню барвників із фібрилами.

4. Explorations of the application of cyanine dyes for quantitative -synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, G. M. Segers-Nolten, G. Veldhuis, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Biotechnic & Histochemistry. Ї 2009. Ї Vol. 84, № 2. Ї P. 55-61. Особистий внесок здобувача -- дослідження можливості застосування амілоїд-чутливих барвників T-284 і SH-516 для визначення фібрилярного АСН in vitro.

5. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar amyloidogenic proteins detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, A. G. Golub, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“First Conference of Young Scientists of Institute of Molecular Biology and Genetics Dedicated to the 185^th Anniversary of Gregor Mendel”], (Kyiv, 17-18 May, 2007). Ї K. : Inst. of Mol. Biol. and Gen. NASU, 2007. Ї 155 p. Особистий внесок здобувача -- аналіз залежності між здатністю барвника підвищувати флуоресценцію у присутності фібрилярних білків і його хімічною структурою.

6. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar alpha-synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Biological Basis of Senile Pathology Development”], (Kyiv, 29 January, 2007). Ї K. : Inst. of Gerontology AMNU, 2007. Ї 162 p. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії ціанінів у присутності АСН; виявлення хімічних груп, що сприяють зв'язуванню барвник/фібрила.

7. Cyanine dyes as novel fluorescent probes for selective amyloid proteins detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, R. J. Vermeij, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“First Asian Spectroscopy Conference & Asian Biospectroscopy Conference 2007”], (Bangalore, 29 January-2 February, 2007). Ї Bangalore : Indian Inst. of Science, 2007. Ї 540 p. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії ціанінів у присутності БЛГ; виявлення хімічних груп, що сприяють зв'язуванню барвників із фібрилами.

8. Novel fluorescent dyes for selective fibrillar -synuclein detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, A. O. Balanda, M. Yu. Losytskyy, R. J. Vermeij, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“10^th Conference on Methods and Applications of Fluorescence”], (Saltzburg, 9-12 September, 2007). Ї Regensburg: Inst. of Anal. Chem., Chemo- and Biosensors, 2007. Ї 498 p. Особистий внесок здобувача -- спектральні дослідження серії моно- і триметинціанінів у присутності АСН; аналіз залежності між здатністю барвника підвищувати флуоресценцію у присутності фібрилярних білків та його хімічною структурою.

9. Cyanine dye T-284 interaction with -synuclein fibril: fluorescence anisotropy studies / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Actual problems of biochemistry and biotechnology 2008”], (Kyiv, 12-13 June, 2008). Ї K. : Palladin Inst. of Biochem., 2008. Ї 40 p. Особистий внесок здобувача -- дослідження барвника Т-284 у комплексах із амілоїдними фібрилами АСН в поляризованому світлі.

10. Studies of T-284 and SH-516 cyanine dyes as fluorescent probes for specific -synuclein fibrils detection / K. D. Volkova, V. B. Kovalska, V. Subramaniam, S. M. Yarmoluk // Conference thesis [“Bridges in Life Sciences Annual Scientific Review”], (Zagreb, 4 October, 2008). Ї Budapest : VARIMED Ltd., 2008. Ї 112 p. Особистий внесок здобувача -- характеризація комплексів ціанінових барвників T-284 і SH-516 із фібрилярним АСН методами флуоресцентної спектроскопії з розділенням у часі, поляризаційної флуоресцентної спектроскопії та атомної силової мікроскопії.

АНОТАЦІЯ

Волкова К. Д. Ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції фібрилярного -синуклеїну. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 -- біотехнологія. -- Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2009.

Мета дисертаційної роботи -- пошук нових флуоресцентних зондів серед ціанінових барвників для специфічної детекції фібрил -синуклеїну та вивчення структури комплексу барвник/амілоїдна фібрила. Уперше запропоновано ціанінові барвники як флуоресцентні зонди для детекції амілоїдних агрегатів _лактоглобуліну і -синуклеїну. Виявлено структурні фрагменти, наявність яких у молекулі ціанінів сприяє його зв'язуванню з фібрилярними білками. Комплекси барвник/фібрилярний -синуклеїн охарактеризовано за допомогою методів флуоресцентної анізотропії, спектроскопії з розділенням у часі й атомної силової мікроскопії. На основі результатів комп'ютерного моделювання запропоновано модель комплексу барвник/фібрила, згідно з якою барвник розміщується в «каналі зв'язування» своєю найдовшою віссю паралельно довгій осі фібрили. Моно- (Т_284) і триметинціанінові (SH-516) барвники запропоновано як зонди для визначення _синуклеїну, агрегованого у фібрили та кількісної оцінки процесу фібрилоутворення in vitro.

Ключові слова: ціанінові барвники, флуоресцентні зонди, амілоїдні фібрили, -синуклеїн.

АННОТАЦИЯ

Волкова Е.Д. Цианиновые красители как флуоресцентные зонды для детекции фибриллярного -синуклеина. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой ступени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Цель диссертационной работы -- поиск новых флуоресцентных зондов среди цианиновых красителей для специфической детекции фибриллярного _синуклеина и изучения структуры комплекса краситель/фибрилла. Впервые цианины предложены как флуоресцентные зонды для детекции фибрилл _лактоглобулина и -синуклеина. Определены структурные фрагменты, наличие которых в молекуле красителя способствует связыванию красителя с фибриллой. Комплексы краситель/фибрилла охарактеризованы методами флуоресцентной анизотропии, спектроскопии с разрешением во времени и атомной силовой микроскопии. На основе результатов компьютерного моделирования предложена модель комплекса краситель/фибрилла, согласно которой краситель размещается в «канале связывания» своей длинной осью параллельно длинной оси филамента. Моно- (Т_284) и триметинцианиновые (SH-516) красители предложены как зонды для определения -синуклеина, агрегированного в фибриллы и количественной оценки процесса фибриллообразования in vitro.

Ключевые слова: цианиновые красители, флуоресцентные зонды, амилоидные фибриллы, -синуклеин.

SUMMARY

Volkova K. D. Cyanine dyes as fluorescence probes for fibrillar -synuclein detection. -- Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (PhD) Degree in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Amyloid aggregates are hallmarks of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's, and Huntington's disease, and of the prion diseases.

The human -synuclein protein plays a central role in the etiology of Parkinson's disease, and forms fibrillar aggregates that are found in Lewy bodies in the brain, structures which are characteristic of the disease.

Detection of -synuclein and other amyloid fibrils is usually performed by measuring the strongly enhanced fluorescence emission of specific fluorescent probes upon interaction with amyloid fibrils.

The fluorescent dye, Thioflavin T, is the most frequently used dye for detection of amyloid structures.

Despite the widespread use of Thioflavin T, its application for amyloid quantification often gives inconsistent and inaccurate results.

Thus the design of new dyes which can selectively interact with fibrillar amyloidogenic proteins is of substantial importance for basic research, and has a practical significance for biotechnology and medicine.

For the first time we ascertained the ability to detect fibrillar -synuclein and в_lactoglobulin of a series of mono-, tri-, penta-, and heptamethinecyanines based on various heterocycles and squaraine dyes.

Fluorescence properties of these cyanine dyes were measured in the unbound state and in the presence of monomeric and fibrillar proteins and compared with those for the commercially available dye Thioflavin T.

The correlation between the chemical nature of the dye molecules and the ability of dyes to bind aggregated proteins was established.

It was shown, that cyanine dyes demonstrated noticeable specific fluorescence response in the presence of aggregated proteins and could be proposed as fluorescent probes for -lactoglobulin and -synuclein detection.

Studies of structure-function dependences have shown that incorporation of amino-substituents into heterocycles of mono- and trimethinecyanine dyes yields in a appearance of a selective fluorescent response to fibrillar -lactoglobulin and _synuclein presence.

Also it was revealed, that meso-methyl-substituted trimethinecyanine dyes specifically increase their fluorescence in aggregated proteins presence in couple of times higher, as compared to their analogues without substitutions in the polymethine chain.

Benzothiazole 6-dialkylamino-substituted monomethine cyanine (T-284) and meso-ethyl-substituted trimethine cyanine (SH-516) exhibited the greatest specific increase of fluorescence intensity in the presence of fibrillar -synuclein and were proposed as novel fluorescent probes for aggregated -synuclein detection.

Cyanine dye/-synuclein fibril complexes formation was confirmed by means of fluorescent anisotropy and time-resolved spectroscopy methods, as well as atomic force microscopy. In such a way, upon interaction with aggregated -synuclein total lifetime value (~2,5 ns) and fluorescence anisotropy value (~0,27-0,28) for the cyanines were in about order of magnitude higher, as compared with free dyes or dyes in presence of monomeric -synuclein.

Moreover, the fluorescence lifetime studies of the T-284 in free state and in presence of fibrillar ASN demonstrated, that dye binding to protein yields three-exponential fluorescence decay, while for the free dye the two-exponential decay was observed. Appearance of additional long-time component of the dye in fibrils presence may be related to protein-embedded dye molecules.

The quantitative analysis of atomic force microscopy images of fibrillar -synuclein reveals differences in heights between -synuclein fibrils alone and in complex with T-284 dye (6,3±1,0 nm and 8,0±1,1 nm respectively).

Performed calculations of molecular dimensions of a series of cyanine dyes gave us the possibility to presume, that dyes bind to the fibril with their long axes (Y) parallel to the fibril long axis via insertion into the neat rows (so called “binding channels”) running along fibril.

Based on the literature data (Krebs et al., 2005) and by comparing data of fluorescent studies and molecular dimension calculations, we suggest that favorable molecular dimensions for dye to be inserted into “binding channels” and fix in it are about 3 Е along dyes' Z-axis and up to 6,5 Е along Y-axis).

Our experiments yielded equilibrium constants of dye binding to the -synuclein fibrils for the monomethine cyanine dye T-284 (K_b ~1,8Ч10⁶ M^-1) and trimethine cyanine SH-516 (K_b ~1,5Ч10⁶ M^-1) Obtained K_b values are comparable with the corresponding values for Thioflavin T binding with aggregated synthetic peptides (Spillantini et al., 1998).

The T-284 and SH-516 cyanine dyes appeared to be suitable for quantitative detection of as little as ~1,5 мg/ml of fibrillar -synuclein, which is comparable to the detection limit for commercially available dyes for protein quantification in solution (Crystal et al., 2003).

The upper detection limit for SH-516 and T-284 in fluorometric quantification was ~28 мg/ml and ~19 мg/ml of fibrillar protein, respectively. It was shown, that both cyanine dyes are applicable for specific detection of various fibrillar protein species, namely aggregated insulin and lysozyme.

Also T-284 and SH-516 dyes appeared to have ability to follow the step-by-step transition of monomeric -synuclein into fibrils. The enhancement of both dyes fluorescence intensity in the aggregation assay correlated with the formation of amyloid fibrils, which was confirmed by atomic force microscopy.

It was shown, that reproducibility within triplicate measurements is better for the cyanine dyes T-284 and SH-516 than for Thioflavin T.

The superior reproducibility of the T-284 and SH-516 cyanine dyes suggests that they may be more useful for quantitative monitoring of aggregation of -synuclein into amyloid fibrils than Thioflavin T.

This property is crucial for developing cyanine dye-based fluorescent assays for in vitro screening of agents capable of inhibiting aggregation of ASN.