Вплив кадмію на показники азотного і вуглеводного обміну в організмі щурів різного віку

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

УДК 577.1:615.9:546.48:599.323.4

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ КАДМІЮ НА ПОКАЗНИКИ АЗОТНОГО І ВУГЛЕВОДНОГО ОБМІНУ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ РІЗНОГО ВІКУ

Шепельова Ірина Анатоліївна

Київ 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник кандидат біологічних наук, доцент Мельникова Неля Миколаївна, Національний аграрний університет, професор кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Герасименко Віктор Григорович, Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри екології і біотехнології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Хижняк Світлана Володимирівна, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету

Захист відбудеться “29” лютого 2008 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 у Національному аграрному університеті за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, кімн. 28

Автореферат розісланий “26” січня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради І.В. Калінін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вільним амінокислотам належить важлива біологічна роль у регуляторних і адаптаційних процесах організму, а зміни в їх вмісті відображають глибину деструктивних і катаболітичних процесів, які відбуваються в організмі за патологічних станів (Мак-Мюррей У., 1980; Передерий В.Г. и др., 1993; Бенсон Дж. и др., 1994; Ганиев Х.Г., 1996).

Утворення вільних радикалів, яке відбувається, зокрема, за умов надходження до організму важких металів і кадмію, прискорює процес пероксидного окиснення, що супроводжується пошкодженням макромолекул та надмолекулярних компонентів клітини, виснаженням системи антиоксидантного захисту організму, змінами азотного, вуглеводного обміну й інтенсивності біоенергетичних процесів (Меньшикова Н.Б. и др., 1994; Мельничук Д.О. та ін., 2004). Ініціація окисної модифікації білків є однією з ланок токсичного пошкодження клітин унаслідок порушення функціонування цитоплазматичних ферментів і мембранних іонних насосів із наступним запуском різноманітних механізмів руйнування клітин (Dean R.T. et al., 1997).

Отруєння тварин важкими металами призводить до порушення процесу гліколізу, функціонування циклу трикарбонових кислот - важливих шляхів біологічного окиснення і генерації енергії, а також до змін амінокислотного складу організму, внаслідок чого порушується перебіг метаболічних процесів, що призводить до виникнення низки патологічних змін в організмі (Clarkson T.W., 1987). Одним із механізмів токсичного впливу кадмію є його здатність зв'язуватися з HS-групами білків, що призводить до інгібування активності ферментів та утворення комплексних сполук з органічними й неорганічними лігандами (Коротков С.А., 1996).

Іони кадмію є одним із факторів, які зумовлюють розвиток окисного стресу, внаслідок чого відбувається модифікація амінокислот (Levine R.L. et al., 1990; Мещишен І.Ф. та ін., 1999; Дубиніна О.Ю., 2001). Модифікація амінокислотних залишків призводить до змін структурної організації білкової молекули. Це супроводжується фрагментацією їх з утворенням низькомолекулярних компонентів або агрегацією білкових молекул, які підлягають дії активних форм кисню (Davies K.J. et al., 1987; Starke-Reed P.E. et al., 1989; Levine R.L. et al., 1990). Крім того, виникають зміни кислотно-лужного стану організму, змінюються біохімічні показники крові. Порушення кислотно-лужного стану пов'язані з накопиченням кислих продуктів обміну, внаслідок чого виникає метаболічний ацидоз (Мельничук Д.А., 1989; Засєкін Д.А. та ін., 2003; Мельникова Н.М. та ін., 2004; Кравців Р.Й., Буцяк В.І., 2005).

Дослідження останніх років дозволили з'ясувати молекулярні механізми участі спеціалізованих тіолових металотіонеїнів і глутатіону в процесах детоксикації кадмію. Разом з цим важливу роль у детоксикації кадмію можуть відігравати вільні амінокислоти крові та різних органів (Кулинский В.И., 1990).

Вікові відмінності реакцій організму на вплив важких металів за багатьма біохімічними показниками мають важливе значення в оцінці його чутливості до утворення токсичних продуктів метаболізму. При цьому чутливість організму до дії важких металів є більш вираженою у тварин в молодому віці (Трахтенберг І.М., 2005). Гомеостатичний механізм цих змін базується на тому, що молоді тварини мають високий рівень обмінного нітрогену, що обумовлюється інтенсифікацією метаболізму (Agrawal H.C. et al., 1968). З віком змінюється значною мірою не тільки концентрація вільних амінокислот, але і їх співвідношення (Ларский Э.Г., 1990).

Нині недостатньо з'ясовані адаптаційні метаболічні зміни, що виникають у відповідь на дію важких металів, та можливість їх корекції. У сучасній науковій літературі відсутні дані щодо проведення системних досліджень вмісту вільних амінокислот у крові та органах тварин різного віку, отруєних кадмію сульфатом. Питання впливу кадмієвої інтоксикації на стан метаболічного пулу вільних амінокислот в організмі, показники азотного обміну, а також вміст метаболітів гліколізу і циклу трикарбонових кислот у віковому аспекті вивчені недостатньо. Не з'ясовано вплив кадмію на вміст вільних амінокислот, які беруть участь у процесах азотного та вуглеводного обміну.

Тому дослідження показників азотного і вуглеводного обміну в крові та органах тварин при введенні кадмію сульфату у віковому аспекті є важливою ланкою у встановленні природи факторів, які викликають зміни інтенсивності реакцій метаболізму, а визначення цих показників в організмі отруєних тварин дає можливість впливати на регуляцію токсичної дії важких металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідних робіт кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва Національного аграрного університету: “Вплив кислотно-лужного стану на характер біологічної міграції важких металів в організмі тварин” (№ держреєстрації 0101U001700) (2001 - 2005 рр.); “Вивчити біохімічну характеристику тканин організму тварин, токсикованих важкими металами, та розробити способи їх елімінації” (№ держреєстрації 0106U003874) (2006 - 2010 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити вплив кадмію сульфату на показники азотного і вуглеводного обміну в організмі щурів 3-, 6- і 18-місячного віку.

Відповідно до поставленої мети визначено такі основні завдання досліджень:

встановити якісний склад вільних амінокислот у крові, печінці, нирках, легенях, серці та селезінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, а також за умов уведення кадмію сульфату;

дослідити кількісний склад вільних амінокислот у крові, печінці, нирках, легенях, серці та селезінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку і при введенні кадмію сульфату;

дослідити концентрації показників азотного обміну - аміаку, креатиніну, сечовини та загального білка в крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку і за умов уведення кадмію сульфату;

визначити вміст метаболітів гліколізу - пірувату, лактату в печінці та крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку і за умов уведення кадмію сульфату;

визначити вміст метаболітів циклу трикарбонових кислот - малату, оксалоацетату та б-кетоглутарату в печінці та крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку і за умов уведення кадмію сульфату;

виявити взаємозв'язок між змінами показників азотного і вуглеводного обміну в крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку та при введенні кадмію сульфату. кадмій креатинін білок щур

Об'єкт дослідження вплив кадмію сульфату на вміст вільних амінокислот у крові та органах, на концентрацію показників азотного обміну в крові, а також на вміст метаболітів гліколізу і циклу трикарбонових кислот у печінці та крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку.

Предмет дослідження - показники азотного обміну - амінокислоти, аміак, сечовина, креатинін, загальний білок; показники вуглеводного обміну - лактат, піруват, малат, оксалоацетат, б-кетоглутарат; кров, печінка, нирки, легені, селезінка, серце щурів 3-, 6- та 18-місячного віку при введенні кадмію сульфату.

Методи дослідження - біохімічні, спектрофотометричні, спектральні, хроматографічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження амінокислотного спектра крові та внутрішніх органів щурів різного віку за умов уведення кадмію сульфату. Встановлено вікові особливості якісних і кількісних характеристик вільних амінокислот у крові та внутрішніх органах інтактних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, а також показано, що в крові та внутрішніх органах щурів 3-місячного віку метаболічний пул вільних амінокислот є найвищим. Виявлено, що введення кадмію сульфату призводить до зміни метаболічного пулу вільних амінокислот у крові та внутрішніх органах щурів різного віку, а зміни вмісту вільних амінокислот мають виражену вікову залежність, яка найбільшою мірою проявляється у щурів 3-місячного віку. Встановлено, що у крові щурів різного віку за умов уведення кадмію сульфату відбуваються зміни в концентрації показників, які характеризують стан азотного обміну: підвищується концентрація сечовини, аміаку та креатиніну, знижується концентрація загального білка. Вперше досліджено віковий аспект змін вмісту метаболітів гліколізу (пірувату і лактату) та циклу трикарбонових кислот (малату, оксалоацетату і б-кетоглутарату) у крові та печінці інтактних щурів і за умов уведення кадмію сульфату. Наукова новизна одержаних результатів дисертаційної роботи підтверджена патентом на винахід.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень щодо визначення амінокислотного складу та показників азотного і вуглеводного обміну розширюють сучасні уявлення про механізми впливу кадмію на організм тварин залежно від віку. З метою контролю за станом обміну речовин в організмі і профілактики патологій при отруєнні важкими металами необхідно систематично контролювати вміст амінокислот і метаболітів азотного та вуглеводного обміну в крові та внутрішніх органах таких тварин. Дослідження якісного та кількісного амінокислотного пулу, а також вмісту метаболітів азотного і вуглеводного обміну в організмі тварин різного віку при введенні кадмію сульфату необхідно проводити для корекції та нормалізації метаболізму в їхньому організмі. Одержані результати досліджень можуть бути використані в навчальному процесі в закладах біологічного, медичного та ветеринарного профілю, а також у науковій та практичній роботі для наукового обґрунтування корекції азотного і вуглеводного обміну отруєних важкими металами тварин, які перебувають на забруднених територіях.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційне дослідження є самостійно виконаною роботою. Автором проаналізовано дані літературних першоджерел згідно з темою досліджень, проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів, виконано та оформлено дисертаційну роботу. Планування і формулювання завдань роботи, розробку схеми досліджень, аналіз та інтерпретацію одержаних результатів, основних положень і висновків здійснено за участю наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на Міжнародній науково-практичній конференції “Біологічні основи здоров'я та продуктивності тварин” (10 - 11 червня 2004 р., м. Львів); Міжнародній науково-практичній конференції “Ветеринарна медицина - 2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва” (30 травня - 4 червня 2005 р., АР Крим, м. Ялта); ІІІ Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (4 - 7 жовтня 2005 р., м. Київ); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми біохімії, фізіології та функціональної морфології продуктивних тварин” (24 - 25 листопада 2005 р., м. Дніпропетровськ); ІІ, ІІІ Міжнародній конференції студентів і аспірантів “Молодь і поступ біології” (21 24 березня 2006 р., 23 - 27 квітня 2007 р., м. Львів); конференції професорсько-викладацького складу, наукових співробітників і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва (5 6 квітня 2006 р., 16 17 березня 2007 р., м. Київ); Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики” (15 - 16 червня 2006 р., м. Львів); Міжнародній науково-виробничій конференції “Актуальні питання ветеринарної патології та морфології тварин”, присвяченій 100-річчю з дня народження професора Авророва А.А. (22 23 червня 2006 р., м. Воронеж); IX Українському біохімічному з'їзді (23 - 27 жовтня 2006 р., м. Харків); V державній науково-практичній конференції “Аграрна наука виробництву” (23 25 листопада 2006 р., м. Біла Церква); ІІ Міжнародній конференції молодих учених “Біологія: від молекули до біосфери” (19 - 21 листопада 2007 р., м. Харків).

Публікації. Основні експериментальні матеріали за темою дисертації опубліковано в 16 наукових роботах, з них 4 статті у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 2 статті - у збірниках наукових праць, 8 тез - у матеріалах і збірниках наукових конференцій, з'їзду та конгресу, 1 методичні рекомендації та 1 патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, що включає 308 найменувань, з яких 135 латиницею, 8 додатків. Робота викладена на 186 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 28 таблицями та 2 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Дослідження проводились на самцях щурів лінії Вістар, які утримувались на стандартному раціоні. Досліди проведено на щурах трьох вікових груп: 3-місячного віку (період статевого дозрівання; молоді), 6-місячного віку (період статевої зрілості; дорослі) і 18-місячного віку (період старості; старі) (Трахтенберг И.М. и др., 1994).

Отруєння кадмію сульфатом (у подальшому кадмій) проводилося шляхом щоденного внутрішньочеревного введення кадмію сульфату в 0,89 % розчині натрію хлориду, з розрахунку 0,134 мг/100 г маси тіла тварини, що становить 1/50 LD50 (Филова В.А. и др., 1988; Трахтенберг И.М. и др., 1994). Інтактним тваринам внутрішньочеревно вводився відповідний об'єм 0,89 % розчину натрію хлориду. Дослід тривав 14 діб. Тварин декапітували під ефірним наркозом на 15 добу від початку досліду.

Дослідні тварини були поділені на 2 групи: І - інтактні щури; ІІ - щури, яким уводили кадмію сульфат (у подальшому щури, отруєні кадмію сульфатом). Проведено 3 серії дослідів. Першу серію проведено на щурах 3-місячного віку; другу - на щурах 6-місячного віку; третю - на щурах 18-місячного віку.

Матеріалом для дослідження слугували кров і внутрішні органи: печінка, нирки, селезінка, легені, серце. Визначали якісні і кількісні характеристики вільних амінокислот у крові та внутрішніх органах, а також концентрацію показників азотного обміну та вміст метаболітів циклу трикарбонових кислот і гліколізу - в крові та печінці щурів усіх досліджуваних груп. Для дослідження якісних і кількісних характеристик вільних амінокислот брали зразки крові, печінки, нирок, селезінки, легенів, серця; концентрації показників азотного обміну - аміаку, креатиніну, сечовини і загального білка - у крові; вмісту метаболітів гліколізу - лактату, пірувату, циклу трикарбонових кислот - оксалоацетату, малату, б-кетоглутарату проводили у печінці та крові щурів усіх досліджуваних груп.

Концентрацію глюкози, сечовини, загального білка та креатиніну у крові визначали за допомогою біохімічного аналізатора Microlab - 200 (Нідерланди). Дослідження проводилися згідно з методиками, визначеними інструкцією, з використанням стандартних наборів реагентів фірми “Human” (Україна). Концентрацію аміаку у крові досліджували за методом Сілакової (Силакова Г.И., 1969). Визначення якісних і кількісних характеристик вільних амінокислот у зразках крові та внутрішніх органів проводилося методом рідинної іонообмінної хроматографії на амінокислотному аналізаторі ААА Т-339 М фірми “Мікротехна” (Чехія) (Овчинников Ю.А., 1974; Козаренко Т.Д., 1975). Вміст метаболітів циклу трикарбонових кислот і гліколізу визначали в крові та печінці методами ферментативного аналізу (Асатиани В.С., 1969).

Результати досліджень підлягали статистичному аналізу. Достовірність одержаних результатів визначали за критерієм Стьюдента (Кучеренко М.Є. та ін., 2001). Зміни вважалися достовірними при Р < 0,05. Для розрахунків використовувалась компґютерна програма Exсel (Microsoft, USA).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Інтенсивність азотного обміну має виражену вікову залежність і визначається насамперед фізіологічним станом організму та нейрогуморальними факторами (Oldam J.D., 1983). Метаболізм амінокислот залежить від ряду факторів як ендогенних (вік, нейрогуморальний статус, функціонування ферментних систем), так і екзогенних (екологічна ситуація, раціон та ін.) (Западнюк В.И. и др., 1982). Вивчення закономірностей обміну амінокислот на певному етапі онтогенезу є необхідною умовою для правильного вибору діагностичних і терапевтичних заходів щодо усунення патологічних процесів, характерних для певного вікового періоду. Дослідження пулу вільних амінокислот у крові є відображенням інтенсивності обміну білків та амінокислот, а також їх змін під впливом різних факторів, зокрема сполук важких металів.

У крові щурів усіх дослідних груп виявлено 18 амінокислот: аланін, аргінін, аспарагінова кислота, валін, гістидин, гліцин, глутамінова кислота, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, пролін, серин, тирозин, треонін, триптофан, фенілаланін, цистин.

В результаті проведених досліджень, які наведені в табл. 1, виявлено відмінності в кількісному складі вільних амінокислот у крові щурів як залежно від віку, так і за умов уведення кадмію сульфату.

Порівняльний аналіз концентрації вільних амінокислот у крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку свідчить про поступове зменшення з віком метаболічного пулу вільних амінокислот. Так, у крові тварин 3-місячного віку відмічено найвищу концентрацію вільних амінокислот, яка становить 330,25 мкг/мл.

Такий характер кількісних змін амінокислотного складу крові у щурів 6- та 18-місячного віку, можливо, пов'язаний з підвищеною деструкцією білкових молекул за умов посилення катаболізму, пригніченням інтенсивності процесів біосинтезу білка та зниженням активності ферментних систем, що беруть участь в обміні амінокислот. Результати проведених досліджень узгоджуються з даними інших авторів, які показали, що у старих тварин концентрація амінокислот знижується, а інтенсивність метаболізму амінокислот залежить від віку (Богданова Е.В., Толкачева Г.М., 1968; Agrawal H.C. et al., 1968).

Встановлено, що в крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку за умов уведення кадмію знижується загальна концентрація вільних амінокислот відносно відповідних показників у крові тварин інтактних груп (табл. 1).

При цьому за умов уведення кадмію сульфату у крові щурів усіх вікових груп підвищується концентрація аспарагінової та глутамінової кислот, ізолейцину, лізину відносно цих показників у крові інтактних тварин. Відомо, що глутамін в організмі є резервною та транспортною формою аміаку, і підвищення його концентрації в крові, очевидно, є свідченням посилення глутамінсинтетичної функції печінки отруєних щурів (Кричевска А.А. и др., 1983).

Показано, що в умовах кадмієвої інтоксикації у крові щурів усіх досліджуваних груп знижується концентрація аланіну, аргініну, валіну, гістидину, лейцину, метіоніну, проліну, серину, тирозину, треоніну, триптофану і цистину порівняно з цими показниками у крові щурів інтактних груп.

Таблиця 1 - Концентрація вільних амінокислот у крові щурів 3-, 6- і 18-місячного віку за умов отруєння кадмію сульфатом, мкг/мл (M ± m, n = 8)

Примітка. Тут і далі * Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями в інтактних тварин.

З вищезгаданих амінокислот за умов уведення кадмію сульфату найбільше знижується концентрація сірковмісних - метіоніну і цистину.

Виявлене зниження концентрації вільних амінокислот у крові отруєних щурів різного віку може бути пов'язане з порушенням процесів їхнього транспорту, зменшенням надходження амінокислот із кишечнику в кров, а також інтенсивним поглинанням амінокислот тканинами, насамперед печінкою (Любченко П.Н., Герасименко Л.И., 1978).

Отримані дані свідчать про вікові зміни вмісту вільних амінокислот у крові отруєних щурів під дією іонів кадмію, що, очевидно, пов'язано з різною інтенсивністю процесів синтезу та окисної деструкції білка, порушенням механізму транспорту амінокислот у клітини внаслідок деструктивного впливу кадмію на біологічні мембрани (Трахтенберг І.М., 2005; Trinchella F. et al., 2006).

Порівняльна характеристика загальної концентрації вільних амінокислот у крові щурів різного віку при введенні кадмію сульфату дозволяє стверджувати, що зниження концентрації вільних амінокислот має виражену вікову залежність і найбільшою мірою проявляється в крові отруєних щурів 3-місячного віку.

Встановлено якісний склад вільних амінокислот у печінці, нирках, легенях, серці та селезінці інтактних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку і за умов уведення кадмію сульфату. При цьому виявлено таку ж кількість амінокислот, як і у крові, але в кількісному відношенні вони мають свої особливості. Для оцінки функціонального стану печінки за умов отруєння важкими металами застосовують численні методи біохімічних досліджень. При цьому провідна роль належить вивченню вмісту амінокислот і білкових компонентів печінки. Це обумовлено тим, що біохімічні та функціональні зміни печінки, у тому числі протеїнсинтетична функція, призводить до кількісних та якісних змін амінокислотного спектра в цьому органі (Мищенко В.П. и др., 1999).

Встановлено, що отруєння кадмієм призводить до збільшення загального вмісту вільних амінокислот у печінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку відносно відповідних показників у печінці інтактних тварин (табл. 2).

Слід зазначити, що вміст вільних амінокислот у печінці визначається її функціональною спроможністю. Процес утилізації цих сполук у печінці відбувається найбільш активно. Очевидно, цим можна пояснити зменшення вмісту глутамату і аспартату - субстратів реакцій переамінування, які беруть участь у процесах сечовиноутворення та знешкодження аміаку.

Збільшення вмісту сірковмісних амінокислот, очевидно, пов'язано з їх участю в процесах детоксикації і може розглядатись як прояв захисної реакції гепатоцитів на введення важкого металу. Авторами робіт показано, що інгібування реакції утилізації сірковмісних амінокислот є однією з найбільш ранніх ознак порушення функціонування печінки (Chawla R.K. et al., 1990).

Таким чином, аналіз вмісту вільних амінокислот у печінці щурів за умов уведення кадмію сульфату дає змогу встановити вікові особливості токсичного впливу кадмію. Так, при отруєнні кадмієм вміст вільних амінокислот збільшується у печінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку на 16,6, 14,7 і 10,5 % відповідно, а вміст аспарагінової і глутамінової кислот зменшується відносно цих показників у печінці щурів інтактних груп.

Таблиця 2 - Вміст вільних амінокислот у печінці щурів різного віку за умов отруєння кадмію сульфатом, мкг/г (M ± m, n = 8)

Отже, найбільш виражені кількісні зміни виявлено в печінці отруєних щурів 3-місячного віку, що, очевидно, пов'язано з високою інтенсивністю азотного метаболізму в молодому організмі.

Порушення ниркової функції призводить до чисельних метаболічних розладів і, особливо, до порушень обміну білків і амінокислот. Ці зміни визначаються віком, здатністю нирок синтезувати або руйнувати певні амінокислоти, пептиди і низькомолекулярні білки, інтенсивністю екскреції та транспорту амінокислот (Fowler B.A. et al., 1993; Гордієнко В.В., 2004).

Відомо, що сполуки важких металів і кадмію, зокрема, проявляють нефротоксичний ефект, порушуючи процеси обміну і тубулярної реабсорбції в нирках, що призводить до підвищення виділення загального білка (Кухарчук О.Л. та ін., 2001; Нейко Є.М. та ін., 2003).

Враховуючи значення функціонального стану нирок та їхню роль у метаболізмі азоту, досліджено вміст вільних амінокислот у даному органі та за умов отруєння щурів кадмію сульфатом залежно від віку (табл. 3). Результати проведених досліджень свідчать, що за умов отруєння кадмієм у нирках щурів 3-, 6- і 18-місячного віку збільшується загальний вміст вільних амінокислот, відносно відповідних показників у нирках щурів інтактних груп на 18,4, 13,4 і 8,9 % відповідно. Найбільших змін зазнає вміст сірковмісних амінокислот - метіоніну і цистину. Вміст останніх у щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, отруєних кадмієм, вірогідно збільшується на 61,5 і 60,9 %, 56,4 і 63,9 %, 34,7 і 56,5 % відповідно відносно цих показників у нирках інтактних щурів.

Отже, найбільших змін зазнає організм тварин 3-місячного віку, що узгоджується з роботами інших авторів (Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Деркач Є.А., 2004) і, очевидно, пов'язано з високим рівнем кумуляції цього важкого металу в нирках, зокрема у корковому шарі (Uriu K. et al., 2000; Yadav N. et al., 2006).

Досліджуючи вплив кадмію сульфату на метаболічний пул вільних амінокислот у легенях щурів 3-, 6- і 18-місячного віку встановлено зменшення загального вмісту вільних амінокислот у легенях отруєних тварин відносно відповідних показників у інтактних щурів. Такий характер змін узгоджується зі зниженням концентрації вільних амінокислот у крові, внаслідок порушення процесів транспорту за умов кадмієвої інтоксикації.

Аналізуючи результати цієї серії досліджень, слід зазначити, що введення кадмію сульфату в організм щурів 3-, 6- та 18-місячного віку призводить до змін пулу вільних амінокислот у легенях отруєних щурів. Ступінь прояву цих змін значною мірою залежить від віку тварин. Найменш виражені порушення вмісту вільних амінокислот у легенях за умов отруєння кадмієм спостерігаються в групі щурів 18-місячного віку і становлять 10,5 %, тоді як у легенях тварин 3- і 6-місячного віку - 16,1 і 13,3 % відповідно, відносно цих показників у легенях щурів інтактних груп, що, можливо, пов'язано передусім із пригніченням інтенсивності метаболічних процесів.

Водночас виявлено, що молодий організм найбільш чутливий до токсичної дії кадмію порівняно з тваринами 6- і 18-місячного віку.

Таблиця 3 - Вміст вільних амінокислот у нирках щурів різного віку за умов отруєння CdSO₄, мкг/г (M ± m, n = 8)

В результаті проведених досліджень показано, що при отруєнні кадмію сульфатом у серці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку спостерігається зменшення загального вмісту вільних амінокислот відносно цих показників у серці тварин інтактних груп.

Можливо, що такий характер змін метаболічного пулу вільних амінокислот у серці отруєних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку може бути обумовлений втратою можливості клітин міокарду акумулювати амінокислоти з плазми крові. Водночас, зменшення загального вмісту амінокислот у серці, можливо, пов'язане з активацією метаболічних процесів у серцевому м'язі у відповідь на введення токсичної речовини, а саме кадмію сульфату. При цьому молодий організм характеризується більш високою інтенсивністю метаболічних перетворень порівняно із щурами 6- і 18-місячного віку. В результаті зменшується загальний вміст вільних амінокислот за умов отруєння кадмієм, що найбільшою мірою проявляється в серці щурів 3-місячного віку і становить 16,0 %, тоді як у тварин 6- і 18-місячного віку - 14,3 і 11,9 % відповідно відносно цих показників у серці інтактних тварин.

Аналіз одержаних результатів свідчить, що отруєння кадмієм призводить до зміни метаболічного пулу вільних амінокислот у селезінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку. Встановлено, що за умов отруєння кадмію сульфатом зменшується загальний вміст вільних амінокислот у селезінці отруєних щурів усіх дослідних груп відносно цих показників у селезінці інтактних тварин. Встановлено, що найбільших змін при отруєнні зазнає молодий організм. Так вміст вільних амінокислот у селезінці щурів 3-місячного віку за умов отруєння кадмієм зменшується на 15,5 % відносно інтактних тварин.

Відомо, що вільні амінокислоти є сполучною ланкою між обміном білків і проміжним обміном нітрогену (Bender D.A., 1975; Мельничук С.Д. та ін., 2001).

У зв'язку з цим досліджено концентрацію показників азотного обміну - аміаку, креатиніну, сечовини та загального білка в організмі щурів 3-, 6- і 18-місячного віку та за умов отруєння кадмію сульфатом (рис. 1).

Одержані дані свідчать, що введення кадмію сульфату в організм щурів різного віку, призводить до зміни концентрації показників, які характеризують стан азотного обміну. Так, у крові отруєних тварин 3-, 6- і 18-місячного віку виявлено тенденцію до зниження концентрації загального білка на фоні вірогідного підвищення концентрації аміаку в 2,1, 2,1 і 1,7 раза, сечовини - у 2,0, 1,6 і 1,2 раза та креатиніну - у 2,5, 1,6 і 1,4 раза відповідно відносно цих показників у крові тварин інтактної групи, що є свідченням посилення амонієгенезу та сечовиноутворення в тканинах, оскільки кадмій є одним із визначальних факторів, що опосередковано, в результаті низки складних метаболічних перетворень, призводить до виникнення метаболічного ацидозу (Мельничук Д.О., Любецька Т.В. та ін., 1987; Мельникова Н.М. та ін., 2004). При цьому в організмі отруєних тварин відбувається процес окисної модифікації білків, який призводить до агрегації або фрагментації білка. Такі окиснені білки є субстратом для протеолітичних ферментів, які, в свою чергу, також обумовлюють зниження у крові концентрації загального білка (Simpson J.A. et al., 1992; Levine R.L. et al., 1999). Найбільш виражені зміни концентрації показників азотного обміну відмічено в крові отруєних щурів 3-місячного віку, що можна пояснити пригніченням з віком метаболічних процесів.

Обмін амінокислот контролюють біохімічні та фізіологічні механізми, що забезпечують відносно стабільний їх рівень у крові та тканинах, а надлишок утилізується в реакціях глюконеогенезу, синтезі ацетил-КоА та утворення проміжних продуктів циклу трикарбонових кислот (Бенсон Дж. и др., 1984). Таким чином, амінокислоти в процесі тканинного обміну утворюють субстрати циклу трикарбонових кислот. Вуглеводи, що зазнають перетворення в результаті гліколізу, є джерелами пірувату і лактату.

Зважаючи на те, що в процесі онтогенезу відбуваються значні зміни окисно-відновних реакцій і, зокрема, зміни гліколізу та циклу трикарбонових кислот (Доліба М.М., Кургалюк Н.М. та ін., 1993), вивчено вікові особливості токсичного впливу кадмію на окремі ланки цих метаболічних шляхів, як одних із найважливіших у процесах біологічного окиснення і генерації макроергічних зв'язків.

За результатами проведених досліджень встановлено, що отруєння щурів 3-, 6- і 18-місячного віку кадмію сульфатом призводить до порушення метаболізму вуглеводів і проявляється підвищенням концентрації глюкози, метаболітів гліколізу та циклу трикарбонових кислот у крові отруєних тварин (рис. 2).

Досліджуючи концентрацію метаболітів гліколізу у крові отруєних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, встановлено вірогідне підвищення концентрації лактату на 33,7, 24,2 і 17,2 %, пірувату - на 77,8, 75,0 і 73,3 % відповідно відносно цих показників у крові інтактних тварин. Надлишок концентрації лактату за умов отруєння кадмієм, імовірно вказує на активацію анаеробних процесів гліколізу. Водночас, підвищена концентрація пірувату в крові отруєних щурів може свідчити, що процеси вуглеводного розщеплення гальмуються на стадії окиснення пірувату.

При дослідженні концентрації метаболітів циклу трикарбонових кислот у крові за умов уведення виявлено їхні зміни у щурів усіх вікових груп. Встановлено, що в отруєних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку вірогідно підвищується концентрація малату на 40,2, 33,8 і 24,6 %, б-кетоглутарату - на 79,4, 63,3 і 50,0 %, оксалоацетату - у 2,1, 1,9 і 1,8 раза відповідно відносно цих показників у крові щурів інтактних груп. Такий характер змін концентрації метаболітів циклу трикарбонових кислот у крові отруєних щурів, можливо, пов'язаний з пригніченням функціонування аеробного шляху розщеплення вуглеводів і, як наслідок, - зниження використання зазначених метаболітів у циклі трикарбованих кислот.

На підставі аналізу одержаних даних можна зробити висновок про відмінності інтенсивності процесів вуглеводного обміну залежно від віку тварин.

Отже, результати проведених досліджень свідчать, що з віком чутливість організму до токсичного впливу важких металів знижується. Зміна біохімічних процесів в організмі щурів на різних етапах онтогенезу лежить в основі адаптаційних реакцій організму до дії ксенобіотиків і є одним із механізмів пристосування до існування за умов отруєння кадмієм (Трахтенберг І.М., 2005). Встановлено, що в крові отруєних щурів 3-місячного віку ступінь активації гліколізу є значно вищою порівняно з відповідними показниками у крові отруєних тварин 6- та 18-місячного віку.

Таким чином, виявлене пригнічення з віком активності гліколізу може свідчити про зниження потенціальних резервів гліколітичної системи.

Результати проведених досліджень доводять, що отруєння кадмієм призводить до зміни вмісту глюкози, метаболітів гліколізу і циклу трикарбонових кислот не тільки у крові, а й у печінці щурів 3-, 6- та 18-місячного віку (рис. 3).

При дослідженні вмісту метаболітів гліколізу - лактату й пірувату в печінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку за умов уведення кадмію, встановлено вірогідне збільшення їх вмісту в 1,5, 1,3 і 1,2 раза і 2,4, 2,0 і 1,7 раза відповідно відносно цих показників у печінці тварин інтактних груп. Збільшення вмісту лактату свідчить про активацію гліколітичних процесів анаеробного дихання за умов отруєння важкими металами й узгоджується з високим вмістом пірувату. Таким чином, активація гліколізу при отруєнні кадмієм, можливо, є пристосувальним механізмом внаслідок пригнічення споживання кисню печінкою, а також зниження активності ряду ферментів, які беруть участь у цьому процесі.

Показано, що при отруєнні кадмію сульфатом у печінці щурів усіх досліджуваних груп збільшується вміст метаболітів циклу трикарбонових кислот - б-кетоглутарату, малату, оксалоацетату. Так, вміст б-кетоглутарату в печінці отруєних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку збільшується у 2,8, 2,3 і 1,7 раза, малату - у 2,7, 2,4 і 1,6 раза та оксалоацетату - у 2,3, 2,1 і 1,8 раза відповідно відносно цих показників у печінці інтактних щурів. Виявлено тенденцію до збільшення вмісту глюкози в печінці всіх досліджуваних щурів при отруєнні кадмію сульфатом відносно цього показника в печінці щурів інтактних груп.

За умов уведення кадмію вміст лактату та пірувату в печінці щурів 3-місячного віку є значно більшим, порівняно з відповідними показниками у тварин 6- і 18-місячного віку при отруєнні кадмієм, що пов'язано з особливостями обмінних процесів у молодому організмі й може свідчити про зниження інтенсивності окисно-відновних процесів і накопичення недоокиснених продуктів проміжного обміну в організмі при дії кадмію сульфату.

Зміни вмісту цих метаболітів у печінці щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, за умов отруєння кадмієм, порівняно із цими показниками у печінці щурів інтактних груп, узгоджуються зі змінами їх концентрації в крові. При цьому аналіз одержаних результатів дозволяє стверджувати, що такий характер змін є проявом пристосувальної реакції організму тварин різного віку до токсичної дії кадмію сульфату, яка найбільшою мірою виражена у щурів 3-місячного віку.

Отже, наведені в роботі дані свідчать, що при введенні кадмію сульфату ступінь змін біохімічних показників визначається, насамперед, віком і найбільшою мірою проявляється в організмі 3-місячних тварин. Показано, що інтенсивність метаболічних процесів на різних етапах онтогенезу має виражену вікову залежність і визначає чутливість організму щодо токсичного впливу важких металів. Встановлено, що за умов отруєння кадмію сульфатом стостерігаються кількісні зміни вмісту досліджуваних показників, які можна розглядати як компенсаторну відповідь організму на дію кадмію, що призводить до розвитку метаболічного ацидозу. Таким чином, дослідження якісного та кількісного спектра вільних амінокислот, а також метаболітів азотного і вуглеводного обміну в організмі тварин різного віку, отруєних кадмію сульфатом дає можливість корекції вмісту цих показників з метою нормалізації метаболічних процесів в отруєному організмі. У свою чергу, корекція таких біохімічних показників, як вміст вільних амінокислот, метаболітів азотного і вуглеводного обміну в крові та внутрішніх органах отруєних щурів різного віку відіграють важливу роль у формуванні адаптаційних реакцій організму тварин до дії ксенобіотиків і кадмію зокрема.

ВИСНОВКИ

Досліджено амінокислотний спектр крові та внутрішніх органів у інтактних щурів і за умов уведення кадмію сульфату в 3-, 6- і 18-місячному віці. Встановлено якісний склад вільних амінокислот у крові, печінці, нирках, легенях, серці й селезінці інтактних щурів усіх вікових груп та за умов уведення кадмію сульфату, яких налічується 18: аланін, аргінін, аспарагінова кислота, валін, гістидин, гліцин, глутамінова кислота, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, пролін, серин, тирозин, треонін, триптофан, фенілаланін, цистин.

Кількісний склад виявлених вільних амінокислот у крові, печінці, нирках, легенях, серці та селезінці інтактних щурів у віковому аспекті показав, що в крові та внутрішніх органах щурів 3-місячного віку загальний вміст вільних амінокислот є більшим порівняно з відповідними показниками у тварин 6- і 18-місячного віку.

Встановлено перерозподіл вмісту вільних амінокислот в організмі отруєних щурів 3-, 6- і 18-місячного віку, які мають подібну спрямованість змін у всіх вікових групах, але найбільш виражені у щурів 3-місячного віку відносно інтактних тварин. Так, при введенні кадмію сульфату загальний вміст вільних амінокислот у печінці 3-місячних щурів збільшується на 16,6 %, при цьому вміст аспарагінової і глутамінової кислот зменшується; у нирках - збільшується на 18,4 %, а в легенях, серці та селезінці - зменшується на 16,1, 16,0, 15,5 % відповідно; у крові - знижується на 17,7 %, але концентрація ізолейцину, аспарагінової і глутамінової кислот вірогідно підвищується. Встановлені зміни вмісту вільних амінокислот є свідченням порушення їхнього метаболізму в організмі за умов дії кадмію сульфату.

Виявлено зміни концентрації показників азотного обміну у крові інтактних щурів різного віку та за умов уведення кадмію сульфату, які найбільш виражені у 3-місячних щурів: вірогідне підвищення концентрації сечовини, аміаку, креатиніну відповідно в 2,0, 2,1 і 2,5 раза та зниження концентрації загального білка на 17,3 %, відносно щурів інтактної групи, що може бути наслідком посилення інтенсивності амонієгенезу та сечовиноутворення.

Встановлено вірогідне збільшення вмісту метаболітів вуглеводного обміну в печінці та крові щурів за умов уведення кадмію сульфату, в усіх вікових групах, що найбільш виражено у тварин 3-місячного віку, відносно цих показників у печінці та крові щурів інтактної групи, а саме вміст метаболітів гліколізу - пірувату і лактату в крові в 1,8 і 1,3 раза, в печінці в 2,4 і 1,5 раза відповідно, циклу трикарбонових кислот малату, оксалоацетату і б-кетоглутарату у крові в 1,4, 2,1 і 1,8 раза, в печінці у 2,7, 2,3 і 2,8 раза відповідно, що вказує на функціональні та метаболічні зміни в організмі отруєних тварин.

Показано, що дослідження показників азотного і вуглеводного обміну в організмі тварин, з урахуванням віку, є необхідною передумовою для корекції змін в їх організмі за умов впливу важких металів.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хімічні методи визначення важких металів у біологічних зразках: Методичні рекомендації для лікарів хіміко-токсикологічних відділів державних лабораторій ветеринарної медицини України, слухачів факультетів підвищення кваліфікації та студентів факультетів ветеринарної медицини, якості та безпеки продукції АПК / Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Вовкотруб М.П., Калінін І.В., Шепельова І.А. та ін. - К.: НАУ, 2004. - 74 с.

2. Мельникова Н.М., Шепельова І.А., Деркач Є.А. Вікові особливості вмісту вільних амінокислот у крові щурів, отруєних солями кадмію // Вісник Дніпропетровського Державного аграрного університету: зб. наук. пр. Д.: ДДАУ, 2005. № 2. - С. 55 - 57. (Дисертантом проведено планування експерименту, поставлено дослід, проведено відбір проб та визначення концентрації вільних амінокислот у крові щурів різного віку, аналіз одержаних результатів, написання статті).

3. Мельникова Н.М., Шепельова І.А. Амінокислотний склад крові щурів за умов токсикування сульфатом кадмію // “Ветеринарна медицина 2005”: Сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва: Міжнар. наук.-практ. конференція присвячена до 90-річчя від дня народження академіка Івана Микитовича Гладенька: 85-й випуск міжвідомчого тематичного наукового збірника “Ветеринарна медицина”. АР Крим, м. Ялта, 30 травня - 4 червня 2005 р. Харків, 2005. Т. 1. С. 773 - 776. (Дисертантом проведено планування та постановка експерименту, відбір біологічних зразків, визначення амінокислот у крові щурів 6-місячного віку, статистична обробка та аналіз одержаних результатів, написання статті).

4. Шепельова І.А., Деркач Є.А., Мельникова Н.М. Вплив кадмію на вміст вільних амінокислот та активність трансаміназ у крові щурів різного віку // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини імені С.З. Гжицького. Львів, 2006. Т. 8, № 2 (29), Ч. 2. - C. 188 - 191. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження, здійснено відбір проб, визначення концентрації вільних амінокислот у крові щурів, аналіз і узагальнення результатів, участь у написанні статті).

5. Шепельова І.А., Деркач Є.А., Мельникова Н.М. Амінокислотний склад крові та показники азотового обміну у щурів, отруєних кадмію сульфатом // Современные проблемы токсикологии. - 2006. - № 4. - С. 35 - 37. (Дисертантом проведені експериментальні дослідження, здійснено відбір проб, визначення концентрації вільних амінокислот і показників азотового обміну у крові щурів 6-місячного віку, аналіз і узагальнення результатів, участь у написанні статті).

6. Мельникова Н.М., Шепелева И.А., Деркач Е.А. Содержание свободных аминокислот в печени крыс отравленных кадмия сульфатом // Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных: Междунар. научно-производ. конф., посвященная 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А.: Матер. конф. Воронеж, 2006. С. 727 730. (Дисертантом проведено планування експерименту, поставлено дослід, проведено відбір проб і визначення концентрації вільних амінокислот у печінці щурів, аналіз одержаних результатів, написання статті).

7. Шепельова І.А., Деркач Є.А., Мельникова Н.М. Вплив кадмію сульфату на вуглеводний обмін в організмі щурів різного віку // Укр. біохім. журн. - 2007. - Т. 79, № 2. - С. 92 - 96. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, здійснено відбір проб, визначення концентрації метаболітів гліколізу і циклу трикарбонових кислот у крові щурів різного віку, статистична обробка та аналіз одержаних результатів, написання статті).

8. Патент на корисну модель 26310 Україна, G01N 33/48 Спосіб моделювання кадмієвої інтоксикації. Патент на корисну модель 26310 Україна, G01N 33/48 Мельничук Д.О., Мельникова Н.М., Деркач Є.А., Шепельова І.А. (Україна). № u 2007 05711; Заявл. 23.05.2007; Опубл. 10.09.2007, Бюл. № 14. 4 с.

9. Мельникова Н.М., Шепельова І.А., Деркач Є.А. Вміст вільних амінокислот у крові щурів отруєних кадмію сульфатом на різних етапах онтогенезу // ІІІ Міжнар. конгрес спеціалістів ветеринарної медицини: Тези доп. Київ, 4 - 7 жовтня 2005 р. К.: НАУ, 2005. С. 136 - 137.

10. Шепельова І.А., Мельникова Н.М., Деркач Є.А. Амінокислотний склад крові щурів в онтогенезі // Молодь і поступ біології: ІІ Міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів. Львів, 21 24 березня 2006 р. Львів, 2006. - С.75 76.

11. Мельникова Н.М., Шепельова І.А., Деркач Є.А. Вплив кадмію сульфату на вміст метаболітів трикарбонового циклу в печінці отруєних щурів // Конференція професорсько-викладацького складу, наукових співробітників і аспірантів навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва: Тези доп. Київ, 5 6 квітня 2006 р. К.: НАУ, 2006. С. 75 - 76.

12. Шепельова І.А., Деркач Є.А. Вікові особливості вмісту аспарагінової та глутамінової кислот в печінці щурів отруєних сульфатом кадмію // IX Український біохімічний з?їзд: Матер. з?їзду. Харків, 24 - 27 жовтня 2006 р. - Х., 2006. - Т. 2 . - С. 235.